骨架蛋白肌联蛋白、伴肌动蛋白、纽蛋白的降解对冷却猪肉持水性的影响

摘 要：肉的持水性可用许多指标衡量，而汁液流失率（drip loss）是其中一个重要指标。持水性受很多因素影响，但目前对形成汁液流失的机理的认识还很有限。本文综述了近几年来国内外学者对持水性的研究，主要分析了宰后骨架蛋白（肌联蛋白、伴肌动蛋白、纽蛋白）的降解及钙激活蛋白酶系统降解骨架蛋白对持水性的影响，以期为宰后猪肉持水性提高和肉品质改善提供参考。

关键词：持水性；汁液流失；骨架蛋白；降解

Effect of Postmortem Degradation of Cytoskeleta Proteins： Titin， Nebulin and Vinculin on Water-Holding

Capacity of Chilled Pork

QI Si-ka-na，ZHENG Wei，CHEN Tao，ZHANG Dong-yi

（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract：Drip loss is an important measure of the water-holding capacity of raw meat， which is affected by many factors. However， there is only limited knowledge about the formation mechanism of its drip loss. This article reviews recent Chinese and foreign studies on the water-holding capacity of raw meat. This review highlights the postmortem degradation of cytoskeleta proteins： titin， nebulin and vinculin and the water-holding capacity of raw meat as a function of calpain activities， aiming at providing references for improving the postmortem water-holding capacity and quality of chilled pork.

Key words：water-holding capacity；drip loss；cytoskeletal protein；degradation

中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）03-0042-04

肉的质量指标主要包括颜色、滋味、质地、性和气味等，它能直观反映出肉的品质。动物屠宰后肌肉保持自身水分的能力被称之为持水性（WHC）。持水性与冷却肉的感官品质和肉类企业的经济效益密切相关，是冷却肉最重要的品质之一。有许多指标可用来衡量持水性，但汁液流失率（drip loss）和贮藏损失（purge loss）用的最多，其范围一般在0.1%～10%之间。

我国因人口众多，肉类产量已连续15年稳居世界第一位，2011年全国肉类总产量已达7957万t，其中猪肉占5053万t。冷却肉是指对严格执行检验检疫制度屠宰后技术获得的可食用胴体进行迅速冷却处理，使胴体温度在24h内降至0～4℃，并在后续加工、流通和销售过程中温度保持在0～4℃范围内的鲜肉。冷却有安全系数高、营养价值高、感官舒适性高等优点，是我国肉类行业技术发展的重点之一[1]。20世纪80年代，我国开始了对冷却肉的研究与生产，但由于经济、技术等方面的原因，发展相对滞后。近年来，虽然我国的肉品工业得到了长足的发展，但始终使肉品销售者头疼的是，冷却肉普遍存在货架期短（仅3～5d）、表面易褐变，汁液流失严重、肉品持水性低，性差等问题[2]。由于冷却肉的持水性差，在加工、运输和销售过程中将产生大量的汁液流失，不但使产品重量减少，影响肉的外观、嫩度，给生产企业带来重大经济损失，同时大量的蛋白质流失还降低了肉的营养价值。肉在分割、储藏过程汁液流失率范围可达2%～10%之间[3]，据初步调查，目前我国冷却肉的汁液流失率为3.0～5.0%，平均比发达国家高出1.5%以上，每年因汁液流失造成的肉类重量损失折合人民币达数亿元。因此，如何将汁液流失率控制在最低限度以内是全球肉类研究者共同的目标。

1 肌肉中蛋白概述

1.1 肌肉中的水分和蛋白质

肌肉中的水分含量大约是75%，他们主要存在于肌原纤维中、肌原纤维间、肌原纤维与细胞膜间，细胞间和肌束间的空隙中[4]。水是两性分子，与蛋白质分子中的电荷相互吸引而结合在蛋白质分子上的称为结合水，占肌肉水分的很小比例；受空间效应的影响存在于肌肉中，但不与蛋白质结合的部分叫不易流动水；能在肌肉中自由流动，存在于肌细胞外间隙的水称为自由水。宰后，结合水基本不变；僵直成熟过程中，不易流动水受显著影响；肌肉转变成肉的过程中，受影响最大的是不易流动水。

肌纤维是骨骼肌的基本构成单位，主要由肌纤维膜、细胞核、肌浆以及大量的肌原纤维组成，其中肌浆约占肌细胞的30%，肌原纤维约占肌纤维的70%。肌原纤维由20%的蛋白质和80%的水组成，并且占有瘦肉中约80%的细胞空间[5]。肌肉中大量的水分与蛋白质的极性基团结合形成水合离子而储留在蛋白质的空间结构中，这是肌肉持水性的原因[6]。有报道指出，肌原纤维蛋白质的变性程度和持水性降低密切相关[7]。Greaser等[8]提出，猪刚屠宰时的肉的pH值接近7，约1h后开始下降，经僵直过程后，最低pH值于5.4～5.6之间，而后随着僵直解除及成熟时间的延长，pH值缓慢上升，肌纤维收缩减轻，持水力上升。同时另有报道指出，蛋白质的降解和肉的持水性也有关系[9]。

1.2 骨架蛋白概念及分类

骨架蛋白指的是把肌原纤维和细胞膜连接在一起，对肌肉收缩起到调节和稳定作用，以维持细胞结构的蛋白质。骨骼肌细胞骨架按位置不同可分为肌小节内骨架、肌小节外骨架和肌细胞膜骨架[10]。细胞骨架蛋白以细丝状存在，与粗丝和细丝平行排列，也叫间隙纤丝（gap filaments）。他们存在于肌原纤维的间隙，可以起到连接肌节的作用，当肌肉高度收缩时用电子显微镜能够观察到这种纤丝的桥梁作用[11]。肌小节外骨架主要由中等纤维（intermediate filaments）组成，它位于肌原纤维周围，连接于Z盘、核膜和肌细胞膜之间，包括肌间线蛋白（desmin）、巢蛋白（nestin）、核纤层蛋白（lamins）、波形纤维蛋白（vimentins）以及细胞角蛋白（cytokeratins）。其中，主要的肌肉特异性的中等纤维是肌间线蛋白。连接蛋白和伴肌动蛋白是肌小节内的主要骨架蛋白，肌细胞膜骨架蛋白包括跨膜的和与膜相连的蛋白，如纽蛋白（vinculin）、连接蛋白（intergrins）、膜收缩蛋白（spectrin）、抗肌萎缩蛋白（dystrophin），这些蛋白将肌细胞内的肌原纤维和胞外的基质间接联结起来，而其中的纽蛋白和连接蛋白与细胞肌膜中的核纤层蛋白有联结，在细胞内与微丝相联结，对细胞彼此间的附着具有重要作用。

2 骨架蛋白变化与持水性关系

2.1 汁液流失形成机理

国外在20世纪60年代开始研究冷却肉汁液流失形成的机理，人们认为，猪宰后僵直期间，由于pH值和钙离子的诱导使得肌原纤维收缩，使肌纤维内水分外流形成汁液流失[12-13]，新鲜猪肉的汁液流失率与僵直收缩程度、细胞膜渗透压等因素相关，研究发现，肌肉骨架蛋白质的变化和肉的持水性也有关系。

1995年，Huff-Lonergan等[9，14]研究表明宰后肌肉的蛋白质降解通常伴随着嫩度变化，也可能伴随着汁液流失。实验表明连接肌原纤维与细胞膜的蛋白（如肌间线蛋白）降解时，这些蛋白的收缩会导致肌原纤维网格结构收缩，最终导致整个肌细胞收缩，形成汁液流失通道，从而增加汁液流失[15]。因此蛋白质降解强度增大可能会阻碍肌原纤维收缩，从而减少汁液流失；Kristensen等[15]认为持水性的增加是由于骨架蛋白质的降解使肌细胞横向膨胀的结果；2004年Lawson[16]研究表明汁液流失通道形成于肌细胞膜和肌纤维分开的位置，此通道的形成是由于钙蛋白酶降解了肌动骨架蛋白和细胞膜之间的连接蛋白（intergrin）。但Sch?fer等[17]在研究宰后3～24h骨架蛋白变化与持水性关系时发现，肌肉骨架蛋白的降解与汁液流失无关。

可见，宰后肌肉蛋白质的降解和汁液流失的关系至今尚未搞清楚，对冷却肉汁液流失形成机理认识还十分有限。开展宰后肌肉蛋白质变化与冷却肉持水性的关系研究，有助于揭示冷却肉的汁液流失形成机理。

由于各骨架蛋白在肌肉中所处位置不同，起到的连接作用不同，对宰后肌肉持水性的影响也不尽相同，如肌联蛋白（titin）、伴肌动蛋白（nebulin）和纽蛋白（vinculin）。

2.2 肌联蛋白和伴肌动蛋白的降解对持水性的影响

肌联蛋白是横纹肌中的弹性蛋白，约占肌原纤维蛋白质量的10%[18]，可能是细胞骨架蛋白的主要蛋白，也是目前所发现的最大的单链蛋白，其分子质量约为3000kD[19]，一个肌连蛋白分子可从Z盘到M线，长达1μm。肌连蛋白有两个主要作用：（1）通过连接各种蛋白质，控制肌节的各成分组成；（2）将粗肌丝与Z-线连接，以维持肌原纤维的完整性和稳定性，保持舒张肌肉的静息张力，使粗肌丝处于肌小节的中央位置，是受牵拉的肌肉可恢复初始状态和保证肌肉收缩的张力输出。在肉的成熟过程中，由于内源性酶的作用，肌连蛋白很易发生水解，这些内原酶包括钙激活酶（calpain）和羧基蛋白酶（carboxyprotease）[20]。

伴肌动蛋白（nebulin）的分子质量约为800kD[21]，其在肌原纤维蛋白中的含量约为5%[22]。当肌肉处于松弛状态时，伴肌动蛋白起源于Z盘，延伸至I带，连接于Z盘与Z盘之间，平行于A带中的肌动蛋白（actin），其主要作用是保持肌动蛋白的正常结构。此外伴肌动蛋白可以附着在间隙纤丝的连接蛋白上，在肌原纤维中起到结构和调节作用。

研究表明，每半个肌节中都有6个肌联蛋白和伴肌动蛋白，它们源于M线，螺旋缠绕于A纤丝，延伸至邻近Z线[22]。这两种蛋白在在宰后发生降解，他们的降解作用累加在一起可能会促使肌原纤维小片化，而肌原纤维小片化指数升高可能会导致肉嫩度的提高。Wang等[23]报道，宰后早期，肌联蛋白蛋白是成对存在的，即T1（未降解的肌联蛋白）与T2（肌联蛋白的大分子降解产物）。Huff-Lonergan等[24]经SDS-PAGE电泳对肌联蛋白和伴肌动蛋白蛋白研究知，宰后0～3d，T1与T2成对清晰可见，宰后3天T1降解，T2比T1更为清洗可见，并有分子质量1200kD的多肽降解物产生，且无完整的伴肌动蛋白条带。Rees等[25]发现宰后电刺激引起汁液流失增加的同时，SDS-PAGE电泳显示肌连蛋白的降解程度增加。2011年，Farouk等[26]报道，牛宰后21d内汁液流失增加，而随着储藏时间的延长汁液流失下降，同时，SDS-PAGE电泳显示，宰后21d起，有大量肌连及伴肌动蛋白降解产物生成。

2.3 纽蛋白的降解对持水性的影响

纽蛋白也是细胞骨架蛋白，其作用是连接肌动蛋白和细胞膜，呈弓肋状排列，位于Z线处，分子质量约为126kD[21]。2001年Kristensen等[15]经对猪骨架蛋白的Western Blot分析发现，宰后1d纽蛋白、踝蛋白（talin，225kD）开始降解，肌间线蛋白（55kD）未见降解，第4天踝蛋白降解了68%，而肌间线蛋白、纽蛋白只有轻微降解，到宰后10d，肌间线蛋白和纽蛋白降解了71%和63%；同时观察到宰后1d水分损失为3.9%，宰后3d升至11.9%（即持水性下降），7d后持水性增加，10d后持水性回升至4.5%。同时，他发现纽蛋白和肌间线蛋白、踝蛋白在宰后成熟过程中被水解，细胞骨架的破坏使得骨骼肌膜结构遭到破坏，将水向细胞外推斥的作用力不复存在，从而提高了肌肉的持水能力。

3 影响骨架蛋白降解的钙蛋白酶系统

钙蛋白酶是细胞内依钙中性半胱氨基酸巯基内肽酶，是由钙调蛋白和木瓜蛋白酶以非共价键结合成的嵌合体，主要分布在肌原纤维的Z盘附近。根据该蛋白酶表现最高活性所需的Ca2+浓度不同可将其分为μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶两种，二者均具有水解肌原纤维蛋白的活性。Koomaraie[27]发现在有Ca2+存在的情况下，钙蛋白酶会开始自溶，降低了满足其最大活性的Ca2+需要量，使其被激活。钙蛋白酶自溶时所需的Ca2+浓度与其表现蛋白质水解酶活性所需的Ca2+浓度很相近，且自溶的钙蛋白酶疏水性更强，与肌原纤维结合更牢固，因此钙蛋白酶自溶体的出现被认为是钙蛋白酶被激活的表现。Suzuki等[28]发现钙蛋白表达量的减少会导致肌肉蛋白的水解。宰后活体的Ca2+浓度只能激活μ-钙蛋白酶而不能激活m-钙蛋白酶，因此，μ-钙蛋白酶被认为是降解肌原纤维的主要作用酶。许多与嫩度和汁液流失相关的蛋白质都是μ-钙蛋白酶的底物，如肌联蛋白、伴肌动蛋白、纽蛋白、结蛋白（desmin）、肌源蛋白T（troponin-T）等，但不降解α-肌动蛋白（α-actin）、肌球蛋白（myosin）等。因此推测，钙蛋白酶可能是通过对肌原纤维蛋白进行特异的局部降解从而实现对肌原纤维蛋白结构和功能的调控的。据推测钙蛋白酶所诱导的肌肉降解分为两步：首先，攻击肌原纤维的肌节部位（两相邻Z盘之间的一段肌原纤维），释放肌丝使其降解为小片段，然后被溶酶体捕获而进一步降解[29]，破坏了肌原纤维的有序性和完整性，从而改善肌肉的持水性。

2005年，Lawson[30]提出了一个新的有关汁液流失形成的机理，他认为宰后早期，动物屠体进入尸僵状态，肌原纤维收缩使得肌原纤维间的水分流出。如果尸僵前钙蛋白酶被激活且降解连接蛋白（intergrin），在肌纤维收缩时，细胞膜就会与肌原纤维分离而形成汁液流失通道。如果在尸僵前抑制钙蛋白酶活性，阻止了连接蛋白的降解，从肌原纤维间流出的水分就会进入肌纤维周围的结缔组织间，由于结缔组织具有很好的持水力，水分不会外流，从而降低汁液流失，即钙蛋白酶活性越高，汁液流失率越高。

4 结 语

影响猪肉持水性的因素很多，但归结到肌肉的生理和生化水平上，蛋白质的变化对持水性的影响尤为重要，特别近年来的一些研究发现宰后肌肉骨架蛋白的降解使得肌原纤维网格结构收缩时会导致在细胞间和肌束间形成汁液流失通道。但是，由于各个骨架蛋白在细胞内所处的位置及功能的不同，其与持水性呈现出的相关性也不同。甚至还有研究报道骨架蛋白的降解与持水性关系不紧密，因此，骨架蛋白降解与持水性的关系还有待进一步研究。

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