时间：2023-03-05 04:06:33
半胧氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)广泛分布于植物、细菌、病毒、原生动物和哺乳动物体内，参与各种生理和病理的过程，如蛋白质的分解代谢、感染与免疫、肿瘤的侵袭和转移等。早在20世纪60年代末，Fossum和whitaker[’〕就已从鸡蛋清中分离得到半胧氨酸蛋白酶抑制剂并发现其具有抑制无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶及二肤酶的活力。80年代早期，Anastasi等[zl首次采用亲和层析方法从鸡蛋清中分离得到半胧氨酸蛋白酶抑制剂并命名为“cystatin”，此后，cystatin相继在不同的物种中被分离纯化。这些在结构和功能上具有进化上相似性的内源性半胧氨酸蛋白酶抑制剂构成一个Cystatin超家族。
cystatin除了具有独特的抑制半胧氨酸蛋白酶(如组织蛋白酶eathepsinB、L、S和天冬酞胺内肤酶AE功活性外，还具有一些免疫调节活性。本文就cystatin的分类、结构及免疫调节活性方面的研究进展作一综述。
由一条约含100个氨基酸的多肤链构成，不含二硫键和糖基，分子量约11一12KD。这类分子包括人stefinA、B，鼠。tefin。、俘等，主要分布于上皮细胞和多形核白细胞内;②cystatins家族，为分泌型蛋白。由约120个氨基酸组成，分子量约13一14KD，位于多肤链的c端有两个链内二硫键，也不含糖基。目前，有些学者认为川。ystati。超家族除上述的3个类型外，还包括一些胎球蛋白、组氨酸糖蛋白、cys-tatin相关蛋白以及恒定链等，这些均与cystatin同源，归为新一类cystatin超家族成员。
cystatin分子的结构特征cystati。分子的共同特征是[5]能以等摩尔与半胧氨酸蛋白酶分子发生紧密、可逆地结合。经氨基酸序列分析发现它们具有3个高度保守的区域:①靠近N端的区域，其中甘氨酸一11(cystatinC序列)高度保守;②第一个发夹环，包括高度保守的QVvAG序列(谷氨酞胺一55一甘氨酸一59);③第二个发夹环，包括脯氨酸一105和色氨酸一106。这3个区域均为疏水性，其疏水性作用与cystatin和目标酶的结合有关。
eysrain与抗原呈递树突状细胞(DC)是[7]一类重要的抗原呈递细胞(APC)。早期或未成熟的DC具有很强的摄取抗原的能力，而无或很弱的呈递抗原的能力。它们在外周组织接受刺激(如抗原、1S、细胞因子等)后逐渐向次级淋巴器官迁移。在迁移过程中，DC经历一个130成熟的过程:首先逐渐丧失内化抗原的能力，接着表达MHC一n分子和协同刺激分子增加，最后胞膜表面呈递抗原肤一MHC一n复合物。总之，DC通过调控MHC一11分子的胞内转运和胞膜表达来调节其抗原呈递能力。
[关键词]鱼腥草 胰蛋白酶抑制剂
中图分类号：P618.21 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）10-0374-01
蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor， PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动植物和微生物中。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的药用价值，对急性胰腺炎、肺气肿、抗休克、防治脑水肿和脑缺血等都有很好的临床 治疗 效果，还有研究表明对 HIV 和肿瘤的治疗也有重要意义。因此，从传统中药中筛选具有TI活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本实验根据前期筛选的结果，利用鱼腥草为材料对从鱼腥草中提取TI的工艺进行优化，找出最佳的提取条件，为今后的 工业 化生产TI提供基础性数据。
1 仪器与试剂
1.1 试剂胰蛋白酶（ 北京麒麟宏伟公司） 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯；鱼腥草。
1.2？ 仪器可见光分光光度计（7202B） 、离心机（LD-4） 、精密pH 计、水浴锅、精密 电子 天平（FA2004N）。
2 方法
2.1？ 鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交实验设计根据 文献 及预实验结果，本实验采用双蒸水作为提取TI的溶剂。称取干燥的鱼腥草全草5 g，粉碎，在平行操作条件下，选用L9（34）正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次，然后过滤并收集滤液，减压浓缩到100 ml。
2.2？ 鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分对胰蛋白酶的抑制率测定方法采用苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法：取胰蛋白酶液1 ml，加药材提取液1 ml在37℃水浴保温5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保温10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在410 nm条件下测定吸光度。按下列公式 计算 样品提取液的抑制百分率：i=（Ar-Abr ）-（As-Abs）（Ar-Abr）×100%
式中：i ―抑制百分率；Ar ―标准溶液的吸光度；Abr―含标准溶液的空白对照液的吸光度；As―样品溶液的吸光度；Abs―含样品溶液的空白对照液的吸光度。
3 结果与方差分析
由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>A>C>D，其中因素B为高度显著，因素A，C影响显著，因素D没有统计学意义，对试验结果的影响很小。由R值可知， 各因素对试验结果的重要次序为B>C>A>D。考虑到规模化生产中 经济 、效率等因素，本文优选工艺A1B2C3D2， 即在60℃，用30倍量水， pH值为9，3 h/次为最佳提取工艺。按照此工艺条件进行3次平行实验，测定提取液对胰蛋白酶的抑制率，结果平均抑制率为58.27%，表明本实验确定的工艺路线稳定可靠。
4 讨论
因素A对实验结果有显著的影响，60℃时提取活性最高，随着温度的上升抑制率有下降的趋势，说明随着温度的上升对TI有失活的作用。因素B对实验有高度显著的影响，在所有因素中影响最显著，说明随着溶剂量的增加会提高TI的提取效率，但从变化趋势看当30倍量时继续增加溶剂量，TI的提取率增幅不是很明显，因此考虑生产成本和效益用30倍量是最好的。因素C对实验结果也有显著影响，随着pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，这说明在碱性条件下提取效率升高。
本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化， 并按最佳工艺进行了验证试验， 结果证明用该工艺作为鱼腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。
参考文献
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【关键词】 Eppin； ； 男性； 不育症； 避孕； 无症
进入21世纪，人们逐渐发现人类的繁衍生育能力正在逐渐下降，不孕不育已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后威胁全人类生存的三大疾病之一。WHO指出，排除女方的因素，婚后有规律性生活、未采取任何避孕措施的夫妻生活达到一年以上者，女方仍未能怀孕，可诊断为男性不育症。据WHO最新的统计结果显示，全球的不孕不育患者占世界人口的15%，并且这个数字还在飞速增加。我国的发病率约在12.5%左右，这些患者中约40%是由于男性因素导致的[1]。
质量是决定男性生育力最主要的方面，男性质量的下降是导致男性不育症的最重要原因，主要有少症、弱症以及畸形症[2]；另一方面，现代社会女性意外怀孕后的流产比例越来越高，目前针对男性的避孕措施仅仅局限于、体外、输精管结扎等[3]，并没有针对男性的可逆性药物，所以针对男性的避孕措施相对较少。大量研究表明Eppin（epididymal peptidase inhibitor）与生殖和免疫性避孕关系密切。本文对Eppin基因及蛋白的发现、特征及其在男性生殖等方面的作用做一综述。
1Eppin的发现及特征
研究发现部分人的精浆中存在一种蛋白质抗体，这种抗体会阻碍的液化和的运动，进而导致男性不育，后来人们将其命名为Eppin蛋白，由Eppin基因编码[4-6]。
人类Eppin表达的三种mRNA实际上只编码两种蛋白亚型（1、3的蛋白质序列一样），分别为Eppin 1和Eppin 2，它们的区别在于N端的氨基酸序列不同。Eppin 1是最主要的，它的mRNA编码133个氨基酸残基，1～21是信号肽，22～133是成熟蛋白，所以是一种分泌蛋白；Eppin蛋白理论上的等电点是8.52，相对分子质量（Mr）为15283[7]。这类蛋白质在和附睾中被检测到，可能在灵长类动物的繁衍中发挥重要的作用。
2Eppin对活动力的影响
O′Rand等[8，9]研究证实，重组Eppin免疫的雄猴无法使雌猴自然受孕，经过检测这些雄猴的血清发现其Eppin抗体阳性率非常高。王增军等[10]采用严谨的实验方法证明了存在于精浆中和表面的Eppin蛋白能够与精囊的凝固蛋白酶（Semenogelin）结合，同时让重组Eppin和重组Semenogelin的不同氨基酸片段自由结合，发现C端Eppin75-133氨基酸片段能够与Sg164-283氨基酸片段相结合，而且人类Semenogelin中唯一的胱氨酸残基（Cys239）就存在于Semenogelin片段中，这项研究证实了Eppin能够通过影响Semenogelin而发挥其作用，因此推测Eppin可能干扰了Eppin-Semenogelin结合，使形成团块影响了活动力。
ELISA法检测25例抗抗体阳性的不育患者中有7例Eppin（28%）阳性。然后使用Western blot方法进一步检测7例阳性患者的标本，发现有5例Eppin阳性表达。另外对25例可以正常生育的男性患者的进行检测，发现抗Eppin抗体均为阴性表达。这说明抗抗体阳性的不育患者的中含有抗Eppin抗体。抗Eppin抗体能够通过干扰正常Eppin和Semenogelin的相互作用，影响的成熟过程和液化情况，致使运动能力下降，进而导致患者不育。
丁新良等[11]通过对Eppin基因SNPS（单核苷酸多态性）的研究发现，位点rs2231829与数量之间以及位点rs6124715、rs11594与运动能力之间均存在显著相关性。在SNPS与发病风险的分析中，发现多态性位点rs2231829和rs11594的存在显著改变男性原发性不育症的发病风险，并且这种风险在质量异常的病例中非常明显。然而，这些SNPS各基因型对应的血清睾酮水平没有显著性差异。生物信息学分析表明，位点rs2231829影响转录因子的结合，而位点rs11594影响mRNA结构。因此可以推测Eppin基因多态性可能通过影响转录因子的结合以及mRNA的结构而影响该基因的生物学功能，进而干扰成熟过程，影响生育结局，但是这一假设还有待进一步研究证实。此外，以小鼠为研究对象，采用整体动物RNA干扰结合显微注射与膜片钳技术，发现Eppin基因低表达会引起小鼠运动能力明显下降，主要表现为平均路径速度、活力、直线速度和曲线速度的显著下降。进一步研究表明与运动能力变化相一致的是，小鼠生精细胞的T型钙电流也随之显著下降，T型钙通道的mRNA水平亦显著降低。因此可以得出以下结论：Eppin基因低表达导致生精细胞T型钙通道mRNA水平的降低和T型钙电流的下降，进而引起运动能力的下降。
3Eppin在OA和NOA诊断中的应用
基于Eppin基因在附睾和异性表达，Liu B等[18]采用Western blot的方法检测40例正常人和46例无症患者中Eppin蛋白的表达，将精浆中Eppin蛋白有表达的无症患者诊断为非梗阻性无症（NOA，Non obstructive azoospermia），而精浆中Eppin蛋白无表达的无症患者诊断为梗阻性无症（OA，Obstructive azoospermia），并且进一步通过经皮附睾穿刺术/经皮穿刺术（PESA/TESA）确诊无症的类别。对比发现，通过Western blot检测Eppin蛋白的表达得到的诊断结果与PESA/TESA的诊断结果非常类似。因此，Eppin蛋白检测或许是一种新的、有效的、无创的诊断OA和NOA的方法，将来有望在临床中得到广泛的应用。
4Eppin在男性避孕方面的应用
目前在避孕领域，男性避孕疫苗是研究的热点之一。Eppin蛋白是由和附睾特异性分泌，广泛存在于后的人类头部和尾部表面，进入附睾输出管后，表面与附睾头部和尾部所分泌的Eppin蛋白会发生特异性结合；另一方面，膜蛋白在发生和成熟过程中、受精过程中和胚胎早期发育过程中有着至关重要的作用，可能涉及到获能、顶体反应、穿透卵子透明带、精卵结合和受精卵的分裂等方面，机体可能对一些膜蛋白发生免疫反应，导致免疫性不孕症。顶体赤道区及顶体内膜含有顶体膜蛋白17（Sp17），Sp17会在顶体反应后大量表达，有促进受精的作用，其机制可能是Sp17能够与透明带上的糖基结合引起。因此Sp17和Eppin都可作为潜在的避孕疫苗靶点。
房磊臣等[19]采用基因重组及抗原抗体反应等方法，将人Sp17和Eppin作为靶抗原，成功构建了酵母Sp17-Eppin融合蛋白表达系统，获得了高纯度Sp17-Eppin融合蛋白，并且进一步在大量动物实验中发现这种融合蛋白疫苗组的避孕效应显著强于单一重组的Sp17蛋白疫苗组，大大增加了避孕效应。尽管其避孕效应具有可逆性，但同时也会造成缩小，因此对的生精功能会有一定程度的影响。然而这仍是对融合蛋白避孕疫苗构建的大胆尝试，为探索开发安全、高效、可逆的男性免疫性避孕疫苗新途径打下了坚实的实验基础。
5Eppin与糖尿病、肥胖症的关系
糖尿病、肥胖症等对男性生育力的影响正越来越受到大家的关注，它们造成的激素改变和新陈代谢紊乱会对男性生育力构成一定的危害，而且现在糖尿病和肥胖症的发病年龄越来越小，因此越来越多的人的生育力在生育年龄之前已经受到负面的影响。最近一项研究表明体重指数（BMI）对男性生育力的影响仅次于年龄。采用差异凝胶电泳方法对糖尿病患者、肥胖人群和正常人群的Eppin蛋白质组进行分析识别，对数据结果进行对比分析，证实了糖尿病患者和肥胖人群与正常人群之间的Eppin蛋白质组在表达程度上存在显著性差异[12～17]。
6结语
综上所述，Eppin基因和蛋白对质量有重要的影响，进而影响男性生育，但对其具体的分子机制报道的较少，下一步应着重对其机制方面进行研究。中抗Eppin抗体的检测或许能成为一种研究男性免疫性不育机制的无创的方法，不仅改善了不育症患者的特异性诊疗，拓宽了患者的辅助诊断指标，同时也为男性免疫性避孕疫苗的研发提供了一定的实验和临床研究基础。
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关键词：苦瓜；分离；胰蛋白酶抑制剂；测定方法
中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0014-04
Study on Measurement Method for Activity of Trypsin Inhibitors from Momordica charantia
FU Zhong-ping, ZHOU Ji-yan, WANG Fu-jun*
(Institute of Traditional Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,
Shanghai 201203, China)
Abstract：Objective To study a modified method for detecting inhibitory activities of trypsin inhibitors purified from Momordica charantia (MC) seeds. Methods The method was assessed by the stability, repeatability and specificity tests. Results The relative molecular mass of trypsin inhibitors from MC was around 1×103; specific activity was 1 153U/mg; the inhibitor solution was stable and the activity lose was less than 2% within 2 h; RSD of the method was 2.5% and 0.05mg/ml BSA did not interfere the activity measurement. Conclusion The method is suitable for the determination of inhibitory activities of trypsin inhibitors from MC.
Key words：Momordica charantia; separation; trypsin inhibitor; measurement
蛋白酶抑制剂是一类多肽，广泛存在于动物、植物和微生物中。由于在抗肿瘤、抗病毒等方面的功效，蛋白酶抑制剂倍受关注，其生物活性测定方法的可靠性和可比性也愈显重要。现在比较常用的有Hiroshi 等[1]提出的测定方法，但该方法对不同浓度的同一抑制剂的活性测定误差较大。本研究采用了一种改进的测定苦瓜中提取的蛋白酶抑制剂活性的方法，并考察了该方法的稳定性、重复性和专属性，验证了其可行性。
1仪器与材料
1.1仪器
752紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；冷冻离心机（Beckman）；5415D离心机（Eppendorf）；粉碎机（Philips）；冷冻干燥机（Labconco）；透析袋（Green bird）。
1.2材料
苦瓜种子（四川德昌永华贸易有限公司）；胰蛋白酶（上海阿敏生物技术有限公司）；苯甲酰精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE，C15H22N4O3-HCl，上海三杰生物）；低分子量蛋白marker（上海升正生物技术有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，华美生物工程公司）。
2方法
2.1胰蛋白酶抑制剂提取
参考Nobuaki等[2]的提取方法。提取液在100 ℃沸水中水浴10 min之后，上清液中加硫酸铵至50%饱和度，沉淀2 h后离心去除沉淀；上清液中加硫酸铵至90 %饱和度，离心收集沉淀。将沉淀用蒸馏水透析（MWCO为1×103的透析袋），将透析液常温10 000 rpm/min离心10 min，上清冷冻干燥得干燥粉末。
2.2SDS-PAGE 检测苦瓜胰蛋白酶抑制剂
按照SDS-PAGE低分子量marker说明书，分离胶为12.5％，浓缩胶为5.5％。
2.3胰蛋白酶活性测定
测定方法参照中国药典2000年版二部734页。
取底物BAEE溶液（底物8.57 mg，溶于100 mL pH 7.6 0.067 mol/L的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲液。以水作空白，用该缓冲液调节A253nm在0.575～0.585之间）3.0 mL，加0.001 mol/L 的HCl 100μL，混匀后加入200μL酶液（0.020～0.030 mg/mL 胰蛋白酶），迅速混匀并立即计时，在A253nm，25℃±0.5℃条件下测定A值，以BAEE 3 mL + 0.001 mol/L盐酸300μL作空白对照，每30 s读取A253nm值，共读取5 min，A为纵坐标，时间为横坐标作图。每30 s改变值应在0.015～0.018之间，呈线性关系的时间不得少于3 min。在上述吸光度对时间的关系图中，取在直线上的度，按下列公式计算胰蛋白酶活性单位：
P=(A2-A1)/0.003TW
式中P为每1 mg供试品中胰蛋白酶的量（U/mg）；A1为直线上开始时的吸光度；A2为直线上终止时的吸光度；T为A1至A2读数的时间（min）；W为测定液中含供试品胰蛋白酶的量（mg）；0.003为在上述条件下，吸光度每min 改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位。
2.4抑制剂活性测定与方法学比较实验
方法同2.3，以BAEE3 mL + 0.001 mol/L HCl 200μL + 待测抑制剂溶液100μL 作空白，取BAEE 溶液3 mL与待测液100μL 混匀后，加入胰蛋白酶溶液200μL，立即计时，迅速混匀后在A253nm，25℃±0.5℃条件下测定A值，测定加入抑制剂之后的胰蛋白酶活性。取加入胰蛋白酶1 min 后A变化值比较平稳的读数范围计算酶活性。
用Hiroshi等的测定方法，具体步骤参照文献[3]，测定不同浓度的苦瓜胰蛋白酶抑制剂的活性，比较2种测定方法的优劣。
2.5稳定性试验
测定抑制剂溶液在室温下不同时间段的抑制活性。
2.6重复性试验
称取6份抑制剂样品，配制成相同浓度，在相同时间段内测定抑制活性。
2.7抑制剂专属性试验
选取BSA作为对照测定样品，按同样蛋白质量测定抑制剂活性。
3结果与讨论
3.1SDS-PAGE鉴定苦瓜胰蛋白酶抑制剂
如图1所示，苦瓜中所提取的胰蛋白酶抑制剂相对分子质量在1×103左右，与文献报道相一致[4]。
泳道1 为分离得到的胰蛋白酶抑制剂，泳道2 为低分子量marker
3.2胰蛋白酶活性
调整胰蛋白酶溶液浓度，使A253nm读数变化稳定在0.015～0.018之间，活性曲线如图2。测定所得胰蛋白酶活性单位为3 042 U/mg。
3.3苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性与方法学比较
将冷冻干燥得到的抑制剂样品配置成0.05 mg/mL和0.025 mg/mL2种浓度，用新测定方法分别测定抑制剂活性。
由表1结果可以看出，苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性很高，选取抑制率接近50％的数据为准，能达到1 153 U/mg，0.025 mg/mL和0.05 mg/mL 2个浓度测定得到的抑制剂活性RSD小于2%。
用Hiroshi等的测定方法测定1.3 mg/mL和0.65 mg/mL苦瓜胰蛋白酶抑制剂活性，数据如表2。
由表2数据可以看出，依Hiroshi等的测定方法，不同浓度的抑制剂活性RSD较大，达到了2.3 %。与Hiroshi等的方法用总反应速率来进行活性测定相比，本文提出的方法则是用反应过程中的瞬时反应速率进行测定，得到的抑制剂活性单位更为准确，RSD较小。
3.4抑制剂稳定性
以抑制剂浓度0.05 mg/mL进行稳定性试验，分别在0，2，5 h测定抑制剂的抑制活性。见表3
从表3数据可以看出，0～2 h内，抑制剂活性变化小于2%，不是很明显。故该抑制剂最好是在配制后2 h之内进行活性测定。
3.5测定方法学的重复性实验
称取6份抑制剂干燥粉末，配成相同浓度，分别测定抑制剂活性。
由表4结果可知，重复6次测定抑制剂活性的相对标准偏差为2.5％，相差不是很大。之所以造成误差的原因可能是由于称重的因素，可见该测定方法的重复性比较好。
3.6方法学专属性试验
称取BSA配置成0.05 mg/mL，测定其抑制剂活性，见图3。
从图3可以得出，BSA对本方法测定体系没有抑制活性，对采用本法进行胰蛋白酶抑制剂的活性测定没有干扰。
从以上结果可得出，本法测定胰蛋白酶抑制剂活性比Hiroshi等的测定方法更为准确，且在稳定性、重复性和专属性方面均比较理想，适合进行胰蛋白酶抑制剂活性测定。
参考文献
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【关键词】 钙蛋白酶抑制剂；脑外伤大鼠；神经保护；凋亡
脑外伤是一种由于间接或直接作用， 使脑部出现损伤的情况。比较常见的脑外伤有颅骨骨折、头皮裂伤、颅内血肿、脑震荡等[1]。受伤后伤者会出现不同程度的意识模糊、呕吐、头痛、运动障碍等情况。颅脑损伤后脑细胞常出现凋亡的情况， 这与继发性脑损伤的严重程度有密切关系。钙蛋白酶作为脑外伤继发性损伤中的重要组成因素之一， 通过激活caspase系统可能会对脑外伤继发性损伤具有一定的保护作用。现采用大鼠实验的方法进行研究。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选取56只2～3个月大的健康SD大鼠作为研究对象， 所有大鼠的重量为255～290g之间， 其中雌性大鼠20例， 雄性大鼠26例。将其随机分为观察组和对照组， 每组28例。
1. 2 方法 先给予所有大鼠注射250 mg/kg水合氯醛（10%）， 然后给予观察组28例大鼠的侧脑室注射10 μl钙蛋白酶抑制剂， 给予对照组28例大鼠的侧脑室注射10 μl生理盐水。按照不同的处死时间点将每组各分为四个小组， 每小组为7例：0.5 h组、6 h组、24 h组以及3 d组。次日， 利用自由落体撞击方式制造大鼠脑外伤（撞击的高度为1.6 m，重量为55 g）。在各处死点观察和记录大鼠神经功能的缺失症状。
1. 3 TUNEL检测法检测凋亡 使用多聚甲醛（4%）和生理盐水快速灌注大鼠， 然后将大鼠的整个脑组织取出， 并将软脑膜剥离完全。将取出的脑组织侵泡于多聚甲醛（4%）中约4 h， 然后再将其捞出侵泡于5℃的蔗糖溶液（30%）中约2 d时间[2]。将固定后的脑组织进行冰冻切片（厚20 μm）， 并在TUNEL试剂盒中进行苏木素染色。最后使用400倍的光镜观察并记录阳性细胞数。
1. 4 统计学方法 数据的统计分析使用SPSS11.5软件， 数据使用均数（ x-±s）表示， 并使用t检验， 以P
2 结果
TUNEL法检测结果显示两组大鼠的海马区存在不同数量的TUNEL染色阳性的凋亡细胞。观察组中， 0.5 h组为（54±2.9）个、6h组为（56±1.0）个、24h组为 （59±2.2）个、3d组为 （66±3.1）个；而对照组相中， 0.5h组为（ 66±2.4）个、6h组为（ 64±1.4）个、24h组为 （68±5.6）个、3d组为 （74±2.9）个。可见， 观察组的TUNEL阳性的凋亡细胞在不同的处死点均比对照组少， P
3 讨论
Calpain系统是一种比较复杂的蛋白降解体系， 其主要的作用对象是受体蛋白、蛋白激酶、细胞骨架蛋白。通过对其进行降解， 从而将细胞分解， 使其引起凋亡。因此， Calpain的活化成为细胞凋亡的主要途径。通过本次大鼠实验研究， 总结钙蛋白酶诱发细胞凋亡的可能原因有以下两点：①启动了Caspases介导的细胞凋亡；②Ca2+的释出起到诱导死亡受体配体表达的作用。研究中， 给予观察组脑损伤大鼠钙蛋白酶抑制剂治疗， 在大鼠脑外伤0.5 h能检测到大鼠的凋亡细胞， 且凋亡细胞的数量呈逐渐上升的趋势， 在第3 d时达到高峰， 这也与其他文献资料中的研究结果相一致。出现此种现象的原因可能是：使用钙蛋白酶抑制剂治疗大鼠属于一次性注射治疗， 在大鼠体内的作用有限， 因此， 能在短时间内检测到该药物对细胞凋亡的影响作用。为此， 推测3d后再进行TUNEL法检测， 由于药物在大鼠体内的代谢降解作用， 浓度越来越小， 可能难以抑制钙蛋白酶， 无法阻止细胞凋亡的进度。不过对于具体的有效时间目前仍需进一步实验研究。通过本次研究， 证明钙蛋白酶抑制剂对脑外伤后的大鼠具有一定的保护作用。从而能在一定程度上减少脑外伤后神经细胞继发性损伤， 这对于钙蛋白酶抑制剂用于治疗人类的脑外伤具有十分重要的意义。
参考文献
[1] 杨瑞，罗承良，孙玉霞，等.E64d对创伤性脑损伤小鼠神经细胞的保护作用.苏州大学学报（医学版）， 2011，31（2）：183-187.
【关键词】半胱氨酸蛋白酶抑制剂C;测定方法;临床应用
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2010)07-0044-02
血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C 又名胱抑素C)是目前发现的对组织蛋白酶B抑制作用最强的物质,其生物学功能主要是调节半胱氨酸蛋白酶活性。因其分子量小,能自由通过肾小球滤过膜,几乎完全被肾小管重吸收且不被分泌,能很好的替代肌酐而成为一种新的反映GFR的理想标志物。随着科学家对胱抑素C的深入研究,发现其不仅在肾脏疾病方面有临床价值,而且还揭示了它与肝脏疾病、糖尿病、肿瘤等具有一定的相关性。现就其在临床疾病中的研究进展概述如下。
1 血半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的结构和特性
1961年Clausen 于脑脊液中发现一种物质,因它与哺乳动物胱蛋白A 和胱蛋白B 的结构及活性相似,当时被称为胱蛋白C 。1985 年cystatin C 首次被报道可作为评估GFR 的指标,称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 。其最重要的生理功能是调节半胱氨酸蛋白酶活性[1]。
Cystatin C 是一种非糖基化的碱性蛋白质,由120 个氨基酸组成,相对分子质量是13.36×103 ,等电点为9.3,特点为位于羧基端附近有2 个二硫键。人的cystatin C基因片段位于20 号染色体上,其基因序列在大多数组织中能稳定表达。cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的一员。半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶家族中的组织蛋白酶(主要存在于溶酶体中) 和Ca2+激活蛋白酶家族中的Ca2+激活蛋白(主要存在于细胞质内) 。它们在细胞内肽类和蛋白质代谢特别是胶原代谢中起重要作用。
Cys C的测定方法很多,包括单向免疫扩散法、酶免疫测定法、时间分辨荧光免疫法、放射免疫法、乳胶颗粒增强免疫比浊法等。
2 CystatinC的临床应用
2.1 Cys C与肾移植:肾脏移植目前已成为治疗终末期肾病最有效的方法,因此肾脏移植手术后移植肾的功能监测成为临床工作之重点。2002年4月在德国马尔堡召开的国际专家会议上[3],与会专家一致认为,Cys C不受身高、性别、年龄、肌肉量的影响。王盛华等人的研究结果说明:健康人与非肾移植感染患者的Cys C浓度差异无统计学意义,故认为Cys C也不受感染因素影响。该研究还发现,Cys C在肾移植后诊断急性排斥反应时明显优于血清肌酐(serum creatinine,Scr),即Cys C比Scr提前(2.7±1.8)d升高;与排斥前比较,Cys C升高148.9%,远高于Scr的43.9%。Le Bricon等也曾报道,Cys C在排斥时比Scr升高得更早、更明显。
王盛华等人还发现,肾移植术后Scr缓慢下降,1周左右转阴(低于判断值122umol/L)而Cys C术后3d内迅速下降,尤以第1天为著,可达69.2%,第2天91%的患者即转为阴性(低于判断值1.79mg/L),也有报道肾移植术后Cys C可立即下降(293±1.7)%。Cys C的这一优势在诊断加速性排斥反应时得以发挥优势效果,而Scr虽有升高,但处于术后下降的背景中,不易观察;而Cys C可立即由阴性转为阳性,变化明显。
2.2 Cys C与肝脏疾病:Cys C与肝炎、肝硬化、肝癌: Cys C与肝脏疾病的关系少有报道。慢性肝病在发展成为肝硬化或肝癌的过程中,细胞外基质蛋白量的改变是一个非常显著的特征。肿瘤的生长和转移需要对周围基底膜和组织成分的降解。因此,细胞外基质合成与降解的失衡是肝硬化、肝纤维化,甚至肝癌发生的重要因素。有研究表明,基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制物(MMPs和TIMPs)是肝病中细胞外基质合成与降解的失衡原因之一。除MMP系统外,其它蛋白酶解系统也参与肝纤维化的形成,例如组织蛋白酶活性升高。国内有相关报道,Cys C在肝脏疾病患者中显著升高,且慢性肝炎、肝硬化和肝癌均有不同幅度的升高变化,推断Cys C与肝病的严重程度相关。
2.3 Cys C与糖尿病肾损害:糖尿病肾损害的主要病理改变为肾小球基底膜受损,而作为全部肾功能单位滤过率的总和,GFR是评价肾功能受损的一项好的指标,国内外很多研究都说明Cys C在评价肾损害比Scr要更为灵敏、特异。
尿微量清蛋白对早期糖尿病肾病诊断有重要价值,但最近一些临床研究发现,伴微量清蛋白尿的糖尿病患者仅有30%-45%,在10年内进展到临床糖尿病肾病。有人对23例仅尿mAlb一项为阳性,46例仅Cys C为阳性和其阳性而同时伴尿mAlb为阳性而未进行治疗的糖尿病患者进行跟踪调查测定,6个月内复查上述指标两次,结果发现前者有7例病人两次测定结果转为阴性,后者仅有2例两次测定结果恢复正常,证实单用尿mAlb诊断早期糖尿病肾病存在一定比例的假阳性,而Cys C的特异性较强,血清Cys C联合尿mAlb测定可提高糖尿病早期肾损害诊断的正确率[4]。2.4 Cys C与妊娠高血压综合征:妊娠高血压综合征(简称妊高征)一直是产科的疑难杂症之一。国内有研究显示,血清UA、Cr在中重度妊高征患者中较正常未孕者明显增高(P
2.5 Cys C与格林-巴利综合征(Guillain Barre syndrome, GBS):格林-巴利综合征(Guillain Barre syndrome, GBS)是以周围神经和神经根的脱髓鞘及小血管周围淋巴细胞及巨噬细胞的炎性反应为病理特点的自身免疫性疾病。在发展中国家发病率比较高,其病因和发病机制尚不明确。大量的实验证明,GBS患者脑脊液中存在蛋白质的异常表达,这为我们研究GBS提供了一个独特的窗口。目前,国内外已开始将蛋白质组学技术应用于研究GBS患者脑脊液,从总体水平找到一些与GBS相关联的蛋白质[6],但是这些蛋白与GBS的关系尚未完全明确。
有研究表明,Cystatin C可作为疼痛的脑脊液生物学标记物,持续的疼痛诱导神经系统Cystatin C的合成与释放]。然而,本实验GBS组中Cystatin C相对于对照组表达明显下调,可能与GBS的主要症状的瘫痪与麻痹影响有关。
2.6 Cys C与心血管动脉粥样硬化(AS):目前基础研究证明动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症过程,发病机制涉及细胞外基质降解与血管壁重构。
有关专家应用免疫染色法与免疫杂交法发现动脉粥样斑块中cystatin C含量较正常血管减少,而组织蛋白酶S及K却过度表达,认为cystatin C的缺失以及蛋白水解酶与其抑制剂的失平衡可能是AS的发病机制之一。Sukhova等对ApoE-1-小鼠的实验研究结果也直接证明AS形成时cystatin蛋白酶/蛋白酶抑制剂失衡。经研究发现CHD患者血清cystatinC浓度明显低于对照组,表明了CHD患者存在低cystatin C血症,这一结果支持cystatin C的缺失可能是AS的发病机制之一的结论,表明cystatin C对CHD患者可能有一定的保护作用。
3 Cys C的临床应用展望
Cystatin C在体内产生速率稳定,影响因素极少, ,测定Cys C对疾病指导诊断及治疗,具有重大的临床意义Cys C在临床上的应用已经不再局限于评价GFR了,它在很多疾病中的关联也越来越明显了。虽然目前的研究结果中还存在着很多的推测,但是随着分子诊断学的发展,很多的难题定会得到解决。同时它将会广泛应用于临床其他指标的评价,其在疾病的发生、发展中势必会发挥越来越大的作用。
参考文献
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【关键词】基质金属蛋白酶-1；组织金属蛋白酶抑制剂-1；诊断；治疗
细胞外基质（ECM）是由细胞合成并分泌到胞膜外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要由胶原、糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白等组成。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组由Zn2+依赖性的高度保守的内肽酶组成的酶家族，对细胞外基质具有特异性的降解作用，几乎能够降解细胞外基质的所有成分[1]。现将基质金属蛋白酶-1和组织金属蛋白酶抑制剂-1的研究进展总结如下。1基质金属蛋白酶-1（MMP-1）
1.1MMP-1的合成及结构MMP-1是最早被纯化的脊椎动物胶原酶。MMP-1主要由结蹄组织细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等多种细胞合成[2]，以无活性的酶原形式分泌到细胞外基质中。羧基端结构域也叫血红素样结构域，是大约含有210个氨基酸残基的血红素结合蛋白样的结构域，此结构域包含4个半胱氨酸残基的重复序列，决定底物的特异性。
1.2MMP-1的生物学功能MMP-1是胶原酶亚家族的成员之一。细胞基质中无活性的MMP-1可在蛋白水解酶和氧化性谷胱甘肽、4-氨基苯基乙酸乙酯、氯化汞等体外化学剂的作用下被激活[3]。MMP-1还可以通过分解作用释放细胞外基质中贮存的生物活性分子，如MMP-1可以分解基膜蛋白多糖，释放出与其结合的成纤维细胞生长因子。MMP-1还可裂解细胞表面分子和其他非基质分子，其中包括L-选择蛋白、IL-Iβ、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、胰岛素生长因子结合蛋白、肿瘤坏死因子和基质细胞衍生因子等发挥作用。
1.2.1MMP-1与恶性肿瘤的关系已证实[4]，MMP-1的表达异常与多种疾病密切相关，如恶性肿瘤（胃癌、食管癌、舌癌等）、心脑血管病变、关节炎、椎间盘突出等，涉及机体的多个系统。在恶性肿瘤的浸润和转移过程中，MMP-1通过降解细胞外基质，促进癌细胞的浸润和转移[1]。在心脑血管病变中，MMP-1与动脉粥样硬化和血栓也有密切的联系。通过免疫组化法对心肌梗死、不稳定型心绞痛组和稳定型心绞痛三组病例的尸体解剖发现，MMP-1的表达在破裂的动脉粥样硬化斑块中明显高于未破裂的斑块。
1.2.2MMP-1与骨性关节炎的关系研究表明，骨性关节炎的发生与发展，与软骨基质的破坏紧密相连，MMP-1可降解软骨基质中最具特征、含量最多的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，导致软骨基质中胶原纤维的“网状拱形结构”破坏，使软骨失去正常的弹性及变形能力[4]。此外，MMP-1还与疤痕组织的过度增生、椎间盘突出、肠粘连、功能性子宫出血、子宫内膜异位症等多种疾病密切相关。
1.3MMP-1的活性调节MMP-1在正常组织中检测含量极低，主要参与胚胎发育、血管再生、凋亡、排卵、神经发育等生理过程。MMP-1的表达调节同其它MMPs分子相似[3]，主要在受控于基因转录水平、酶原的激活、以及组织金属蛋白酶抑制剂。通过上述三种调节基质共同作用，使机体组织内MMP-1的水平和TIMP-1之间保持相对平衡的状态，共同参与细胞外基质的更新降解、重塑过程。2组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）
2.1TIMP-1的合成及结构TIMP-1为相对分子质量为28000的N-乙酰糖基化可溶性分泌蛋白，其基因座位于人第10号染色体短臂Xp11.23-Xp11.4，在肿瘤组织与间质细胞中均可表达。TIMP-1有两个结构域构成：N-端结构域和C端结构域。每个结构域中包含三个保守的二硫键，N端结构域可折叠为一个独立单位，与MMP-1的Zn2+活性部位结合；C端结构域可与MMP-1的其他部位结合，形成1：1的复合物[5]。
2.2TIMP-1的生物学功能TIMP-1具有多种生物学功能，首先，TIMP-1能抑制绝大多数MMPs，但主要与MMP-1、3、9结合，TIMP-1作为MMP-1的内源性抑制剂，起到负性调节MMP-1的作用，在恶性肿瘤、心脑血管病变、肝硬化等疾病中发挥着重要作用[6]。MP-1、TIMP-1水平的不平衡，更能促进舌癌发生浸润、转移。在心脑血管病变中，TIMP-1和MMP-1的表达变化，对各类心脏疾病的发生、发展至关重要。在各种心脏疾病的各个阶段TIMP-1/2/3/4都很重要[7-8]。TIMP-1对于心肌重构有很重大的意义。此外，TIMP-1在晚期疤痕重塑、肝纤维化、盆腔器官脱垂的发生发展过程中，也起着至关重要的作用。3展望
MMP-1、TIMP-1广泛参机体的生理及病理过程，在恶性肿瘤、心脑血管病变、骨性关节炎、肝纤维化等病理过程中有特殊的临床意义，涉及到机体中的多个系统。TIMP作为MMP的抑制剂，仅可抑制肿瘤细胞的生长，而无杀伤作用，只能用于部分早期肿瘤患者的辅助治疗，且目前人工合成的TIMP特异性差、毒副反应较大，临床应用受到一定限制。
随着对MMP、TIMP作用机制的不断研究，将有助于开发特异性更好的TIMP，为疾病的治疗提供新策略。
参考文献
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【关键词】 糖尿病；高血压；肾病；血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C
随着人类生存环境及生活模式的改变，高血压、糖尿病、肿瘤等疾病的发生率不断上升，且可能伴发各种并发症，如肾功能损害。因此，糖尿病肾病及高血压肾病为临床常见病，目前临床用于诊断肾功能损害的方法有Cys C、BUN、Scr检测等实验室检查方法，其中Cys C检测是近些年迅速发展的用于诊断肾功能损害的重要诊断手段[1]。本文通过对我院糖尿病肾病患者、高血压早期肾病患者进行Cys C的检测，并以本院健康体检者体内Cys C水平为对照，探讨研究Cys C的诊断价值。具体叙述如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2012年3月——2013年1月于我院就诊的糖尿病肾病患者39例，作为糖尿病组，其中男21例，女18例，年龄22-63岁，平均（43.8±11.2）岁，纳入标准符合WHO糖尿病诊断标准。选取同期在我院就诊的早期高血压肾病患者41例，作为高血压组，其中男19例，女22例，年龄22-63岁，平均（43.8±11.2）岁，纳入标准符合WHO高血压诊断标准。对照组为52例健康体检合格者。三组入选者在年龄、性别方面无显著差异。所有入选者均无原发性肾病及慢性肾脏疾病，无其他基础性疾病。
1.2 方法 所有入选者同时检测Cys C、Scr、BUN。早晨空腹抽取血样，室温条件下静置30min，离心5min（3000r/min），取上层血清，要求4h内测定完毕。收集24h尿液，准确测量尿量，取5ml测定尿液中cr含量。
仪器设备为迈瑞全自动生化仪（BS-400），试剂为广州科方生物技术有限公司生产。Cys C、检测采用的是免疫比浊法，BUN的测定方法为脲酶UV法，Scr的测定方法为氧化酶法。根据体表面积标准化法计算Ccr。
1.3 统计学处理 使用SPSS18.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，数据用t检验，组间对比用X2检验，P
2 结果
关键词：尿胰蛋白酶抑制剂（UTI）；肝癌细胞HepG2；增殖；迁移
Effects of urinary trypsin inhibitor （UTI） on the migration and invasion of HEPG2 hepatocellular carcinoma cells in vitro.
Yang Chaowen Luo Jiaxing Luo Weimin
Abstract：Objective： To investigate effects of urinary trypsin inhibitor （UTI） on the proliferation and migration of HepG2 hepatocellular carcinoma cells in vitro. Methods：Effects of UTI on HepG2 cells proliferation was evaluated by MTT assaya； Effect on HepG2 cells migration by UTI was evaluated by Transwell assay. Results：The UTI do not effect the proliferation of HEPG2 cells （P>0.05）. UTI suppress the migration of HepG2 cells dose-dependantly（P
Key words： Urinary trypsin inhibitor （UTI）； Liver hepatocellular carcinoma HepG2 cells； Proliferation； Migration
【中图分类号】Q51 【文献标识码】A 【文章编号】1674-7526（2012）12-0128-02
UTI是从尿液中提取的一种Ⅱ型Kunitz第二结构域的蛋白多糖，对丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）、透明质酸酶和纤溶酶等多种酶具有抑制作用[1]，属于蛋白酶抑制剂，临床上常用于急慢性胰腺炎的治疗。然而近年国内外研究表明，UTI还能抑制多种肿瘤的转移，如卵巢癌、结肠癌、恶性间皮细胞瘤等，但其对肝癌细胞生物学的影响文献报道较少。目前认为抑制肝癌的转移已成为进一步提高肝癌术后生存率和治愈率的难点，在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞的增殖和迁移能力尤为重要。因此，本研究通过体外细胞实验研究UTI对HepG2细胞的增殖、迁移的影响，初步探索UTI用于肝癌细胞活性的影响，为下一步研究内在机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂：人肝癌细胞株HEPG2由南华大学医学院病理实验室保存；UTI（批号021004042）购自广东天普生化医药股份有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；高糖DMEM培养液购自美国Invitrogen公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司； Matrigel胶购自美国BD公司；PT-PCR试剂盒购自碧云天公司；Transwell小室购自美国Corning公司，膜孔径8μm；UPA多克隆单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。
1.2 细胞培养与UTI配置：HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃及5%CO 的湿化培养箱中。4-5d传代一次。UTI用培养液配成浓度为10000U/ml的储存液，过滤除菌，-20℃保存，使用时稀释至所需浓度。
1.3 细胞增殖实验：取对数生长期的HepG2细胞按1×104个/孔的密度接种于96孔培养板中。24h后，更换含不同浓度UTI的培养液（600、900、1500U/ml），每组设3个复孔；对照组为空白对照组。培养板继续培养24、48、72h，每天更换相应浓度UTI培养液，以保证浓度相对恒定。移除培养液后，每孔分别加入20μlMTT，37℃孵育4h。弃去MTT溶液后加入100μl二甲基亚砜，晃动10min。酶标仪测定490nm波长处每孔的吸光度（A）值。按公式计算增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（对照组A值-处理组A值）/对照组A值×100%。实验重复3次。
1.4 细胞迁移实验：取对数生长期HepG2细胞，消化后制成含无血清DMEM培养基的细胞悬液，调整细胞浓度为1×10 5/ml。在Transwell的上室中加入每孔150μl的细胞，加入含不同浓度UTI的培养液（600、900、1500U/ml），每组设3个复孔，对照组为空白对照组。在对应Transwell下室中加入600μl含20%FBS的DMEM培养基，37℃培养12h后取出Transwell小室，PBS轻轻冲洗2次，用棉签小心擦净小室底部微孔滤膜上层的细胞，然后将小室置于4%甲醇中固定10min，取出小室后结晶紫染色10min，PBS冲洗2次，于显微镜下观察滤膜下层的细胞。计算方法为200倍光学显微镜下随机计数5个视野的细胞，取平均值。
1.5 图像处理：利用HPIAS21000高清晰度彩色病理图像分析系统（南华大学医学院医研中心）分析细胞迁移图片，200倍光镜下随机选择5个视野拍照计数。
1.6 统计学处理：统计软件为SPSS 13.0。One Way-ANOVA方差分析比较多组间的差异，两组间则利用t检验；P
2 结果
2.1 UTI对HepG2细胞增殖无影响：试验结果显示，不同浓度UTI处理组分别在24、48、72小时的时间段，对HepG2细胞增殖的影响，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表1 UTI对SK-HEP-1细胞增殖的影响（A490，）
注：对照组与各实验组比较，P>0.05
2.2 UTI显著抑制HepG2细胞迁移：HepG2细胞经过UTI处理12h后行transwell迁移试验，与对照组（403.17±27.05）个相比，600U/ml组穿过滤膜的细胞数为（298.83±20.9）个，900U/ml组为（153.5±18.9）个，1500U/ml组为（127±15.17）个。结果表明，与对照组相比，UTI各剂量组均能显著抑制HEPG2细胞的迁移且呈剂量效应关系，差异有统计学意义（P
3 讨论
原发性肝癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，其对放化疗不敏感，病人5年生存率较低。目前临床上对于肝癌的切除率己有很大提高，但术后5年转移复发率仍然高达60%以上，因此，转移复发是影响肝癌远期疗效的主要原因。
UTI是从人体尿液中提取的一种Ⅱ型Kunitz第二结构域的蛋白多糖，是一种对酸对热较稳定的丝氨酸蛋白酶抑制物，具有抑制糖、多种蛋白酶和脂类水解酶的活性，稳定溶酶体酶，抑制炎性细胞因子的过度释放，防止缺血-再灌注损伤的作用。近年来，国外学者研究发现，UTI可抑制肿瘤的侵袭和转移[2，3，4]，但其对肝癌细胞的影响文献报道较少。本研究通过细胞迁移实验，证实UTI能在体外明显降低肝癌细胞的迁移能力，而对肝癌细胞的增殖无影响，这与在其他肿瘤中的发现是相符的[3，4]。过去认为肿瘤细胞表面存在UTI（UTI receptor，UTIR）受体，UTI与UTIR结合，改变细胞表面的环境、调节血浆酶的活性来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。后来进一步的研究发现，UTI不能抑制肿瘤细胞的增殖，其抑制肿瘤的侵袭和转移也不是与UTI受体结合产生的结果，而可能是通过抑制与肿瘤细胞表面受体相关的纤溶酶系统而发挥作用。Kobayashi等[9]对卵巢癌的研究中发现UTI的N-末端是UTI与肿瘤细胞结合的位点，其C-末端则是抑制肿瘤转移的部位。然而，UTI抑制肿瘤细胞迁徙和转移的机制及UTI作用的靶点却仍不明确。
综上所述，本研究发现UTI能在体外显著抑制人肝癌细胞HEPG2的迁移能力，推测UTI对其UPA的mRNA及蛋白质表达抑制可能是其潜在机制。到目前为止，国内尚未见关于UTI抑制肝癌肿瘤侵袭和转移机制研究的报导，在体外实验中证实了UTI对肝癌细胞迁移能力的抑制作用。本研究为针对肝癌转移的治疗提供了新的思路，为下一步研究UTI影响肝癌细胞转移的内在机制奠定了实验基础。
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P851-862
【摘要】目的 探讨急诊抢救室脓毒症（sepsis）、全身炎症反应总综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）与非SIRS患者半胱氨酸蛋白酶抑制剂C (cystainC, Cys-C)阳性检出率的差异； Cys-C与APACHE（acute physiology and chronic health evaluation）Ⅱ评分的相关性及对于死亡预后的意义。方法 选取2008年10月到2009年10月在北京朝阳医院急诊抢救室救治的患者250例，排除存活不足24 h者。将所有入选病例分为3组：非SIRS组（n=74）、SIRS组（n=121）及脓毒症组（n=55），检测3组病例的Cys-C水平并评估APACHEⅡ评分，计算Cys-C＞830 ng/ml的检出率并进行比较。统计3组病例的28d病死率，研究Cys-C、APACHE Ⅱ评分对于3组病例28d病死率的预测价值。结果 Cys-C的阳性检出率在脓毒症组与非SIRS组之间差异有统计学意义（41.38% vs. 13.57%，P=0.007），SIRS组与非SIRS组之间比较，差异具有统计学意义（32.79% vs. 13.57%, P=0.005），但在脓毒症组与SIRS组之间差异无统计学意义（41.38% vs. 32.79%, P=0.346）。脓毒症组、SIRS组患者28d病死率与非SIRS组比较,差异具有统计学意义（41.6% vs. 17.2%, P＜0.01；36.91% vs. 17.2%, P＜0.05）。脓毒症组患者Cys-C与APACHE Ⅱ评分有良好正相关（P＜0.0001）。Cys-C与APACHE Ⅱ评分是脓毒症组28d死亡的独立预测因素。结论 SIRS患者和脓毒症患者Cys-C阳性率较非SIRS患者明显升高，并且脓毒症患者Cys-C是预后不良的指标。
【关键词】半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；APACHE Ⅱ评分；全身炎症反应综合征；脓毒症;病死率
The positive detection rate of cystatin C in patients with sepsis and its prognostic significance WANG Jun-yu,LI Chun-sheng. Emergency Department, Beijing Chaoyang Hospital of the Capital Medical University，Beijing 100020，China
Corresponding author：LI Chun-sheng，Email：