时间：2023-03-08 00:50:06
为迎接更全面的生命科学的发展，提高生物科学专业学生适应学科发展的需要的能力，我们学院专门开设了针对生物科学专业的限选课程――蛋白质化学与蛋白质组学。本课程在介绍蛋白质化学基本内容的同时，兼顾学科发展动态，使学生掌握蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和生物信息学在蛋白质组学及蛋白质工程方面的应用及典型的研究实例，力求增长生物科学专业学生的专业知识与技能，为完成毕业论文设计及今后从事生命科学相关工作打下坚实基础。课程开课几年来，笔者及同教研室课题组对蛋白质化学与蛋白质组学课程的教学理念、教学内容、教学方法，教学效果评价方式进行了积极的实践与探索。
一 教师本身要努力提高教学质量
蛋白质化学与蛋白质组学的授课对象是生物科学专业本科三年级的学生。该阶段的学生面临毕业论文设计及准备考研两大难题，对此，本课程的教学目标应该是养成学生的科研思维，提高实验设计水平，培养其动手能力。这就要求教师必须更新教育理念，改变以往理论课单向授课的方式，要认识到此时的教学课程必须以学生为中心。因此，教师在精心准备教案讲义，认真制作多媒体课件的同时，应当思索如何灵活地运用各种教学方法，引导学生的兴趣，并使学生参与到教学过程中来。提高教师自身的理论水平和科研能力，改革教师课堂教学方法和教学结构，认真研究学生的认识规律和学习方式，培养学生的学习兴趣，充分调动学生的主观能动性是提高教学质量所必需的。在教学过程中，教师扎实的理论基础、丰富的科研经验、熟练的实验操作水平是引导教学成功的先决条件。
二 教学理念要转变，教学方式要灵活
“以学生为中心，以能力培养为导向”这一理念近年来备受教师关注和学生欢迎[2]。这一理念强调由教师引导，确定教学目标，学生为中心和主导，根据教学目标，主动收集整理资料，自主探究相关知识，发现问题，分析问题，解决问题，最后由教师总结，将学习的主动权真正交还给学生。这样，教师与学生在发现分析解决问题的过程中，各自完成教学任务，效率和认知度远超过以往单向的教授方式。
由于该门课程为限选课，选课学生维持在25～40人左右，因此，教师从备课开始就应以灵活的方式与学生去沟通。在课堂上，我们在进行多媒体教学的同时，增加与学生的互动，及时掌握学生的兴趣点与理解程度，可以充分调动学生的积极性。实践证明，教师更新教学理念，提高教学质量，对于端正学风，提高学生的积极性有着积极的作用。
生命科学是一门实践性很强的科学，因此理论与实践相结合是完成教学任务的必经之路。因此，笔者根据课程的教学内容和学生的理论水平及兴趣点，经常开展各种课间讨论，促进学生深刻并灵活地掌握知识。笔者常采用以下方式：首先，生命科学是一门发展迅速的科学，与医学、社会学等学科有交叉，且与我们的生活生产密切相关。因此，灵活地举例对于培养学生的学习兴趣显得十分重要。例如，北京蛋白质组学研究中心是我国蛋白质组学国家重点实验室，作为国际人类肝脏蛋白质组计划实行总部，目前该中心已成功鉴定人类肝脏蛋白质13000余种，并绘制了高可信度的肝脏蛋白质互作图谱，发现了58种潜在的肝脏疾病候选基因等。像常见的脂肪肝、肝炎病毒感染、肝癌癌变及转移等标志蛋白质陆续被发现，为今后肝脏相关疾病的预防及治疗打下了坚实的基础。通过这一举例，既能够增强学生对蛋白质组学的认可度，且因为该项目为我国自主研究项目，能够为学生提供今后科研的方向，也能增强学生的科研信心。其次，安排学生参加教学实验或科研实验，引导学生有意识地学会科研思维，激发学生学习兴趣，培养其分析问题和解决问题的能力。例如，通过让学生参与笔者主持或参与的科研课题，了解科研实验的实施过程，在此过程中理解并掌握所学知识。再次，指导学生进行实验设计和科研设计，培养其科研能力。例如，让学生根据需解决的科研问题和掌握的实验方法等，指导其通过参考文献等方法进行初步的实验设计及课题研究报告的撰写。近年来，笔者已指导学生撰写科研课题研究报告多项，并获学校及学院立项，极大地提高了学生的信心和兴趣。此外，为了提高课程的实用性，提高学生的动手能力和解决问题的能力，笔者所在学院开设了开放实验课程，我们鼓励学生主动地进行实验设计，习得相应的实验技能。
三 考核方式和教学效果评价方法要改进
高校的选修课程普遍采用平时成绩和期末成绩综合评价的方式进行考核。以往的课程其平时成绩部分通常以出勤率或者答题的方式为参考，对于评价学生的学习效果并不适用，而期末成绩仅凭一张理论考试试卷也难以评价学生的科研思维和能力。生命科学是一门实践性很强的学科，而蛋白质组学的教学目的，是通过本课程培养学生的科研思维，培养学生的科研能力。因此，在考核方式上，也应当实施多种考核方式，综合评价学生能力。考试方式主要由平时成绩、综述写作及期末理论考试成绩组成。以探究式教学方法教学，重点在于灵活地考查学生运用理论知识探究科学问题的能力。因此，在平时，我们让学生以小组或个人形式，自由地进行发挥。如，进行课题设计，讨论实验思路，撰写研究论文，演讲PPT及答辩等方式进行评分，借此改变单独理论考试的单一形式，建立更科学的多元化评价方式，引导学生进行探究式学习，注重对学生能力的培养。此外，综述的写作有助于学生形成对某一科研领域的综合认识，期末理论考试主要考白质组学相关概念和理论的掌握程度，同时结合实验分析题也可以一定程度上了解学生对某些重要蛋白质组学技术的掌握程度。
蛋白质化学与蛋白质组学这门课程作为生物科学专业学生的限选课程，在国内院校开得并不多，该课程在我校已开设多年，以探究式的教学方式为主要教学方法受到了学生的欢迎和肯定。对于需要进行毕业论文设计和今后即将进入医院或科研机构的生命科学专业学生来讲，这门课程在一定程度上让他们初步形成了科研思维，并且得到了一定的训练，对于今后进入实验室有着较好的铺垫作用。此外，毕业论文设计的指导老师也普遍认为学生具有一定的科研思维能力，知识较全面，因此也充分显示了该课程教改的优势和效果。
四 教师应当以身作则，培养学生求真的科学态度
伟大的教育家陶行知曾说：“千教万教教人求真，千学万学学做真人”。科研探索是用于发现问题、分析问题和解决问题的，在此过程中，需要对每次的实验结果进行多次论证，力求结果的真实及科学性。孔子云：“其身正，不令而行。其身不正，虽令不从。”因此，教师自身良好的教学态度和科研精神起到了楷模示范的作用。由于学生理论及实验水平有限，在课外指导学生进行实验设计或论文撰写时，教师必须直接参与并监督实验的实施与完成，在此过程中，教师需要一丝不苟，严谨求真，坚韧不拔，同时，也应严格要求学生在实验前做好各项准备工作，实验过程中规范操作，对实验结果进行独立思考和分析，杜绝造假及人为疏忽。
在处理与学生的关系时，一定要真诚平等，这一点十分重要。教师传授知识，学生学习知识，师生关系融洽是完成教学任务的一项重要保证。教师如能自律，一丝不苟，真诚平等地对待每一位学生，那么学生也会以真诚的态度对待课程，如此才会有良性循环。
综上所述，蛋白质化学与蛋白质组学的教学过程中应时刻把握“以人为本，以学生为中心”的教学理念。将探究式教学方式贯穿课程的教学过程，能够提高学生的科研思维和创新能力，在此过程中，学生自主或相互合作，与教师共同参与教学过程，激发了学生的学习兴趣，充分地调动了其主观能动性，因而直接提升了教学质量，对于面对即将进行毕业论文设计，即将考研或即将实习的生物科学专业学生而言，受益匪浅。
当然，该门课程属于新开课程，碰到许多难题。首先，在教材的选择上，我们选择很久，教育部没有正式出版的专门针对蛋白质化学与蛋白质组学的规划教材，因此，我们选择何华勤主编的《简明蛋白质组学》作为授课教材，该书内容全面且简明扼要，并以利布莱尔主编的《蛋白质组学导论――生物学的新工具》、Wilkins主编的《蛋白质组学研究：概念、技术及应用》为参考书要求学生阅读。第二，学生前两年以修学分为主，理论课程较多，实践时间较少，因此对本课程很多稍微复杂点的实验内容，如亲和柱层析、DIGE等缺乏深刻理解;此外，课程中讲解到的各种实验仪器，如双向电泳系统、质谱仪等由于价值不菲，对本科生的开放程度有限，因此，学生即使掌握理论，但无法形成深刻认识;最后，生物信息学内容专业复杂，学生的认知度与课程要求有落差，限制了教学的效果。但是笔者与同课题组成员课余开放本研究所现有的双向电泳平台，力求为学生创造条件。
生命科学学科发展日新月异，高校人才培养观念和体系也要不断与时俱进，教师需要不断修正教学方案，及时总结教学规律，才能提高教学质量，这样才能真正做到以学生为中心，以能力培养为导向，努力而有效地培养出适应社会和经济发展需求的生命科学学科专业人才。
参考文献
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性，有所提高，本文就蛋白质组学在药物研究中的作用做一综述。
1 药物蛋白质组学
由于蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者， 因此蛋白质不仅是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子，而且也成为大多数药物的药靶乃至直接的药物。蛋白质组学正是近年来新发展起来的、强有力的发现药靶的技术平台， 这是一个新的学科发展领域。以药物发现为起点， 基因组学与蛋白质组学间的相互协调运作， 将有助于阐明疾病的发生、发展机制、鉴定新的药靶， 以及新的生物标志物， 并用于指导临床试验。一项科学统计表明：在90 年代中期， 全世界制药业用于找寻新药的药靶共283个， 它们主要是蛋白质(受体占45%， 酶占28%等)； 而当时全世界正在使用的药物总数大约有2 000 种， 其中85%都是针对上述483种药靶。从功能基因组学的角度看，人们认为每种疾病平均与10种左右基因相关， 而每种基因又与3~10种蛋白质相关。如果以人类主要的100~150种疾病进行计算， 则将有3 000~15 000种的蛋白质可能成为药靶。
药物蛋白质学研究的内容，在临床前应包括：发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物有人称此为化学基因组学(chemogenomics)，也应包括应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学[3]；在临床研究方面应包括：药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。类似于基因组和蛋白质组，药物蛋白质组的成功将不仅需要综合的技术和计算机的发展，而且也将需要药物发现过程在制药工业中发生根本的变化。朝向这个目标的任何研究进展都将可能产生大量的、可专利的药物分子。
许多公立和私立机构都在实施结构蛋白质组计划。公立的计划现在德国、加拿大、日本和美国展开，总共投入了约10亿美元的基金。现在，已有将近15 000 个蛋白的3D结构已经公开并且可以很方便地使用。未经处理的粗糙的数据和细化的同源性模型工具能预示大量的药物相关蛋白靶的结构和潜在的配体结合位点的形式，及其物理特性。对于制药工业，在蛋白质组规模了解结构信息有以下几个方面的重要性：①结构信息可用于解释功能，因而揭示新的潜在靶点；②能通过分析与共同的小分子结合的其它已知蛋白的同源性，来辅助验证靶，而那些只有结构特性，但不与药物结合的蛋白不能确认为靶；③用基于结构的方法，设计先导化合物，完善结构预示的计算方法，这些最终将使科学家能从序列预示结构和功能；④利用结构信息，对已知的化合物数据库和天然产物数据库作初步筛选，将提高先导化合物的产出效率，降低高通量生物学筛选的成本。
随着后基因组时代的到来和科学技术尤其是蛋白质组学，生物信息学等的发展，蛋白质组学在药物开发中的作用会越来越明显，通过蛋白质组学开发的药物也会越来越多[4-7]。
药物蛋白质组学就是应用蛋白质组学的方法对基因表达水平上的疾病和药物作用效果进行分析[3]，目前虽然蛋白质组学应用于新药研究还处于初级阶段，但其蕴涵的巨大潜能已被药品研究人员看好，在药物发现阶段，大量合成的有机化合物和分离得到的天然产物有效成分，在有效的药理模型上利用自动化的筛选技术进行随机筛选，发现具有进一步开发价值的化合物，称为先导化合物[4-6]。药物发现阶段对创新药物的研究具有决定性的意义，筛选效率的提高将大大缩短新药发现的周期，蛋白质组学技术能促进靶点的发现、筛选模型的建立和中药的研究开发具有重要的意义。
2 靶点的发现
2．1 疾病相关蛋白质 蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用下表达异常蛋白质的方法。这种蛋白质可以作为药物筛选的靶点。还可以对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分析，发现一些疾病不同时期的蛋白质标志物，这不仅对药物发现具有指导意义，而且还可以形成未来诊断学、治疗学的基础理论[7-8]。癌症被称为当今人类的一大天敌，因而抗肿瘤药物的开发也成了科学家研究的重点。现今大多数抗癌药物都伴随着严重的不良反应。特别是对晚期癌症进行单一化疗或联合放疗、过热疗法时，经常伴随着癌细胞对细胞抑制剂的耐药性的发生。如果能发现耐药细胞体系中表达异常蛋白或者与细胞密切相关的蛋白质，就可以以此蛋白为靶点设计出用于联合用药的药物，也可以此信息为参考，设计避免耐药性或毒副作用的药物[9-11]。另外造成癌症患者死亡率极高的另一个原因是肿瘤细胞的转移。现在国内一些实验室已经开始采用蛋白质组学技术，通过对高低转移的细胞株蛋白的比较，来寻找与肿瘤转移相关的蛋白质，同样也可以以高转移株异表达的蛋白为靶点，开发抑制肿瘤转移的新药[12]。
2．2 新型抗生素 由于传染病是死亡的主要原因，因而抗感染药仍然是各国新药开发的热点之一。但面对抗生素的耐药问题以及不断出现的新的微生物感染性疾病，老的方法已经束手无策，其根本的原因是在于对药物的作用机制缺乏透彻的认识。蛋白质组学技术可以人们更清楚的了解细菌内哪些蛋白质会在抗生素的作用下发生改变，以及发生何种改变。根据这些变化，并以蛋白质为新药设计的靶点，筛选出新一类的抗生素。同时还可以取一些耐药菌株，考察起耐药性。另外二维电泳技术还可以让人们了解在细菌的不同生长阶段、不同生理与代谢机制下，蛋白质的表达谱，进而全面掌握不同条件下的细胞内的调节，将这些信息归档在数据库，可有助于建立微生物的细胞模型[13-15]。
2．3 信号传导分子 靶向信号传导分子的治疗概念是近几年提出来的。由于许多疾病与信号传导异常有关，因而信号传导分子有可以作为治疗药物设计的靶点。信号传递过程涉及到成千上万的蛋白质。蛋白质-蛋白质的相互作用发生在细胞内信号传递的所有阶段。而且，这种复杂的蛋白质作用的串联效应可以完全不接受基因的调控而自发产生。通过与正常细胞的比较，掌握与疾病细胞中某个信号途径活性增加或丧失有关蛋白的改变，将为药物设计提供更为合理的靶点。
2．4 分子药理筛选模型采用分子水平的筛选模型的大规模药物筛选已经被普遍用于第一步初选，其优点为特异性强，灵敏度高，微量快速。蛋白质组学技术应用于筛选模型构建的一个最大的优势就能更清楚、更详细的阐明分子药理机制，提供更为有效、合理的药理模型。根据现有的蛋白质组学的研究结果表明：蛋白质基因表达的调控构成了真正的药物作用机制。有关这方面的文献很多，例如在黄曲霉素诱发的肝癌细胞中加入dithioethiones，通过与对照组细胞的双向电泳图谱比较，可以清楚的看到，在它的作用下，使一种名为黄曲霉素B1还原酶的蛋白质得以表达，表明这种蛋白质具有使黄曲霉素失去毒性的作用。因而，基因表达水平的改变是用来反应疾病和药物作用机制的分子印记。Anderson 等[3]组建了两个蛋白质数据库。一个是分子解剖学和病理学数据库，另一个是药物的分子效应数据库。前者主要用来界定蛋白质在不同组织的表达模式和在各种疾病的表达改变，而后者则着眼与药物蛋白质作用基理的阐明。这些数据库将成为新药发现的指南针，同时亦引领人们进入分子药理学的新纪元。
3 展望
在不久的将来，药物蛋白质组学还可以在靶点的优化和先导化合物的鉴定和优化发挥重要的作用主要表现为① 靶点的优化-如果涉及小分子抑制剂、抗体、抗原的一些技术手段结合蛋白质组技术体系中，将不仅有助于人们更好的了解疾病过程中蛋白质的功能发挥和疾病产生的各种轨迹，还可以提供一种评价手段，考察作为靶点的蛋白质是否为待筛选药物的最佳选择;②先导化合物的鉴定和优化-利用蛋白质组学还可以反过来在蛋白质层面上考察待筛选化合物的药效学，加速先导化合物的鉴定和优化;③蛋白质组学的发展为中药的研究提供了契机。因为蛋白质的作用靶点和作用用途大多是通过蛋白质来体现的，如果利用蛋白质组学相关技术研究中药对细胞蛋白表达谱的影响，就可以建立蛋白质组学和生物信息学等技术平台，利用此平台将中药复方多组分、多靶点、多途径作用特点与基因蛋白表达关联起来，比较各自不同的表达差异谱，确定不同配伍组方对应的蛋白表达靶点，从而阐明药物作用的物质基础及内在的配伍规律。这种结合不仅对中医药基础理论现代化研究具有重要的理论意义，而且对中药的研究开发走向世界具有重要的意义.
参 考 文 献
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【中国分类号】R245【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0009-01
针灸血清的概念来源于20世纪80年代的“血清药理学”和90年代的“中药血清”研究。针灸血清的概念于1996年公开提出。1998年杨永清研究员的针灸血清研究获得国家自然科学基金资助。目前已成为针灸研究的一个新亮点［1］。
1. 针灸血清
“针灸血清”研究，是指将针灸处理后的人或动物体中采集到的血清，作为效应物质加到另外一个反应系统中，与在体或离体器官、组织、细胞或分子等靶目标接触，通过它们的形态学或功能的改变，直接观察针灸处理后产生的效应［2］，是近年来针灸领域中提出的一种新的研究思路和方法，目前已广泛应用在哮喘、肿瘤、心肌缺血、脊髓损伤等疾病的研究中，实现了针灸离体实验方法学的改进，为针灸研究开辟了一条新的道路。
2.蛋白质组学
蛋白质组学的研究目前已经成为当今生命科学的热点之一。蛋白质作为生命活动的主要承担者，在机体生理功能中发挥着重要作用，一直以来也是研究的重点。其概念最早是由澳大利亚（1994）Wilkins和Willias提出。蛋白质组学是在特定细胞或组织水平上对蛋白质的表达进行研究，具体说它是对不同空间和时间上发挥功能性特定蛋白质群组进行研究，即在蛋白质水平上探索其作用模式、功能机理、调节调控，以及蛋白质群组内相互作用，运用这项技术可以在正常与病理情况下检测蛋白质的差异表达。运用蛋白质组学技术在临床方面可以研究特定蛋白与疾病的关系，从而找到疾病标记蛋白，为疾病诊断、病理分析、药物筛选、新药开发等，提供理论依据［3］。
3.血清蛋白质组学
血清中含有90-91%的水，6.5-8.5%的蛋白质和2%作用的低分子量蛋白质。血清中广泛存在的蛋白质种类大约有10000种，大多数蛋白的含量非常低，即低丰度蛋白。而低丰度蛋白的识别非常重要，潜在的新的疾病生物标志分子往往呈现低丰度。并且许多低丰度蛋白常常行使着“信使”的作用。由于血清蛋白组成极为复杂，因此血清蛋白质组学的关键在于能否将所研究的血清样本进行有效地分离。血清蛋白质组学是指研究选定的目标人群血清中所表达的全部蛋白质，在建立正常蛋白质表达图谱的基础上，寻找差异蛋白质点,鉴定疾病相关蛋白质，进而研究其功能和结构，为研究重大疾病病理生理学机制、早期诊断的特异性标志物、药物作用靶点等开辟新的途径。
4.血清蛋白质组学技术
（1）双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（two-dimensional polyacrylamide gel electro-phoresis,2D-PAGE）：双向电泳是一种方便、灵敏的蛋白质分离方法。双向电泳的第一向是等电聚焦，根据蛋白质等电点不同将其分离。双向电泳的第二向是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrohoresis,SDS-PAGE）［4］：根据蛋白质分子质量不同进一步分离等点相同的蛋白质。双向电泳技术因其分辨率高、可重复性好、结果直观、实验成本较低等特点，已成为蛋白质组研究中最常用的分离技术。另外固定化PH梯度技术可以把目的蛋白固定在极狭窄的凝胶区域加以分离，提高2D-PAGE的重复性与上样量。虽然2D-PAGE分辨率很高，但不能被用于分析低含量蛋白质，灵敏度低，这又与生物体内蛋白质种类数目繁多相比，远不能满足需要，因而容易阻碍早期状态疾病特异性标志物的发现。
（2）质谱技术(mass-spectrometry,MS) MS技术的应用是蛋白质组学研究中的重大进展，它具有高通量、准确、灵敏和操作自动化等优点，已取代传统的Edman降解测序和氨基酸组成分析，成为蛋白质鉴定的核心技术。MS技术根据电离源的不同分为2种：1种是基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization -time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，其原理是利用氮源脉冲激光使基质吸收激光的能量使固相的多肽样品离子化，离子化的肽段进入质量分析器，因质量/电荷比(m/z)差异发生电离，通过测量肽段离子的相关参数，可获得肽质量指纹(peptidemass finger-print PMF)、肽序列标签(peptide sequence tag, PST)或部分氨基酸序列,然后用相应的软件寻找蛋白质组数据库，实现对蛋白质的定性鉴定或定量分析。Baumann等［5］通过一系列试验试图使血清蛋白质组学MALDI-TOF-MS技术标准化，并认为单纯解冻的血清标本重复性最好,通过标准化的血清标本预处理、储存程序和磁珠分馏法，可有效提高MALDI-TOF-MS技术的重复性。第2种是电喷雾电离串联质谱(electrospray ionization tendem mass spectrometry,ESI-MS/MS)，ESI技术是在强电场存在的前提下，在喷射过程中利用电场使液相的多肽样品离子化，产生单价或多价的气态离子，离子化的肽段进入质量分析器而测定其相关参数。ESI的优点在于其可方便地与其它蛋白质分离技术联合应用,如液相色谱+电喷雾+串联质谱(LC-ESI-MS/MS)。串联质谱的可靠性要明显优于MALDI-TOF-MS，现在新建的质谱鉴定实验室多为串联质谱。
（3）表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱(surface enchanced laser desorption and ionization-time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)：SELDI是一种以亲和力为基础的质谱法，蛋白质被选择性地吸附到经化学变性的固体表面上，杂质可通过清洗去除。采用能量吸收基质，蛋白质通过激光解吸质谱分析进行识别。SELDI-TOF-MS有许多优点，可以为分子量在200~500kD的蛋白质提供很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟就可以完成，对低丰度蛋白,即使浓度仅atto-mole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到。SELDI可直接使用粗样本，即未经处理的原始样本进行检测；可以大规模、高通量、超微量、全自动筛选蛋白质；另外，它不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可进行相关疾病的研究。目前SELDI-TOF-MS已经广泛应用于血清蛋白质组学的研究。随着科学技术的发展，应用单一技术平台分离血清样品已经不能满足科研的需要。目前通常采用的方法是联合使用几种不同的技术平台以达到对样品的有效分离。如高丰度蛋白去除+全蛋白酶解+二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱+反相色谱)分离+质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱)；高丰度蛋白去除+色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定等。
（4）蛋白质芯片 蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是继基因芯片之后作为基因芯片的补充而发展起来的蛋白质分析技术。它以蛋白质或多肽为材料，可以在同一时相分析整个蛋白质组。根据芯片表面的不同化学成分，可将蛋白质芯片分为化学表面芯片（亲水、疏水、阳离子、阴离子和金属离子整合芯片）和生物表面芯片（抗原抗体、受体配体和DNA蛋白质芯片等）。化学表面芯片用于检测未知蛋白，并获取指纹图谱；生物表面芯片可显示与之结合的抗原或配体的不同分子量亚型。目前常将蛋白在芯片、SELDI相结合来研究差异表达蛋白质，即不同的蛋白质样品和同一种蛋白质芯片相作用，洗掉未结合的蛋白质，然后用SELDI进行分析鉴定。它可用于对血清及组织样品中的各种蛋白质直接进行检测，特别适于以往蛋白质分析的盲区，即对低分子量、低丰度和疏水的蛋白质进行研究。因此，在蛋白质组学的研究中与目前常规方法相比具有较显著的优势。
5.展 望
近年来针灸血清的研究成为一大亮点，研究者认为针灸血清中含有某些活性物质，从而发挥治疗和预防疾病的作用。目前对针灸血清成份的研究，虽取得了一定成果，但尚未完全揭示其本质，今后应进一步结合蛋白质组学技术，进行针灸血清的研究。在针灸血清种类研究方面，目前主要集中在针刺血清，电针血清，艾灸血清和天灸血清，其它报道较少，今后可以结合更多的特色针灸方法，对其血清进行相关研究［6］。如对自血穴位注射等具有特色疗法的针灸血清进行深入、系统研究，对于揭示针灸血清的作用机理，可能具有突破性意义。对于针灸血清的作用机理，当前学者多结合具体病种，从细胞水平或信号转导途径等进行研究，针灸血清可能通过多靶点，多途径发挥作用，今后研究角度应进一步深入。
参考文献
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[关键词] 喉癌；蛋白质组学；双向凝胶电泳
[中图分类号] R739.65 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）06-0031-03
Comparative proteomic analysis of differentiation cancer of larynx
LV Jingyao LI Zhihai CAI Zhiyi
Department of Otolaryngology, Taizhou Hospital in Zhejiang Province, Taizhou 318000, China
[Abstract] Objective To study on differences of human laryngeal carcinoma group expression in high, low cancer group, using online databases of different protein spots of the peptide fingerprint analysis and identification. Methods Analysis and study on ENT pathology retrospectively clinical data from 2011 January to 2011 May in our hospital. Results The fresh specimens of laryngeal carcinoma classified as well-differentiated cancer group and the low differentiation cancer group. The extraction of two groups of tissue protein, for two-dimensional gel electrophoresis, compared to the normal mucosa tissue. Conclusion High differentiation carcinoma and poorly differentiated cancer tissues expression shows, laryngeal cancer cell differentiation and proteomics have very close relationship.
[Key words] Laryngeal cancer; Proteomics; Two-dimensional gel electrophoresis
目前喉癌的发病率约占全身恶性肿瘤的5％，是头颈部肿瘤中较为常见的恶性肿瘤，喉癌的总体生存率低，就算积极投入治疗，现阶段的医疗水平对其生存率并无明显改善。近年来，随着经济的发展，人类的生存环境日趋恶化，喉癌的发病率也呈现逐年递增的趋势。蛋白质组学是从整体上研究其在不同时间和空间中所发挥的功能及蛋白质间的相互作用的一门新兴的学科，其特征就是建立双向电泳差异图谱，采用透视全体基因在特定细胞或组织的动态表达的分析方法，从而达到解释蛋白质功能与细胞生命活动的规律[1-3]。另外,还有部分的实验室将研究的结果建立了数据库，以利于蛋白质组学技术在肿瘤研究的中临床应用。本文选取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的病理临床资料6例进行回顾性分析与研究，通过运用网上数据库对人类的喉癌组织表达差异中的高、低分化癌组之间的相互差异性的研究，从而达到对不同蛋白点的肽指纹图的分析和鉴定，并总结分析，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取本院耳鼻喉科2011年1~5月喉癌患者的临床资料6例进行回顾性分析与研究。6例喉癌患者中，男4例，女2例，年龄30～60岁，病理结果显示其病理组织来源于鳞状上皮组织，其中高分化鳞癌2例，低分化鳞癌4例。6例患者均作为蛋白质组研究的组织标本,同时选取对侧未被肿瘤侵犯的正常喉室或室带黏膜作为对照组的正常黏膜，6例配对的癌旁正常喉黏膜组织均距离肿块边缘达5 cm以上。
1.2 研究方法
1.2.1实验的试剂与仪器的备用 组织物备用：将所有选取的喉癌组织及正常黏膜均用冰盐水清洗干净，滤纸吸去多余的液体1 min后将其置于-70℃冰箱保存备用，此项过程的处理需于组织离体后30 min内完成。
试剂备用：选用超纯尿素（urea）、甘氨酸（glycine）、硫脲（sulfocarbamide）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基磺酸钠（SDS）和低分子量蛋白标记Tris碱、pH 3～10固相化线性17 cm干胶条(IPG strip)购自Bio-Rid公司。CHAPS（两性离子去垢剂）、二硫苏糖醇（DTT）、10固相化线性13 cm干胶条及考马斯亮蓝R-250，以上均购自上海生工公司。
仪器备用：选用低温高速离心机（Beckman公司）、Imagescanner扫描仪（Amersham Pharmacia公司）、真空冷冻干燥仪（Savant speed Vac&UVS400）、Ettan DALT垂直电泳槽（Amersham Pharmacia公司）、Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS质谱仪（Applied Biosystem公司）和IPGphor等电聚焦仪（Amersham Pharmacia公司）等。
1.2.2 具体操作方法 双向电泳样品的制备：从喉癌黏膜组织中提取蛋白质80 mg作为样品，加入组织裂解液，其中尿素7 mol/L，DTT 65 mol/L、硫脲2 mol/L、Tis 50 mmol/L、充入4％CHAPS、1 mmol/L PMSF混合，放置于4℃下20 min，然后加入DNA酶0.1 g/L，置于冰浴上再给予匀浆器以手工匀浆5 min后，吸取其上清液，所得就是组织的总蛋白质，再辅予RNA酶0.025 g/L，取其上清组织进行分装，贮存于-70℃冰箱备用。
BCA法测提取液中的蛋白质浓度：选取BCA蛋白定量试剂盒（按50体积Solution A加以体积Solution B（50∶1）的完全溶解蛋白标准品，再配置适量的BCA工作液，使其最终达到浓度0.5 mg/mL，然后充分混匀蛋白质样品，置于室温24 h内稳定及其标准品均用PBS稀释的BCA工作液中，然后适当增加体积样品于标准品稀释液中，再将稀释后的标准品加入标准品稀释液的将所有标准品中，具体均于各孔中加入LBCA作为工作液，放置30～60 min冷却后达到室温的程度时，再采用酶标仪测进行测定波长的吸光度，予以标准曲线进行计算，其所得出的结果就是样品中的蛋白浓度。
将以上的分析与喉高分化鳞癌和低分化鳞癌相结合，与癌旁正常黏膜组织进行了2-DE比较，并将三组中斑点位置清晰的图像分别进行合成和分析。
2 结果
2.1 双向凝胶电泳结果
如图A所示，图像显示出现低分化癌组中有7个特异表达或表达上调超过3倍的蛋白点，其高、低分化喉癌组织和癌旁正常黏膜组织的大部分蛋白斑点分子量均位于20.1~116 kD及pI 4~8的区域。在高分化癌组中有6个特异表达或表达上调超过3倍的蛋白点出现，位于30～80 kD及pI 4.5～7.5区域中的蛋白质斑点分布非常密集，呈现3块合成胶的表现。将两组进行两两比较之后，发现高分化癌组与正常组的平均匹配率为70．1％，蛋白斑点数约为600～950之间，蛋白质斑点清晰可辨。
如图B所示，运用PD-quest7．0软件分析3组凝胶图。①喉组织的高低分化两组的pH极酸和极碱性蛋白质的含量均较少，有两个蛋白点的位置基本相同；高、低分化癌组中均有特异表达；低分化癌组与正常组的平均匹配率为71.9％。②正常组平均检测的蛋白点为（606±65），在高分化癌组中有4个特异表达或表达上调的蛋白点。
将喉癌高低分化组织中共同的特异性标志物与癌旁正常黏膜组织相比：高低分化癌组中均有5个特异表达或表达上调的蛋白点，结合肉眼观察得出；低分化癌组平均检测的蛋白点为（832±49）个，高分化癌组的平均检测蛋白点（846±57）个。
2.2 蛋白质点的鉴定结果
在相同的实验条件和参数的情况下，从差异蛋白质斑点中分辨最清楚的蛋白点上选取一对组织中表达相差3倍以上的点，然后在喉癌及正常黏膜组织凝胶图像中进行标记，重复三次操作，以酶自降解峰进行校正，然后对5对组织中具有相同变化的蛋白点处进行切取并进行MALDI-TOF-MS分析，结果视为差异蛋白质点。最后将所获得的肽质量指纹图以空白胶作阴性对照，软件识别其有效肽片段峰后查询数据库，获得了肽质量指纹图。差异表达蛋白质的生物学功能初步分析获得蛋白质分子量及等电点，与网上的双向凝胶电泳数据库对比分析发现，组中与数据库中基因存在相似的位点。见表1。
3 讨论
随着科学的高速发展，人类的基因组全序列测定理论和技术也得到了长足的发展和完善，近年来，后基因组时代的功能基因组学发展迅速，能从组织或细胞蛋白质的整体和动态水平的全新角度来研究疾病的发病机制[3]。而作为功能基因组学重要内容之一的蛋白质组学（proteomics）[4]也被广泛应用于人类疾病的发病机制、治疗和药物筛选的研究之中，并取得了可喜的成果。而蛋白质组学研究的迅速发展，源于双向凝胶电泳技术[5]的创立和有效运用，其对组织成分的复杂性及人体的个体差异的独特分析作用，已被作为当前分离组织细胞蛋白质组的核心技术来运用，在细胞系的研究发展史上起到关键性作用[6]。
本实验对组织标本的选取及对样量进行了多次的摸排的研究，使其重复性大大增加。在样品制备和双向胶的制备以及考染过程等尽量保持统一性，最终获得了高分化、低分化喉癌组织及癌旁正常黏膜组织等三种组织中固相pH梯度2-DE图谱，而且图像清晰、分辨率高和具有极高的重复性,可反复试验。
样本的收集和处理实验过程中由于蛋白质的样品会被特异组织蛋白质污染，要想获得图像清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱则需要做好样本的收集和处理，以避免受到污染而影响实验结果[7]。需要特别注意的是新鲜组织样本取得之后，一定要用滤纸吸干样本上表面所黏附的水分，在样本清洗滤干后，应立即去除其他组织，并用生理盐水彻底洗去表面的血液及黏液，以免发生组织蛋白降解和结构破坏的现象。
样品的制备中减少分离步骤因为盐的浓度过高会降低等电聚焦的电压，其蛋白质样品的制备是2-DE中最为关键的一步，甚至会损坏IPG胶条破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用；而降解酶的活性会造成2-DE获取的直接失败，所以为了避免蛋白质在抽提过程中被丢失和破坏，处理这一步的结果好坏会直接影响到2-DE图谱的显示。提取样品蛋白质过程中使其处于完全变性状态，应尽可能提高样品的溶解度，必须考虑除去影响蛋白质可溶性和2-DE重复性的物质，样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。所以，抽提最大量的总蛋白，常常会释放出各种蛋白酶和蛋白质修饰的酶类，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子，以及加蛋白酶抑制剂等，会明显减少蛋白质的损失。所以，实验应尽量在低温下进行，以避免大分子的存在阻塞凝胶孔径，以达到减少对蛋白质的人为修饰的目的。
在样品数量增加的时候，除了会引发双向电泳图谱的畸变外，影响2-DE的结果。蛋白质具有凝集和沉淀的特点，而这些特点则会造成丰度较高的点，特别是在第一向电泳的时候会更加明显。如果再加大以上样品量时能够增加凝胶上点的数目，以至进行第二向的电泳时，当样品量过大时则会出现丰度高的蛋白质点掩盖丰度低的蛋白质点的现象，最后从而产生2-DE图谱上水平和垂直的条纹。
在上样量为1 mg总蛋白时，会导致2-DE图谱上的分辨率下降，只有这样才会在第一向电泳完毕后才能够获得清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱。另外，需在IPG胶条在第二向电泳平衡两次后，测定样品蛋白质的浓度。
每次15 min的双向凝胶间的界面精密接触时，其水的纯度对染色结果会造成明显的影响，表现为在第一次平衡时会出现减少电内渗的现象，不能单纯缩短平衡的时间，否则会出现接触不好或两者之间有气泡的出现，所以遇到这个问题时，需使用去离子水（电导
比较肿瘤组织与正常组织中的蛋白质在表达数量的差异时，对喉癌和喉正常组织进行了三次重复性2-DE实验。实验结果发现，寻找与癌变机制相关蛋白的关键就是寻找与癌变相关的特异蛋白质和获得分辨率较高的组织参考图谱，而发现肿瘤分子标记的有效途径就是重复蛋白斑点数目的匹配率需在85％以上。
以癌旁正常的黏膜组织作为对照物，因为高分化与低分化喉癌的图谱之间存在较好的可比性。在2-DE实施分离和可视化的蛋白质数量多少能局部反映组织蛋臼质组的改变，代表了喉癌与正常组织的差异性。本研究运用了目前蛋白质组学研究中所使用的进行蛋白质分离纯化技术中最为常用的一种技术――2-DE技术，充分运用其作用机制，通过调节固相的pH梯度干胶条的等电点区间或应用大面积SDS-PAGE胶，能同时分离展示细胞或组织中成百上千的蛋白质，从而最终达到进一步提高差异蛋白质点的分析和鉴定目的，并能通过一向等电聚焦使不同的蛋白质按等电点聚集的特性，最后使更多的蛋白质得到较为清晰和高分辨率的展现，局部地反映部分组织蛋白质组的改变。
4 结论
本研究在喉癌组织和正常喉黏膜组织的蛋白质表达图谱的获得中发现，经质谱分析及生物信息学技术能初步鉴定喉癌组织的部分差异蛋白质，并能通过凝胶图像的分析找到喉癌组织和正常喉黏膜组织之间的差异蛋白，而其中有部分蛋白可能与喉癌发生发展具密切相关关系[7]。而这些差异蛋白能否作为喉癌诊断的标记物和治疗靶标，建立喉癌蛋白质组数据库，尚需进一步研究。本研究为整体上认识喉癌以及探索喉癌早期诊断和早期治疗的研究提供一定的理论依据。
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关键词：蛋白质组学；证本质；方证结合
中图分类号：R2－03 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2008)07－1551－03
1 证本质研究的现状
证是中医辨证论治的核心，是理法方药一脉相承的桥梁和关键，多年来一直是中医研究现代化的突破口。人们普遍认为，抓住了证的研究，就抓住了中医现代化研究的瓶颈。其中证本质的研究是近年来中医学者瞩目的专题，也一直是中医学术界研究的热点，人们试图超越疾病探求证的本质，寻求证的客观指标，认为只要发现和证实了与证有关的特异性物质成分，便揭示了证本质，便可对证进行客观的解释和度量，并可实现中、西两种医学本质上的交汇与融合。
因此自20世纪50年代，在中医界全面开展了一场轰轰烈烈的证本质研究，取得了一定的成绩，主要表现在：根据中医文献及临床资料，明确病、证、症的关系，制订某些证的诊断标准，使辨证达到规范化，并将现代医学的实验指标结合到证的研究标准之中；由传统的对临床病人的研究，发展为结合证的动物模型，通过动物模型的研究来与人的辨证研究对照。并结合临床流行病学研究，在脏腑病证的规范化、标准化方面进行了一定探讨。
虽然我国在中医证的本质研究方面取得了不少成绩，但是我们并没有揭示证的本质，主要表现在：证候实质研究的传统目标是追求研究指标的高特异性，而其研究结果的特点却恰恰是弱特异性；动物模型研究的局限性；研究思路的片面性等。
2 蛋白质组学简介
蛋白质组的概念最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkim等于1994年提出的。蛋白质组学(protcomics)是上世纪90年代中期产生的一门新兴科学，它从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，从而揭示生物学行为，以及基因表达调控机制的一个新的研究领域。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Expression Proteomics)，细胞图谱蛋白质组学(Cell－Map Proteomics)和功能蛋白质组学(Functional proteumics)。生物功能的主要体现者是蛋白质，复杂的基因间和蛋白质间的相互作用、细胞内的活动和环境的影响都会影响基因的表达及蛋白质的翻译后加工。蛋白质组作为一个在空间和时间上动态变化着的整，体，各个蛋白质之间并非杂乱无章或者相互孤立，而是通过蛋白质与蛋白质之间的相互作用，密切有序地联系在一起，形成多个子系统，实现特定的生理功能。从基因水平向蛋白质水平的深化，已成为生命科学研究的迫切需要和新的任务。蛋白质组学的建立为研究蛋白质水平的生命活动开辟了更为广阔的前景，提供了新型有效的研究手段。
3 蛋白质组学应用于证本质研究的可行性
3．1 认知上的可行性 中医理论认为，疾病的发生主要是机体整体功能的失调，证候是疾病在发生发展过程中某一阶段的病理变化实质的概括，是机体内因和环境外因综合作用的机体反应状态，随着病程的发展而发生相应的变化，可见证候有着明显的整体性。蛋白质组学不仅研究蛋白质的构象，更重要的是进一步阐明不同的蛋白质、不同的构象功能的表现。它不是单纯从蛋白的个体进行研究，而是从人体的整个蛋白质，即在蛋白质组的基础上进行研究。因此。蛋白质组学是证本质研究的最佳切入点。从中西医结合的角度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证发生发展的动态变化过程，是在证发生发展过程中产生的特殊物质。蛋白质组学对蛋白质研究的整体观念同中医对疾病认识的整体性有很多的共同之处。采用对整个细胞甚至整个组织的全套蛋白质的蛋白组学研究方法，对证候研究有着重要意义。现代医学也认为疾病的发生大多数是多种病因通过多种途径导致整体功能紊乱的过程，在生命大系统中，如果仅用单因素分析思路来研究多因素系统中的各种关系，往往陷入网络式联系中，难以理出头绪来。因此中医证候理论研究作为中医理论现代化的突破口是理所当然的，而蛋白质组学也是从整体水平上反映了疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，与中医的辨证论治的认识方法相似相通。
3．2 技术上的可行性 Patricko Fanell等于1975年建立了双向电泳技术，可同时分离数千种蛋白质。目前应用于蛋白质组学的主要研究技术有：①激光捕获切割技术(LCM)：该技术减少了由于样本成分复杂而造成的干扰或个体差异，提高了样本的均一性；②表面增强激光解吸电离－飞行时间－质谱技术：该方法通过选择性吸附的途径大大降低了样品中蛋白质的复杂性，而同时又保持对多样品、多蛋白的同时分析，从而把每个蛋白放在一个具有相互参照的背景里；③荧光双向差异凝胶电泳(DIGE)：该方法因为采用荧光染料，灵敏度高，故所需样品量非常少，而且一张胶可同时分析3个样品，省去了不同胶之间的匹配问题，减少了工作量，不仅重复性显著提高，而且也提高了分析通量；④蛋白质芯片技术：蛋白质芯片技术是把数以万计的蛋白质高密度排列在固相支持物表面，通过探针蛋白特异性的捕捉样品中的靶蛋白，洗去未结合的其他蛋白质，经相应的检测系统即可对靶蛋白进行定性及定量分析。这种技术可以快速、高效、高通量的分析蛋白质组，并能鉴定出蛋白质间的相互作用，利用此技术可以将一个细胞或组织的疾病和健康状态的蛋白质图谱进行比较，找出差异蛋白质，鉴定疾病过程中的标志物，也可通过对疾病发生的不同阶段蛋白质的变化进行分析，发现疾病不同时期的蛋白质标志物，为临床诊断提供量化指标。同时，随着计量化学、统计物理学、信息学的发展，生物信息学家Amos Bai，roch和Appel发展了一种蛋白质专业分析系统，该系统将Geneva 2D gel数据库与SWISS－PROT蛋白质序列数据库联网，帮助研究者从蛋白质序列预测其功能。分析化学的迅猛发展，生物信息技术日新月异的突破，相关学科的交叉渗透，为蛋白组学应用于证研究奠定了技术基础。
3．3 蛋白质组学引入证实质研究的优势 首先，证作为相对独立的一个系统，只能用系统的语言来表达。蛋白组学应用于系统的证的研究，通过蛋白质芯片技术或建立蛋白质序列数据库，对各个症状、证进行蛋白质组分分析，明确各种病不同证之间的蛋白质组分的异同，在此分析还原的基础上进行综合归纳，概括其共性与个性。因而，蛋白质组学引入证实质研究，是用一种特殊系统语言对证的实质进行表达。
其次，将蛋白质组学引人证实质研究更符合证研究自身的特点。证在相当长的一段时间里一直被误认为是一种
“功能态”，这很大程度上是由于忽略了它的物质性所致。因而，对作为功能的物质载体一蛋白质进行整体性研究，可以跨越了单纯实体结构研究或功能模拟研究证实质的局限性；而且，由于内、外环境的影响，蛋白质的功能表现可表现出一过性或阶段性或持续性的特点，这些特点正符合证功能的活动性、过程性特点。将蛋白组学引人证实质研究，更有利于动态地揭示同一个研究对象不同时期的变动性，更符合证研究自身的特点。
再次，将蛋白质组学引入证实质研究，有利促进中医证型实验学的发育。将蛋白质组学引入证实质研究，可从功能表现的具体形式寻找其物质根源－蛋白质组分，然后针对需要模拟的功能形态进行基因－蛋白质的干预。这样能确保功能模拟的准确性和重复性，提高中医证型的实验室研究水平，对中医基础理论研究无疑是巨大的促进。
4 证实质研究的思路与途径
4．1 证的物质基础应是一组相关物质而非单一特异性物质因此蛋白质组学研究方法是一种有益的尝试要研究证的本质，首先对证要有真正深入的理解。从中西医结合医学的角度来看，中医证本质的含义是指证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的发生发展之动态变化过程，是在证的发生发展过程中产生的特殊物质群。所以，证本质的研究归根结底也是探寻证物质基础的研究。到目前为止，人们对证先后提出了十几种定义，但仍对其内涵和外延没有得到一个明确统一的界定。如果我们暂不考虑证的定义，只从中医临床辨证的方法就可以看出，证实际上是外在疾病征象的某种排列组合，是症状和体征的集合，有集合论“群”的特征。再者，中医脏腑不单纯是一个脏器，包含着现代医学意义上的多个系统的功能。例如。肾虚证就可能涉及到泌尿系统、生殖系统等多脏器、多系统的生理和病理变化。中医学认为“有诸于内，必形诸于外”，现代医学也认为结构和功能是统一的，有结构改变就会有其功能表现，有功能改变就必有其结构基础。因此，根据以上分析我们可得出以下构想：呈现某证患者的机体内必然有引发该证一系列症状和体征的物质基础，且分布于机体各组织脏器中；正是由于存在于机体各组织脏器中的这些物质基础的某种改变引发了中医的各种证候。因而，证候物质基础不会集中在某一脏器，也就更不会是单一的特异性物质。
4．2 方证结合 以方测证以方验证是研究证本质的有效途径中医是以方治证，尽管中医理论博大精深，哲理性强，但在临床诊断上，无论是八纲辨证、脏腑辨证、气血津液辨证、卫气营血辨证、三焦辨证、还是六经辨证，最后的治疗都要落实到相应的方剂上去。
据此可以设想，中医的每一个证候最终都有相应的方剂可以给予治疗，如果该证候没有相应的治疗方剂，则该证候的命名和研究也就失去了意义。因为研究证候的最终目的是为了指导临床精确选方用药，不应存在只有名称而无相应治疗方剂的证候。如果此论可立，那么就可将某一方剂在治疗相应证候的患者或动物模型时所调节与纠正的那些物质视为该证候的物质基础。因为正是该方剂在机体内发挥其药理作用的过程中调节与纠正了这些物质后，才使该证候的临床症状得以缓解或消失。因此，方证结合、以方测证、以方验证是研究证本质的有效途径。
4．3 蛋白质组学和代谢组学是适用的技术手段 由于方剂一般由多味中药组成，其组分复杂，又是多靶点、多环节、多层次的整体性药理机制，对机体各个组织脏器有着广泛的调节作用。因此，方剂进人体内调节与纠正的物质应存在于机体各个组织脏器中。蛋白质组学和代谢组学的出现，使寻找这些物质有了可能。只要比较某方剂在治疗相应证候前后机体各组织脏器蛋白质组学、代谢组学的图谱，找出发生变化的那些物质，便可视其为该证候的物质基础。
蛋白质组学对蛋白质研究的整体观念同中医对疾病认识的整体性有很多的共同之处，蛋白质组学从整体水平上反映了疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，与中医的辨证论治的认识方法相似相通，因此蛋白质组学是研究证本质的适宜技术手段。
5 展望
现代质谱技术作为蛋白质组学支撑技术之一，在蛋白质和肽段的鉴定、定量和结构分析方面起着非常重要的作用。质谱分析进行蛋白质鉴定和序列测定的基本原理是使用电喷雾离子化和基质辅助激光解吸离子化的软电离方法，经酶切后的蛋白质肽段或完整蛋白质带上电荷，然后根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定相对质量。样品分子进行上述方法电离时能保留整个分子，确保了完整性而不会形成碎片离子，称为肽质量指纹图谱（PMF）技术。PMF是一种现在运用最广的用来鉴定2-DE分离出来的蛋白质和肽的方法，伴随着现代质谱技术的不断发展，其在蛋白质组学中的应用将越来越广泛。
高效液相色谱及多维液相色谱高效液相色谱（HPLC）技术最初被用于分离蛋白质或多肽。现在，HPLC已成功应用于蛋白质组学研究中，它是基于样品分子在固定相（柱填料）和流动相（淋洗液）间的特殊相互作用而实现样品分离的。无须变性处理样品，可实现上样收集及在线分析的自动化。利用液相色谱结合电喷雾质谱（ESI-MS）而不依赖于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特异性的胰蛋白酶消化，产生的多肽由强阳离子交换柱和反相HPLC分离后经ESI-MS/MS分析。液相色谱与MS联用，采用高速且高灵敏度的色谱分离法来代替耗时的2-DE蛋白质分离法，故其与经典的2-DE-MS法相比，具有快速、样品需要量少和多肽分离的通用性强等优点，将会在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更进一步的应用。但由于层析填充物对许多蛋白质组分有吸附作用，且难以实现多组分蛋白质样品的多维层析，因此仅适用于研究单一蛋白质或简单样品蛋白质组。多维液相色谱（MLC）则是利用与串联质谱联用，可以检测低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最新的技术，可快速并高通量鉴定复杂蛋白质混合物。
蛋白质组学技术在畜禽动物营养学中的应用
传统肉类生产中的饲养管理、饲料结构、饲喂方式和饲养密度在基于动物营养和饲料工业的现代肉类生产的出现后，发生了本质性的改变。同时，大规模的现代肉类生产影响到了饲养动物的生理学、行为学和生物化学过程，随之导致了肉品品质的下降。同时生产者为了增大产量和减少疾病风险，在养殖过程中滥用抗生素等化学药物，加剧了肉类品质的恶化。此外，为了追求提高肉类的某些性能，忽视了饲养动物的体质健康、外部形状与内在机能的协调，生理学的平衡和整体适应性，从而导致现代肉用动物（猪和鸡）对周围环境条件的高度敏感性，最终导致了肉品的食用品质，如：色泽、风味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素残留现象极为突出。鉴于此，对肉品品质进行评价并对其进行可能的等级标注及对其生产过程控制，对于现代肉品生产至关重要。蛋白质是肌肉组织的重要组成成分，研究表明：肉类品质研究与功能蛋白质的结构研究间密不可分，蛋白组变化可能与肉的嫩度相关。肌纤维分红肌纤维和白肌纤维2种类型，这2种类型在代谢水平上存在着结构和功能的差异。纤维类型与肉质性状，如：性、风味和嫩度等的关系存在着很多争议，尤其是纤维类型对肉嫩度的影响仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白质组学分析屠宰后猪肌肉的变化情况，采集了刚屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白质组样品，这些肌肉蛋白质相对分子质量介于5000~20万不等，pH在4~9，结果发现蛋白质组模式发生了15种显著的变化。此后的研究中Lametsch等最终确定了可作为肉品质标记的20多种蛋白质，包括结构蛋白质（肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白）和代谢酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在这些标记蛋白中，人们发现肌动蛋白和肌球蛋白重链与肌肉的剪切力间存在极显著的相关，这就清楚地表明屠宰后肌动蛋白和肌球蛋白重链的降解会影响肉的质量。Remignon等直接对肌肉蛋白质片段进行分析，认为蛋白质的改变很可能是导致家禽PSE肉综合征的直接原因。Molette等研究发现火鸡屠宰后胸肌糖酵解的速度比较快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），从而使得肉品质发生改变，如：系水力下降、加工产量降低和嫩度降低等。同样报道了糖酵解快的动物肉的系水力低，并且提取到的肌浆蛋白含量低，这表明当pH下降的速率加快时蛋白质功能发生了改变。
蛋白质组学技术在水产动物营养学中的应用
蛋白质组学方法在水产动物营养特别是鱼的品质鉴定中已有应用，目前也被广泛应用到了对虾和海蜇等的品质控制中。随着对鱼类水产品的需求日益增长，保障和控制其安全生产具有重要的意义。在以数量增长为主的水产集约化养殖、运输和销售过程中，拥挤应激是常见的影响水产品食用品质的因素，解冻程序同样深刻地影响水产的品质。近年来，蛋白质组学已被广泛地应用到了水产品品质控制。Inger等利用2-DE技术研究新鲜的鳕鱼与死后鳕鱼肌肉，发现有11个蛋白质点的丰度发生了变化，其中8个蛋白质点的丰度显著增加，后续分析表明：这些蛋白质点是肌原蛋白、肌浆蛋白和肌肉纤维等肌肉组织的分解产物。由此可见，蛋白质组学技术对评价鱼肉鲜度等品质具有重要的现实意义。Kjaersgard等通过对11种不同冷冻储存条件下对鳕鱼肌肉蛋白质图谱进行研究分析，发现不同冷冻储存温度对蛋白质图谱并无显著影响，但经过不同的冷冻储存时间（3、6和12个月），肌浆球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶A和2-α肌动蛋白片段等蛋白质的质量浓度发生了显著变化，从而导致鱼肉的质地和味道发生了变化。Martinez等通过研究人工养殖的鳕鱼与野生的鳕鱼，比较发现人工养殖的鳕鱼2-DE图上蛋白质相对分子质量在3.5万~4.5万间存在显著差异。然而目前蛋白质组学技术在水产养殖和贮藏加工过程中的研究还处于起步阶段，随着相关技术的发展，将在水产动物营养中起到更加重要的作用。
前景展望
过去蛋白质研究的根本缺陷在于孤立地研究单个蛋白质的结构、功能、表达以及与疾病的关系。但是，人体或自然界的生物并不仅仅是各种蛋白质的混合物，而是一个统一的整体。一种蛋白质的缺陷可能导致其它相关蛋白质含量的改变，或者由其它的蛋白质加以代偿。因而从单一蛋白质出发，无论是进行疾病的论断还是生物技术，都将是不全面的。更何况许多疾病或生命现象是多基因产物的结果，单纯的遗传分析很难诊断多因素的疾病复杂的基因间相互作用，因而必须充分认识细胞内不同的蛋白质是如何相互作用、相互协调的。而这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。在此背景下，蛋白质组学(pr-oteomics)应运而生。
1 蛋白质组学的概念
蛋白质组(proteome) 一词，源于蛋白质( PROTEin) 与基因组( genOME) 两个词的结合, 最早由澳大利亚学者Wilkins和Willian等人于1994 年提出,是指基因组所表达的全部蛋白质。它与基因组相对应,也是一个整体的概念。从这个定义看，蛋白质组内蛋白质的数目应该等于基因组内编码蛋白质的基因(准确地说应为开放阅读框，ORF) 的数目，但在生物体内这样的蛋白质组是不存在的。 基因组是静态的，一个生物体的基因组在其一生中基本上是稳定不变的。但基因组内各个基因表达的条件和程序则是随时间、地点和环境条件而变的，因而它表达的产物的种类和数量随时间、地点和环境条件而变化。从基因表达的角度看，蛋白质组内蛋白质的数目总是少于基因组中ORF的数目，但从蛋白质修饰的角度看，蛋白质组的蛋白质的数目又远远大于这个数字。因为mRNA 的剪切和编辑可使一个ORF 产生数种蛋白质，蛋白质翻译后的修饰，如糖基化、磷酸化同样增加了蛋白质种类。朊病毒学说认为一级结构相同的蛋白质在一定条件下可以形成不同结构的蛋白质，从结构上进一步丰富了蛋白质种类的概念。因此，蛋白质组的概念也被定义为在一个细胞内存在的全部蛋白质。 基因组基本是固定不变的，蛋白质组却是动态的，具有时空性和可调节性，能反映出特定基因的表达时间、表达量以及蛋白质翻译后的加工修饰和亚细胞分布等。 它是在人类基因组计划研究发展的基础上形成的新兴学科。
蛋白质组学就是研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律[1～3]。与以往蛋白质化学的研究不同，蛋白质组研究的对象不是单一或少数的蛋白质，它着重的是全面性和整体性，需要获得体系内所有蛋白质组分的物理、化学及生物学参数，如分子质量、等电点、表达量等，以及细胞内蛋白质之间的相互作用。主要在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、结构及其活动规律。它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等，最终揭示蛋白质功能，是基因组DNA 序列与基因功能之间的桥梁。
2 蛋白质组学研究的重要工具
如何同时测定一个生物中大量或全部基因的表达可以通过引入cDNA和寡核苷酸微阵列得以解决。用DNA微阵列和相关方法分析基因表达依赖于两个重要工具：PCR和寡核苷酸与互补序列的杂交。但是蛋白质没有PCR等价物，且不能专一性与互补氨基酸序列杂交。另外由于翻译后修饰使得许多蛋白质以多种形式存在，检测和区分特定基因的多种蛋白质产物时蛋白质组学在分析方面更具挑战性。尽管存在上述困难，但由于几种重要工具的发展和结合使用给研究人员提供了灵敏度和专一性较高的识别和鉴定蛋白质的方法。
第一种必需工具是蛋白质的分析分离技术。蛋白质组学中蛋白质分离有两个目的。一是将蛋白质混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂蛋白质混合物。二是蛋白质的分离分析可以比较两个样品蛋白质的不同表观，研究者可以标记用于分析特定的蛋白质。双向凝胶电泳（two-dimensional electrop-
horesis, 2-DE）可能是目前分离复杂样品蛋白的最好单项技术。其他的蛋白质分离技术，包括1D-SDS-PAGE、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）和亲和色谱等都是蛋白质组学的有力工具。为了适应蛋白质组学自动化、高通量、高产出的要求，人们将不同的蛋白质和肽分离技术结合发展为多维技术，比如离子交换色谱与反相色谱的串联是分离复杂肽混合物的有力工具。
第二种工具是质谱（Mass spectrometry, MS）。质谱仪的使用在过去10年中有了极大的革新，再发展为分析生物分子，特别是分析蛋白质和肽的高灵敏度和准确度上达到顶点。MS仪器的使用可提供在蛋白质组学研究中都非常重要三类分析。首先，MS可以进行100kDa或更大完整蛋白质的精确质量测定。估计蛋白质质量的最好方法是MS分析，而不是测定蛋白质在SDS-PAGE的迁移。高精度蛋白质质量测定的应用有限，因为它往往不够灵敏，况且精质量对精确鉴定蛋白质往往也是不充分的。其次，MS能对蛋白质水解消化产生的肽进行精确的质量测定。相对于完整蛋白质质量测定，肽质量测定可以有高灵敏度和高质量准确度。而且对于蛋白质水解肽有较好的分析方法，如肽质量指纹谱（Peptide Mass Finger,PMF）可以直接用肽质量测定数据在数据库中进行检索，该方法常常可以确切鉴定靶蛋白质。最后MS可以对蛋白质水解消化得到的肽序列进行分析。目前认为MS是肽序列分析中的最新技术，MS序列数据为蛋白质鉴定提供了最有力和最精确的方法。
第三种工具是数据库。蛋白质、EST和基因组序列数据库共同提供了生物全部蛋白质的完整数据库目录。当用有限的序列信息，甚至原始质谱数据进行检索时，我们可以根据数据与数据库的匹配情况鉴定蛋白质组分。
第四种必要的工具是对数据库定蛋白质序列与MS数据进行比对的各种软件。虽然从MS数据可以测定序列，但是这种从头开始分析成百上千的谱图是一项费时费力的任务。蛋白质组学软件将为分析的MS数据，在特定算法的帮助下于蛋白质、EST和基因组序列数据库的序列相比对，自动检测大量用于蛋白质序列匹配的MS数据。然后研究人员检查自动检测的结果，估计数据的质量，所用的时间比手工解释每一张谱图要少得多。目前常用的肽质量指纹图谱的搜索工具有Mascot、ProFound、MS-Fit、MOWSE等；常用的MS/MS搜索工具有SEQUEST、Mascot、MS-Tag等。
这4种工具的结合使用形成了蛋白质组学当前的技术，每一种工具在技术上都发展迅速。
3 开设《蛋白质组学》课程的重要性
蛋白质组学提出后，澳、欧、日、美等纷纷成立研究机构和公司，迅速启动蛋白质组计划。例如：丹麦Odense大学的Center for proteome Analysis（CPA），澳大利亚Macquarie大学的Australian Proteome Analysis Facility（APAF）。国际著名学府如哈佛、斯坦福等均跻身此类研究。由于蛋白质组学研究比基因组学研究更接近应用，具有巨大的市场前景，企业与制药公司纷纷斥巨资开展蛋白质组研究。蛋白质组研究对现代生命科学和医学的贡献可能使研究工作者从核酸时代回归蛋白质时代，对生命系统活动与疾病发生分子机制的认识有间接的基因层次深入到生命活动的执行者――蛋白质层次。蛋白质组研究已成为后基因组时代最重要的研究之一，是21世纪生命科学的重要支柱之一，其发展不可限量。
蛋白质组学是一门极富辐射能力的前沿学科，其本身综合了生物学、医学、生物工程学、计算机及网络技术等多学科的技术方法。蛋白质组所解决的问题涵盖生物医学的各种学科。蛋白质组分析已成为专门的技术体系广泛用于生物医学众多领域的研究，比如磷酸化蛋白质组学、结构蛋白质组学、疾病蛋白质组学、蛋白质组学与药物开发等。其基础研究与分析应用正已指数增长方式发展。所以，面向研究生开设《蛋白质组学》课程，介绍学科背景，了解相关技术理论和最新进展，对于研究生选题和了解学科前沿具有重要意义。
经过近十年的发展，双向电泳分离技术和生物质谱鉴定技术作为蛋白质组研究的主要支撑技术在国内外大学和科研机构已基本配套，形成了一定规模的专业队伍和专业机构。国内大学相继成立的蛋白质组学实验室，建立了蛋白质组学技术平台。近年来国内外大学和研究机构开始将面向学生讲授蛋白质组学，有关蛋白质组学的参考书也相继问世，为开设《蛋白质组学》课程奠定了基础。
4 关于授课内容和授课形式的建议
根据国内外开设《蛋白质组学》课程的内容安排并结合学校实际情况，授课内容将蛋白质组学基本技术原理和实验演示相结合。我们拟介绍蛋白质组学研究背景和主要研究内容，蛋白质组学两大主要支撑技术双向电泳和质谱技术的原理和方法，蛋白质组学数据分析原理和方法，蛋白质组学的技术进展及其生物医学应用。经过两年的教学实践，受到学生的好评。但是仍然存在较多问题，主要表现在：（1）蛋白质组学本身综合了生物学、医学、生物工程学、计算机及网络技术等多学科的技术方法，而学生基础参差不齐，部分学生感到理解困难。（2）双向电泳技术、质谱技术等虽然使用多媒体教学尽可能形象、生动，但是由于缺少实践、没有直观认识，仍然使学生感到抽象、难理解接受。针对以上问题，如果采取分级分班教学、制作双向电泳操作录像光盘等措施可能提高教学质量，以满足新世纪对医学人才培养的新要求。
关于分级分班教学可根据学生的专业情况、知识基础以及学生自愿等原则分为两个层次进行教学。
一为知识普及层次，主要让学生了解蛋白质组学的基本理论、技术方法，了解学科前沿，而不要求其掌握技术方法的原理和操作,比如卫勤管理、计算机等专业学生,通常不会涉及蛋白质组学相关课题，而且由于通常他们的相关知识背景较薄弱，掌握技术方法的原理和操作也较困难。另外一些本身基础较差又对蛋白质组学相关课题不感兴趣的学生可自愿选择在该层次进行教学。对于这部分学生教学最主要的目标是拓宽其知识面。
二为知识掌握层次，不仅要求学生了解学科前沿，而且要求掌握蛋白质组学基本理论及原理、掌握样品处理和双向电泳实验操作技术、掌握双向电泳图谱的软件分析、掌握蛋白酶解技术、熟悉质谱工作原理和MOLDI-TOF质谱鉴定蛋白的方法。对于该层次的教学，不仅进行课堂理论讲授，可能的情况下开设演示实验课，比如双向电泳实验操作过程以及PDQUEST软件使用和数据库检索的实验演示，让学生对实验方法有更直观地认识。
另外，蛋白质组学不仅是一门理论性较强的学科，同时它又是一门实验性很强的学科。由于双向电泳具有较高灵敏度和分辨率，可同时分离上千种蛋白，且与下游的质谱鉴定技术有较好的兼容性，因而成为目前蛋白质组学研究中广泛使用的蛋白质分离技术，也是蛋白质组学教学中最常要求掌握的技术。但是双向电泳的实验周期长（3～4天）、仪器昂贵、试剂要求高等因素限制了在教学中开展学生实验。如果能制作一部双向电泳实验操作的录像片在课堂上边播放边讲解，通过直观的录像显示可极大提高学生的学习兴趣、增强理解，解决了学生人数众多时实验难以开展的问题。
蛋白质组学在农学基础的研究领域中主要应用于以下几两个方面：（1）农作物与微生物之间相互的作用机理。有关文献表面，农作物在生长过程当中会与微生物的生存之间存在对资源的竞争，其最终的生长发育会随着微生物存在的现状进行改变。那么，对于这一事实也可以用蛋白质组学理论进行解释。产生这一现象的主要原因是由于当农作物作物遭遇到微生物的共生和寄生，以及遭遇到病菌的侵害的时候,其就会改变被侵害部位的蛋白质的含量，从而向外界或者是其他未受侵害的组织或者部分传递这一信号，从而引起整个农作物个体的反应机制；（2）农作物的品质改良、提升产量问题。通过利用蛋白质组学技术，科学家发现可以提高农作物的产量，还可以改善农作物的品质。例如，著名生物学家Natarajan，其对野生型的黄豆和农户种植型的黄豆，利用蛋白质组学技术进行研究、比较其两种不同生长环境下的黄豆，其内部硫氨基酸的含量存在较大区别，从而证明了提升黄豆蛋白中的硫氨基酸的浓度，能够极大的改善现有大豆农作物产品的品质。
二、蛋白质组学在林学研究研究领域中的应用研究
时至今日，世界范围已经开始应用蛋白质组学这门技术，来对林木的生长、发育、繁殖，以及当林木受到了生物以及非生物的胁迫后产生的反应展开研究。这些研究为人们增加了眼界，使得当前人们对有关林木生物学产生了更为深刻的了解。在今天，蛋白质组学已经渗透到了农学基础领域的多个方面，例如：在林木的遗传育种领域、林木病虫害的防止领域等等。通过对蛋白质组学的应用，解决了以往让诸多从事这一研究领域科学家头疼的问题。以下作者将结合上述几种应用领域进行分别应用研究：（1）林木的遗传育种领域。著名生物学家Huang在其文中建立了具有高分辨率的和高稳定性的一种双向的电泳式的图谱，并以经过矮化处理过后的杉木叶片中蛋白质为例，运用蛋白质组学技术对其展开了有关研究。其发现，经过矮化处理的杉木其叶片蛋白质的数量较野生杉木叶片蛋白质的数量更低。（2）关于林木的逆境应答研究。著名生物科学家Renaut等人，采用情景模拟的方式，为林木设置逆境的环境，经过研究发现，在拥有六百个蛋白质的植物经过环境变化，其内部蛋白质的数量减少了百分之十，并且这些消失的蛋白质主要是与林木的新陈代谢有关。（3）关于林木病虫害领域研究。著名科学家Fan等人，以毛泡桐、白花泡桐为例，通过设置同龄和同方位的产生病虫害的部位切片，对这一切片中的蛋白质进行了单项和双向两种方式的电泳分析。其研究结果发现，这两种类型的泡桐的病虫害切片当中均找寻不到蛋白多肽这种物质，从而他们得出了这一的研究结论，即：林木的病虫害与林木中所含的蛋白多肽存在负相关的关系。
三、蛋白质组学在其他农业生物科学领域中的应用研究
蛋白质组学还可以应用于研究水产业和畜牧业的研究，例如：可以利用蛋白质组学技术，研究水产业和畜牧业的肉类不同品质、不同性状时其内部所含有的蛋白质的数量，从而判断哪种元素能够促进蛋白质总量的增加，从而改变肉质和性状。另外，也可以利用蛋白质组学技术去研究这些产业中神经组织中蛋白组的问题、逆境胁迫的应答反应，或者是用于其他领域，例如：研究分离和鉴定农药蛋白质中所包含的靶分子的结构等等。
四、结论
通过上文的研究，可以发现，蛋白质组学在生命科学研究领域当中拥有核心的地位，其将引领生命科学领域未来的研究。在本文中，作者对蛋白质组学在农业生物科学领域的应用研究进行了总结和扩展，通过将这一领域的研究分为三个部分，分别从农学基础、林学、畜牧学和水产学进行应用研究，为蛋白质组学在我国生命科学领域未来的发展提供了指引性和参考性的案例。并且，随着我国市场化程度不断拓展，作者也希望，我国有关研究部门能够增强与国际的交流，加强与国际其他国家相关学科之间的战略合作，从而为蛋白质组学在我国生命科学领域的研究提供更多的经验和意见，并且能够为世界共享数据库的建立打下坚实的基础，从而为人类与自然界未来的发展创造美好的未来。
关键词：免疫蛋白组学；研究进展
中图分类号：Q939.91文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0050-05
Research Advance in Immunoproteomics
HAN Chen
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract：Immunoproteomics is a new science from the combination of proteomics and immunological analytical methods. The forming process，tools, main technical points and applications of immunoproteomics have been discussed in this paper. Meanwhile, the development of this new science is prospected in terms of its limitations.
Key words：immunoproteomics; advance
免疫原性蛋白质一直是微生物学家及医学家研究的热点。酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫共沉淀及蛋白质印迹（Western blot）等技术都是基于抗原抗体特异结合的原理，用于检测抗原存在与否，及探测一种疾病或一种微生物的免疫蛋白质组。但是，ELISA不能区分不同的免疫原性蛋白质，免疫沉淀则需要大量的抗体，且在抗原鉴定前需要去除抗体。起初，科学家曾试图用抗体从电泳后的固体胶中探测抗原，但因所需抗体量大、操作过程复杂且重复性差等原因进展缓慢。蛋白质从凝胶向膜转移技术的建立，使经凝胶分离后免疫原性蛋白质的探测成为可能，也促进了蛋白质印迹技术的发展。但传统的蛋白质印迹技术由于电泳分离的效果差，及抗原鉴定成功率低，往往只用于普通的检测、分析，很少用于大规模探测免疫原性蛋白质[1]。
蛋白质组学的特点是采用高分辨率的蛋白质分离手段，结合高效率的蛋白质鉴定技术，研究蛋白质的各种代谢和调控途径[2]，使分离高分辨率及鉴定高成功率复杂蛋白质成为可能。现代蛋白质组学技术与传统免疫杂交方法相结合产生了一门新兴的交叉学科免疫蛋白质组学（immunoproteomics）[3]。
1 蛋白质组学
1.1概述
蛋白质组学属蛋白质化学的范畴，蛋白质化学包括研究蛋白质的结构和功能，通常涉及生物化学和酶学。蛋白质组学重点研究组成一个大系统的多个不同蛋白质的相互作用，它需对复杂混合物进行分析，不是通过测定完整序列进行鉴定，而是在数据库匹配工具帮助下进行部分序列测定。它是系统生物学而不是结构生物学；是鉴定系统的行为而不是鉴定任何单一组分的行为。
“蛋白质组”是一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套蛋白质[4]。生命科学的研究工作主要有4个层次：基因组学（genomics），转录组学（transcriptomics），蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabolomics）。人类基因组计划（human genomic project）顺利完成之后，后基因组时代（post genome era）来临，从而蛋白质组学成为科学家面临的最大挑战[5-7]。
蛋白质组学研究也是对分析手段的挑战。如何同时测定一个生物中大量或全部基因的表达似乎通过引入cDNA或寡核苷酸微阵已得以解决。用DNA微阵和相关方法分析基因表达依赖于两个重要工具：聚合酶链反应（PCR）和寡核苷酸与互补序列的杂交。但是没有类似的工具用于蛋白质分析。原因首先是没有蛋白质PCR等价物，目前不可能有多肽分子类似于核苷酸通过PCR复制的方式复制；其次，蛋白质不能专一性与互补氨基酸序列杂交。
另一个蛋白质组学的特有问题是细胞中每一个蛋白质产物并不一定只有一种分子实体。这是由于蛋白质翻译后有修饰[8]。修饰的内容随蛋白质的种类、细胞的调节机制和环境因子变化，许多蛋白质以多种形式存在。对任何特定基因的多种蛋白质产物进行检测和区分的必要性使蛋白质组学在分析方面更具挑战性[9]。
1.2蛋白质组学的工具
高通量、高灵敏度和规模化的双向凝胶电泳-质谱是目前最流行、最可靠的技术平台[10]；酵母双杂交技术已用于研究蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统。生物信息学方法在蛋白质组学研究领域已得到有效的利用，其中突出的代表是Eisenberg等联合采用系统发育分布图（phylogenetic profiles）法、融合蛋白序列（rosetta stone）法和基因邻居（gene neighbor）法，成功地建立了酵母沉默信息调节子（silencing information regulator，SIR）作用网络和酵母朊病毒（prion）功能连锁网络。
除双向凝胶电泳，其他的蛋白质分离技术包括一维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1D -SDS AGE）、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、等电聚焦（IEF）和亲和层析。最有力的技术是将不同的蛋白质和肽分离技术结合为多维技术，例如离子交换液相层析（LC）与反相高效液相色谱（RP-HPLC）的串联是分离复杂肽混合物的有力工具[11]。
1.3蛋白质组学的应用
1.3.1蛋白质表达谱鉴定生物或细胞的特定状态，如分化、发育状态或疾病状态下蛋白质的表达以及物理、化学刺激下蛋白质的表达。这种信息对于检测药物治疗的潜在靶子极为有用。
1.3.2蛋白质网络谱这是在生物系统中测定蛋白质之间相互作用的蛋白质组学方法。大多数蛋白质在执行功能时与其他蛋白质密切相关，这些相互作用是通过体外纯化的蛋白质和酵母双杂交系统获得的。通过亲和俘获配对技术与分析蛋白质组学方法相结合，蛋白质组学可以鉴定更复杂的蛋白质网络。在细胞中多蛋白质复合物与点到点的信号传导途径有关。在蛋白质网络谱可测定的过程中，所有参与者的状态是蛋白质组学最具远大前景的应用之一。
1.3.3蛋白质修饰谱这是鉴定蛋白质怎样以及在何处得到了修饰。许多蛋白质翻译后的修饰控制着蛋白质的靶向、结构、功能和转换。此外，许多环境化学因素、药物和内源化学因素可产生修饰蛋白质的活性亲电体。修饰蛋白质可用抗体测定，但是一个特定修饰的精确序列位点往往是未知的。蛋白质组学是研究翻译后修饰的性质和序列专一性最好的方法。此法的扩展允许在一个网络中同时鉴定调节蛋白质的修饰状态，这是蛋白质组学技术的重要扩充[12]。
2 免疫蛋白质组学的技术要点
2.1二维凝胶电泳
二维凝胶电泳（two-dimensional gel elect-rophoresis，2DE）又称双向凝胶电泳，它的发展使得蛋白质混合物的分离达到高重现性和高分辨率，使定性和定量分析2个或多个细胞或组织标本中的蛋白质成为可能。2DE的出现早于通过基因测序技术检测基因表达的方法，但2DE本身是一种重要的描述性技术，当分离后的蛋白质缺少快速和可靠的鉴定工具时，它在分子生物学研究中的应用受到限制。
软电离技术电喷雾离子化 （ESI）和基体辅助激光解吸电离 （MALDI）的出现，使质谱成为现代蛋白质科学中最重要的组成部分。基体辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、电喷雾离子化串联质谱（ESI-MS/MS）取代了速度较慢、灵敏度较差的Eadman化学降解法，用于分析和鉴定2DE分离所获得的蛋白质样品。此类方法的一般步骤是：先从2DE胶切下待分析的蛋白质斑点，用胰蛋白酶对蛋白质进行胶内消化，然后用质谱技术分析消化后得到的多肽片断，用MALDI-TOF-MS测定酶解后的多肽片断得到肽质量指纹图谱并通过数据库检索来对蛋白质进行鉴定。在同一实验中未鉴定的蛋白质，再用纳升电喷雾串联质谱（nano- ESI-MS/MS）或联机的反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱进行自动的数据扫描，肽离子经碰撞诱导裂解（CID）产生的串联质谱图谱，与数据库中肽序列的理论串联质谱图进行对比检索，鉴定蛋白质。
纳升电喷雾串联质谱是基于Wilm和Mann的理论研究，现已成为分析从1D和2D上分离得到的微量蛋白质的有力工具。电喷雾上样还可在电喷雾接口前用HPLC分离多肽（在线CapLC-ESI-MS/MS）。nano-ESI- MS/MS和在线CapLC-ESI-MS/MS 2种方法是相互补充的，各有优势[3]。
2.2 半干转印
蛋白质从凝胶中向固相支持物的转移创造了Western免疫杂交研究方法，由于是在液体环境中进行，它转移速度慢，需要大电流，而大电流易产热，所以实验需在低温下进行，使用很不方便。半干转印解决了这个问题，且避免了缓冲液中不纯杂质向固相膜载体的转移。半干转印法只需将凝胶与膜紧贴，夹在转移缓冲液浸泡过的滤纸中间，然后将它们一起置于石墨电极之间，接通电源即可转移，在室温下1~2 h即可完成，非常方便。由于SDS在转移环境中与蛋白质可逆结合，如果胶上的蛋白质与SDS已经分离，则它由于失去了电场提供的驱动力而不能转移到膜上；相反，如果蛋白质已经转移到膜上而仍未与SDS分开，则蛋白质可能穿透膜而不能结合到膜上，因此，要控制好半干转印的时间。一般而言，高相对分子质量的蛋白质易丢掉SDS而留在胶中，低相对分子质量的蛋白质则不易丢掉SDS穿透膜。在阴极滤纸的转印缓冲液中补加SDS可促进SDS与蛋白质结合，从而有利于高相对分子质量蛋白质向膜上转移；通过增加杂交缓冲液中的离子强度，增加蛋白质与膜之间的疏水性相互作用，使低相对分子质量蛋白质获得了较好的杂交效率。
2.3免疫芯片
免疫芯片（immunochip）作为一种高通量同步多元检测系统，其检测操作所需样品量少、反应速度快、灵敏度高、稳定性好，在分子诊断学和蛋白质组学领域将会大有作为[13]。
目前，蛋白质组分析的研究主要依靠双向电泳和质谱，繁琐且低效，亟需建立简便易行、灵敏、高通量的表达蛋白质分析方法。其中之一就是基于抗体微阵列的蛋白质芯片[14]。通过抗体工程可以得到各种重组抗体，加上目前商业可得的抗体，将组成数量可观的抗体库，应用这些抗体制造的抗体微阵列免疫芯片即能对含有各种功能基团的蛋白质进行全面快速的分析。
随着芯片微型化技术的发展，微点的尺度进一步缩小至纳米尺度，出现了纳米阵列（nanoarray）免疫芯片。纳米点阵应用原子力显微镜（atom force microscopy，AFM）的针尖制作，纳点（nanospot）直径一般为100~350 nm，仅约为微米阵列中微点尺度的1/1 000。它不仅微型化程度高，而且检测程序无需进行分子标记，可直接用于复合物的测定，与表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）检测方法有相似之处。2002年，美国西北大学的研究人员利用AFM制作了以免疫球蛋白为捕获探针的纳米阵列免疫芯片，并验证其可与抗免疫球蛋白结合反应。
探针点并非越小越好，当点尺度小到一定程度时，因每点所含捕获分子数量过少，检测体系将表现出较大的差异性，从而失去统计学意义[15]。
3 免疫蛋白质组学的临床应用
3.1在糖尿病中的应用
Ⅰ型糖尿病（T1DM）是一种多基因、多病因的自身免疫性疾病，发病特点是选择性且不可逆的破坏胰岛B细胞，导致胰岛素产生障碍，患者终生需要外源性胰岛素。1987年，Nepom等用2DE和免疫沉淀法分析T1MD患者HLA分子，发现HLA分子存在杂合性。Winer研究非肥胖型糖尿病（non obesity diabetes，NOD）小鼠和糖尿病患者，通过SELDI-TOF-MS的质谱技术鉴定出胰岛Schwann细胞和Langerhans细胞分泌自身抗体，刺激胶质纤维酸性蛋白。研究发现，T1DM发病机制中存在自发免疫系统对抗胰岛神经组织的途径。Nielsen等的体外研究发现，B细胞成熟过程中在2 239个蛋白点中135个有差异变化，这是翻译后修饰的结果，这些翻译后修饰的蛋白质是研究T1DM发病机制的潜在靶位[16]。
蛋白质组学的研究技术在提高，将双向电泳技术用于小鼠组织，通过增大2D胶、使用窄范围的pH胶、细胞器分离可以获得超过10 000个蛋白点，远远超过传统方法获得的1 900个蛋白点。用 IL-1β研究胰岛B细胞系的蛋白质组学得到得结论是T1DM发病是多因素、动态的，并非某个基因单独作用的结果。
3.2在肿瘤诊断中的应用
蛋白质组学被用于鉴定癌症诊断的标志物，检测疾病进展和鉴定治疗的靶位。它在发现癌症的标志物方面具有重要价值，因为蛋白质组反映了细胞内在的遗传程序和直接的环境影响。美国国立肿瘤研究所组织的早期疾病探测研究机构多中心三期临床试验得出结论：通过血清及仪器标准化质控，增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）是目前最有希望的检测肿瘤早期的方法[17]。对乳腺癌和卵巢癌检测的敏感性和特异性为93%和91%，较传统的检测标志物癌抗原提高很多[18]；对前列腺癌检测的敏感性和特异性为83%和97%；国内外学者还用SELDI技术对肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、食道癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤进行了检验和研究，也取得了很好的效果[19, 20]。
3.3在病原性疾病中的应用
许多感染性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒、鼠疫等的抗原尚依赖ELISA、放射免疫法、免疫荧光法等间接测定，用SELDI则可同时直接检测这些疾病特异性抗原的相对分子质量，并进行窗口期检查，这是其他检测手段无法做到的。
Jungblut等[21]通过免疫蛋白质组学手段，利用感染早期和晚期患者的血清研究了嘎氏疏螺旋体的免疫原性蛋白，在验证了传统使用的2个靶标抗原的同时，又找到了2个新的靶抗原。并且在幽门螺杆菌的诊断中，分别用幽门螺杆菌感染不同阶段及其他原因导致的胃炎患者的血清，探测了幽门螺杆菌不同菌株的免疫原性蛋白，对其感染特异的免疫原性靶标蛋白进行了深入系统的研究，为其诊断、预防和治疗奠定了良好的基础。
应天翼等[22]提取福氏贺杆菌2a 2457T全菌蛋白进行不同pH梯度的双向电泳，结合蛋白质印迹技术寻找发生免疫反应的蛋白质。用MALDI-TOF-MS鉴定了19个免疫反应蛋白点，对应于10种蛋白质，成功建立了福氏贺杆菌2a 2457T的免疫蛋白质组学研究方法，为寻找保护性抗原打下了基础。
Pitarch等[23]通过免疫蛋白质组学手段从白假丝酵母中鉴定到了42个有免疫原性的持家酶。通过进一步的研究发现，在念珠菌病发病过程中，磷酸甘油酸激酶与乙醇脱氢酶抗体的产生与刺激人的免疫分化有关，并验证了循环系统中白假丝酵母特异性抗体对念珠菌病发展的抑制作用。他们认为，高浓度的抗烯醇酶抗体的出现标志着患者处于恢复期，可作为病情发展的标记物。此研究为念珠菌病的早期检测及临床跟踪提供了靶标，且可能被用作设计抗真菌药物及疫苗的靶标。
3.4在其他疾病中的应用
英国Rrian Austen研究小组检测了老年性痴呆（AD）患者的组织和脑脊液，发现了一种β-淀粉样蛋白多肽，并被公认为是人脑产生神经退行性改变的标志物[24]。用SELDI进一步确定了抗原变异片段，为B型多肽的片段1~42，相对分子质量为4 511，是引发疾病的关键标志物。
在心血管病的诊断中，Allard等用SELDI技术首次发现载脂蛋白C-I（ApoC-I）和载脂蛋白C-Ⅲ（ApoC-Ⅲ）可区别缺血性和出血性脑卒中。用SELDI技术测定补体C3α链及纤维蛋白原的早期降解蛋白指纹，能更早地发现心肌梗死。
最近，Chen等提出免疫蛋白质组学应该分为3部分，（1）通过免疫蛋白质组学筛选外膜中具有免疫原性的蛋白质；（2）通过免疫后攻毒的方法鉴定免疫原性蛋白的保护性；（3）通过其中和能力来确定候选疫苗。按照上述原则，该研究小组通过实验从嗜水气单孢菌的外膜蛋白中筛选出了保护性达71.4%的抗原。但研究者认为，如果只作为诊断靶标，后两步不是必需的，而应通过与其他菌株之间的交叉反应来筛选。
4 展望
目前免疫蛋白质组学已成功地应用于生物医学的许多领域，如病源性微生物、自身抗原、肿瘤抗原及蛋白质修饰等的研究；也应用于不同种类免疫反应以及免疫反应过程中不同阶段特异性免疫蛋白质的研究。其原理还用于蛋白质翻译后修饰的研究，如通过磷酸化抗体来探测被检蛋白质中磷酸化的情况等。在今后生命科学的相关研究中，免疫蛋白质组学将应用于更为广泛的领域。
方法学上，二维凝胶电泳-质谱仍是目前最流行和较可靠的技术，但其通量、灵敏度和规模化均有待进一步加强，一些学者开始重视研究以色谱/电泳-质谱为主的技术。此外，酵母双杂交技术虽已用于研究蛋白质连锁群和蛋白质功能网络系统，但尚缺乏快速、高效的手段获取复杂蛋白质相互作用的多维信息。蛋白质组的生物信息学研究虽已有成功的先例，但其应用范围与准确率仍需提高，所面临的更大挑战是如何综合信息，准确分析蛋白质的相互作用，界定相互作用连锁群。
学术上，在基因组、转录组基础上的蛋白质组全谱研究，微生物已有成功的报道，但是在高等生物尤其是哺乳动物尚未见报道，人类组织或细胞的蛋白质组全谱研究则基本未涉足。此外，人类基因组草图虽已公布，但是，估计的3.5万左右基因中一半以上属理论推测，需要从蛋白质组水平予以检验与确认，因此，开展人类组织或细胞的蛋白质组表达谱的分析势在必行。
受基因调控的细胞内各种信号转导途径之间是相互交错和彼此关联的。虽然近年人们对转导途径以及相互关系的认识取得了进展，但是，针对任一生物体组织、细胞开展全方位的蛋白质组相互作用网络的分析鲜有报道。而此类相互作用网络的揭示对于深刻认识重要生理、病理过程的机制是不可缺少的[25]。
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关键词：蛋白质组学；蛋白质组学技术体系
中图分类号：Q753
文献标识码：A
文章编号：1672－979X(2010)5－0207－04
21世纪是生物技术和信息技术的世纪。随着人类基因组测序计划的完成，功能基因组学逐渐成为新的研究热点，研究蛋白质组学是功能基因组研究的重要组成部分，是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代研究的核心内容之一。
1 蛋白质组与基因组――从基因组到蛋白质组的转变
基因组用于描述生物的全部基因和染色体组成。基因组学包括结构基因组学和功能基因组学两方面的内容。
随着研究的深入，人们认识到单纯基因组信息不能完全揭示生命的奥秘。基因是遗传信息的携带者，蛋白质才是生理功能的执行者和生命活动的直接体现者。几乎所有的生理和病理过程都能引起蛋白质相应的变化，研究蛋白质结构和功能将直接阐明生物体在不同生理或病理条件下的变化机制。由此产生了蛋白质组学(protemics)。在后基因组时代，生命科学的中心任务将是阐明基因组所表达蛋白质的表达规律和生物功能。生命科学的研究重心将从基因组学移向蛋白质组学。
2 蛋白质组学的研究内容
蛋白质组学研究的内容主要有结构蛋白质组学和功能蛋白质组学两方面。结构蛋白质组学主要是研究蛋白质表达模式，功能蛋白质组学主要是研究蛋白质功能模式，目前的研究主要集中在蛋白质组相互作用网络关系上。
目前蛋白质组学又出现了新的研究趋势：(1)亚细胞蛋白质组学分离、鉴定不同生理状态下亚细胞蛋白质的表达，这对全面了解细胞功能有重要意义；(2)定量蛋白质组学精确的定量分析和鉴定一个基因组表达的所有蛋白质已成为当前研究的热点；(3)磷酸化蛋白质组学蛋白质磷酸化和去磷酸化调节几乎所有的生命活动过程。蛋白质组学的方法可以从整体上观察细胞或组织中蛋白质磷酸化的状态及其变化；(4)糖基化蛋白质组学可用于确定糖蛋白特异性结合位点中多糖所处的不同位置。近来在蛋白质组学背景下进行的糖生物学研究已取得了可喜的进展；(5)相互作用蛋白质组学通过各种先进技术研究蛋白质之间的相互作用，绘制某个体系蛋白质作用的图谱。
3 蛋白质组学研究技术
蛋白质组学的发展，既是技术推动又受技术限制。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于技术方法水平的高低。蛋白质组学的蓬勃发展主要得益于三大技术突破：固相化pH梯度胶条即IPG胶条的发明和完善；两种软电离质谱技术的出现：蛋白质双向凝胶电泳图谱数字化和一系列分析软件的问世。当前国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面。
3.1蛋白质样品制备技术
样品制备是双向电泳成功的关键之一。选择合适的样品制备方法对获得满意的双向电泳图谱非常重要。不同来源的样品有不同的处理方法。目前常用的样品处理技术有液相等电聚焦、亚细胞分级、吸附色谱、连续多步提取方法等。
激光捕获显微切割技术是上世纪末期发展起来的新技术。利用激光切割组织，能高效地从复合组织异性地分离出单个细胞或单一类型细胞群，显著提高样本的均一性。
3.2蛋白质分离技术
3.2.1双向凝胶电泳(2-DE) 其原理是根据蛋白质的等电点和相对分子质量来分离蛋白质。近年双向电泳技术的蛋白质分离分辨率和重复性显著提高。尤其是差异荧光显示凝胶电泳(DIGE)技术，将蛋白质样品经不同的荧光染料CYPRO Ruby(Cy2、Cy3、Cy5)标记后，等量混合双向电泳，蛋白量差异可通过蛋白点荧光信号间的不同比率分辨。此法灵敏度高，所需样品量少，一张胶可同时分析3个样品，减少了工作量，重复性显著提高。目前该技术已得到了广泛应用。
3.2.2高效液相色谱技术(HPLC) 2D-LCO口串联HPLC也是分析蛋白质组学最有效的工具之一。其基本原理是先进行第一向分子筛柱层析，按蛋白质相对分子质量大小分离。从柱上流出的蛋白峰自动进入第二向层析进一步分离，第二向层析通常是利用蛋白质表面疏水性质进行反相柱层析。
3.2.3毛细管电泳(CE) 在高电场强度作用下，按相对分子质量、电荷、电泳迁移率等差异有效分离毛细管中的待测样品。CE分辨率高，分离速度快且易于和ESI-MS实现在线连接，在蛋白质分析中应用的极为广泛。与2-DE比较，CE可在线自动分析蛋白质的分离，并可分析相对分子质量范围不适于2-DE的样品。缺点是复杂样品分离不完全。
3.3蛋白质定量分析
蛋白质组研究中，以2-DE为基础的蛋白质定量方法大致有考马斯亮蓝染色法、银染法、负染法、荧光染色法和放射性同位素标记法等。其中，考马斯亮蓝染色法和银染法是最常用的定量手段，操作简单易行，而且能很好地与质谱鉴定匹配，但灵敏度较低，检测下限为0.2～0.5g，背景较高。
银染的优点是灵敏度高，可染出蛋白质量1ng／点，但与蛋白质量的线性关系不如考马斯亮蓝染色法，且对质谱鉴定影响较大。
负染方法简单快速，但是，其重复性依赖于许多物理化学因素，例如染色液的pH，胶中阴离子浓度、温度等，所以不能作为一种通用方法。
荧光染色法的灵敏度与银染相似但速度快得多，且不需要固定蛋白质。这为后续的蛋白酶解或印迹带来很大方便。此外，荧光染色的线性范围较宽，定量结果较可靠。
在所有的染色方法中，最灵敏的是同位素标记法，20×10-6量的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度测定。但此方法易污染，易对人体产生伤害，操作也不方便，一般不采用。
3.4蛋白质的鉴定
3.4.1氨基酸组成分析此法可提供蛋白质一级结构信息，耗资低，但速度较慢。所需蛋白质或肽的量较大，在超微量分析中受到限制；且存在酸性水解不彻底或部分降解而致氨基酸变异的缺点，故应结合蛋白质的其它属性鉴定。
3.4.2 C-端或N-端氨基酸序列分析常用Edman降解法测定蛋白质N－端氨基酸序列。常用羧肽酶法、化学降解法测定蛋白质C-端氨基酸序列。目前均可用自动测序仪。
3.4.3质谱能清楚地鉴定蛋白质并准确测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰，因灵敏度高、速度快、易自动化，已成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。
质谱技术的基本原理基于：带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子质量与携带电荷比的不同而变
化，可据此判断粒子的质量和特性。目前常用的质谱仪有气相色谱－质谱仪(GC－MS)：液质联用质谱仪(LC－MS)；电喷雾电离串联质谱仪(ESI－MS－MS)；液相色谱－电喷雾离子化质谱仪(LC－ESI－MS)；基质辅助的激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI－TOF－MS)等。其中MALDI－TOF－MS和ESI－MS－MS是简单高效且灵敏的方法，是目前蛋白质组学研究中应用最广泛的生物质谱仪。
3.4.3.1肽质量指纹图谱法鉴定蛋白质在蛋白质数据库中检索实验获得的肽质量指纹图谱，根据肽段匹配率和蛋白质序列覆盖率寻找具有相似肽指纹图谱(PMF)的蛋白质，就可以初步完成蛋白质鉴定。
当前测定蛋白质的肽质量指纹图谱，常用的质谱仪为MALDI－TOF－MS，精度可达0.1个质量单位，灵敏度可以达到分解亚皮摩尔量的蛋白质，并且分析时间极短，适于蛋白质的高通量鉴定。
3.4.3.2质谱测肽序列信息鉴定蛋白质为进一步鉴定蛋白质，可将液相中的肽段经电喷雾电离后进入串联质谱，肽链中的肽键断裂，形成N－端和C－端碎片离子系列。根据肽片段的断裂规律综合分析这些碎片离子系列，可得出肽段的氨基酸序列，联合肽片段的相对分子质量和肽段的序列信息，就足以鉴定一个蛋白质。
表面增强激光解吸电离－飞行时间－质谱(SELDI－TOF－MS)是在MALDI－TOF－MS基础上进一步改进的质谱技术。它通过表面选择性吸附大大降低了样品蛋白质的复杂性，而又能同时分析多样品、多蛋白质，具有分析速度快、简便易行、样品用量少和高通量等特点。
3.4.4同位素标记亲和标签(ICAT) 这是应用MALDI－ToF和LC－MS／MS表达蛋白质差异的定量分析技术。其优点是可以直接测试混合样品而不需分离，能迅速定性和定量鉴定低丰度蛋白质，但也存在特异性吸附、不可逆吸附和容量低等缺点。
3.4.5iTRAQ iTRAQ试剂是在ICAT基础上发展起来的氨基反应试剂，可标记四重样品，以便用串联质谱仪比较分析丰度。Hirsch等利用iTRAQ-MS／MS研究大鼠肝脏局部热缺血处理后Kuppfer细胞内蛋白质的变化，获得了总计1559种蛋白质的定量比较数据。
3.4.6蛋白质芯片技术这是用于分析蛋白质功能及相互作用的生物芯片。待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子杂交或相互作用或用其他分离方式分离后，用激光共聚焦显微扫描仪检测和分析杂交信号，从而实现高通量检测多肽、蛋白质及其他生物成分的活性、种类和相互作用。此技术快速、操作简便、样品用量少，可平行检测多个样品，可直接检测不经处理的各种体液和分泌物等。在蛋白质组学研究中较目前用的常规方法有明显优势。
3.5蛋白质之间的相互作用技术
蛋白质之间相互作用是细胞生命活动的基础和特征。目前主要的研究方法有以下几种。
3.5.1酵母双杂交系统这是在真核模式生物酵母中进行的，灵敏度很高。目前此技术不但可用于体内检验蛋白质之间，蛋白质与小分子肽、DNA、RNA之间的相互作用，而且能用于发现新的功能蛋白质，研究蛋白质的功能，对于认识蛋白质组特定代谢途径中的蛋白质相互作用关系网络发挥了重要作用。
这种技术可用于研究大量蛋白质间的相互作用，易自动化、高通量，但存在假阳性和假阴性现象。酵母双杂交系统提供的蛋白质之间可能的相互作用信息，还需通过进一步的生物化学实验确定和排除。
3.5.2噬菌体展示技术主要是在编码噬菌体外壳蛋白质基因上连接一单克隆抗体基因序列。噬菌体生长时表面会表达出相应单抗，噬菌体过柱时，如柱上含有目的蛋白质，则可特异性地结合相应抗体。该技术具有高通量及简便的特点，与酵母双杂交技术互为补充，弥补了酵母双杂交技术的一些限制。缺陷是噬菌体文库中的编码蛋白均为融合蛋白，可能改变天然蛋白质的结构和功能，体外检测的相互作用可能与体内不符。
3.5.3串联亲和纯化(TAP)
利用一种经过特殊设计的蛋白标签，经过两步连续亲和纯化，获得更接近自然状态的特定蛋白复合物。TAP技术可在低浓度下富集目的蛋白，得到的产物可用于活性检测及结构分析。因其高特异性和选择性可减小复杂蛋白质组分离的复杂性。
TAP技术的开发是研究蛋白质相互作用方法学上的巨大突破。该方法集成了经典的亲和纯化和免疫共沉淀两种技术的优点，可快速得到生理条件下与目标蛋白真实相互作用蛋白质的特点。这些分离技术与2－DE相互补充或不同分离模式组合，将成为蛋白质组学高通量分析的重要工具。
3.5.4表面等离子共振技术(SPR) 为研究蛋白质之间相互作用的全新手段。典型代表是瑞典BIACORE的单元蛋白质芯片。SPR技术的特点是检测快速、安全，不需标记物或染料，灵敏度高。除用于检测蛋白质之间的相互作用外，还可用于检测蛋白质与核酸及其他生物大分子之间的相互作用，并且能实时监测整个反应过程。因此，SPR技术在检测生物大分子特异性相互作用上比传统方法更具优势。
3.6生物信息学分析
生物信息学是蛋白质组学研究不可或缺的研究方法。蛋白质组学研究任一物种的基因组编码的全套蛋白质，通常是高通量的，在预测和结构分析蛋白质功能时，生物信息学就成为蛋白质组学研究的核心技术之一。数据库是生物信息学的主要内容，各种数据库几乎覆盖了生命科学的各领域，建立与开发蛋白质组数据库和分析软件是蛋白质组定性和定量分析的重要基础。Mascot，Expasy，PeptideSearch和ProteinProspector等是目前蛋白质组学中常用的检索数据库。
4 展望