时间：2023-03-10 08:15:42
[关键词] 蛋白酶体抑制剂；泛素-蛋白酶体通路；肺癌；作用机制
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（b）-0038-04
[Abstract] The ubiquitin-proteasome pathway is the principle pathway for intracellular protein degradation. Research shows that ubiquitin-proteasome pathway plays a significant role in the genesis and progression of malignancy by regulating many processes of cellular biology. Proteasome inhibitors targeting the ubiquitin-proteasome pathway can inhibit tumorous cellular growth， becoming a novel class of potent and effective antitumor agents. Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths globally. The study about the effect of proteasome inhibitors on lung cancer is ongoing. The mechanisms are complicated， relating to the down-regulation of NF-κB， cell cycle control， PTEN/PI3K/AKT pathway， the regulation of P53 and others. The recent advances about proteasome inhibitors in the treatment of lung cancer is going to be reviewed in this paper.
[Key words] Proteasome inhibitor； Ubiquitin-proteasome pathway； Lung cancer； Mechanism
泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是生物体内蛋白质降解的重要通路，此通路选择性降解细胞内受损及错误折叠的蛋白质，并对各种短寿命的功能蛋白具有快速降解作用。80%～90%的细胞内蛋白均通过此途径降解，其中包括细胞周期调控因子、基因转录因子、癌基因蛋白等[1]。UPP通过对上述蛋白的降解，调节细胞增殖、分化、存活和凋亡，在人体诸多生理过程中发挥重要作用，如信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡调节、转录调控等，对维持细胞的稳态具有十分重要的意义，其功能的改变和异常能直接导致或诱发人类的许多重要疾病[2]。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性而阻断UPP，具有抑制多种肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用，目前已成为抗肿瘤治疗的研究新热点。本文就UPP、蛋白酶体抑制剂在肺癌治疗中的进展综述如下：
1 泛素-蛋白酶体通路的组成
UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、26S蛋白酶体、去泛素化酶等组成。此途径的核心是26S蛋白酶体，它是一个多催化复合物，由20S核心蛋白酶和两端各一的19S调节亚基组成。20S核心蛋白酶是蛋白酶体复合物的水解核心，具有胰蛋白酶、糜蛋白酶和胱天蛋白酶活性。UPP在降解靶蛋白时，首先要实现靶蛋白的泛素化，即若干泛素经E1、E2、E3的作用与靶蛋白相连[3]。只有泛素化的靶蛋白方可被19S调节亚基识别，进而进入20S核心蛋白酶体内部，被降解成3～22个氨基酸的小肽段，在细胞内回收利用。泛素分子则被泛素解离酶从靶蛋白上解离下来，重复利用[4]。
UPP通过上述过程，上调或下调某些抑癌基因、转录因子和细胞周期素等的表达以及改变MHC-Ⅰ限制性抗原肽的生成[5]，参与恶性肿瘤多种细胞生物学过程的调节，从而参与恶性肿瘤的发生和发展。
2 蛋白酶体抑制剂
蛋白酶体抑制剂按其不同的末端亲电基团可以分为硼酸肽类、环氧酮肽类、醛基肽类和乙烯基砜肽类等多种类型，以上均属于合成化合物，此外还有天然蛋白酶体抑制剂如乳胞素、3，4-二氯异香豆素（DCI）、阿克拉霉素（Aclacinomycin）、PR-39等。按其作用方式不同，蛋白酶体抑制剂又可分为可逆性和不可逆性两种。醛基肽类是第一个被发现并广泛应用的蛋白酶体抑制剂，如MG132，是可逆性蛋白酶体抑制剂，其进入细胞速度快，能抑制ChT-L活性、半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶活性，但醛基肽类化合物是非选择性的，会抑制其他酶类，且稳定性较差，易被氧化。
目前临床上研究最多、最完善的是硼替佐米，它属于硼酸肽类，是一种具有高选择性、可逆性的蛋白酶体抑制剂。硼替佐米（PS341、万珂）于2003年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，具有较广的抗肿瘤谱，除了用于治疗多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤外，它对其他肿瘤细胞，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等均具有细胞毒性，可引起肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长[6]。近年来，研究者对硼替佐米进行结构改造，得到了新型硼酸肽类蛋白酶体抑制剂YSY-01A，研究表明，它在多种肿瘤细胞中均具有抑制增殖的作用[7]，其LD50值高于硼替佐米3倍，且毒副作用更低，有望成为新的研究热点。此外，环氧酮肽类化合物卡非佐米也于2012年被FDA批准用于多发性骨髓瘤的治疗。
3 蛋白酶体抑制剂与肺癌
肺癌在人类癌症死亡中居于首位，严重危害人类健康。据世界卫生组织统计，2008年，世界范围内有160万人被诊断为肺癌，同年有140万人死于此病。我国每年大约超过60万人死于此病。而其中非小细胞肺癌（NSCLC）大约占肺癌所有患者的80%。因此，为了使这个庞大的患者群体得到更好的治疗，能否制订出有效的抗肿瘤方案尤为重要。蛋白酶体抑制剂对多种血液系统肿瘤及实体瘤均有疗效，有关蛋白酶体抑制剂对肺癌，特别是NSCLC治疗研究亦不在少数，但其作用机制仍不完全明确。
3.1 作用机制
3.1.1 下调核因子κB 核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）普遍存在于真核细胞中，对超过200种基因具有调节作用，其中包括细胞黏附分子、血管内皮生长因子、凋亡调节基因如Bcl-2、Bcl-xL等，这些基因与肿瘤生长和转移息息相关。故而NF-κB的下调对抑制肿瘤的生长或促进肿瘤细胞凋亡发挥重要作用[8]。通常情况下，NF-κB以二聚体形式与其抑制蛋白IκB相结合，以无活性状态存在于细胞中。但当细胞受到细胞因子、生长因子、细菌、病毒、应激状态等刺激时，IκB被UPP降解，NF-κB从而被游离、激活[9]，发挥对其下游转录基因的调控作用，最终发生肿瘤生长因子表达增多，血管生成，细胞凋亡减少，诱发肿瘤可能[10]。蛋白酶体抑制剂可抑制IκB降解，从而阻止上述过程，调控细胞周期进程，控制细胞凋亡，抑制血管生长，对肿瘤治疗的各方面靶点均有作用。
3.1.2 对细胞周期的调控 在真核细胞中，细胞周期由细胞周期蛋白和细胞周期依赖性激酶（CDKs）调节。不同的CDK对应相应的细胞周期蛋白，调节细胞周期的各个阶段。而CDKs的抑制物（CKIs）则限制CDKs活性及细胞周期进程。P21WAF1/Cip1是众多CKIs中的一种，其在细胞周期G2/M期阻滞中发挥作用。P27Kip1是另一种CKI，可以阻止细胞从G1期到S期，上述二者都是UPP的降解底物[11]，当蛋白酶体被抑制时，CKIs不能被降解，使细胞分裂停止于各个不同时期，导致细胞凋亡而抑制肿瘤生长[1]。Ling等[12]在PS341作用于NSCLC H460细胞的研究中发现，在PS341作用下G2/M期细胞增多，研究中亦发现G2/M期阻滞与周期蛋白A1、周期蛋白B及其激酶的增加有关。
抗凋亡基因Bcl-2与肿瘤细胞凋亡抑制及化疗抑制有关，蛋白酶体抑制剂能克服Bcl-2介导的凋亡抑制，同时上调Bcl-2家族中的促凋亡分子Bax，降低Bcl-2/Bax的比值，促使肿瘤细胞凋亡。Ling等[13]在PS341作用于NSCLC的另一项研究发现，G2/M期细胞的数目与Bcl-2的磷酸化程度相一致，提示蛋白酶体抑制剂通过磷酸化作用下调NSCLS细胞中的Bcl-2水平，这也是癌细胞凋亡的机制之一。
3.1.3 P53的调控 抑癌基因P53在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。当细胞受到化学或电离辐射，DNA发生损伤时，P53经磷酸化或其他途径活化，从其抑制物MDM2中脱离，P53蛋白大量积累，诱导P21WAF1/CIP1转录，使细胞周期停滞，并阻止DNA合成，同时修复损伤的DNA。许多肿瘤中都存在P53基因突变，使P53不能表达或无法诱导下游的转录活动，DNA无法修复，异常的DNA传递给子代细胞，逐步积累，最终导致肿瘤的发生。P53通过UPP降解，故而蛋白酶体抑制剂可使P53积累，且有稳定P53的作用[14]。既往研究认为，P53诱导NSCLC停滞于G2/M期[15]，从而阻止肿瘤的发生。但有研究通过使用除P53外，其余基因完全相同的人类癌细胞，重新评估P53在PI诱导的肿瘤细胞凋亡中的作用[16]，该研究发现，硼替佐米和MG132诱导癌细胞凋亡均不依赖P53。Ling等[12]在NSCLC的研究中也发现，蛋白酶体抑制剂对细胞生长的抑制作用仅部分依赖P53功能，而细胞周期发生G2/M期停滞并不依赖P53。
3.1.4 PTEN/PI3K/Akt 通路 PI3K/Akt信号转导通路是肿瘤生长的重要通路，PI3K的激活是此通路的基础，活化的PI3K可将信息传递给通路的第二信使PIP3，接着活化Akt及PDK1，通过刺激其下游作用因子，促进肿瘤细胞的生长、增殖、浸润和转移。PTEN基因是与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，它可通过PIP3去磷酸化拮抗PI3K/Akt通路[17]。Sherwood等[18]在硼替佐米致结肠癌SW480细胞凋亡的研究中发现，PTEN蛋白表达水平与硼替佐米作用时间正相关，随PTEN蛋白表达增加，Akt蛋白表达降低，从而抑制通路活性。Sun等[19]在YSY-01A抑制NSCLC A549细胞生长的作用机制的研究中亦发现，A549细胞增殖抑制时，PTEN的表达增加，PI3K表达减少。
3.1.5 抑制血管生成 肿瘤直径达到1～2 mm后，若无新生血管生成来提供营养，则不能继续生长[20]。新生的血管不仅可以为肿瘤输注养分、排除废物，还提供了肿瘤细胞的转移途径。实验证明，蛋白酶体抑制剂通过阻碍NF-κB入细胞核的过程，降低其活性，进而下调缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达，使血管内皮生长因子（VEGF）减少，抑制血管生成[21-22]，从而抑制肿瘤生长和转移。
3.1.6 其他 蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤机制复杂，除上述机制外，蛋白酶体抑制剂还可促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导的凋亡[23]，此过程与蛋白酶体抑制剂下调NF-κB，诱导caspase-8和caspase -9活化，上调死亡受体DR4/DR5有关。此外，PIs还可逆转化疗药物的耐药性、增加放化疗敏感性，缓解肿瘤恶病质，这些均为蛋白酶体抑制剂对肺癌的治疗提供了基础。
3.2 联合治疗
放化疗是肺癌治疗中的重要手段，但肺癌细胞对化疗药物的耐药性、毒副作用以及放疗过程的辐射及患者耐受性是治疗过程中的一大难题。上文陈述了蛋白酶体抑制剂在肺癌中的抗肿瘤机制，为肺癌的治疗提供新思路。目前关于硼替佐米对肺癌治疗的临床研究较多见，硼替佐米耐受良好，但单一用药效果较温和。Li等[24]在硼替佐米对初次化疗的已发生癌细胞转移的NSCLC患者治疗的研究中发现，虽然患者耐受良好，但未见疾病客观缓解，其疗效并不明显。另一些研究也表明，患者对硼替佐米耐受良好。Piperdi等[25]在硼替佐米联合标准剂量的卡铂及贝伐单抗治疗晚期NSCLC的研究中发现，硼替佐米剂量分为1.3、1.6、1.8 mg/m2三组，在前3周中，三组中所有16例患者均未出现与硼替佐米剂量相关的不良反应，硼替佐米与当前化疗方案相结合，则显示出令人惊喜的疗效。Davies等[26]在硼替佐米联合吉西他滨/卡铂治疗晚期NSCLC的临床研究中发现，患者生存受益，中位生存期为11个月，1年和2年生存率分别为47%和19%。Zhao等[27]在硼替佐米联合紫杉醇、卡铂及胸部放疗的治疗研究中也提示该方案可潜在获益，其中位存活期为25个月，12个月生存率为73%，但血液系统方面的副作用，如白细胞减少、中性粒细胞减少等有所增加。
4 小结与展望
蛋白酶体抑制剂对肺癌的治疗作用已经取得了一定的研究成果。许多体内外实验证实蛋白酶体抑制剂对肺癌细胞的杀伤作用，目前的临床实验已证实蛋白酶体抑制剂对肺癌的治疗具有很高的可行性。随着蛋白酶体抑制剂的作用机制以及在临床应用方面研究的不断深入，在肺癌方面的作用也会进一步明确，可能成为治疗肺癌的新方法。
[参考文献]
[1] Sorokin AV，Kim ER，Ovchinnikov LP. Proteasome system of protein degradation and processing [J]. Biochemistry（Mosc），2009，74（13）：1411-1442.
[2] Moore BS，Eustáquio AS，McGlinchey RP. Advances in and applications of proteasome inhibitor [J]. Current Opinion in Chemical Biology，2008，12（4）：434-440.
[3] Adams J. The proteasome： a suitable antineoplastic target [J]. Nat Rev Cancer，2004，4（5）：349-360.
[4] Orlowski RZ，Kuhn DJ. Proteasome inhibitors in cancer therapy：lessons from the first decade [J]. Clin Cancer Res，2008， 14（6）：1649-1657.
[5] Mukhopadhyay D，Riezman H. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling [J]. Science，2007，315（5809）：201-205.
[6] Buac D，Shen M，Schmitt S，et al. From bortezomib to other inhibitors of the proteasome and beyond [J]. Curr Pharm Des，2013，19（22）：4025C4038.
[7] Tong K，Liu JT，Yuan X，et al. Cell cycle arrest of compound YSY-01A， a new proteasome inhibitor on HT-29 cells in vitro [J]. Chin Pharmaceu Sci，2012，21（5）：448-458.
[8] Gilmore T，Gapuzan ME，Kalaitzidis D，et al. Rel/NFkappa B/I kappa B signal transduction in the generation and treatment of human cancer [J]. Cancer Lett，2002，181（1）：1-9.
[9] Hoeller D，Dikic I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy [J]. Nature，2009，458（7237）：438-444.
[10] Prasad S，Ravindran J，Aggarwal BB. NF-kappaB and cancer： how intimate is this relationship[J]. Mol Cell Biochem，2010，336（1-2）：25C37.
[11] Escobar M，Velez M，Belalcazar A，et al. The role of proteasome inhibition in nonsmall cell lung cancer [J]. J Biomed Biotechnol，2011，2011（4）：806506.
[12] Ling YH，Liebes L，Jiang JD，et al. Mechanisms of Proteasome Inhibitor PS-341-induced G2-M-Phase Arrest and Apoptosis in Human Non-Small Cell Lung Cancer Cell Lines [J]. Clin Cancer Res，2003，9（3）：1145-1154.
[13] Ling YH，Liebes L，NgB et al. PS-341，a novel proteasome inhibitor， induces Bcl-2 phosphorylation and cleavage in association with G2-M phase arrest and apoptosis [J]. Molecular Cancer Therapeutics，2002， 1（10）：841-849.
[14] Brown CJ，Lain S，Verma CS，et al. Awakening guardian angels： drugging the p53 pathway [J]. Nature Reviews Cancer，2009，9（12）：862-873.
[15] Den linger CE，Keller MD，Mayo MW，et al. Cobined proteasome and histone deacetylase inhibition in non-small cell lung cancer [J]. Thorac Cardiovasc Surg，2004， 127（4）：1078-1086.
[16] Pandit B，Gartel AL. Proteasome Inhibitors Induce p53-Independent Apoptosis in Human Cancer Cells [J]. Am J Pathol，2011，178（1）：355-360.
[17] Yin D，Zhou H，Kumagai T，et al. Proteasome inhibitor PS-341 causes cell growth arrest and apoptosis in human glioblastoma mulfiforme（GBM）[J]. Oncogene，2005，24（3）：344-354.
[18] Sherwood SW，Kung AL，Roitelman J，et al. In vivo inhibition of cyclin B degradation and induction of cell-cycle arrest in mammalian cells by the neutral cysteines protease inhibitor N-acetylleucylnorleucinal [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（8）：3353C3357.
[19] Sun T，Yuan X，Huang W，et al. Effects and mechanism of proteasome inhibitor YSY01――A alone or in combination with cisplatin against A549 cells in vitro [J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2015，24（9）：607-616.
[20] Sun B，Zhang D，Zhang L，et al. Hypoxia influences vasculogenic mimicry channel form ation and tumor invasion related protein expression in melanoma [J]. Cancer Lett，2007，249（2）：188.
[21] Shibata A，Nagaya T，Imai T，et al. Inhibition of NFkappaB activity decreases the VEGF mRNA expression in MDA-MB-231 breast cancer cells [J]. Breast Cancer Res Treat，2002，73（3）：237-243.
[22] 刘敬|，袁霞，徐波，等.新型蛋白酶体抑制剂YSY-01A对肿瘤细胞促血管生成作用的抑制及其机制初探[J].生物化学与生物物理进展，2013，40（8）：748-756.
[23] Sarhan D，D′Arcy P，Lundqvist A. Regulation of TRAIL-receptor expression by the ubiquitin-proteasome system [J]. Int Mol Sci，2014，15（10）：18557-18573.
[24] Li T，Ho L，Piperdi B，et al. Phase Ⅱ study of the proteasome inhibitor bortezomib（PS-341，Velcade）in chemotherapy-naive patients with advanced stage nonsmall cell lung cancer（NSCLC）[J]. Lung Cancer，2010，68（1）：89-93.
[25] Piperdi B，Walsh WV，Bradley K，et al. Phase I/II study of bortezomib in combination with carboplatin and bevacizumab as first line therapy in patients with advanced non-small cell lung cancer（NSCLC）[J]. J Thorac Oncol，2012，7（6）：1032-1040.
[26] Davies AM，Chansky K，Lara Jr PN，et al. Bortezomib plus gemcitabine/carboplatin as first-line treatment of advanced nonsmall cell lung cancer：a phase Ⅱ Southwest Oncology Group Study（S0339）[J]. J Thorac Oncol，2009，4（1）：87-92.
[27] Zhao Y，Foster NR，Meyers JP，et al. A Phase Ⅰ/Ⅱ Study of Bortezomib in Combination with Paclitaxel，Carboplatin，and Concurrent Thoracic Radiation Therapy for NonCSmall-Cell Lung Cancer [J]. J Thorac Oncol，2015， 10（1）：172-180.
[关键词] 泛素-蛋白酶体途径；病毒；感染
[中图分类号] R373 [文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2014）02（c）-0191-03
人体组织细胞中存在多种蛋白降解途径，目前研究最多的是溶酶体降解途径和泛素-蛋白酶体降解途径，溶酶体降解途径无需能量，主要降解细胞外和细胞膜蛋白质；泛素-蛋白酶体降解途径是一种耗能的高效、特异的蛋白质降解过程，控制细胞内大多数蛋白质特别是膜蛋白的降解。泛素-蛋白酶体系统主要由泛素、泛素启动酶包括泛素激活酶（ubiquitin-activating enzyme）E1、泛素载体蛋白（ubiquitin-carrier protein）E2和泛素连接酶（ubiquitin ligase）E3、26 S蛋白酶体和去泛素化酶组成[1-2]。泛素蛋白酶体系统在高等真核生物细胞中的功能主要体现在两个方面：一方面降解细胞内的蛋白质；另一方面是非降解作用，调节细胞内不同蛋白的定位和活性。泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）调控高等真核生物细胞内几乎所有的生命活动，包括细胞增殖、分化、凋亡，DNA复制和修复、转录和蛋白质质量控制等，并参与病原体的入侵、致病和人类机体的免疫应答等过程。另外，泛素介导的蛋白质降解还参与环境有害物质的致病过程以及机体的解毒机制[3]。
泛素是一个广泛分布在真核细胞中的小分子球状蛋白质，其序列高度保守。细胞内需降解的靶蛋白在ATP的作用下被一系列酶催化，其Lys侧链连接到泛素分子的C-末端Gly侧链，而后其他泛素分子以Gly连接到泛素分子的Lys侧链上而形成多泛素化链，这个过程称为泛素化。泛素化是由泛素激活酶E1、泛素载体蛋白E2和泛素连接酶E3等介导的多酶级联反应，在此过程中E3的作用尤为关键，它决定了底物泛素化的时间性和特异性[4-5]。泛素化蛋白被转运到蛋白酶体中被完全降解，蛋白酶体是一种具有多个亚单位组成的蛋白酶体复合体，蛋白酶体沉降系数为26 S，故又称26 S蛋白酶体[6]，这个体系称为泛素-蛋白酶体系统或 UPP[7]。研究发现，许多病毒可以利用UPP通过促使病毒出芽、调控病毒转录、下调细胞表面免疫分子、降解抗病毒蛋白、抑制细胞凋亡等方式在宿主内生存、增殖，现就这五种方面综述如下。
1 促使病毒出芽、释放
泛素及泛素连接酶在病毒的出芽及释放过程中有重要作用，泛素与病毒结构蛋白的具体链接形式不是很清楚，但是很多病毒结构蛋白的出芽及释放需要泛素连接酶的作用。HBV核心蛋白包括两个赖氨酸残基（K7和K96），将K96上的氨基酸残基突变为丙氨酸阻止HBV与泛素结合，可以抑制病毒的出芽并且泛素连接酶的过表达明显促进HBV的出芽[8]。Chung等[9]研究发现，人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染宿主细胞释放病毒颗粒主要由HIV-1 Gag蛋白C端与肿瘤易感基因101蛋白或宿主蛋白ALG-2相互作用蛋白X结合来介导完成，HECT类泛素连接酶NEDD4L的过表达可以激活与缺少TSG101和ALIX结合的L结构域的HIV-1子代释放，且去除内源的NEDD4L能抑制这些缺陷病毒出芽，提示病毒出芽的激活依赖于NEDD4L的泛素蛋白酶体活性。Wang等[10]将蛋白酶体抑制剂MG132加入到感染HBV的细胞中，发现经过6 d MG132的处理，蛋白酶体活性较正常对照组降低，并且乙肝病毒表面抗原、核心抗原及HBV-DNA的水平较对照组明显降低，提示蛋白酶体抑制剂通过阻断UPP能有效地抑制乙肝病毒的复制。Bandi等[11]向感染HBV病毒的小鼠注射目前已用于临床的蛋白酶抑制剂硼替佐米，发现应用硼替佐米6 d后病毒复制减少，同时病毒RNA和蛋白表达量明显降低，提示蛋白酶抑制剂在体内的应用可以明显抑制病毒的复制。
2 调控病毒转录
HIV-1反式激活因子Tat蛋白的泛素化能将19 S复合物引向HIV-1启动子，进而调控病毒转录[12]。王晓菊等[13]通过检测HBV感染者外周血淋巴细胞泛素mRNA的表达与正常组对照发现，慢性HBV感染并有炎症活动者均存在外周血淋巴细胞泛素mRNA表达水平低，病情越重，表达水平越低，提示外周血淋巴细胞泛素mRNA的低表达与HBV感染有关。Bhuvanakantham等[14]发现虫媒病毒如西尼罗病毒可通过泛素化降解等方式逃逸人Sec3蛋白的抗病毒作用。Robek等[15]发现，干扰素抑制HBV复制的过程是通过泛素-蛋白酶体降解病毒或者细胞的相关蛋白实现的。
3 下调细胞表面免疫分子
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）识别与组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类分子连接的病毒蛋白内多肽表位，目前认为MHC由泛素-蛋白酶体降解途径介导[16]。人巨细胞病毒编码的US2和US11糖蛋白泛素化后，可促使新生成的MHC重链从内质网易位到胞质，被蛋白酶体降解，清除MHC分子使病毒抗原决定簇不能提呈而逃避免疫监测[17]。卡波西肉瘤相关疱疹病毒通过泛素连接酶K5使宿主细胞分泌编码的C-型凝集素DC-SIGN及密切相关的DC-SIGNR下调[18]。病毒编码的类似泛素连接酶E3可以促进宿主细胞表面MHC分子降解，如人疱疹病毒8型编码的K3和K5蛋白可作为泛素连接酶E3促进宿主细胞表面的MHCⅠ类分子泛素化[19]。病毒可以通过不同方式利用泛素系统抑制MHC的呈递作用进而逃避免疫检测。
4 降解抗病毒蛋白
载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）是机体固有的抗病毒因子，HIV-1的病毒感染因子（Vif）的氨基端能与APOBEC3G氨基端结合，Vif招募形成泛素连接酶E3复合体并介导APOBEC3G多聚泛素化，随后APOBEC3G经26 S蛋白酶体途径降解，从而拮抗其抗HIV-1的活性[20]。Nathans等[21]通过RNA干扰技术抑制Vif，在Vif形成泛素连接酶E3复合体在蛋白酶体降解APOBEC3G之前，使Vif泛素化被26 S蛋白酶体降解，同时使更多的APOBEC3G掺入到病毒颗粒中，发现可以明显降低病毒的感染力，也证实Vif经UPP介导APOBEC3G降解在HIV病毒感染过程中起重要作用。
5 抑制细胞凋亡
p53是病毒拮抗细胞凋亡过程中的重要靶基因。人瘤病毒E6蛋白与细胞泛素连接酶E6相关蛋白作用形成复合物，使p53多泛素化及溶酶体降解，进而抑制细胞凋亡[22-23]。Wang等[24]通过检测猪流感病毒感染的细胞p53分子mRNA水平，病毒感染没有使p53转录水平升高，但是p53稳定性较对照组明显上升，提示病毒通过提高p53稳定性来抑制细胞凋亡；加用蛋白酶抑制剂MG132处理病毒感染的细胞并且检测泛素化p53，发现病毒感染组p53泛素化水平较对照组明显减少，提示病毒是通过减少p53泛素化水平，抑制p53的通过泛素-蛋白酶体降解来抑制细胞凋亡的。此外，腺病毒及卡波西肉瘤病毒也可以通过降解p53，抑制细胞凋亡[25-26]。
6 总结
目前抗病毒的药物主要针对病毒酶（包括蛋白酶和逆转录酶）和病毒连接物。虽然抗逆转录病毒的疗效显著，但是抗逆转录病毒药物最大的缺点是使病毒出现高突变率，尤其是逆转录药物仅仅抑制病毒复制，病毒可以以低水平在感染的细胞内潜伏。许多病毒可以利用UPP而促使病毒出芽、调控病毒转录、下调细胞表面免疫分子、降解抗病毒蛋白、抑制细胞凋亡等方式在宿主内生存、增殖，因此，从UPP角度探讨抗病毒治疗药物，为降低病毒突变率提供了新思路。
[参考文献]
[1] Choi AG，Wong J，Marchant D，et al.The ubiquitin-proteasome system in positive-strand RNA virus infection[J].Rev Med Virol，2013，23（2）：85-96.
[2] Chondrogianni N，Gonos ES.Structure and function of the ubiquitin-proteasome system：modulation of components[J].Prog Mol Biol Transl Sci，2012，109：41-74.
[3] Jankowska E，Stoj J，Karpowicz P，et al.The proteasome in health and disease[J].Curr Pharm Des，2013，19（6）：1010-1028.
[4] Mettouchi A，Lemichez E.Ubiquitylation of active Rac1 by the E3 ubiquitin-ligase HACE1[J].Small GTPases，2012，3（2）：102-106.
[5] Teixeira LK，Reed SI.Ubiquitin ligases and cell cycle control[J].Annu Rev Biochem，2013，82：387-414.
[6] Sadanandom A，Bailey M，Ewan R，et al.The ubiquitin-proteasome system：central modifier of plant signalling[J].New Phytol，2012，196（1）：13-28.
[7] Tu Y，Chen C，Pan J，et al.The ubiquitin proteasome pathway（UPP）in the regulation of cell cycle control and DNA damage repair and its implication in tumorigenesis[J].Int J Clin Exp Pathol，2012，5（8）：726-738.
[8] Garcia ML，Reynolds TD，Mothes W，et al.Functional characterization of the putative hepatitis B virus core protein late domain using retrovirus chimeras[J].PLoS One，2013，8（8）：e72845.
[9] Chung HY，Morita E，von Schwedler U，et al.NEDD4L overexpression rescues the release and infectivity of human immunodeficiency virus type 1 constructs lacking PTAP and YPXL late domains[J].J Virol，2008， 82（10）：4884-4897.
[10] Wang Y，Li XL，Yu YS，et al.Inhibition of hepatitis B virus production in vitro by proteasome inhibitor MG132[J].Heapatogastroenterology，2013，60（124）：837- 841.
[11] Bandi P，Garcia ML，Booth CL，et al.Bortezomib inhibits hepatitis B virus replication in transgenic mice[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54（2）：749-756.
[12] Brès V，Kiernan RE，Linares LK，et al.A non-proteolytic role for ubiquitin in Tat- mediated transactivation of the HIV-1 promoter[J].Nat Cell Biol，2003，5（8）：754-761.
[13] 王晓菊，汪明明，徐皖苏，等.慢性HBV活动性感染者外周血淋巴细胞泛素mRNA的表达及临床意义[J].山东大学学报·医学版，2009， 47（2）：58-61.
[14] Bhuvanakantham R，Ng ML.West Nile virus and dengue virus capsid protein negates the antiviral activity of human Sec3 protein through the proteasome pathway[J].Cell Microbiol，2013，15（10）：1688-1706.
[15] Robek MD，Wieland SF，Chisari FV.Inhibition of hepatitis B virus replication by interferon requires proteasome activity[J].J Virol，2002，76（7）：3570-3574.
[16] Warnatsch A，Bergann T，Krüger E.Oxidation matters：the ubiquitin proteasome system connects innate immune mechanisms with MHC classⅠantigen presentation[J].Mol Immunol，2013，55（2）：106-109.
[17] Hassink GC，Barel MT，Van Voorden SB，et al.Ubiquitination of MHC classⅠheavy chains is essential for dislocation by human cytomegal ovirus-encoded US2 but not US11[J].J Biol Chem，2006，281（40）：30063-30071.
[18] Lang SM，Bynoe MO，Karki R，et al.Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus K3 and K5 proteins down regulate both DC-SIGN and DC-SIGNR[J]. PLoS One，2013，8（2）：e58056.
[19] Boname JM，Lehner PJ.What has the study of the K3 and K5 viral ubiquitin E3 ligases taught us about ubiquitin-mediated receptor regulation？[J].Viruses，2011，3（2）：118-131.
[20] Binka M，Ooms M，Steward M，et al.The activity spectrum of Vif from multiple HIV-1 subtypes against APOBEC3G，APOBEC3F，and APO BEC3H[J].J Virol，2012，86（1）：49-59.
[21] Nathans R，Cao H，Sharova N，et al.Small-molecule inhibition of HIV-1 Vif[J].Nat Biotechnol，2008，26（10）：1187-1192.
[22] Devine T，Dai MS.Targeting the ubiquitin-mediated proteasome degradation of p53 for cancer therapy[J].Curr Pharm Des，2013，19（18）：3248-3262.
[23] Guo N，Peng Z.MG132，a proteasome inhibitor，induces apoptosis in tumor cells[J].Asia Pac J Clin Oncol，2013，9（1）：6-11.
[24] Wang X，Shen Y，Qiu Y，et al.The non-structural （NS1） protein of influenza A virus associates with p53 and inhibitis p53-mediated transcriptional activity and apoptosis[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，395（1）：141-145.
[25] Yang H，Zheng Z，Zhao LY，et al.Downregulation of Mdm2 and Mdm4 enhances viral gene expression during adenovirus infection[J].Cell Cycle，2012，11（3）：582-593.
[26] Bhatt S，Ashlock BM，Toomey NL，et al.Efficacious proteasome/HDAC inhibitor combination therapy for primary effusion lymphoma[J].J Clin Invest，2013，123（6）：2616-2628.
【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of proteasome inhibitor MG132 on the proliferation and apoptosis of dopaminergic PC12 cells. METHODS: PC12 cells were treated with MG132 at different concentrations for 3 d. The effect of MG132 on the proliferation of PC12 cells was analyzed through MTT assay and the effect of MG132 on the apoptosis of PC12 cells was analyzed through Giemsa staining and flow cytometry. RESULTS: Treated for a same period （3 d）, the inhibitory effect of MG132 on PC12 cell proliferation enhanced with the increment of the concentration of MG132（0, 1, 2.5, 5, 10, 20 μmol/L）. The inhibitory rate exceeded 40% when the MG132 concentration was 2.5 μmol/L, and the 50% inhibiting concentration （IC50）was 3.78 μmol/L. MG132 also induced the apoptosis of PC12 cells obviously. The apoptosis index of the cells treated by MG132 at 2.5 μmol/L for 3 d was 24.7% examined by Giemsa staining and 25.6% by flow cytometry, that of the control cells was 1.3% and 0% respectively. CONCLUSION: MG132 can inhibit the proliferation of dopaminergic PC12 cells and lead to apoptosis. The disfunction of proteasome may do harm to the existence of dopaminergic cells.
【Keywords】 proteasome inhibitor; PC12 cells; Parkinson disease; apoptosis
【摘要】 目的： 了解蛋白酶体抑制剂MG132对多巴胺能细胞PC12增殖和凋亡的影响. 方法： 用不同浓度的MG132处理PC12细胞3 d，通过3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法检测MG132对PC12细胞增殖的影响，通过姬姆萨染色法和流式细胞术检测MG132对PC12细胞凋亡的影响. 结果： 在作用时间相同（3 d）的条件下，随着MG132浓度的增高（0， 1， 2.5， 5， 10， 20 μmol/L），对PC12细胞增殖的抑制作用逐渐增强. 当MG132浓度达到2.5 μmol/L时，对PC12细胞的抑制率超过40%, IC50＝3.78 μmol/L. 同时，MG132能够明显诱导PC12细胞凋亡： 姬姆萨染色显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为24.7%，而对照为1.3%；流式细胞术分析结果表明，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d，细胞凋亡率为25.6%，而对照为0%. 结论： 蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制多巴胺能细胞PC12的增殖并诱导细胞凋亡，蛋白酶体活性的丧失可能影响到多巴胺能细胞的生存.
【关键词】 蛋白酶体抑制剂；PC12细胞；帕金森病；细胞凋亡
0引言
帕金森病（parkinsons disease, PD）是最常见的神经系统退行性疾病之一，严重危害患者身体健康和降低患者的生活质量［1-2］. PD的病因和发病机制至今不够明确. 越来越多的证据表明，多巴胺能神经元内蛋白质的损伤和功能异常蛋白的蓄积在散发性PD的发病过程中起着重要的作用［3］. 蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在泛素蛋白酶体通路（ubiquitinproteasome pathway, UPS）中起催化作用［4-5］. 本研究以多巴胺能细胞PC12为研究对象，观察蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖和凋亡的影响，以探讨蛋白酶体活性异常在PD发病过程中的作用，为阐明PD的发病机理提供新的实验依据.
1材料和方法
1.1材料高分化型PC12细胞购于中国科学院上海细胞所；新生牛血清（奥地利PAA公司）；DMEM培养基干粉（美国Gibco公司）；MTT、MG132（美国Sigma公司）；6 孔培养板（丹麦NUNC公司）；NU2500E型CO2 孵箱（英国Forma Scientif公司）；酶联免疫检测仪（江苏国营华东电子管厂）.
1.2方法
1.2.1PC12细胞的培养与传代细胞在加入100 mL/L小牛血清,100 U/mL青霉素的DMEM培养液中，37℃, 50 mL/L CO2常规培养. 待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代.
1.2.2细胞毒性试验（MTT法）取对数生长期的细胞，接种于96孔板中. 第2日换含有MG132 0, 1, 2.5, 5, 10和20 μmol/L的培养液，继续培养3 d，加入MTT（5 g/L, 20 μL/孔），继续培养4 h，终止培养，小心吸弃培养孔内上清液，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡摇匀，使MTT产生的蓝色结晶充分溶解，在酶标仪上以波长490 nm测定各孔A值. 细胞增殖抑制率按照下式进行计算（对照组为0剂量组，实验组为不同浓度MG132作用组）： IR（%）=（A对照组-A实验组）/A对照组×100.
1.2.3姬姆萨染色法观察取对数生长期的细胞，常规爬片. 24 h以后，分别以正常培养液和加入MG132 2.5 μmol/L的培养液继续培养3 d，然后进行Giemsa染色. 染色方法： 0.01 mol/L PBS清洗玻片3～5次；利用卡诺固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）固定20 min；用新配制的Giemsa染色液染色20 min；自来水流水冲洗，二甲苯透明，光镜下观察染色效果，并拍照. 结果判断： 发生凋亡的细胞以及凋亡小体呈紫蓝色深染，容易在光镜下辨认. 每张盖玻片选择3个视野，每个视野计算100个细胞中阳性细胞数，计算阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞的阳性指数.
1.2.4流式细胞术检测将对照组和实验组（2.5 μmol/L处理3 d）的细胞分别制成单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤2次；700 mL/L的乙醇4℃固定30 min. 流式细胞术测定细胞DNA含量，进行细胞周期分析和凋亡率的比较.
统计学处理： SPSS11.0统计软件进行统计分析. MTT实验结果用x±s表示，假设检验用方差分析，各实验组与对照组之间的比较使用Dunnettt检验；姬姆萨染色法的实验结果用u检验，以P<0.05为有统计学意义.
2结果
2.1MTT实验结果显示，不同浓度的MG132作用于细胞3 d后，在1～20 μmol/L浓度范围内，MG132对PC12细胞呈浓度依赖性的增殖抑制作用（IC50＝3.78 μmol/L）. 作用第3日, 2.5 μmol/L和5 μmol/L MG132对细胞的抑制率分别为43.47%和66.67%（表1）.表1不同浓度的MG132对PC12细胞增殖的抑制作用
2.2姬姆萨染色法检测细胞凋亡浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d后，镜下观察，含有MG132的实验组细胞总数明显低于对照组. 对照组基本上难以看到凋亡细胞，而MG132实验组随处可见紫蓝色深染的凋亡细胞（图1）. 通过计算，对照组细胞凋亡率为1.3%，MG132实验组细胞凋亡率为24.7%. MG132实验组细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05）.
2.3流式细胞仪检测结果显示，2.5 μmol/L蛋白酶体抑制剂MG132作用于PC12细胞3 d后，与对照组相比，S期细胞所占比例有所下降，从28.7%下降到24.6%. 对照组未见凋亡峰，而加入MG132的实验组有典型的亚二倍体凋亡峰，凋亡率为25.6%（图2）.
3讨论
在临床上，PD主要病理改变为黑质、纹状体多巴胺能神经元的进行性变性、死亡，导致纹状体内多巴胺浓度的明显下降［6］. 由此可见，多巴胺能神经元的增殖和凋亡的变化在PD的发病中起重要作用. PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞，高分化型的PC12细胞在形态、生理、生化功能方面接近于中脑多巴胺神经元，因此在国内外常作为多巴胺神经元的细胞模型［3］. 近期的研究表明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积是PD发病的机理之一，传统的研究着重于这些异常蛋白的形成过程，很少关注其代谢和降解途径.
蛋白酶体是一种多价复合酶，分布于细胞质与细胞核内，是哺乳动物细胞中主要的中性蛋白水解酶，在UPS中起催化作用. UPS是蛋白质选择性降解的主要方式，可以清除真核细胞中突变、损伤和异常折叠的蛋白质，维持细胞内环境的稳定，在维持细胞正常功能方面发挥着重要作用［7-8］. MG132是蛋白酶体抑制剂，可以抑制UPS中起主要催化作用的蛋白酶体的催化活性，从而阻断了UPS对异常蛋白的降解. 在PD的研究过程中，人们已经发现，αsynuclein, Parkin和UCHL1等基因的突变可能与一些家族性PD的发生有关. 而这三种基因都与UPS的功能有关［9］.
本研究结果显示，一定浓度的蛋白酶体抑制剂MG132对PC12细胞的增殖有明显的抑制作用. 在引起细胞增殖抑制的同时，MG132还诱导细胞凋亡. 姬姆萨染色和流式细胞术结果均显示，浓度为2.5 μmol/L的MG132作用3 d后，可明显诱导PC12细胞的凋亡. 通过抑制蛋白酶体的活性，直接导致了PC12细胞增殖的抑制以及凋亡率的增高. 这表明，作为维持细胞内稳态的重要物质，蛋白酶体的功能是否正常至关重要，蛋白酶体活性的改变能够对PC12细胞的生存产生重要的影响，正常的蛋白酶体活性对维持神经系统的正常功能有着重要的意义. 本实验结果再次证明，多巴胺能神经元内异常蛋白的蓄积在PD的发病过程中起着不可忽视的作用，保持多巴胺能神经元内异常蛋白的降解系统UPS功能的正常，可以为PD的预防提供一个新的思路.
【参考文献】
［1］ Lieberman A. Depression in Parkinsons disease a review ［J］. Acta Neurol Scand, 2006,113（1）:1-8.
［2］ 黄海东，邓敬兰，陈建宗，等. 偏侧帕金森病模型猴脑黑质和纹状体的超微结构变化［J］. 第四军医大学学报，2004,25（4）:317-320.
［3］ 吴小军，高国栋，吕葆真，等. 神经节苷脂对PC12细胞的抗凋亡作用［J］. 第四军医大学学报，2002,23（6）:517-520.
［4］ Hershko A. The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of the cell division cycle ［J］. Cell Death Differ, 2005,12（9）:1191-1197.
［5］ Yano M, Kanesaki Y, Koumoto Y, et al. Chaperone activities of the 26S and 20S proteasome ［J］. Curr Protein Pept Sci, 2005,6（2）:197-203.
［6］ 傅求真，李柱一，井晓荣，等. 1甲基4苯基吡啶盐对多巴胺能细胞系SHSY5Y的毒性作用机制［J］. 第四军医大学学报，2003,24（16）:1520-1522.
［7］ Hershko A. The ubiquitin system for protein degradation and some of its roles in the control of the cell division cycle ［J］. Cell Death Differ, 2005,12（9）:1191-1197.
［8］ Yano M, Kanesaki Y, Koumoto Y, et al. Chaperone activities of the 26S and 20S proteasome ［J］. Curr Protein Pept Sci, 2005,6（2）:197-203.
炎症是机体最常见的一种病理状态。因此科研工作者们相继从转录及转录后水平开展了大量炎症状态对CYP450的调节研究。20世纪80年代以来，美国Emory大学EdwardT.Morgan教授和他的科研团队致力于研究感染和炎症反应对CYP450的影响。其研究结果显示，感染和炎症条件下，人、大鼠和小鼠肝脏、肾脏和脑组织的细胞色素P450酶表达和活性改变显著。例如给小鼠腹腔注射脂多糖（LPS），LPS能够通过细胞的表面受体激活巨噬细胞，分泌大量促炎性细胞因子，继而对多种CYP450亚型呈现抑制作用。给大鼠分别腹腔注射IL-6和TNFγ后，CYP2C11、CYP2E1和CYP3A2的mRNA表达均下降。分别以人原代肝细胞和大鼠原代肝细胞等为实验对象，用促炎性细胞因子IL-1β和IL-6、TNFα和细胞进行共孵育，发现1A2、2A5、2B1、2B6、2B9、2B10、2C11、2C29、2E1、3A2、3A4、3A11和4A10等CYP的蛋白表达量或活性都显著降低，其中尤以对CYP2B6的影响非常显著，提示炎症能使经CYP2B6途径药物如环磷酰胺、依法韦仑和安非他酮等的体内代谢率显著下降，消除半衰期延长，导致体内药物蓄积而发生严重不良反应[15-19]。
2炎症状态对CYP2B6活性影响的机制研究
研究者对炎症状态下CYP450活性改变的机制也进行了一系列研究，以往的研究更多地关注炎性细胞因子对CYP450的mRNA表达等转录水平的影响，后来大量实验结果证实，炎性细胞因子在对CYP450mRNA表达无影响的情况下，依然可以降低肝药酶活性，提示转录后修饰在此过程中也扮演了重要的角色。
2.1NO在炎症状态对CYP2B6活性改变中的作用
NOS包括神经元型一氧化氮合酶（nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）三种亚型，感染和炎症主要增加iNOS的表达。CYP2B6在大鼠肝细胞主要以CYP2B1形式存在，与人肝细胞CYP2B6的基因有76%的相似。笔者近年来系统研究了炎性细胞因子IL-1β对大鼠CYP2B1的下调作用及其机制。实验结果证实，IL-1β与大鼠原代肝细胞共孵育，可显著诱导iNOS的蛋白表达，增加NO的生成，并进而使CYP2B1蛋白质半胱氨酸的巯基亚硝基化，易于被泛素-蛋白酶体识别而快速降解[21-22]，提示NO和泛素-蛋白酶体系统在炎症对CYP2B6的影响中起到了至关重要的作用，从转录后蛋白降解的水平阐述了IL-1β抑制CYP2B1的机制。
2.2蛋白质修饰在炎症状态对CYP2B6活性改变中的作用
1992年，Stamler等[23]发现NO和活性氮（RNS）可以作用于蛋白质半胱氨酸的巯基（Cys-SH），生成S-亚硝基化基团（Cys-SNO），引起蛋白质的活性与功能的改变，并首次提出了蛋白质巯基的S-亚硝基化修饰概念[24]。Minamiyama等[25]研究发现，使用NO供体NOC7或过氧化亚硝酸盐（ONOO-）和肝微粒体共孵育，可以引起CYP450活性降低及游离巯基的减少。Roberts等[26]也发现IL-1可以使肾小球膜细胞中产生ONOO-，继而使CYP8A1和CYP2B1的活性下降，研究者猜测是由于ONOO-使CYP8A1和CYP2B1酪氨酸残基硝基化，降低了酶的催化活性。要深入阐明NO对蛋白质的亚硝基化修饰作用，需要有高灵敏度和特异性的检测方法。2001年，美国药理学家Jaffrey和Snyder等[27]建立了一种生物素转化的方法（Biotinswitch）来进行S-亚硝基化蛋白的检测。该方法经过不断的改进和完善，目前已得到国际公认[28]。Benhar等[29]成功利用该方法测定了人淋巴细胞中半胱天冬酶-3蛋白的亚硝基化修饰，并发现细胞质和线粒体中的硫氧还蛋白（thioredoxins，Trx）能够降低去亚硝基化的过程。除了亚硝基化外，NO和RNS还可以对半胱氨酸的巯基进行次磺酸化（Cys-SOH）等氧化修饰。研究显示，RNS可以使酪氨酸羟化酶的半胱氨酸次磺酸化，导致酶的活性下降[30]。GSNO能够对组织蛋白酶K的半胱氨酸进行次磺酸化修饰而改变酶的活性[31]。2008年，美国密歇根大学Reddie教授等[32]利用新合成的特异性探针化合物DAz-1，建立了一种新的次磺酸化蛋白检测方法，为研究蛋白质的氧化修饰机制开辟了广阔的前景。2008年，Lee等[33]用NO供体GNSO与大鼠肝微粒体体外共孵育，采用Biotinswitch法检测到经S-亚硝基化修饰的CYP2B1，并发现泛素化CYP2B1蛋白明显增加，表明NO能够对CYP2B1蛋白进行亚硝基化修饰，并促进其和泛素连接；实验还发现另一NO供体NOC18和HeLa细胞共孵育，能够引起CYP2B1蛋白量下降，蛋白酶体（proteasome）抑制剂MG132可以明显抑制这一过程，但溶酶体酶抑制剂和Ca2+依赖性蛋白酶抑制剂对CYP2B1蛋白的降解无影响，说明NO作用下CYP2B1的降解通过泛素-蛋白酶体途径进行。
2.3泛素-蛋白酶体通路在炎症状态对CYP2B6活性改变中的作用
泛素-蛋白酶体通路（Ub-proteasomesystem，UPS）是除溶酶体途径、Ca2+依赖性蛋白酶途径之外的另一种细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，这一发现获得了2004年诺贝尔化学奖。该通路由泛素、蛋白酶体以及一系列相关的泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3组成[34]。泛素是一种小分子球蛋白，能作为“标签”结合到其他蛋白质上，蛋白质被亚硝基化或者次磺酸化修饰后易被泛素连接酶E3识别，使之成为蛋白酶体水解的底物。蛋白酶体是具有多亚基和多相催化活性的蛋白酶复合体，是催化泛素与底物蛋白偶联体降解的关键酶，调节着细胞内蛋白的水平和功能[35]。笔者近年研究发现，单纯使用外源性NO供体药物NOC18同样可以使大鼠原代肝细胞CYP2B1蛋白表达量下降，但降解过程比IL-1所致的CYP2B1蛋白量下降缓慢。有文献报道IL-1可以诱导烧伤大鼠趾长伸肌中免疫蛋白酶体的蛋白水解活性和表达[36]。由此我们推测，IL-1可能通过直接增强大鼠原代肝细胞蛋白酶体的活性或表达，加速了CYP2B1的蛋白降解。最近，我们利用特异性荧光多肽底物初步测定了IL-1对大鼠原代肝细胞蛋白酶体活性的影响，实验结果显示，IL-1能提高蛋白酶体的糜蛋白样（chymotrypsin-like，CT-L）活性。另外，IL-1能够诱导蛋白酶体重要的蛋白水解亚单位LMP2的表达，从而从蛋白酶体途径揭示了炎性细胞因子降低CYP2B1活性的机制[20]。
3展望
CYP2B6是人类CYP2B亚家族的重要成员，近年来发现，尽管CYP2B6只占CYP450的3%~5%，但它却介导了许多临床药物的代谢。和其他CYP450一样，CYP2B6的活性和表达，除了受基因多态性控制外，特殊的病理状态，如感染和炎症也会对其产生显著的影响，导致其对许多临床药物如抗肿瘤药、抗HIV感染的非核苷类反转录酶抑制剂和抗抑郁药等的代谢发生重大改变。因此，研究炎症对CYP2B6活性的影响，对临床合理、安全使用CYP2B6底物药物具有非常重要的意义。目前许多研究证实，炎症状态可以从转录后调节水平显著降低CYP2B6的活性，这一改变机制涉及NO生成、蛋白质修饰等多种因素。进一步高度关注和持续研究炎症状态对CYP2B6活性的作用及机制，将为临床病理状态下CYP2B6底物药物的正确使用提供有价值的理论和实验依据。
量变到质变的学生时代
1986年获得南开大学遗传学专业学士学位后，张丰雪成为河北农业大学林学院的一名助教。3年后再次考取母校的细胞遗传学专业的研究生，毕业后继续在河北农业大学林学院担任教职工作。在不断学习、工作的锤炼下，他为自已未来的研究打下了扎实的专业基础。近20年的量的积累持续发酵，张丰雪学生时代的质变也正在酝酿中。
1999年，张丰雪赴美国阿拉巴马大学伯明翰分校研究生院，在这里攻读细胞生物学博士学位。4年的学习过程，也是他学习阶段的质变时期，一系列科研成果的出现是质变最有力的说明。
读博期间，张丰雪开创性的发现了蛋白酶体受代谢因子如O-GlcNAc修饰和cAMP/PKA磷酸化的调节，建立了蛋白酶体介导的外周蛋白降解在维持正常血糖水平中的作用，为进一步研究蛋白酶体在诸多人类疾病中的作用打开了一扇新的大门。不仅如此，他还建立了蛋白酶体，OGT及PKA的活性分析系统，并对GK O-GlcNAcase的显性负性突变进行了序列分析并定性。 期间，他还参与研究了O-GlcNAc修饰和蛋白酶体抑制在老年性疾病如白内障、肌肉萎缩等中的病理作用。相关研究内容刊登在《细胞》（Cell）、《生物化学与生物物理研究通讯 》（Biochem Biophys Res Commun）等国际权威杂志上。
量变到质变的科研时期
博士后研究结束后，张丰雪进入美国南卡罗莱纳医科大学担任助理研究教授（Research Assistant Professor）。期间他发现了全新的pim1激酶对mTOR的调节机制及其在细胞癌变中的作用，探讨了pim1激酶作为新的前列腺癌治疗标靶的可行性。
2009年到2012年间，张丰雪在美国佐治亚健康科学大学担任助理教授（Assistant Professor）期间，研究了O-GlcNAc蛋白修饰和蛋白酶体的调节在糖尿病血管并发症中的作用，他发现O-GlcNAc和Hsp90在内皮细胞中的交互作用。张丰雪还首次探讨了一个通过抑制N-联多聚糖的生物合成来抑制细胞死亡和慢性炎症反应的全新机制，提出这个机制对缺血/再灌注心脏的保护作用。在这里，张丰雪还启动了脂肪酸诱导的慢性血管炎症反应机制和HDAC6的外信号调节控制及其在血管内皮细胞骨架动态变化中作用的研究。
2013年，张丰雪被电子科技大学医学院引进，就职于电子科技大学附属医院/四川省人民医院器官移植研究所，开始着手筹建糖尿病及心血管病研究的基础医学实验室。在海外学习、工作多年的张丰雪回到国内，开始又一次的质变。依托电子科技大学医学院，未来他将致力于基础医学创新研究领域，希望从分子及细胞水平，探讨糖尿病及其它危险因素诱发的心血管疾病的发病机制，为建立新的临床治疗方案寻求突破。
国外主要科研成果
张丰雪在美国长期从事基础医学研究工作，内容主要涉及糖尿病、心血管病等目前影响人类健康的主要疾病，并在对这些疾病的研究中做出了以下重大发现。
蛋白酶体的调节控制
蛋白酶体是细胞内广泛存在的由多个蛋白酶组成的复合体，约占细胞总蛋白量的1%，作为细胞内主要的蛋白降解机制，它在清除细胞内异常蛋白以及老化、氧化损伤蛋白中起着重要作用，被认为是细胞内的“清洁工”，对维持细胞正常功能起着不可替代的作用。大量的研究表明，对蛋白酶体的抑制会导致异常蛋白及氧化损伤蛋白的积累，严重时导致细胞凋亡。这个过程被认为与各种老年病的发病机理有关。由于对蛋白酶体的调节控制知之甚少，蛋白酶体在疾病发生中的确切作用尚不清楚。张丰雪通过研究提出了O-联葡糖胺（O-GlcNAc）修饰可能通过抑制蛋白酶体的活性在β-细胞衰竭及糖尿病并发症中发挥重要作用。随后进一步发现了首个蛋白酶体的激活机制。这一发现首次将蛋白酶体的活性调节与细胞外信号联系起来，对于进一步研究蛋白酶体在老年性疾病中尤其是心血管病和老年性痴呆中的作用至关重要。由于这些发现，张丰雪和他的研究团队被在生物学领域核心期刊《生理学》（Physiology）杂志邀请撰写特约综述。
Pim1激酶在癌症发生中的作用
Pim 1激酶被怀疑和前列腺癌及白血病的发病有关，为了证明Pim1在癌症发生中的作用，张丰雪对Pim1和mTor通路的激活进行了研究，他发现Pim1可以象Akt一样磷酸化修饰PRAS40从而释放并激活mTor的活性，因此，通过刺激细胞内蛋白质的翻译以及细胞分裂，Pim1可以促进细胞癌化。这一发现为发展抗癌药物-Pim1抑制剂奠定了理论依据。目前，已有几个研究小组正在致力于Pim1抑制剂的研发。
国内的科研工作
回到国内后，张丰雪致力于建立一个世界一流的糖尿病及血管病变的细胞及分子生物学实验室方面的工作。他希望借此推动我国在这个关键领域的研究，以期找到预防及治疗这一重大疾病的新方法。主要研究工作的推进方面，他们将在以下几个方面，从全新的视角来阐述糖尿病及心血管病变发病的分子机制。
一方面，实验室将证明O-GlcNAc抑制proteasome是糖尿病合并血管并发症的主要诱因之一。这部分内容包括三点：一是从探讨细胞内O-GlcNAc修饰的调节机制，并证明高糖引起的O-GlcNAc修饰提高在糖尿病血管病变/糖尿病并发症中的决定性作用；二 是探讨热激蛋白Hsp90与O-GlcNAc转移酶（OGT）的相互作用，进一步确定O-GlcNAc修饰的生物学意义；三是探讨蛋白酶体活性的调节机制，证明蛋白酶体活性异常在血管病变中的重要作用。
除了上述课题外，另一方面，他们还将其研究扩展到了其它心血管病的重要领域，以揭示心血管病变的分子及细胞机制，以期找出对这一重大疾病的预防及治疗的新方法。这部分研究将对四个方向进行探讨。一是探讨血管内皮细胞中组蛋白去乙酰化酶-6（HDAC6）的外信号调节、及其对内皮细胞细胞骨架重排及血管内皮通透性的影响；二是探讨高脂肪酸（free fatty acid，FFA）引起的血管慢性炎症反应机制、及其在血管病变中的作用；三是探讨多聚糖（oligosaccharide）生物合成及N-联糖基化（N-glycosylation）抑制引起的抗细胞死亡的分子机制、证明其对缺血/再灌注心脏心肌细胞的保护意义，并据此开发抗细胞死亡的小分子抑制剂；四是探讨通过抑制多聚糖生物合成及N-联糖基化抑制慢性炎症反应的分子机制。
胃癌因高发病率和高病死率严重威胁人类健康，但有关胃癌的发病机制尚未明确。NOB1(Ninonebindingprotein1)是由NOB1基因编码的、参与核糖体小亚基和26S蛋白酶体生物合成的多功能蛋白质;NOB1异常表达可影响核糖体和蛋白酶体的生物合成，而后两者与肿瘤的发生、发展关系密切。应用免疫组织化学法检测胃癌组织中NOB1蛋白的表达，了解NOB1在胃癌中的作用及其与患者预后的关系。
1材料与方法
1.1材料:收集2009年3月至2014年10月行胃癌根治术的胃癌标本66例，平均57.8岁(38～76岁)，男性37例，女性29例;高分化19例，中分化31例，低分化16例;Ⅰ期10例，Ⅱ期25例，Ⅲ期22例，Ⅳ期9例;其中34例有淋巴结转移，32例无淋巴结转移;收集30例距胃癌组织2cm处经病理学证实的非癌胃组织及20例良性病变行胃切除的标本组织作为对照组。
1.2方法:所有标本均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。切片脱蜡水化，浸于柠檬酸盐缓冲液经中火档微波处理行抗原修复。然后按照SP免疫组化染色试剂盒说明书进行操作。兔抗人NOB1多克隆抗体(上海研生有限公司)，工作浓度1∶80。用已知阳性片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。NOB1蛋白免疫组化染色阳性表现为细胞质内出现的黄色、棕黄色或棕褐色沉淀。根据阳性细胞所占百分比和阳性细胞的着色强度，用半定量免疫评分法对实验结果进行判定:(1)着色强度:无着色为0分，淡黄色为1分;棕黄色计2分;棕褐色计3分。(2)阳性细胞数在计数细胞中所占百分比:阳性细胞≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两者分值相加:0～2分为阴性，3～4分为弱阳性，≥5分为强阳性。每份标本置高倍镜下(×400)选取5个不同视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，盲法判读，由两位高年资病理师独立观片后一起作出判断。
1.3随访:本研究采用电话随访结合主动随访;末次随访时间为2015年1月。
1.4统计学分析:应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计数资料的比较采用χ2检验，当某一个理论数1＜T≤5时，须对χ2进行连续性校正;患者生存率采用Kaplan-Meier法计算，并绘制生存曲线，两组生存率比较采用Log-rank检验。
2结果
2.1NOB1在不同组织中的表达:NOB1蛋白免疫组化主要表达于细胞质，呈黄色、棕黄色颗粒。在胃癌、癌旁胃组织及正常胃组织中均有不同程度的表达(图1);在胃癌组织中阳性表达率明显高于癌旁胃组织及正常胃组织(P＜0.05)。
2.2胃癌中NOB1表达与临床病理因素的关系:NOB1在胃癌组织中阳性表达与临床病理分期呈正相关，NOB1在胃癌Ⅲ、Ⅳ期组织中阳性表达率显著高于Ⅰ、Ⅱ期中阳性表达率(P＜0.05)(表2)。
2.3NOB1的表达与胃癌患者预后的关系:NOB1阳性表达者术后生存时间较阴性者明显缩短，NOB1表达与胃癌患者术后5年生存率呈负相关，Log-rank值为7.873(P＜0.05)。
3讨论
NOB1基因是酵母Nob1p基因的人类同源基因，编码412个氨基酸序列的RNA结合蛋白，该蛋白的N端含一个PIN(PilTaminoterminus)结构域，该结构域可参与核糖核酸酶功能，从而影响核糖体组装和蛋白质的合成;C端含一个ZNRD1(zincribbondomain-containing1，锌带)结构域，其在细胞周期的调节过程中发挥重要作用。NOB1通过PIN结构域参与核糖体小亚基的合成。40S核糖体小亚基的合成包括早期的核仁阶段的转录、rRNA修饰、在A2位点前体rRNA的剪切和晚期的胞质阶段在D位点前体rRNA剪切。NOB1通过PIN结构域可与小亚基20S前体rRNA结合，使核酸内切酶在前体核糖体剪切位点D剪切，促进18SRNA的成熟。NOB1表达异常导致18SRNA不能合成，20S前体rRNA堆积。核糖体合成的大量蛋白用于细胞的生长发育，NOB1异常将导致核糖体不能正确合成，从而影响细胞调控。故此认为，NOB1通过对核糖体合成的影响是参与细胞调控的主要因素。
NOB1可通过ZNRD1结构域参与细胞周期的调节。ZNRD1由1个三股的反平行片状结构和杂环构成，它是参与细胞的转录，并在转录中具有重要作用的结构域。有研究表明，ZNRD1是通过下调细胞周期素D1的表达将细胞增长阻滞于G1期，影响细胞生长和增殖。
泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的重要途径之一，通过降解细胞内某些具有生物活性的蛋白质，可调节细胞的分化、增殖;选择性降解癌基因、抑癌基因的相关产物、凋亡调控蛋白等，从而调控细胞突变。26S蛋白酶体是泛素-蛋白酶体途径的重要组成部分，由一个20S的蛋白酶体和2个19S的调节蛋白(RP)组成。描绘26S蛋白酶体的合成模型:Nob1p与19SRP形成Nob1p-19SRP复合体，并在细胞核内与20S蛋白酶体前体结合，分子伴侣Ump1p被降解，19SRP与20S蛋白酶体前体紧密连接，而Nob1p进入26S蛋白酶复合体内部降解。当产生新的蛋白酶体时Nob1p的转录重新开始。因此认为，NOB1蛋白介导核内20S蛋白酶体与19SRP的连接，促进了26S蛋白酶体的成熟。NOB1的表达异常可导致泛素-蛋白酶体途径失常，降低后者对细胞分化、增殖及癌基因、抑癌基因的相关产物、凋亡调控蛋白的调控能力。NOB1在甲状腺状癌、食管癌、结直肠癌、卵巢癌等多种肿瘤组织中高表达，提示NOB1与肿瘤的发生发展关系密切，但其与肿瘤临床病理特征关系并不完全相同。采用PCR和Western印迹法检测胰腺癌组织中NOB1基因mRNA及其编码蛋白的表达情况，结果发现:NOB1在胰腺癌组织中高表达，并与肿瘤大小呈正相关;而通过免疫组化检测NOB1在宫颈鳞癌中的表达情况，结果表明NOB1表达与患者肿瘤分化程度及是否淋巴结转移正相关，提示NOB1的表达与宫颈鳞癌的预后有关，有可能成为宫颈癌治疗的靶点及预后评估的重要指标。
本实验结果显示，NOB1在胃癌、癌旁胃组织及正常胃组织中出现不同程度的表达，在胃癌组织中表达明显高于在癌旁胃组织、正常胃组织中的表达，在癌旁胃组织及正常胃组织中表达无明显差异，表明NOB1表达增加可能促进了胃癌的发生。NOB1在胃癌的中的表达与肿瘤分期相关，提示NOB1可能在胃癌的侵袭、发展中发挥重要作用。通过对NOB1阳性表达率与胃癌患者随访结果进行分析发现，NOB1的表达与胃癌患者术后5年生存率呈负相关，提示NOB1表达与胃癌患者的病情进展密切相关。综上所述，NOB1不仅与胃癌的发生、侵袭关系密切，而且与预后存在一定关联;表明NOB1可能成为胃癌的新标志物，同时为胃癌的诊治提供了新思路。
目的: 构建pcdna3.1(?)/xapc7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系smmc?7721中的表达。方法: 采用pcr法从pet28b/xapc7重组质粒中克隆得到xapc7 cdna全长序列, 将之与pmd18?t载体连接、 测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcdna3.1(?)中。构建好的pcdna3.1(?)/xapc7真核表达质粒经酶切鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系smmc?7721, 经g418筛选, 得到阳性克隆细胞株, 再应用半定量rt?pcr技术检测转染前后该细胞株xapc7基因的mrna表达水平。结果: pcdna3.1(?)/xapc7经酶切鉴定及dna测序证实, 目的基因xapc7的序列完全正确, 真核表达载体构建成功; 经rt?pcr检测, 重组质粒转染株的xapc7基因mrna表达水平高于对照组, 证实xapc7基因已经稳定转染到smmc?7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因xapc7的稳定转染细胞株, 为进一步研究xapc7的功能奠定了实验基础。
【关键词】 真核表达质粒 smmc 7721 xapc7 构建 表达
xapc7基因编码人类蛋白酶体α7亚基（proteasome subunit, alpha type 7）, 该蛋白是20s蛋白酶体核心复合体的一个α亚基。作为蛋白酶体的一个亚基, xapc7编码产物参与了hbv、 hcv和hiv病毒的复制及多种蛋白质的降解, 并与hbx、 hif?1、 c?abl及arg等多种肿瘤相关的重要蛋白质相互作用; 同时该蛋白还参与膜蛋白的转运及对蛋白酶体活性的调节等; 此外本基因定位于20q13.33染色体, 既往研究提示人类肿瘤普遍伴随20 q的扩增[1, 2], 但xapc7在肿瘤方面的研究目前国内外鲜有报道。为了研究xapc7编码蛋白在肿瘤发生发展中的作用, 我们构建了重组人xapc7真核表达质粒, 并将其转染入人肝癌细胞系smmc?7721中, 以便进一步探讨其对肝癌细胞生长、 死亡以及浸润、 转移的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌dh?5α和人肝癌细胞系smmc?7721均由本实验室保存。原核重组表达质粒pet28b/xapc7由上海复旦大学季朝能教授提供。质粒小量抽提试剂盒及凝胶回收试剂盒购自优晶公司。限制性核酸内切酶bamh i、 xho i、 t4 dna连接酶、 dna mr标准(dl 2000)、 pmd18?t载体均购自大连宝生物工程有限公司。阳离子脂质体lipofectamine2000、 trizol试剂、 g418和pcdna3.1(?)真核表达载体购自invitrogen公司。新生牛血清(fbs)购自gibcobrl公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 为人xapc7基因克隆及半定量鉴定之用, 根据genbank的基因序列(nm_002792), 应用软件primer designer 5.0各设计一对克隆引物及半定量引物。克隆引物: 上游: 5′?ctcgagatgagctacgaccgc?3′; 下游: 5′?ggatcctgatgctttcttttgtttc?3′, 在上、 下游引物中分别引入xho i、 bamh i酶切位点, 扩增大小为747 bp的人xapc7 cdna全长序列; 半定量引物: 上游: 5′?gccatcaccgtcttctcg?3′; 下游 5′?gcccattgctctgcgtat?3′, 扩增片段长度为355 bp。内参照β?actin的引物序列为: 上游: 5′?tgtgacgtggacatccgcaaag?3′; 下游: 5′?tggaaggtggacagcgaggc?3′, 扩增片段为206 bp。所有引物均由invitrogen公司合成。
1.2.2 目的基因cdna的获取 以pet28b/xapc7原核重组表达质粒为模板进行pcr扩增, 反应体系, 质粒模板0.1 μl, 10×extaq pcr buffer 5 μl, dntp(2.5 mmol/l) 4 μl, 灭菌蒸馏水38.65 μl, takara extaq (5 u/μl) 0.25 μl, 上游引物(20 μmol/l) 1 μl, 下游引物(20 μmol/l) 1 μl; 反应条件: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 40 s扩增25个循环; 72℃延伸7 min。pcr产物电泳后, 切胶回收目的片段。
1.2.3 t载体克隆 用凝胶回收试剂盒回收纯化pcr产物, 并用pmd18?t载体连接试剂盒将目的片段与pmd18?t载体连接。连接反应体系为: solutioni 5 μl, pmd18?t dna 1 μl(约50 ng), pcr产物 1 μl(约50 ng), dh2o 3 μl, 置于16℃连接2 h后, 用大肠杆菌dh5α感受态进行转化。随机挑取几个单菌落, 用xapc7克隆引物进行菌落pcr检测, 将阳性克隆菌落扩大培养, 送至invitrogen公司测序。测序正确的克隆命名为: pmd18?t/xapc7。
1.2.4 真核表达载体pcdna3.1(?)/xapc7的构建 用bamh i、 xho i分别双酶切重组pmd18?t/xapc7质粒及pcdna3.1(?)空载体, 凝胶电泳后回收目的基因片段, 连接、 转化并挑取单菌落, 用xapc7克隆引物进行菌落pcr检测, 将阳性克隆菌落扩大培养, 提取重组质粒pcdna3.1(?)/xapc7。
1.2.5 细胞培养 smmc?7721细胞在含100 ml/l新生牛血清的rpmi1640培养液中, 于37℃ 50 ml/l co2饱和湿度的孵箱中培养。
1.2.6 smmc?7721细胞的基因转染和筛选培养 将处于对数生长期的smmc?7721细胞重悬于完全培养液中, 以3×105个细胞/孔接种于6孔板中, 培养24 h, 使细胞达到80%～90%融合。用脂质体lipofectamine2000分别介导空质粒及重组质粒转染细胞, 并设空白未转染组作对照（参照说明书）。转染24 h后采用不同浓度g418进行筛选, 以对照组细胞全部死亡时的g418浓度（800 mg/l）作为参照, 2周后g418改为400 mg/l维持筛选。用选择培养液（400 mg/l g418）培养4周后, 分离出存活的抗g418的阳性克隆, 最后用含100 ml/l新生牛血清的选择培养液扩大培养备用。
1.2.7 转染后真核表达的rt?pcr鉴定 以β?actin为内参照, 采用rt?pcr法用半定量引物扩增xapc7基因, 对转染细胞内目的基因的mrna表达情况进行鉴定。扩增产物用25 g/l的琼脂糖凝胶电泳观察图像。转染细胞总rna的提取、 rt?pcr的具体操作均按试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 xapc7目的基因的pcr产物鉴定 经20 g/l琼脂糖凝胶电泳, 在约750 bp处有明亮条带, 与预期目的片段大小一致（图1）。
图1 pcr产物20 g/l琼脂糖凝胶电泳（略）
m: dl 2000 dna marker; 1: xapc7.
2.2 t载体克隆的鉴定 目的基因与t载体连接后, 菌液pcr扩增产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定与目的基因大小相符, 表明所挑选的几个单菌落均为阳性克隆。菌液测序结果示: 装入t载体的序列与genbank上登录的人xapc7 cdna序列比较完全相符。
2.3 真核表达载体的构建与鉴定 将用bamh i、 xho i双酶切重组质粒pmd18?t/xapc7得到的目的基因插入pcdna 3.1(?)空质粒, 获得pcdna3.1(?)/xapc7真核表达质粒, 该质粒再经bamh i、 xho i双酶切鉴定, 得到了747 bp的目的片段和约5400 bp的载体片段（图2）, 送测序证实该质粒含有完全正确的xapc7 cdna序列。
图2 重组质粒pcdna3.1(?)/xapc7双酶切鉴定（略）
m: dl 2000 dna marker; 1-3: pcdna3.1(?)/xapc7.
2.4 稳定表达株的筛选与鉴定 在6孔板中将pcdna3.1(?)/xapc7质粒转染入人肝癌细胞系smmc?7721, 经4周选择性培养（400 mg/l g418）后, 得到了稳定表达目的基因mrna的阳性细胞株。筛选后的xapc7稳定表达细胞经半定量rt?pcr方法分析, 结果显示, 转染了pcdna3.1(?)/xapc7的smmc?7721细胞与对照转染空载体及未转染的smmc?7721细胞相比, 三者的β?actin表达水平差别不大, 说明rna总量基本一致。在25个循环内, 转染了pcdna3.1(?)/xapc7的smmc?7721细胞扩增后得到一条大小为355 bp的清晰条带, 而对照转染空载体及未转染的smmc?7721细胞则条带非常弱, 几乎看不到, 说明重组子已成功转入smmc?7721细胞并得到表达(图3)。
图3 各转染组细胞xapc7基因的mrna水平变化（略）
m: dl 2000 dna marker; 1: 空白未转染smmc?7721细胞组; 2: 转染pcdna3.1(?)空载体组; 3: 转染pcdna3.1(?)/xapc7组.
3 讨论
人类基因xapc7(又称c6、 hspc或rc6?1)编码人类蛋白酶体α7亚基psma7。其编码成员属于肽酶a t1a家族, 是蛋白酶体20s核心结构的α亚基。1996年huang等[3]以hbx为探针, 采用双酵母杂交法筛选hela细胞的cdna文库, 获得了xapc7的cdna, 并将其命名为xapc7。含248个氨基酸的xapc7与hc8(psma3)有33%的一致性, 并与果蝇的蛋白酶体亚基有高度的同源性。
研究表明xapc7可通过与hbx、 hif?1、 c?abl及arg等蛋白相互作用, 参与病毒复制、 蛋白酶体及转录因子的活性调控。有作者[4]研究证实, xapc7可与hbx相互作用。hbx与xapc7的相互作用是病毒复制的关键, hbx可能通过与xapc7相互作用干扰蛋白酶体复合物的活性, 从而导致hbv病毒的持续感染状态。另有研究报道xapc7与丙肝病毒内部白体进入位点的活化调节(ires)有关[5], 并在控制丙肝病毒翻译和下游的复制中发挥重要作用。同时有研究[6]提示hif?1α是xapc7的细胞靶标。xapc7通过与hif?1α的转录抑制区结合, 将底物hif?1α募集至蛋白酶体复合物中, 促进其转录子的非氧依赖性蛋白酶体途径的降解, 从而抑制hif?1α的转录。可见xapc7在hif?1的活性调节中发挥重要作用。liu等[7]则发现c?abl和arg的sh2区域可通过与xapc7结合而使其磷酸化,进而调节蛋白酶体介导的蛋白质的降解活性。表达磷酸化突变的xapc7细胞将出现g1/s过渡和s/g2进展受损, 氧化应激和电离照射可导致c?abl?xapc7复合物和磷酸化xapc7的形成增加。可见, c?abl和arg介导的xapc7的磷酸酪氨酸修饰调控着26s和20s蛋白酶体的活性。
尽管xapc7参与多种重要的肿瘤相关蛋白的表达及活性调节（如hbx、 hif?1、 c?abl及arg）, 但其本身在肿瘤的发生、 侵袭及迁移中究竟起怎样的作用？ 在肿瘤的发生中, xapc7是作为这些重要肿瘤相关蛋白的上游调控因子, 还是仅作为蛋白质降解的“垃圾处理站”而接受其他因子的调控？ shi等[8]采用serex技术在cdna表达文库中筛选到psma7阳性克隆, 进一步的表达谱芯片表明psma7在hcc样本中呈现表达上调, 实时定量rt?pcr结果16个配对原发性肝细胞癌标本和癌旁非肿瘤组织标本中有7个在肿瘤组织中高表达（44%）, 初步提示psma7是一个原发性肝细胞癌的肿瘤相关抗原。但psma7在肝癌中究竟充当何种角色目前尚不清楚。为此, 本实验中成功构建了能在人肝癌细胞系smmc?7721中表达的人xapc7基因真核表达载体, 为进一步研究xapc7基因对肿瘤细胞生物学功能的影响奠定了实验基础。同时本课题组正在制备抗xapc7 mab, 并构建rna干扰重组质粒, 从细胞增殖、 细胞周期、 细胞凋亡及对肿瘤细胞的侵袭迁移的影响等多方面考察本基因及其编码蛋白的功能。
致谢: 感谢上海复旦大学生命学院遗传所季朝能教授对本课题的协助和支持！
【参考文献】
[1] israeli o, goldring?aviram a, rienstein s, et al. in silico chromosomal clustering of genes displaying altered expression patterns in ovarian cancer[j]. cancer genet cytogenet, 2005, 160(1): 35-42.
[2] el?rifai w, frierson jr hf, moskaluk ca, et al. genetic differences between adenocarcinomas arising in barrett’s esophagus and gastric mucosa[j]. gastroenterology, 2001, 121(3): 592-598.
[3] huang j, kwong j, sun ec?y, et al. proteasome complex as a potential cellular target of hepatitis b virus x protein[j]. j virol, 1996, 70(8): 5582-5591.
[4] zhang z, torii n, furusaka a, et al. structural and functional characterization of interaction between hepatitis b virus x protein and the proteasome complex[j]. j biol chem, 2000, 275(20): 15157-15165.
[5] kruger m, beger c, welch pj, et al. involvement of proteasome alpha?subunit psma7 in hepatitis c virus internal ribosome entry site?mediated translation[j]. mol cell biol, 2001, 21(24): 8357-8364.
[6] cho s, choi yj, kim jm, et al. binding and regulation of hif?1α by a subunit of the proteasome complex, psma7[j]. febs lett, 2001, 498(1): 62-66.
[7] liu x, huang w, li c, et al. interaction between c?abl and arg tyrosine kinases and proteasome subunit psma7 regulates proteasome degradation[j]. molec cell, 2006, 22(3): 317-327.
[关键词] 肺腺癌；蛋白酶体抑制剂；A549细胞；Bcl-2；Bad
[中图分类号] R734.2；R730.54 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）12（a）-032-03
The effect and mechanism on the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with MG132
ZHU Yi, GONG Li, NIU Hongyan
Department of Chest Aurgery, the Second People's Hospital of Huai'an City Affiliated of Xuzhou Medical College, Jiangsu Province, Huai'an 223002, China
[Abstract] Objective: To study the apoptosis of adenocarcinoma of lung A549 cell treated with different concentrations of proteasomes inhibitor MG132, and to observe the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells. Methods: In vitro, A549 cells were exposed to 0, 5, 10, 20, 40 μmol/L of MG132. 24 hours later, the survival rate of A549 cells was detected with MTT chromatometry, flow cytometry detected the apoptosis rate of A549 cells, and the expression of Bcl-2 and Bad in A549 cells was measured with Western Blot. Results: MG132 caused the apoptosis of A549 cells in a concentration-dependent manner, the survival rate of cells was gradually decreased while the apoptosis rate of cells was increased after 24 hours exposure to MG132. Meanwhile, the expression of Bcl-2 was decreased, and the Bad expression was unchanged in A549 cells. Conclusion: MG132 could induce A549 cells apoptosis partly through depressing the expression of Bcl-2, but not promoting Bad expression.
[Key words] Adenocarcinoma of lung; Proteasomes inhibitor; A549 cell; Bcl-2; Bad
近几十年来，肺癌的发病率和死亡率不断升高。在1998~2002年，肺癌的发病率和死亡率在我国大多数地区居恶性肿瘤的首位[1]；而在2002年肺癌的新病例和死亡人数在全世界也居恶性肿瘤首位[2]。肺癌的病理分型出现腺癌比例增加的趋势。在生物体内蛋白质进行选择性降解的重要途径之一是泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin proteasome pathway，简称UPP 通路），它在调节细胞凋亡过程中的作用非常重要[3-4]，在研究UPP在细胞凋亡中的作用时，蛋白酶体抑制剂（MG132）的应用为我们提供了有力的手段。有研究表明，蛋白酶体抑制剂能够诱导多种人肿瘤细胞的凋亡是通过阻断泛素化通路而实现，但其具体作用机制到目前仍未被阐明[5-6]。该研究应用体外培养的人肺腺癌细胞株A549，并且给予不同浓度的MG132处理，观察其对A549细胞凋亡率的影响，以及细胞内Bcl-2和Bad蛋白表达水平的变化。探讨MG132调控A549细胞凋亡的可能机制，为进一步研究MG132诱导A549凋亡的机制和其他类型肺癌以及其他肿瘤的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 A549细胞和试剂
人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。新生牛血清（NBS，杭州四季青生物工程材料研究所）；RPMI-1640培养基（Gibco公司）；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒（上海博蕴生物试剂有限公司）；MG132、一抗Bcl-2和Bad、MTT（Sigma公司）。
1.2 细胞培养及处理
将A549细胞常规复苏后，以RPMI-1640培养液加10%NBS培养，放入37℃、5%CO2的培养箱内培养，细胞传2~3代后按照需要接种于不同培养板中，当细胞融合密度约70%时，换无血清的RPMI-1640培养液培养，MG132在给药前应用RPMI-1640培养液现配。并且进一步稀释使其在培养液中的终浓度为：0、5、10、20、40 μmol/L，并设空白对照组（不做任何处理）。培养24 h，检测相关指标。
1.3 MTT比色法检测细胞存活率
细胞按照需要接种于96孔板，处理方法同“1.2”所述，将培养24 h后的每组细胞，每孔中加入MTT 20 μl（PBS配制、5 g/L）。4 h后终止培养，吸弃所有液体，再加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）200 μl充分溶解，静置于37℃条件下30 min。用酶标仪测定570 nm光密度（OD）值，计算细胞存活率（即每组OD值/正常对照组OD值×100%＝该组的细胞存活率）。
1.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）
将传代后细胞接种于培养瓶内，处理同方法“1.2”所述。培养24 h后收集细胞，应用胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白，测蛋白后分装，保存于-80℃冰箱中备用。将等量蛋白以10%聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，半干转法至NC膜上，随后经5%脱脂奶粉封闭，室温下1 h，加入稀释的一抗Bcl-2（1∶300）和Bad（1∶300），4℃条件下过夜。第2日晨复温30 min，常规方法洗膜，NBT/BCIP显色，双蒸水洗膜终止反应。应用图像处理仪（Gene Company）扫描结果，Image J软件进行半定量分析。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率
细胞传代后接种于6孔板，处理方法同“1.2”所述。培养24 h，吸尽培养基，用胰蛋白酶（0.25%）消化细胞后收集，磷酸盐缓冲液（PBS）液洗2次，每组细胞收集为1管，每管加入凋亡试剂盒中的结合缓冲液将细胞重悬，随后将细胞转移到试管中。每管再分别加入10 μl的PI和5 μl的Annexin V-FITC。避光，室温放置5 min，流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，Sigma Plot 2000作图。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用最小显著差（LSD-t）法，以P
2 结果
2.1 MG132对A549细胞成活率的影响
MTT法检测结果显示，随着MG132浓度的增加A549细胞存活率逐渐下降（表1），呈现浓度依赖性关系。并且，与正常对照组比较，除了0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
表1 MG132对A549细胞存活率的影响（n=5）
注：与空白对照组比较，*P＜0.05
2.2 MG132对A549细胞凋亡率的影响
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示，空白对照组A549细胞凋亡率约（4.0±1.4）%，0 μmol/L组凋亡率为（4.1±1.7）%、5 μmol/L组凋亡率为（12.2±2.1）%、10 μmol/L组凋亡率为（26.3±2.9）%、20 μmol/L组凋亡率为（33.1±3.0）%、40 μmol/L组凋亡率为（54.2±4.7）%，与空白对照组比，除0 μmol/L组外，其余各组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。
2.3 MG132对A549细胞中Bcl-2和Bad蛋白的影响
Western Blot结果显示，随着MG132的浓度增高A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低（图1A），除0 μmol/L组外，其余各组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而促凋亡蛋白Bad的表达在各组中无明显变化（图1B）。与空白对照组比，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。
A代表Bcl-2在各组中的表达，B代表Bad在各组中的表达；与空白对照组比，*P＜0.05，与空白对照组比，#P＞0.05
图1 Western Blot检测细胞内Bcl-2和Bad蛋白的表达
3 讨论
泛素-蛋白酶体通路[7]（UPP）调控着真核生物细胞内绝大部分蛋白质的降解过程，参与细胞转录、蛋白质稳定、蛋白质降解、细胞凋亡、应激反应和受体胞吞等多种生理过程，能够通过多种途径影响细胞周期的进行，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统。MG132[8]（Z-Leu-Leu-Leu-CHO，三肽基乙醛）可以抑制UPP途径介导的蛋白质降解，是一种常用的肽醛类26S蛋白酶体抑制剂，如影响NF-κB、调节细胞内凋亡信号通路、调节细胞周期相关蛋白和凋亡调控蛋白等过程，从而抑制细胞的增殖促进细胞凋亡，是很有发展前途的抗肿瘤药物。也有研究表明：与凋亡调控相关的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均与UPP有关[9-10]。在本研究中笔者特别关注Bcl-2家族在UPP通路中的作用，在细胞凋亡调控机制方面，Bcl-2是迄今研究最广泛而深入的凋亡调控基因之一，在细胞凋亡中起着非常重要的作用，Bcl-2能够抑制细胞凋亡，而Bad则促进细胞的凋亡，是该家族中两组作用相反的蛋白。本研究应用体外培养的A549人肺腺癌细胞，给予不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132处理一段时间后，检测细胞凋亡率的变化，同时观察对细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白表达水平的影响，初步探讨在A549细胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的机制。
该研究结果显示，随着MG132浓度增加A549细胞的凋亡率逐渐增加，并且细胞中Bcl-2蛋白的表达水平也逐渐降低。同时在笔者的实验中也发现，Bad蛋白的表达水平在各组中没有明显变化。因此，笔者推测，MG132可能是通过减少Bcl-2蛋白的表达诱导A549细胞凋亡，而Bad蛋白似乎不参与MG132诱导A549细胞凋亡的作用。Pigneux 等[11]发现MG132 能够明显地增强一种抗肿瘤药物（IDA）诱导白血病细胞的凋亡， 而此作用是通过上调促凋亡蛋白Bim和Bax的表达实现。Yan等[12]观察到MG132 处理的MG-63细胞内除了Caspase-8活性增加、p27聚集外，Bcl-2和Bax比值也明显增加， 说明Bcl-2家族蛋白之间的比例失衡可能也是MG132诱导细胞凋亡的机制之一。Guzman等[13]发现MG132能够诱导人白血病细胞的凋亡， 而对正常的白细胞几乎没有作用。MG132与目前大多数的抗肿瘤药物对细胞无选择性的杀伤作用有明显的不同，因此笔者设想，蛋白酶体抑制剂的应用为肿瘤的治疗提供了新的方向。
然而，对于MG132其抑制肿瘤的作用和机制还有很多需要回答的问题，例如其是否还影响Bcl-2家族中其他成员的表达；是否影响另外两个与凋亡相关的家族蛋白Caspase家族和凋亡抑制蛋白（IAP）家族成员的表达，以及其与临床常用的抗肿瘤药物有何差异等，这些问题还有待于在以后的研究中深入探讨。
[参考文献]
[1] 陈万青,张思维,李连弟,等.中国部分市县1998-2002年肺癌的发病与死亡[J].中国肿瘤,2006,15(9):570-574.
[2] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.
[3] Asams J. The proteasome: structure, function, and role in the cell [J]. Cancer Treatment Reviews,2003,29:3-9.
[4] Podar K, Gouill SL, Zhang J, et al. A pivotal role for Mcl-1 in Bortezomib-induced apoptosis [J]. Oncogene,2008,27(6):721-731.
[5] 张卫国,吴清明,于皆平,等.泛素-蛋白酶体抑制剂对食管癌细胞增殖的影响[J].中国药理学通报,2004,20(3):355-356.
[6] Adams J, Palombella VJ , Sausville EA, et al. Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents [J]. Cancer Research,1999,59:2615-2622.
[7] Wu HJ, Zhang ZG. Ubiquitin-Proteasome pathway and its significance [J]. Journal of International Pathology and Clinical Medicine,2006,26(1):7.
[8] Inoue S, Nakase H, Mat suura M, et al. The effect of proteasome inhibit or MG132 on experimental inflammatory bowel disease [J]. Clinical and Experimental Immunology,2009,156(1):172.
[9] Melikova MS, Kondratov KA, Kornilova ES. Two different stages of epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis are sensitive to free ubiquitin depletion produced by proteasome inhibitor MG 132 [J]. Cell Biol Int,2006,30(1):31-43.
[10] Letoha T, Somlai C, Takacs T, et al. The proteasome inhibitor MG132 protects against acute pancreatitis [J]. Free Radic Biol Med,2005,39 (9):1142-1151.
[11] Pigneux A, Mahon FX, Moreau Gaudry F, et al . Prot easome inhibit ion specifically sensitizes leukemic cel ls to anthracyclin-induced apoptosis through the accumulat ion of Bim and Bax pro-apoptotic proteins [J]. Cancer Biol Ther,2007,6(4):603-611.
[12] Yan XB, Yang DS, Gao X, et al. Caspase- 8 dependent ost eosarcoma cell apoptosis induced by prot easome inhibitor MG132 [J] . Cell Biol Int,2007,31(10):1136-1143.
[13] Guzman ML, Neering SJ, Upchurch D, et al. Nuclear factor kappa B is constitutively activated in primitive human acutemye logenous leukemia cells [J]. Blood,2001,98(8):2301-2307.
关键词：蛋白；泛素/26S蛋白酶体；原核表达；抗体
中图分类号：Q511 文献标识码：A
Purification of Arabidopsis Rad23 Recombinant
Protein in Engineering Bacteria
and Preparation of Its Polyclonal Antibody
LI Xiu-shan, LIU Bin, ZHAO Li-jian, TANG Dong-ying,
ZHAO Xiao-ying, LIU Xuan-ming
(College of Biological Sciences, Hunan Univ, Changsha, Hunan 410082，China)
Abstract:Rad23 gene which participates in ubiquitin/26S proteasome pathway in Arabidopsis， is known to play important roles in plant development and responses to hormone. In order to study its function and molecular mechanism, an expression vector pCold-Rad23 was constructed and transformed into E. coli BL21. Then the recombinant fusion protein was induced by IPTG.The results of SDS-PAGE have shown that Rad23 fusion protein existed in a soluble form with a relative molecular mass 94 ku, which is fit for the molecular mass supposed from gene coding frame. Finally, the Rad23 recombinant fusion protein was used as an antigen to prepare polyclonal antiserum in mice. The western blot results have shown that the polyclonal antiserum has high specificity and can react to the native protein expressed in different tissues of Arabidopsis.
Key words:protein; ubiquitin (Ub)/26S proteasome; prokaryotic expression; antibodies
蛋白泛素化是真核细胞内广泛存在的一种蛋白翻译后修饰方式，其在基因表达调控、细胞周期调控、DNA损伤修复及细胞凋亡等多种生物途径中发挥重要作用 ［1-2］.研究表明，作为一种复杂且高度调控的过程，蛋白质泛素化需要3类酶参与催化，这3类酶分别称为E1―泛素激活酶，E2―泛素耦联酶，E3―泛素连接酶.泛素化的整个过程大致如下：在ATP的参与下，E1的半胱氨酸活性位点与泛素C末端的甘氨酸首先形成硫酯键；接着，连接在E1上的泛素被转移到E2的活化半胱氨酸位点；最后在E3的催化下，泛素C末端与底物某个位点的赖氨酸氨基结合并被蛋白酶体识别和降解［3-6］.
目前已在拟南芥中发现有上千种基因表达产物具有泛素连接酶E3的功能［7-9］，它们主要通过介导泛素/26S蛋白酶体途径，参与26S蛋白酶体调控细胞内大多数蛋白质的降解［10-11］.如Rad23(radiation sensitivity protein-23)就是其中的一种，该蛋白N端具有一个能够和蛋白酶体结合的UBL(ubiquitin-like)区域，C端含有二个可和ubiquitin结合的UBA(ubiquitin-associated) 区域，其中起主要调控作用的是位于C端中心区域UBA1，去掉靠近C端末尾的UBA2区域并不影响ubiquitin结合功能［12-13］.这些特定结构域的存在，使得Rad23蛋白能通过选择性的与其他蛋白特定位点的结合，精确地调控蛋白泛素化，为泛素蛋白酶体精确调控相关蛋白降解奠定了基础.
1 材料和方法
1.1 材 料
主要试剂：限制性核酸内切酶Xho I，EcoR I，Taq DNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶为MBI公司产品.ELISA试剂盒、HRP 标记的羊抗鼠IgG均购自杰辉生物技术有限公司.RPMI1640和胎牛血清购于Invitrogen公司，弗氏佐剂购于Sigma公司.载体与菌株：菌株E.coli DH5α,E.coli BL21(DE3) 和Sp2/0细胞由本实验室保存，质粒pCold-TF购买于TaKaRa公司.实验动物：昆明小白鼠购自中南大学动物实验中心.
1.2 方 法
1.2.1 重组质粒构建与鉴定
公司pCold-Rad23重组表达质粒的构建与鉴定，以AT5G38470基因为模板，上游引物5′-CCGCTCGAGATGAAGATTTTCGTGAAGACT CTCA-3′(引入Xho I酶切位点) ，下游引物为5′-CCGGAATTCTTATTGATCTTCAAACTCATGC-3′(引入EcoR I酶切位点) .PCR 扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30 个循环；72 ℃后延伸10 min.用Xho I和EcoR I分别双酶切PCR 产物和pCold 原核表达载体，回收的酶切产物用T4连接酶连接后转入大肠杆菌DH5a中培养，挑取单克隆进行酶切及测序鉴定.
1.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
将构建的重组质粒pCold-Rad23 转化到宿主菌BL21中，取1 mL经不同摩尔浓度IPTG诱导处理的细菌离心，去上清后加入SDS凝胶上样缓冲液100 ℃煮沸5 min，12 000 r/min室温离心5 min，取20 μL 进行SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达.
1.2.3 镍柱亲和层析分离纯化重组表达蛋白
将1 L经0.6 mmol/L IPTG诱导处理的pCold-Rad23阳性菌(BL21)收集离心，去上清后将沉淀重悬于Lysis buffer中4 ℃超声波粉碎，12 000 r/min 离心，取上清和Ni2NTA agarose 混合，4 ℃条件下搅拌1 h，经咪唑浓度梯度法分离纯化蛋白(咪唑摩尔浓度分别为10，50，100，150，250 mmol/L )，纯化蛋白用透析法去除咪唑，透析后的蛋白分装冻存于-80 ℃.
1.2.4 拟南芥白提取
分别取野生型拟南芥的根、茎、叶、花组织2 g，加入4 mL提取缓冲液，匀浆破碎细胞，经三层滤膜过滤后弃去沉渣，将上清液350 g，4 ℃，8 min离心，弃去上清，沉淀用含l%TritonX-100的提取缓冲液重悬；350 g，4 ℃离心8 min，弃去上清，沉淀再用提取缓冲液重悬；350 g，4 ℃离心8 min，收集沉淀并加入100 μL上样缓冲液(2×)，混匀，金属浴加热10 min, -20 ℃保存.
1.2.5 蛋白质印迹检测
以纯化前后的pCold-Rad23蛋白样品和拟南芥不同组织提取的蛋白经SDS-PAGE电泳，然后将PVDF膜放甲醇溶液中浸泡5 min后，将膜和6张滤纸均用DTB缓冲液浸泡5 min，然后放置在半干转移仪上进行转移.转移1 h后，将膜用5%牛奶液封闭1 h.用PBST洗膜3次后，以鼠血清(将鼠血清按1∶3 000稀释)为一抗温育1 h；洗膜后以HRP标记的羊抗鼠多抗(1∶3 000稀释)为二抗温育1 h；PBST液洗膜3次后，加入显色液A和B显色1 min，然后显影.
2 结 果
2.1 pCold-Rad23重组表达质粒的构建与鉴定
琼脂糖凝胶电泳检测以Rad23(AT5G38470)基因为模板进行PCR扩增的产物，可见大小为1 100 bp左右的特异性片段(图1（a）).将双酶切的PCR产物和pCold-TF大片段连接过夜后转化E. coli TOP10感受态细胞，提取经菌落PCR鉴定为阳性的克隆质粒DNA，XhoⅠ和EcorⅠ双酶切结果表明：阳性质粒可切出约1 137 bp的目的片段(图1（b）)，将该片段进行测序后与NCBI提供的序列相比对，发现测序结果与检索序列完全一致.
2.2 pCold-Rad23蛋白诱导表达
将鉴定正确菌株，接种到LB培养基中，摇菌2 h后，加入不同浓度的IPTG，比较IPTG诱导浓度对融合蛋白表达影响的结果发现：诱导24 h后，即在约94 ku处有目的蛋白条带的出现，重组蛋白对IPTG浓度变化(从0.2 mmol/L到1.0 mmol/L)不敏感(图2)，但未加入IPTG条件下，重组目的蛋白
基本没有诱导表达.随后，通过对构建的重组蛋白分别在不同温度、不同时间和不同OD值条件下诱导，结果发现：在不同诱导温度下，低温(0~13 ℃)和较高温度(18~30 ℃)下蛋白表达较少，蛋白表达最适合温度为15 ℃.重组蛋白表达量受诱导时间(从2 h到30 h)和诱导菌液OD值(从OD0.2到OD1.4)影响较大(数据另文发表).
2.3 pCold-Rad23蛋白纯化
诱导24 h的菌体蛋白经6×His标签亲和层析吸附后，利用不同浓度咪唑(从10 mmol/L到100 mmol/L)梯度洗脱，将收集液体经12％SDS-PAGE分离，结果显示：在10 mmol/L咪唑下目的蛋白和杂蛋白都被洗脱下来，而在50 mmol/L咪唑浓度条件下，很少有目的蛋白被洗脱下来，说明在10 mmol/L咪唑浓度下蛋白还有未完全结合的目的蛋白，而在100 mmol/L咪唑浓度梯度下的目的蛋白被大量洗脱下来(图3)，而且杂蛋白很少，利用咪唑浓度梯度法，得到了较纯的94 ku目的条带 (图3)，所制得的重组抗原可以用于免疫动物制备抗血清.
2.4 Western-blotting 鉴定
为了检测制备血清的特异性，我们利用Western-blotting考察了该血清对纯化前后重组蛋白的识别效果.从实验结果(图4)可以看出：多克隆血清与重组蛋白杂交后可在胶片上产生特异性条带，分子质量为94 ku左右，条带大小与预期重组蛋白太小完全相符.此外，我们进一步考察了多克隆血清识别拟南芥细胞Rad23蛋白的可能性，从实验结果(图4)发现：拟南芥的不同组织样品蛋白均能与制备的抗体特异性作用，在分子质量为40 ku的位置均能产生特异性条带，与推测拟南芥Rad23蛋白的分子质量一致，在检测的样品中，该基因在花中表达最多，茎中较少，这些结果证明制备的抗体具有高特异性.
3 讨 论
本研究利用分子克隆了Rad23基因，并采用原核高效表达载体表达了pCold-Rad23蛋白.该载体系TaKaRa公司最近推出的一种新的高效表达载体，它含有一个cspA(cold shock pretein A)启动子能够促进重组蛋白在低温下大量表达，同时在低温条件下亦可抑制其他杂蛋白表达，有趣的是该载体还含有一个TF结构的伴侣蛋白，该结构能促进融合目的蛋白的正确折叠，有利于重组蛋白在上清中表达.与现阶段一些原核表达载体相比，该载体特有的结构不仅能促进目的蛋白在上清高效表达，还可降低其他杂蛋白的产生，为下一步纯化提供了便捷.
在酵母中已开展了许多关于Rad23蛋白家族功能研究工作，但在植物体内其具体作用机制还不是很清楚，为进一步研究植物体内Rad23蛋白的具体功能和相关作用机制，本实验室构建了pCold-Rad23基因重组蛋白，并制备了具有高效特异的抗体，该抗体不但能识别重组蛋白，还特异性识别植物体内的天然蛋白，WB鉴定发现该天然蛋白主要在拟南芥花和叶中表达较多，而在植物的茎中表达较少，这可能与该基因家族具有抗紫外修复功能有关.最近研究报道发现Rad23基因家族参与了泛素/26S蛋白酶体途径［11］，参与相关蛋白的调控，但其具体作用机制还不是研究得很清楚，还需进一步对Rad23蛋白在植物体内作用机制开展研究.
参考文献
［1］ SMALLE J,VIERSTRA R D.The ubiquitin 26S protesome proteolytic pathway［J］. Annu Rev Plant Biol,2004,55(11):555-560.
［2］ PICKART C M. Back to the future with ubiqutin［J］. Cell,2004,116(2):181-190.
［3］ WEISSMAN A M.Themes and variations on ubiquitylation［J］. Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(3):169-178.
［4］ ROBINSON P A,ARDLEY H C. Ubiquitin protein ligases［J］. Cell Sci,2004,117(5) :191-194.
［5］ REED S H,GILLETTE T G.Nucleotide excision repair and the ubiquitin proteasome pathway-do all roads lead to Rome［J］.DNA Repair,2007,6:149-156.
［6］ VIERSTRA R D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(11)：385-397.
［7］ WILKINSON K D. Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome［J］. Semin Cell Dev Biol,2000,11(3):141-148.
［8］ DOHERTY F J,DAWSON S,MAYER R J. The ubiquitin proteasome pathway of intracellular proteolysis［J］. Essays Biochem,2002, 38(8):51-63.
［9］ MOON J, PARRY G, ESTELLE M.The ubiquitin-proteasome pathway and plant development［J］.The Plant Cell,2004,16(6):3181-3195.
［10］ELSASSER S, FINLEY. Delivery of ubiquitinated substrates to protein-unfolding machines［J］. Nat Cell Biol,2005,7(8):742-749.
［11］LISA M,FARMER,VIERSTRA R D.The RAD23 family provides an essential connection between the 26s proteasome and ubiquitylated proteins in arabidopsis［J］. Plant Cell, 2010,22(10): 124-142.
［12］RAO H,SASTRY A.Recognition of specific ubiquitin conjugates is important for the proteolytic functions of the ubiquitin-associated domain proteins Dsk2 and Rad23［J］.J Biol Chem,2002,277(14):11691-11695.
关键词：硼替佐米；DU145细胞；人类前列腺癌；DR5；Fas
前列腺癌是一种极易发生侵袭和转移的男性泌尿生殖系统肿瘤。激素非依赖性前列腺癌临床上尚无一种有效的治疗手段，现在正期待着有效的治疗药物的产生[1]。硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，曾有研究也验证了硼替佐米在实体瘤的应用[2]，但硼替佐米对激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖和凋亡的影响的研究较少，本文拟用激素非依赖性前列腺癌细胞系DU145验证硼替佐米对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能机制。
1资料与方法
1.1一般材料 硼替佐米（Millennium Pharmaceuticals，USA），细胞毒性检测CCK-8试剂盒（Dodindo，Japan）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（南京凯基试剂公司，China）。
1.2方法
1.2.1细胞培养方法及条件 DU145细胞用含10%的FBS的RPMI 1640培养基，在37℃、5% CO2的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁。
1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖 DU145细胞37℃，5% CO2条件下培养24h。细胞贴壁后，各实验组分别加入不同浓度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米。继续培养24、48、72h。DU145细胞用完全培养基作为阴性对照孔，每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养2h，在酶联免疫检测仪OD 450 nm处测量吸光值。细胞增殖率（%）=（实验组OD值-对照组OD值）/对照组OD值×100%。
1.2.3 AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡 DU145细胞种入6孔板中，贴壁24 h。不同浓度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米处理DU145细胞24 h，用AnnexinV- FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测测定处理后细胞的凋亡情况。
1.3统计学分析 所有数据均为3次独立实验结果，以均值士标准差（x±s）表示。采用SPSS11.5软件进行统计学分析。两组之间比较采用t检验，多个样本之间进行方差分析，P
2结果
2.1硼替佐米抑制了DU145细胞的增殖 DU145细胞暴露于不同浓度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米后24、48、72 h后，用CCK-8法分析肿瘤细胞的增殖情况。细胞在用硼替佐米15或20 nmol/L的浓度孵育48 h后显著的降低了增殖活性，见表1。
2.2硼替佐米能够诱导DU145细胞凋亡 DU145细胞暴露于不同浓度（0、5、10、15、20、25 nmol/L）硼替佐米24 h， Annexin-V/propidium iodide法分析凋亡情况。在用15 nmol/L或更高浓度的硼替佐米处理后，DU145细胞显示了很明显的凋亡增加，见图1、表2。
图1 硼替佐米对前列腺癌细胞DU145凋亡的影响
2.3硼替佐米对DU145细胞DR5蛋白表达水平的影响 DU145细胞暴露于0 nmol/L或20 nmol/L硼替佐米24 h，流式细胞术检测蛋白表达水平。结果显示，随着硼替佐米浓度的增加，DU145细胞显示了明显的DR5蛋白表达水平的增加，见图2。
图2 硼替佐米对DU145细胞DR5 蛋白表达水平的影响
注：灰线为未处理组，黑线为20 nmol/L硼替佐米处理组。
2.4硼替佐米对DU145细胞Fas蛋白表达水平的影响 我们将DU145细胞在正常条件下培养或用20 nmol/L硼替佐米处理24h后用PE连接的抗Fas抗体标记细胞。用流式细胞仪分析Fas蛋白在细胞表面表达水平。发现硼替佐米处理后，上调了DU145细胞表面Fas蛋白的表达水平，见图3。
图3 硼替佐米对DU145细胞Fas蛋白表达水平的影响
注：灰线为未处理组，黑线为20 nmol/L硼替佐米处理组。
3讨论
26S蛋白酶体是一种复杂的酶类，在所有的真核细胞胞核和胞浆中表达，通过泛素连接来降解靶蛋白[3]。蛋白酶体对维持内环境的稳定起了重要作用。这些作用使它成为了一种有潜力的肿瘤治疗靶点[4]。本研究我们证明了在激素非依赖性前列腺癌细胞中，硼替佐米以浓度和时间依赖的方式抑制了DU145细胞的生长。并证明了>15 nmol/L浓度时硼替佐米能够显著的诱导前列腺癌细胞的凋亡。
据报道，蛋白酶体抑制参与大范围的细胞效应，包括NFκB的活化[5]、减少c-FLIP的表达，累积前凋亡蛋白Bik，通过细胞内的凋亡通路活化caspase-3等[6]。为了验证硼替佐米是否也能通过外源性凋亡途径促进肿瘤细胞的凋亡，在这里，我们发现硼替佐米处理后的DU145细胞死亡受体DR5和Fas的蛋白表达水平明显增加 。这证明了硼替佐米可部分通过增加死亡受体DR5和Fas的表达来诱导前列腺癌细胞的凋亡。通过本研究，我们可以更深刻的认识硼替佐米的抑瘤作用，为激素非依赖性前列腺癌的治疗提供新的策略。
参考文献：
[1]Popiolek M， Rider JR， Andrén O， et al. Natural history of early， localized prostate cancer： a final report from three decades of follow-up. Eur Urol. 2013， 63（3）：428-435.
[2]Blaney S M， Bemstein M， Neville K， el al. Phase 1 study of the proteasome inhibitor bortezomib in pediatric patients with refractory solid tumor：a Children's Oncology Group study. Clin Oncol. 2004；22（23）：4804-4809
[3]Pickart C M. Back to the future with ubiquitin. Cell. 2004；116：181-190.
[4]Goldberg A L， Stein R， Adams J. New insights into proteasome function： from archaebacteria to drug development. Chem Biol. 1995；2：503-508.
[5]Zwickl P. The 20s proteasome. Cur Top Microbiol Immunol. 2002； 268：23-3l