热休克蛋白范文

时间:2023-03-09 05:49:33

热休克蛋白范文第1篇

细菌、病毒等许多微生物都有可能感染人体,这之后大致有两种结局:急性感染和慢性感染。微生物慢性感染不仅会导致各种炎症等疾病,而且还可诱发肿瘤,例如胃幽门螺旋杆菌感染可引起胃癌。在对微生物感染研究取得进展以前,人们普遍认为,微生物感染是对人体健康有害的。然而,越来越多的证据却表明:病原微生物持续存在的慢性感染对人体有害,而感染的微生物最终被清除的急性感染则可能会给人体带来益处。

早在17世纪末,科利(Coley)等人就尝试使用化脓链球菌提取物注射的方法治疗肿瘤患者,这种治疗会引起患者产生39℃的高烧,而高烧能够起到杀死肿瘤细胞的作用,对部分患者有很好的疗效。后来,又有人尝试使用大肠杆菌、牛型分枝杆菌、埃及病毒等微生物治疗各种肿瘤,也都取得了一定的疗效。微生物感染治疗肿瘤既然有这么好的效果,为什么没有应用到肿瘤的临床治疗中呢?由于这些早期临床试验是直接用微生物感染患者或使用微生物粗提取物向患者注射,这些治疗方式都存在一定的安全隐患,而且在那时,研究人员对微生物抗肿瘤的机制还不清楚,这些原因直接或间接地阻断了利用微生物感染治疗肿瘤的尝试。

热休克蛋白免疫功能的发现

随着分子免疫学的发展,人们逐渐认识到,我们身体中有一种T淋巴细胞(也称T细胞),该细胞对于消灭肿瘤至关重要。然而,T细胞对肿瘤的活化和杀伤需要满足两个条件,一是识别什么是肿瘤细胞,二是需要炎症因子的刺激。那么T细胞是如何识别肿瘤细胞的呢?原来,急性微生物感染通常引起发热等症状,肿瘤细胞相对于正常细胞而言不耐热,因此身体发热可杀死肿瘤细胞并诱导身体产生一种应对高温的蛋白――热休克蛋白,热休克蛋白结合肿瘤的抗原(即携带肿瘤细胞的“指纹信息”),并将结合的肿瘤抗原最终呈递给T细胞(即将肿瘤指纹信息“告诉”T细胞)。因此,T细胞就能识别肿瘤细胞并将其杀伤和清除。

T细胞的活化还需要炎症因子。那么,炎症因子是如何产生的呢?我们的身体细胞表面和细胞内部存在许多模式识别受体,模式识别受体具有识别外来微生物的特异性。一旦发现外来感染的微生物,就会刺激细胞产生炎症因子,以对抗微生物的感染。炎症因子实际上和我们通常说的发炎密切相关,在微生物感染的情况下,身体会大量产生炎症因子。这些炎症因子会促进T细胞生长,从而有助于对肿瘤细胞进行杀伤和清除。研究发现,热休克蛋白本身能作用于多种模式识别受体,进而产生炎症因子,这会进一步刺激杀伤肿瘤的T细胞的生长,发挥抗肿瘤的作用。

基于对热休克蛋白在激活抗肿瘤T细胞免疫功能中的认识,近年来,用热休克蛋白gp96治疗肿瘤的临床试验相继在美国、英国、德国的医院或癌症中心展开研究。目前,热休克蛋白主要用于肾癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、胃癌、肺癌等肿瘤的治疗,临床试验结果发现,其对于治疗恶性肿瘤安全有效,能显著延长肿瘤患者的生存期,部分患者甚至能治愈。目前,美国食品药品监督管理局和欧盟药监局已经批准利用热休克蛋白gp96自体免疫治疗黑色素瘤、肾癌、脑瘤等多种肿瘤。值得一提的是,2009年4月,世界疫苗大会将“热休克蛋白自体肿瘤治疗疫苗”评价为目前最好的恶性肿瘤治疗性疫苗,这使得利用微生物感染治疗肿瘤这一古老的方法重新焕发出了勃勃生机。

肿瘤也可

预防吗?

热休克蛋白范文第2篇

[关键词]热休克蛋白;特性;序列分析

1 热休克蛋白的介绍

1.1 热休克蛋白国内外研究现状

1.1.1热休克蛋白

热休克蛋白又称热应激蛋白,是机体在应激情况下细胞内迅速合成的一组蛋白质,具有高度的保守型以及应激性,普遍存在于从细菌到人的整个生物界中。当生物细胞在受热、受损、应激刺激(如缺血、缺氧、重金属离子、射线、病毒感染、DNA损伤等)作用下,都会发生热休克反应,抑制一些正常蛋白质的合成、折叠,致使疏水区暴露相互聚集结合形成不溶性沉淀,与此同时细胞启动热休克蛋白基因,合成热休克蛋白,阻止蛋白的相互结合。

小分子量Hsp家族蛋白质降解,类杭原加工.淋巴细胞回巢.自身免疫性。其中,Hsp70家族是生物体内最保守的和最重要的热休克蛋白家族,它在原核生物和真核生物体内都存在,并存在于所有的细胞区室和器官中。

1.2热休克蛋白70

1.2.1热休克蛋白70

Hsp70家族是分子量在70KDa左右的热休克蛋白,其不仅能在热胁迫下表达,而且也组成性的存在于所有的活体细胞中。Hsp70家族是Hsp中最保守的一类。Hsp70家族主要包括结构型Hsc70和诱导型Hsp70两种类型。当谈及Hsp70时就是指Hsp70和Hsc70。这两种蛋白质的氨基酸序列有90%是相同的,它们的生化性除了电泳泳动度稍有差异外,其它大部分特性也是相同的。

1.2.2热休克蛋白70的特性:

Hsp70家族的成员由于其氨基酸有很高的同源性、蛋白结构上的相似性,所以它们具有一些共同的生物学性质。Hsp70家族具有弱的ATP酶活性,与肌肉的肌动蛋白结构很相似,当ATP酶活性被激活时可与伸展的多肽结合,并且它具有保护生物体中各种酶免受热损伤,使聚合的蛋白质解聚等生化特点

1.2.3热休克蛋白70的功能:在众多种类的Hsp蛋白中,最重要的是Hsp70,而且也是现在研究最多、最深入的。Hsp70具有多种生物学功能,包括分子伴侣功能、抗细胞凋亡功能、参与免疫反应、抗氧化功能、提高细胞的应激耐受性等。

2 实验方法

2.1苜蓿夜蛾RNA提取苜蓿夜蛾的总RNA是从苜蓿夜蛾四龄幼虫的整个虫体中提取出来的,提取方法参照上海生工出产的RNA提取试剂盒中的说明并结合试验中具体条件以及情况进行改进。在提取总RNA前,先将幼虫在38℃热刺激下3h。

2.2 RNA的检测

RNA检测采用甲醛变性电泳法和紫外吸收法(参照分子克隆实验指南)相结合的办法,利用RT-PCR扩增保守区之间的cDNA序列,根据Genebank中的烟草天蛾(AY220911)、甘蓝夜蛾(AB251895)、粘虫(EU306518)和家蚕(FJ573459)四种鳞翅目昆虫的热休克蛋白Hsp70基因的mRNA序列进行比较后,找到并通过保守区域设计了一对引物:

为cDNA合成的引物,反转录得到的cDN段以HelupHsp70和HellowHsp70为引物进行PCR扩增。

3 实验结果

3.1苜蓿夜蛾总RNA的提取,平行做三个重复,都是苜蓿夜蛾总RNA电泳条带。总RNA中约有98%-99%的RNA是核糖体RNA,因而总RNA的完整性可以通过检测核糖体RNA(rRNA)来判断。 通过测定试验所提取的RNA的吸光度值可以计算RNA的浓度。测序结果进行去载体处理后得到1816bp长度的基因特异性片段。之后和NCBI Blast 进行比对,发现与其同源的已发表的序列大多为昆虫Hsp70基因,并且得到的苜蓿夜蛾Hsp70基因特异性片段与甘蓝夜蛾Hsp70基因(登录号为:AB251895.1)具有94%的同源性,确定得到的苜蓿夜蛾特异性基因序列属于热休克蛋白Hsp70家族。

3.2热休克蛋白的提取。热休克蛋白70标签序列中:333aa-347aa(这一标签序列的第333aa处不同,在第344aa处不同,在第345aa处不同(分别是异亮氨酸、亮氨酸),在347aa处不同。分析上述不同位置的不同氨基酸大部分都是都是同一家族的氨基酸,不但有些具有相同的分子组成,只是结构上不同以外,还是相同的氨基酸家族,虽然有差别但还可以称为是热休克蛋白的标签序列。

3.3昆虫HSP70分析。从昆虫Hsp70氨基酸聚类分析图中得知:苜蓿夜蛾HelHsp70基因的氨基酸序列与甘蓝夜蛾首先聚类,之后与日本柞蚕、竹蠹螟在聚类,与粉茎螟聚类后又与烟草天鹅聚类也就是鳞翅目昆虫聚类完毕后与鞘翅目昆虫聚类,之后再与双翅目昆虫聚类,再与膜翅目昆虫聚类,最后与同翅目昆虫聚类。各种昆虫的Hsp70的聚类分析图显示进化分类地位与传统的分类结果大致相同。

结论:

1.本试验中提取的苜蓿夜蛾总RNA经过1%琼脂糖凝胶电泳后的条带28s和18s的亮度比是1:2,宽度比是1:2。昆虫的总RNA在变性电泳时,28S rRNA与18S rRNA在比例上不呈2:1的关系。

2.序列分析找到了Hsp70家族的三个标签序列出现在已得到的HelHsp70基因氨基酸序列中确定了HelHsp70蛋白分子的疏水区和亲水区;明确了此蛋白分子中并无O-糖基化位点存在,这也说明了HelHsp70基因的保守性;对得到的HelHsp70基因的ORF进行限制性酶切分析,得到酶切图谱为进行下一步的与达载体的连接和原核表达进行准备;通过软件模拟了其蛋白质二维结构图和三维分子结构图。

热休克蛋白范文第3篇

关键词:热休克蛋白;结构;功能;针灸;中药

中图分类号:R456 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0718-03

Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine

HUANG Yun,Advisor:LING Yaping

(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)

Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.

Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine

收稿日期:2009-11-11

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772707 )国家教育部博士点科研基金资助项目(20070541003)

作者简介:黄芸(1984-),女,湖南耒阳人,硕士研究生,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。

通讯作者:林亚平(1956-),女,湖南长沙人,教授,硕士研究生导师,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先发现的,当时在研究果蝇唾液腺染色体时发现一种在细胞高温应激时能产生对细胞有保护作用而且高度保守的蛋白质[1]。HSPs每个家族针对不同的亚细胞结构都有组成性和诱导性表达,如HSP60和HSP90在哺乳动物中为组成性表达,而HSP70和HSP27在受到高热、氧化应激或抗癌药物刺激时的高表达为诱导性表达。

HSPs的功能[2]主要有 :①维持细胞蛋白自稳。②“分子伴侣”作用。③提高细胞对应激原的耐受性。④参与免疫调节,增强免疫功能。⑤既有直接的神经元保护作用,又可诱导其他保护性机制的产生,直接或间接参与神经元的自身保护。⑥参与细胞周期的调节。

HSPs的分子生物学特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物种有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%~90%的一致性, 但不同家族HSPs之间则无明显序列同源性。③非特异性。除热环境以外,其他的物理、化学及生物应激原,如缺血、缺氧、感染、创伤、重金属离子、氧自由基等均可诱导HSPs的产生。④交叉耐受性。是指一种应激刺激诱导细胞产生HSPs后,不仅使细胞对该刺激的耐受性增加,也增加了细胞对其他应激原刺激的耐受性。⑤模拟性。指能以分子模拟宿主自身抗原,兼具迷惑宿主与致病的两重性。⑥双重性。指有自身抗原和特异抗原,能引起抗感染免疫及肿瘤防护,又能诱导多种自身免疫病及感染炎症。

除了上述的共同特点外,各个热休克蛋白家族又有独特的结构、功能及生物学特性。

HSP90:HSP90家族成员主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞浆内主要以同源二聚体的形式存在,每个同源二聚体又由2 个单体构成。HSP90 单体包括3 个主要的结构域:由1个保守的25×103的N 末端结构域和1个55×103的C末端结构域和1个中间结构域[4]。其N端结构域是结合底物蛋白结构域,类似蛋白酶结合底物口袋,C端为寡聚化结构域[5]。HSP90是胞浆蛋白,它通过与靶蛋白的活集团的结合,使其维持所谓“无活性稳态”。HSP90通常可逆性地结合并稳定胞浆中受体分子的活性结合位点,从而避免这些结构与胞浆中的其它生物分子形成聚合体而失活[6]。在抑制细胞凋亡、促进细胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各个通路上。HSP90能直接与Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它们的活性受到抑制,促进细胞存活。

HSP90作为HSPs 重要成员之一,在肿瘤中研究和应用最多。HSP90在肿瘤细胞中主要处于活化态,而在正常细胞中则主要处于静默态。pp60v2src 是第一个被发现能与HSP90 作用的原癌基因,它能够与HSP90 形成HSP902pp60v2src复合体。P53基因突变是至今已知的与人类癌症相关的最普遍的基因异常, HSP90 也能够和突变型p53 特异性结合,导致突变型p53 复合体的积聚和半衰期的延长[7]。HSP90 还参与肿瘤血管的生长、侵袭及转移。研究表明抑制HSP90 的功能可对肿瘤达到“多点攻击”,达到抑制肿瘤的生长和转移。HSP90抑制剂可以通过特异性抑制HSP90 阻断肿瘤生长转移信号网络通路中的多个靶点,还能逆转肿瘤的耐药性,使肿瘤对化疗药物敏感性增加。HSP90及其抑制剂是目前抗肿瘤研究的热点和前沿[8]。

HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根据表达形式的不同可分为结构型和诱导型两种:HSC70固定表达存在于胞液与细胞核中,被称为结构型HSP70;诱导型HSP70(又称为HSP72或HSP70)为高度应激所诱导。通常所指的HSP70即诱导型HSP70[9]。HSP70蛋白由两部分组成,即ATP酶区(AT-Pase domain)和底物识别区或叫多肽结合区(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜结构相关蛋白,其生物学作用主要是结合靶蛋白的疏水片断而防止肽链的错误盘绕。在细胞受到环境变化和有害刺激时,细胞的一部分结构和功能蛋白发生变性,在正常状态下处于分子内部的疏水片断暴露“外化”,而形成不稳定的空间结构。HSP70则通过与这些疏水片断的结合而稳定其结构,并通过复杂的分子间相互作用,利用水解ATP的能量,协助变性蛋白的复性[11]。在控制细胞凋亡中,HSP70高表达能抑制caspase的激活、线粒体的损伤和核断裂。可以通过直接或间接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,还可作为天然的抑制蛋白结合到JNK,抑制其活性,从而抑制JNK细胞凋亡通路。

HSP70是HSPs中反应最为敏感研究最多最深入的。在临床上,HSP70与癫痫、心脑缺血、多发性硬化、感染、肿瘤等多种疾病关系密切。在脑血管病和心血管病中对心肌细胞和脑细胞有显著的保护作用,减少细胞缺血坏死范围,修复损伤蛋白质,提高细胞对缺血的耐受性[9,12]。急性脑创伤后在易受损伤区域的神经元HSP70的转录表达,能减少神经细胞凋亡,有助于延迟神经细胞的死亡,与神经保护关系最为密切[13-14]。HSP70可与突变型P53形成稳定复合物,从而使核内P53转移到胞浆中,丧失了控制细胞增殖的能力。HSP70可以激发抗肿瘤细胞的特异性反应,结合细胞内的全部异常肽库,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多价的,这有利于防止免疫逃逸从而增强免疫效果,为肿瘤疫苗开发提供了新的思路。

HSP60:真核生物的HSP60主要位于线粒体内(约70~80%),另有小部分位于胞浆。此外, HSP60存在于某些细胞的分泌颗粒中,例如胰岛的β细胞。HSP60是线粒体内最主要的分子伴侣蛋白之一,它与HSP10组成的高分子量聚合物被形容为“巨型呼吸器”,是线粒体基质蛋白折叠和修复系统的关键组成部分。人类HSP60与其分子伴侣HSP10的基因头对头位于2号染色体上,两个基因之间有双向启动子,启动子中则含有热休克元件,接受热休克转录因子的调控[15]。正常条件下,HSP60以稳定状态存在于细胞质和线粒体基质中,维护抗凋亡因子的正常构象和功能;应激条件下,HSP60迅速从胞质中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白,对促凋亡因子产生保护和协同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的双向调整作用。它的这种抑制或者促进作用可能与细胞种类、所受刺激类型、细胞状态、HSP60含量和活性等多种因素有关。HSP60 是一种T细胞信号,压抑或禁止化学反应,其中Peptide (p277) 是它的一个24个氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠体内发现的一种抗原,p277能阻止先天的或适应性T细胞受体对B 细胞的损害,从而对1型糖尿病有治疗作用[17]。

sHSP:小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)几乎存在于所有生物体中,其主要结构是由N端域和C端域2个部分组成,C端域含有一个相当保守的α晶体蛋白(α-crystallin)结构域,由约90个氨基酸残基组成,与其相邻的是可变的N端域。小热休克蛋白家族成员的共同特点是特殊丝氨酸残基上的磷酸化,磷酸化作用会导致sHSP低聚体状态发生改变,从而使sHSP的生物学功能得以发挥[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是内质网内唯一的一种热休克蛋白,它是一种能与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网驻留蛋白。在胶原合成及纤维化病理过程中发挥重要作用。国外有多项研究证实,抑制HSP47的表达,可抑制胶原合成,减弱纤维化程度[19-20]。HSP27为ATP非依赖性分子伴侣,其功能主要是防止蛋白质聚集. HSP27既可以维持细胞氧化还原稳态又可以维持线粒体的稳定性,结合和稳定肌动蛋白维持肌动蛋白网状系统的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid进入线粒体膜。

HSPs与针灸、中药。HSPs对机体具有保护作用,故设法寻找一种没有毒副反应的HSPs诱导剂或方法,诱导HSPs合成,增加机体对细胞的保护过程,已成为国内外研究的活跃领域。中医中的针灸和中药能影响HSPs的表达。在机体受到疾病损伤时,用对机体没有损伤的针灸和中药诱导HSPs的表达,对机体产生保护作用。

祖国医学认为针刺作为一种刺激,作用于腧穴,通过经络系统的传导,调节机体脏腑功能,具有温通经络,消瘀散结,祛散阴寒,益气升陷,回阳救逆及保健强身,预防疾病等作用,已得到国内外医学界的公认[21]。临床上,刺血疗法治疗类风湿性关节炎具有镇痛和泻热作用显著的特点,用三棱针在大鼠患侧“昆仑”穴刺血,这种物理性刺激可以直接刺激机体促进HSP70的产生,增强HSP70表达。HSP70的增高又抑制炎症细胞因子如IL-1、PGE2的转录,使之减少分泌并降低循环中的含量[22]。对心脏手术者取双侧内关、列缺、云门穴位针刺,发现针刺对心肌细胞HSPmRNA基因表达有一定的增强作用,表明针刺对心脏手术者的心肌缺血有一定保护作用。刘志彬等对慢性脊髓损伤大鼠模型使用电针治疗后,通过增加HSP70的表达能量显著降低iNOS的活性,保护脊髓神细胞并减轻继发性脊髓损伤[23]。

艾灸是将艾叶点燃后放置在腧穴或病变部位进行烧灼和熏熨,借其温热刺激及药物作用以防治疾病的一种外治方法。艾灸具有镇痛、改善血循环、调整代谢紊乱、调节免疫功能和调整脏腑功能等作用。《医学入门》说:“虚者灸之使火气以助元气也,实者灸之使实部随火气发散也,寒者灸之使其气复温也,热者灸之引郁热外发”。易受乡等[24-26]对应激性胃溃疡大鼠艾灸“足三里”“梁门”穴。研究结果显示,与艾灸非穴对照点组比较,艾灸足三里、梁门穴组大鼠胃黏膜的HSP70家族的表达均明显增强、MDA含量明显减少胃黏膜损伤程度明显减轻,显著降低了应激性溃疡指数和溃疡面积比,并使应激模型大鼠的死亡率降低。

中药复方或单味药物的提取物能提高HSPs在机体的表达。于泽等[27]用三七五参汤作用与心肌缺血损伤的试验中,Western和免疫组化结果显示三七五参汤组大鼠心肌组织中HSP70的表达较正常组和模型组明显为高,心肌损伤程度明显减轻,说明三七五参汤对缺血心肌的保护作用可能与其诱发HSP70表达有关。涂胜豪等[28]观察雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠的作用。结果发现,雷公藤甲素可以有效地下调模型大鼠关节滑膜和软骨细胞异常表达的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ类分子。在脑缺血再灌注中,分别用补阳还五汤、黄芪、川芎嗪、葛根素、丹参、复方阿魏酸来诱导HSP70,结果显示,虽然这些药物的作用机理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表达明显增强,对脑缺血损伤有保护作用。补阳还五汤可明显抑制HSP70的转录,而黄芪则除了可明显抑制其转录外,还可轻度降低HSP70的翻译[29]。

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热休克蛋白范文第4篇

【关键词】大肠癌;热休克蛋白;ATM蛋白.

【中图分类号】R57 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2014)02-0823-01

大肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,严重的威胁人们的身体健康。因为其发病的机制尚未完全阐明,另外早期无特殊的临床表现是其发病率升高的原因。目前对大肠癌分子领域研究的日新月异,对大肠癌的发生、发展的研究不断深入。本文对近年来与大肠癌相关的ATM、热休克蛋白等分子领域的研究做出综述。

1 ATM基因

1.1 ATM的生物学特征

ATM基因的发现与ATM蛋白的结构特点,使人们对ATM基因及其蛋白的认识是基于一种被称为毛细血管共济失调扩张症(ataxiatelangiectasia,AT)的疾病[1]。AT病是一种单基因常染色体隐性遗传性疾病,具有进行性小脑退化、高辐射敏感性、早衰、免疫缺陷、基因组不稳定性和易患癌症等特征。ATM基因位于人类染色体11q22-23区域上,全长约150kb,编码序列约12kb,包含66个外显子,编码蛋白包含3056个氨基酸,分子量约为350kDa。该蛋白在从N端到C端分为5个结构区域:HEAT重复域、FAT域、KD域、PRD域和FATC域。ATM、DNA-PKcs和ATR同属于PIKKs家族,在结构上它们的C端具有高度相似的同源序列,包括KD域、FAT域和FATC域,因此这三种激酶在功能上有类似的作用。ATM蛋白在高等真核生物体组织细胞内普遍存在,分布于的细胞核和细胞质中,在增殖细胞中主要分布于细胞核;然而在卵细胞或一些分化细胞如小脑神经元中则主要位于细胞质ATM功能异常导致肿瘤易感性升高。

1.2 ATM与肿瘤

ATM基因是一种DNA的损伤修复基因,位于人类染色体11q22-23区域,此区域的突变和缺失出现在很多肿瘤中,比如一些淋巴瘤、白血病及乳腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌等上皮性肿瘤。其中以染色点11q22-23区域杂合性缺失较常见。AT病人由于ATM功能的丧失导致肿瘤易感性升高。有文献显示:A患者(即纯合子)的患癌率较正常人群高约100倍。而多数研究是针对ATM缺失的杂合子的,大约有1%的人是ATM缺失的杂合子。有研究显示:AT患者的女性亲属(ATM缺失的杂合子)患乳腺癌的风险增高。后来研究证实AT携带者患的乳腺癌风险较正常人增加3-7倍。除了乳腺癌,AT携带者的人群患宫颈癌、卵巢癌等其他癌症的风险也增高。ATM功能异常在散发性肿瘤发生与演进中也起到重要的作用。对多种散发性肿瘤如淋巴系统恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌等进行了总结分析,发现都存在11q22-23区域杂合性的缺失,缺失比率根据不同的肿瘤为17-50%不等,提示ATM可能会起到抑癌基因的作用。ATM主要是通过调控DDR通路而发挥抑癌的作用。在膀胱癌、乳腺癌、大肠癌和肺癌等多种肿瘤的癌前病变阶段存在有较高水平的DDR,包括ATM、H2AX、Chk2、p53等DSBs的反应分子磷酸化激活,且ATM-Chk2-p53信号活化先于p53的突变。这表明,细胞处于癌前病变阶段或者之前就已经开始启动DDR,延迟或防御癌变。当DDR的某些信号分子发生突变或调控异常时,DNA的损伤应答异常、细胞周期调控异常、DNA修复功能不全等导致较多DSBs积累,进而使细胞染色体不稳定性增加,积聚的突变有可能形成或激活癌基因,最终导致肿瘤发生。总之,ATM功能异常引起肿瘤易感性增加可能是由于DNA修复和细胞周期检查点这两个过程均缺陷的联合作用所致。

2 热休克蛋白

2.1热休克蛋白及其分类

热休克蛋白(Heat Shock Protein,HSP)是生物受到应激,如环境中物理、化学、精神等诱导所发生应激反应而合成的蛋白质。目前热休克蛋白尚无明确的分类标准。大多数分类方法都是根据同源性及相对分子质量的大小进行划分,可分为HSPll0、HSP90、HSP70、HSP60、HSP27等小分子HSP及泛素等几个家族。

2.2热休克蛋白的生物学特性

HSP主要参与一些重要细胞的折叠、转运和装配的生理活动。HSP是一类高度保守的蛋白质。主要表现为不同的生物中无论进化程度如何,其分子结构都有很高的同源性。不同的HSP分子序列大部分相似或相同。生物体或组织受到应激刺激后,需要度过一个绝对的恢复期,细胞在此期间先合成HSP,然后才能获得耐受应激刺激,如果超出一定期限,HSP就会失去保护作用[2]。它作为一种非特异性的细胞保护蛋白,可以增强应激耐受性、提高细胞存活率,并且与许多疾病的发生、发展有着密切的联系。

2.3热休克蛋白与大肠癌

近年来的研究发现热休克蛋白与大肠癌的发生、发展以及对大肠癌的化疗耐药等方面都有密切的关系。赵亮[3]等研究发现伴淋巴结转移的大肠癌组织比未发生大肠癌组织HSP27的表达增强。裴海平[4]等究发现HSP27在结肠癌中d的表达比在炎症组织中的显著增高,伴发淋巴结转移的结肠癌组织中较未发生转移的结肠癌组织中HSP27的表达增强。李永武[5]等发现HSP27、HSP60、HSP70在直肠癌中表达高,在癌旁、炎症和正常组织中的表达低。因此说明HSP27、HSP60、HSP70可能与结肠癌癌变过程,肿瘤的发生、发展有着密切的联系。有关HSP27与肿瘤的研究取得了一定的进展,已证实其在多种肿瘤中的过表达,但具体机制还不是十分的清楚,需要进一步研究,这对阐明肿瘤的发生机制有重大的意义。

3 结语

大肠癌的发生、发展是多因素和多阶段的逐步演化过程。ATM蛋白表达或活性改变涉及了肿瘤的发生,并影响肿瘤的治疗及预后,说明ATM也许能会成为今后肿瘤治疗过程中新的作用靶点。热休克蛋白在多种肿瘤的过表达已经被证实,但具体机制还不十分清楚,需要进一步研究。在今后的分子领域技术的不断改进、知识的不断积累,相信会对肿瘤的发病机制有更为全面和深入的了解,也对为肿瘤的临床治疗提供新的思路。

参考文献:

[1] 李革,李春香,罗强等.ATM蛋白在不同放射敏感性大肠癌细胞株中的表达[J].中国现代医学杂志.2010.20(23).3559-3561.

热休克蛋白范文第5篇

关键词:HSP27;HSP47;HSP70;肾脏纤维化

【中图分类号】Q51;R692 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)06-0237-01

1 HSP27与肾脏纤维化

HSP27是小分子热休克蛋白家族主要成员,在细胞抗应激损伤、维持细胞内环境的稳定方面发挥着重要作用,参与多种效应反应[3]。

有研究报道,热应激、ATP耗竭等损伤可诱导肾小管上皮细胞表达HSP27,高渗透压可诱导肾组织细胞表达HSP27,IL-1、转化生子因子β等可诱导细胞合成HSP27,说明HSP27在肾小管上皮细胞生理和功能状态的维持和调节中发挥作用[4]。

周生国等[5]通过建立单侧输尿管梗阻肾小管间质纤维化大鼠模型,应用组织病理学和免疫组织化学法检测HSP27在肾小管间质纤维化大鼠肾组织中的表达,发现肾小管间质纤维化过程中肾皮质肾小管中HSP27的表达明显上调,主要分布于扩张的肾小管,这提示HSP27表达上调可能与肾小管上皮细胞对损伤的早期应激反应有关。

2 HSP47与肾脏纤维化

HSP47存在于内质网,与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网驻留蛋白,在体内主要作为“分子伴侣”帮助新合成前胶原形成正确的三股螺旋结构,稳固前胶原的三股螺旋分子,防止结构错误的前胶原泌出内质网,协助前胶原在正常状况下分泌等,对胶原成熟的质量控制起着重要作用,与肾脏纤维化形成有着紧密的联系[6]。

正常生理情况下,肾内HSP47仅微量表达。在肾脏病理状态下,HSP47的表达或活性增加,可分布在多种细胞中如肾小球脏层上皮细胞、肾小球壁层上皮细胞等,并可直接刺激系膜细胞及肾小管上皮细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅳ型胶原,积极参与肾小管上皮细胞-间质转换(EMT)过程,促进细胞外基质(ECM)的合成及过度聚集,引起肾纤维化过程中组织的过度修复,最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化。因此,HSP47可能是肾脏纤维化的关键因子,通过HSP47为切入点研究肾纤维化,研制针对HSP47的拮抗剂,可能会找到防治肾脏纤维化的新方法。

已有研究报道,采用干扰HSP47表达的方法来改善肾纤维化[7]。在抗Thy-1肾小球肾炎大鼠模型中,HSP47反义寡聚脱氧核苷酸转染大鼠肾小球细胞,抑制了HSP47表达,从而成功减少了胶原的合成,减轻了肾小球硬化的程度。单侧输尿管梗阻大鼠模型,通过输尿管注射HSP47siRNA入梗阻侧肾,肾纤维化程度明显减轻,胶原蛋白明显减少[8]。HSP47的相关研究已经成为近年防治器官纤维化的研究热点。

3 HSP70与肾脏纤维化

HSP70是热休克蛋白家族中具有最高敏感性和高度保守性的一个家族,主要作为“分子伴侣”可促进新生多肽链的正确折叠,对解聚蛋白及维持恰当构型,分子重排以及新生多肽链在细胞内外跨膜转运有重要辅助作用。HSP70在正常细胞中含量较低,在应激状态下,蛋白合成量显著增加。

在离体的人肾培养细胞NRK52E中,暴露TGF-β诱导肾上皮细胞纤维化和细胞凋亡,通过保留上皮细胞钙粘蛋白表达水平和α-肌动蛋白来选择性诱导HSP72的表达可以抑制TGF-β诱导的肾上皮细胞纤维化,说明HSP72对肾脏纤维化有着密切的关系。该研究首次证实,HSP72通过调控Sat3介导的信号通路抑制肾间质成纤维细胞的活化、增殖以及细胞外基质的积聚,从而抑制肾脏纤维化。提示HSP72具有多途径、多水平和多靶点阻抑肾脏纤维化进程的作用,为慢性肾脏病的防治提供新的思路和途径。

由于HSP70能够加强自身体内细胞本身抗损伤潜能,有效减轻肾缺血再灌注损伤及肾间质纤维化,若能阐明HSP70基因表达调控的机制,通过无毒性的药物或基因转染等手段,诱导HSP70局部合理表达,可使肾脏细胞耐受潜在损伤刺激的能力增加,将为创伤、外科手术或移植等病理生理过程中肾脏的保护提供一个新的有效途径。

4 结语

肾脏纤维化是所有肾脏疾病发展到终末期衰竭的共同变化,及早阻止甚至逆转肾脏纤维化对防治终末期肾衰竭有重大意义。肾纤维化过程涉及很多细胞和分子参与,各种因素相互作用,机制非常复杂,本文简要介绍了HSP27、HSP47、HSP70与肾脏纤维化的关系,在肾脏纤维化过程中发挥着重要的作用,为治疗肾脏纤维化提供新的靶点和思路。但对其作用的机制和原理缺乏充分的认识,随着研究的不断深入,HSP27、HSP47、HSP70在肾脏纤维化过程中的作用机制将逐步被阐明,对防治肾脏纤维化的发生发展具有一定的指导意义。

参考文献

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[2] 钟文英等.热休克蛋白的分子生物学研究进展[J].医学综述,2005,11(2):148

[3] Oh DJ et al. Heat shock protein express in adenosinie triphosphate depleted renal epithelial cells[J]. Korean J Intern Med, 2004, 19, (3):149-54

[4] 周生国等. 小分子热休克蛋白在大鼠肾间质纤维化中的表达[J].中外医疗, 2009, 27: 28-29

[5] 肖红波等. 热休克蛋白47在肾脏纤维化中的作用及机制[J].中国中西医结合肾病杂志, 2009, 10(12): 1109-1111

热休克蛋白范文第6篇

[关键词]热休克蛋白90(HSP90);糖尿病;难愈创面;创面愈合

[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的难愈创面已成为目前临床治疗的一大难题,研究表明,高糖会抑制人表皮细胞的迁移,从而导致创面上皮化延迟[1-2]。近来,Li.W的研究发现热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能够有效促进人表皮细胞的迁移[3],而关于其是否能够有效促进糖尿病性难愈创面的研究并未见报道。本实验旨在将HSP90应用于糖尿病性难愈创面,并辅以胰岛素作为参照,以观察不同时期各组创面的愈合程度及创面中HSP90的表达含量。

1材料和方法

1.1动物及分组:选用健康清洁级雄性SD大鼠100只,由第四军医大学动物试验中心提供,体重(200±3)g,分为A、B、C、D、E五组,每组20只。A组为正常创面但不予以任何治疗,即对照组;B组为糖尿病大鼠难愈创面给予空白凡士林药膏治疗组,即空白组;C组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90的凡士林药膏治疗组,即HSP90组(HSP90浓度:1μg/ml);D组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有胰岛素的凡士林药膏治疗组(胰岛素浓度:30μg/ml)E组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90及胰岛素的凡士林药膏治疗组,即联合用药组(E组,HSP90浓度:1μg/ml,胰岛素浓度:30μg/ml)。每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,

1.1.1 构建2型糖尿病难愈创面模型:采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法诱导2型糖尿病造模。各组提前4周高脂高糖饮食,饥饿12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并维持高脂高糖饮食,并于注射后48h用强生稳步血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,体重明显下降(>50g)为造模成功[4]。三天后补注STZ(以10~20mg/kg体重剂量腹腔注射),并测量FBG值。切取全层皮肤暴露肉膜为准后以d=2cm的金属环间断缝合固定于创缘,防止创面挛缩。

1.1.2 给药及分组:A组不涂抹任何药物;B组为空白药膏;C组为含有浓度1μg/ml HSP90的药膏;D组为含有浓度30μg/ml胰岛素的药膏;E组为含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰岛素的药膏。各给药组均以外用涂抹局部给药,药膏均匀覆盖整个创面(约1g/次)为准(含有药物的药膏均委托金花生物制药集团有限公司完成)。HSP90的浓度为我们参考了Li.W试验中用于正常创面的治疗浓度后[3],并以15只糖尿病大鼠给予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml进行了简单的预实验,发现三种浓度的效果并无显著差异,所以取最小浓度。

6941,

2实验过程及观察设计

在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗,动物创面予以暴露。创面的固定环会于创面形成后的第10天予以摘除,因为此时皮肤挛缩力量较大,会导致缝合线断裂,为统一标准予以摘除。并创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5个时间点各取n1=3个标本,而在第21天取n2=5个标本,各标本取材时取全层厚皮肤,保留创缘约1~2mm的正常皮肤。

2.1 大体观察指标:分别于用药后第3、5、7、10、14、21 进行大体拍照观察并采用ADOBE photoshop cs4 计算各时期的创面愈合率;

2.2 镜下观察指标:并于3、5、7、10、14、21天取创面标本,3、5、7、10、14天每组各时间点3只,21天时每组5只。皮肤标本剪成横断面,标本均用1%中尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色、并使用ABC法进行HSP90的免疫组化染色。并采用image pro plus 6.0彩色图像分析系统, 每张切片选取5个有代表性的200倍视野,测量每个标本HSP90阳性表达密度及积分光密度IOD值的均值并记录。

2.3 数据统计:所得试验数据均采用SPSS11。文中数据以均数和标准差(x±s) 表示,并且对创面愈合率采用两个独立样本t检验进行比较。

3实验结果

3.1 大鼠创面愈合率差异比较:各组大鼠在各时间点创面愈合率比较见表1。由表可见,单独使用HSP90(C组)及单独使用胰岛素(D组)均能够提高创面的愈合率(与同期B组相比,P

3.2 各组创面第10天时HSP90的免疫组化对比:见图1~5。由图可见,联合用药组及正常创面对照组创面中,HSP90的阳性表达较为强烈。

3.3 HSP90阳性表达的比较:为更加客观的反应HSP90在创面中的阳性表达状况我们选取平均阳性率及积分光密度作为指标[5-6]。各组大鼠各时间点HSP90平均阳性率(Density Mean,DM)值的比较见图6。各组大鼠各时间点创面中HSP90的平均积分光密度(Identical Optical density,IOD)的比较见图7。

由图6、图7我们发现:①在糖尿病大鼠创面中,HSP90的表达明显下调(同期对照组相比,P

4讨论

美国创面愈合协会的资料显示大约有66%的难愈性创面即使经过6个月的治疗护理仍无法治愈[7],仅处理创面的材料每年就花费90亿美元[8]。糖尿病创面的治疗一直是难题,表皮细胞迁移迟缓也是其发生机制的一个重要特点。 在糖尿病创面的临床治疗中,胰岛素的局部应用的疗效及作用机制均得到了验证,这一方法也成为了临床治疗糖尿病创面的经典方法。而其作用机制主要在于降低创面组织血糖浓度,加快糖尿病创面的新生毛细血管形成,促进上皮细胞的增殖与迁移[9-10]。

2007年DR. Woodley等发现人表皮细胞受到缺氧刺激后,会大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能够有效促进人表皮细胞的迁移,并将其应用于正常创面,发现HSP90α能够加速创面的再上皮化过程[3,11]。在此之前,人们对于HSP90的关注了解更多的集中在癌症领域,作为重要的分子伴侣,它介导了多条调控细胞增殖、凋亡、迁移的信号通路[12],并保护细胞产生应激反应,抵抗各类损伤带给机体的不可逆性伤害[13]

在本实验中我们主要为了研究HSP90是否能够促进糖尿病性难愈创面的愈合,并观察HSP90在糖尿病性难愈创面中的表达,探索HSP90在创面中的表达是否与创面的愈合速率有关联。我们的研究发现:在大体观察下,①外源性给予糖尿病性难愈创面HSP90,同期的创面愈合率有所提高(与同期空白组相比,P0.05)。仅从大体实验的观察结果我们认为,创面中HSP90的表达与糖尿病难愈创面的愈合是存在相关性的。在镜下观察,我们发现:①糖尿病性难愈创面的高糖微环境明显抑制了HSP90的表达(空白组与同期对照组相比,P

分析结果我们认为,高糖环境会降低HSP90在创面中的表达,减弱HSP90对细胞的保护作用。并且创面中HSP90的表达高低与创面的愈合速率具有相关性。虽然无论是局部给予胰岛素改善高糖微环境,还是局部应用HSP90提高创面中HSP90的表达,均能够提高糖尿病性难愈创面的愈合率,但是我们发现联合应用后糖尿病性难愈创面的愈合效果最好。据此我们认为,胰岛素改善了糖尿病性难愈创面的局部微环境,有利于创面中HSP90的表达提高,进一步局部给予HSP90,提高创面中HSP90的含量,从而激活部分HSP90参与调控的信号通路,提高创面中各类生长因子的表达,促进了糖尿病性难愈创面的愈合。

然而,我们的研究尚属浅显,对于HSP90在糖尿病创面愈合过程中的作用机制也未进行研究。但是,依然为我们寻找糖尿病创面的治疗方向提供了一个具有临床应用意义的思路。下一步,我们会对HSP90在糖尿病性难愈创面的作用机制进行进一步的研究,探索HSP90在糖尿病性难愈创面中所调控的与创面愈合密切相关的生长因子与细胞外基质的变化。并且HSP90的提取目前还很昂贵,所以进一步寻找到其稳定的上游信号分子或寻找一种能够有效且廉价的提取HSP90的方法会成为我们今后的研究方向。

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[收稿日期]2010-02-26 [修回日期]2010-04-20

热休克蛋白范文第7篇

【关键词】

大肠癌;热休克蛋白;治疗

DOI:10.3760/cma.j.issn 16738799.2010.01.178

作者单位:200127上海电力医院/上海交通大学医学院附属仁济医院

近年的研究发现HSP的高表达和肿瘤的发生发展之间存在着联系,其机制可能与增强了肿瘤细胞抗凋亡能力有关,曾有研究发现 HSP 在结肠息肉与结肠癌组织中的表达不论是在量上或质上均有相当的差异,并且HSP可能与结肠肿瘤的恶性程度及预后相关,HSP的抗体或反义HSP能增加结肠癌细胞对治疗的敏感性,为结肠肿瘤的治疗提供了新的方向。在HSP家族中HSP70,HSP90是拮抗细胞凋亡的两大家族,与肿瘤的发生发展关系密切,以下对热休克蛋白(HSP70,HSP90)在肿瘤发生特别是结肠癌发生发展中的作用作一研究。

1 热休克蛋白家族及其功能

HSP首先发现于热休克的果蝇唾液腺,此后的研究证实各种应激状态能诱导细胞过量表达HSP,HSP被认为是应激状态下细胞产生的保护细胞免受损害的蛋白质。更深入的研究发现HSP是一组结构保守广泛存在的蛋白质,在非应激状态下在细胞内亦有基本表达,表明其在保持细胞内的动态平衡中起重要作用,HSP能帮助其他蛋白质进行正确的折叠与重构,并能在细胞内帮助蛋白质的转运,把受损害的蛋白质递呈给蛋白酶进行降解[1],在免疫应答抗原递呈反应过程中HSP能作为一种危险信号帮助机体免疫系统识别死亡与受损害的细胞,因此HSP被称为分子伴侣。

作为分子伴侣,HSP能调节细胞自体平衡并能提高细胞生存能力,90年代以来,随着对细胞抗调亡机制研究的深入,各种研究表明HSP能通过抑制细胞凋亡起到细胞保护作用,而许多肿瘤细胞也能通过过度表达HSP从而使肿瘤细胞避免凋亡,并使肿瘤细胞进一步进展与恶化。

2 热休克蛋白(HSP70,HSP90)家族的抗凋亡机制

在HSP家族中HSP70,HSP90是拮抗细胞凋亡的两大家族,其抗凋亡机制主要为:

2.1 抑制多种死亡受体信号途径,阻止caspase酶活化 HSP70能抑制TNF、 Fas(Apo1/CD95)等死亡受体家族并能抑制JNK、Ask1等信号蛋白途径诱导的凋亡[4,5]。HSP90能抑制丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径诱导的凋亡,并与ErbB2、Src等癌基因的激活有关[6]。

2.2 直接抑制多种caspase酶 HSP70、HSP90直接抑制多种caspase酶如caspase3,caspase9等[7],从而抑制细胞凋亡。

2.3 抑制线粒体凋亡途径 近年的研究提示线粒体是细胞凋亡的中央处理器,在细胞凋亡中起重要作用,其中线粒体细胞色素C的释放以及Apaf1、AIF的活化能促进凋亡,HSP70、HSP90都能抑制线粒体细胞色素C的释放,并能抑制Apaf1、AIF的活化从而抑制线粒体凋亡途径。

2.4 影响一些凋亡调控基因以抑制凋亡 Bcl2、p53是重要的凋亡调控基因,Bcl2能抑制凋亡,而p53能促进凋亡,有研究表明HSP90能上调Bcl2基因[8],而HSP70能使野生型p53失活或使p53基因突变从而抑制凋亡[9]。

3 热休克蛋白(HSP70,HSP90)在结肠癌中的作用

热休克蛋白(HSP70,HSP90)与结肠癌的发生与发展密切相关,Yusei Kanazawa等[10]通过免疫组化技术研究50例结肠癌组织中HSP70,HSP40的表达,阳性率分别为80%与14%,均高于正常对照组织,Cen等[11]应用RTPCR技术研究35例散发的人结直肠癌中HSF1,HSF27,HSP90的表达情况,结果发现HSF1表达率为86%(30/35),HSP90表达率为63%(22/35),均显著高与正常组织,提示其可能在散发的人结直肠癌的发生中起重要作用。也有研究对80例人结肠癌组织中HSP70及grp94的表达用免疫组化法进行分析,结果发现在结肠癌组织中HSP70及grp94的表达率分别为92.5%、85.0%,显著高于邻近组织的56.3%(HSP70)和42.5%(grp94)。在有转移的结肠癌组织中HSP70及grp94的表达率均为100%,显著高于没有转移的结肠癌组织,其表达率分别只有75%、50%[12]。以上研究均证实结肠癌组织中存在HSP70,HSP90的高表达。

结肠癌组织中HSP70,HSP90的高表达通过多种途径抑制肿瘤细胞凋亡并与结肠癌患者预后相关。Dundas SR等[13]用比较蛋白组学分析方法发现在结直肠腺癌中存在mhsp 70(线粒体hsp 70)的过度表达,并通过免疫染色结合患者临床资料,发现存在mhsp 70的过度表达的患者预后较差,提示mhsp 70在结直肠肿瘤的形成中起作用并与患者预后相关。其作用机制可能与mhsp 70能结合p53蛋白并影响RasRafMAPK信号蛋白途径有关。Rashmi R等[14]发现hsp27 和 hsp70的高表达与胃肠道肿瘤患者肿瘤细胞转移、不良预后以及对放疗化疗的不敏感有关。其机制可能为hsp70能抑制细胞色素c释放、AIF活化并能抑制caspases3和 caspases9的活性,从而促进肿瘤细胞的发生与发展。

HSP70,HSP90的高表达与结肠癌细胞的恶性增殖密切相关。肿瘤的形成过程中,肿瘤细胞不断增殖,合成代谢增强,需要大量的HSP调节和稳定这一异常增殖过程,而肿瘤组织生长旺盛,其增生的血管存在相对血供不足,缺氧与应激的细胞环境也反过来诱导了HSP的过度表达。HSP70,HSP90的高表达一方面介导癌基因及抑癌基因产物的构象成熟、跨膜转运,另一方面介导错配蛋白的降解,协调肿瘤细胞的蛋白质快速代谢平衡,使肿瘤细胞得以无限增殖。Yokota等[15]发现HSP的复合物在人结肠癌中的表达较正常组织显著增高,并且其表达水平与PCNA(增殖细胞核抗原)相关,而PCNA是细胞增殖的一个重要指标,提示HSP的复合物的高表达与结肠癌细胞的快速增殖有关。

4 热休克蛋白研究在结肠癌的治疗中的意义

近年来的研究发现在结肠癌的治疗中使用HSP70,HSP90的抗体或应用反义寡核苷酸技术抑制这些基因的表达,能增加肿瘤细胞对治疗的敏感性,从而为结肠癌的治疗提供了新的方向。Yang WL等[16]在裸鼠皮下种入人结肠癌HT29细胞,切除肿瘤组织并进行射频消容(RFA),分别使用42°C,45 °C,50°C三种温度,抽提RNA逆转录使用Western blot法分析HSP的表达,结果发现50 d后50°C组肿瘤复发率为0%,45°C组为30%,42°C组为100%,HSP70的表达在RFA后明显升高,提示热疗可能诱导HSP70产生并使肿瘤细胞存活,而抑制HSP70的表达能提高RFA的疗效。Kobayashi S等[17]发现 HSP90的拮抗剂geldanamycin(格尔德霉素)能增加人结肠癌HT29细胞对放疗的敏感性并减少放射剂量,同时应用HSP90的拮抗剂及MAPK途径激动剂Indomethacin(吲哚美辛)能进一步增加放射治疗的疗效。Rashmi R等[18]用人结肠癌SW480细胞株转染正义或反义hsp70 cDNA并选择稳定的克隆细胞株检测其对姜黄诱导的细胞凋亡的敏感性,结果发现Hsp70能使结肠癌细胞对姜黄诱导的细胞凋亡产耐药,而反义hsp70能提高结肠癌细胞对姜黄的敏感性。

HSP多肽复合物可制成免疫疫苗,为结肠癌提供肿瘤免疫疗法,Mazzaferro等[19]在29例结肠癌根治术后肝转移的患者中接种HSP多肽复合物疫苗,发现其能诱导CD8和T细胞介导的免疫反应,限制原发瘤的复发及转移,并且未发现严重的毒性反应。

5 展望

综上所述,热休克蛋白家族与结肠癌及多种肿瘤发生发展密切相关,其机制与通过各种途径抑制肿瘤细胞凋亡有关,并且多种研究证实HSP在胃肠道肿瘤组织中的高表达与肿瘤的分级及预后相关,对肿瘤诊断与预后存在意义。热休克蛋白的抗体如HSP90的抗体geldanamycin(格尔德霉素)的衍生物17丙烯基脱氧格尔德霉素毒性较小,作为抗肿瘤药物与肿瘤的放疗、化疗相结合,已进入II期临床试验阶段[20],而应用反义寡核苷酸技术抑制HSP70、HSP90等基因的表达能抑制肿瘤细胞增生、促进肿瘤细胞凋亡并能增加肿瘤细胞对放疗、化疗及热疗的敏感性[21]。HSP肽类复合物能刺激CD8(+)T淋巴细胞的免疫保护作用,限制肿瘤的生长与转移,因而体外合成的HSP多肽复合物可制成免疫疫苗,在肿瘤的治疗中具有潜在优势[22]。以上的各种方法在结肠癌及其他多种肿瘤的治疗中存在良好的前景,更深入的研究还在进行之中。

总之,随着对热休克蛋白作用的了解不断深入,使热休克蛋白与肿瘤发生发展的相关理论更加完善;为我们对肿瘤治疗方法的研究提供更多的方向,使治疗的方式方法更加多元化。同时对患者的预后的评估也有积极意义。

参考文献

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热休克蛋白范文第8篇

【关键词】 胃癌;肠癌;热休克蛋白27;谷胱甘肽s转移酶

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热休克蛋白(hsps)与蛋白质的合成、折叠、积聚、装配、运输和降解及组织的分化有关〔1,2〕,同时与肿瘤细胞的耐药性也有一定的关系〔3〕;谷胱甘肽?s?转移酶(gst?π)可以促进肿瘤的侵袭及使肿瘤细胞产生耐药性〔4〕。以往对hsp27和gst?π在胃肠癌中的表达情况及其与癌细胞分化程度的相关性少有报道,本文以期探讨hsp27和gst?π在胃肠癌中的表达情况及其与癌细胞分化程度的相关性,并对化疗方案的制定有所指导。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集我院2005~2007年间手术切除的部分胃肠癌标本72例,其中胃癌标本41例,肠癌标本31例,男41例,女31例,年龄60~77(平均65±2.7)岁。

1.2 标本处理 将新鲜标本固定于10%中性甲醛溶液内,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片厚度5 μm。

1.3 染色 he染色供病理诊断与组织分型;免疫组织化学染色:hsp和gst抗血清由美国zaxim公司生产。sp试剂盒和dab显色剂由北京中山生物技术公司购入。染色程序严格按说明书操作。阴性对照片以pbs代替ⅰ抗。阳性对照片由中山公司提供。

1.4 统计学处理 数据组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 hsp27和gst?π阳性率的相关性 经病理诊断表明,hsp27和gst?π在72例标本中阳性率分别为37.5%(27/72)和62.5%(45/72),两项同时阳性率12.5%(9/72);hsp27和gst?π的表达与肿瘤细胞的分化程度有一定相关性。与肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移和患者年龄无显著相关性。

2.2 hsp27的表达 胃、肠癌的肿瘤分化程度与hsp27的表达明显相关,胃癌高分化组阳性率明显高于低分化组(p<0.05),肠癌高中分化组阳性率高于低分化组(p<0.05)。hsp27在肠癌中阳性率高于胃癌,但差异不显著(p>0.05)。见表1。

表1 hsp27阳性率(%)与肿瘤分化程度的相关性(略)

与低分化组比较:1)p<0.05,下表同

2.3 gst?π的表达 胃癌的肿瘤分化程度与gst?π的表达明显相关,高、中分化组阳性率明显高于低分化组(p<0.005)。而肠癌的gst?π阳性率低分化组高于高分化组(p<0.05)。gst?π在肠癌中阳性率高于胃癌,但差异不显著(p>0.05)。见表2。

表2 gst?π阳性率(%)与肿瘤分化程度的相关性(略)

3 讨论

3.1 hsps生物学特性和肿瘤分化程度的相关性 hsps对细胞具有保护作用〔5,6〕,同时也是造成肿瘤细胞耐药的基因之一,其造成肿瘤细胞耐药的机制,一般认为有以下两点:①药物转运障碍,hsp27可以将药物滞留于高尔基体内,使药物与作用靶位之间保持一定距离,而不能发挥作用。②抑制细胞凋亡,导致再生性耐药。hsp27能封闭细胞凋亡因子apo?1介导的细胞凋亡;在结节型乳腺癌中hsp27高表达与细胞增生呈正相关,与耐药性也呈正相关。研究发现〔7〕,hsp27的过表达,能下调人鳞癌细胞系a431中细胞分化基因g24的表达,影响组织的分化。本研究结果也显示:在胃肠癌中,hsp27的阳性率高分化组明显高于低分化组,与临床高分化癌对化疗敏感性差相符合。

3.2 gst?π生物学特性及与肿瘤分化程度的相关性 gst?π基因位于第11号染色体上,当受到致癌因素刺激时,造成gst?π基因突变,导致该基因过度表达。在免疫组织化学染色时,可见gst?π呈高度表达状态。本研究中gst?π在胃癌中gst?π的表达,高分化组明显高于低分化组,但在肠癌中则低分化组明显高于高分化组。这一结果的原因需在今后进一步研究。但有研究者报道〔8〕:在食道癌和癌前病变中,gst?π的表达明显增高,且随着不典型增生程度的递进而增加。同时gst?π在细胞的解毒功能上起重要作用,可催化亲电物质与谷胱甘肽结合,其本身可与亲脂性细胞毒药物结合以增加其水溶性,促进其代谢,还可促进dna的修复,从而使细胞产生耐药〔4〕,因此推测gst?π高表达的胃肠癌容易产生耐药。

【参考文献】

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热休克蛋白范文第9篇

【关键词】 肿瘤热

【摘要】 目的 研究肺腺癌有效的治疗方法。方法 采用提纯小鼠肺腺癌LA795细胞热休克蛋白抗原肽复合物,对小鼠背部LA795肺腺癌移植瘤进行治疗。结果 免疫组和免疫+化疗组移植瘤重量明显减少,小鼠生存期明显延长。结论 热休克蛋白70抗原肽复合物有强大的抗肿瘤免疫原性,保护实验动物免受肿瘤细胞的攻击,抑制肿瘤细胞的生长,延长动物生存期。

关键词 热休克蛋白70 抗原肽复合物 移植瘤

【Abstract】 Objective To explore an effective recipe for pulmonary adenocarcinoma.Methods The mice which LA795were injected subcutaneously in the right back,were treated by purification of HAC70from mouse pulˉmonary adenocarcinoma LA795.Results In the immunized group and the combined immune and chemical therapy group,the mouse survival periods were prolonged.Conclusion HAC70is of powerful antineoplastic immunogenicity,which protects experimental animals from attacks of tumor cells,inhibits the growth of tumor cells,prolongs animal surˉvival periods.

Key words heat shock protein70 antigen peptide complex transplant tumor

为了寻找一种治疗肺腺癌有效的方法,我科自2000年9月~2003年10月对小鼠LA795肺腺癌细胞热休克蛋白70抗原肽复合物(HAC70)进行提纯扩增,并对种植LA795肺腺癌细胞的T739雌性近交系小鼠进行包括HAC免疫治疗在内的各种治疗的动物实验,取得良好的治疗效果。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肺腺癌细胞标LA795;中国协和医科大学基础研究院提供。T739雌性纯系小鼠(6~10周龄);中国医学科学院肿瘤研究所动物研究中心提供。RPMI-1640,AmohotericinB,GIBCO公司产品。Hepes,BSA,SDS.Acr.Bis.Coomassie brilliant blue R-250。PMSF,ADP-Agarose,ADP二钠盐,2-Me,TEMED,抗小鼠HSP70单抗;SIGMA公司产品。DeAe-52;WHATMAN公司产品。SephdexG-200;PARMACIˉA公司产品。羊抗鼠IgG:ROCKLAND公司产品。Aprotinin;BOEHRINGER公司产品。DTT:PROMEGA公司产品。MTT,USB公司分装。低分子量标准蛋白质MARRER;天津TBD生物技术发育中心提供,中国科学院上海生化所产品。胎牛血清:天津生物技术发育中心提供。小鼠HSP70单克隆抗体:SANTA CRUZ BLOTOCHNOLOGY公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肺腺癌LA795细胞HAC70的提纯 体外培养LA795细胞,获得约16g湿重细胞。经低渗、反复冻融、机器震荡后破碎细胞。通过ADP-AGAROSE亲和层析,DeAe-52离子交换层析、透析、离心及蛋白浓缩而获得蛋白质。再经SDS-PAGE电泳,WESTERN-BLOTS进行定性及纯度检验,证明为HSP70,通过CBB法测定蛋白浓度。

1.2.2 肿瘤模型的制备及实验分组 在96只雌性T739近交系小鼠右背皮下注射2.5×10 6个/ml LA795小鼠肺腺癌细胞悬液0.2ml以制备肿瘤动物模型,随机分为预防组、早期治疗组、晚期治疗组三大组,每大组32只小鼠。每大组再分为对照组、免疫组、化疗组、免疫+化疗组四个亚组,分别标为A、B、C、D组。预防组、早期治疗组、晚期治疗组分别在接种肿瘤细胞前14天、7天、接种肿瘤细胞当天及接种后7天、接种肿瘤细胞后10天、17天给予治疗。其中A组小鼠皮下注射PBS溶液0.2ml/只;B组小鼠皮下注射HAC70溶液0.2ml/只,即100μg/只;C组小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液剂量为60mg/kg;D组小鼠皮下注射HAC70溶液0.2ml/只,腹腔注射环磷酰胺溶液剂量为60mg/kg,观察各组治疗后有无毒副反应;各亚组治疗2周后(预防组在接种肿瘤细胞两周后),随机在各亚组中抽取4只小鼠处死,解剖称肿瘤重量,余观察小鼠的生存期,将所得数据经SAS软件处理,成组设计单因素方差分析q检验。

2 结果

2.1 动物模型的检验结果 在10只纯系T739雌性8周龄小鼠右肩胛下接种LA795细胞,各注射为2.5×10 5 个/ml,0.2ml/只。接种10天后,接种部位可触及0.4~0.6cm肿物,肿块呈圆形或卵圆形,界限清楚、活动。肿物生长迅速。小鼠在接种肿瘤后25天开始死亡,第33天全部死亡,说明此模型适合应用于检验抗肿瘤药物。

2.2 各组治疗2周后(预防组在接种肿瘤细胞2周后)荷瘤重量的变化 如表1。

表1 荷瘤重量 (略)

从表中可以看出,在预防组,B、D两组未见肿瘤形成,A、C组均形成肿瘤;用成组设计单因素方差分析及q检验,各处理组之间的差异有非常显著性(F=105.71,P<0.0001);其中A、C组之间无显著性,B、D组无差异,差异来源于A、C与B、D组之间(P<0.05)。在早期治疗组,A组肿瘤重量明显重于B、C、D组,用成组设计单因素方差分析及q检验,各处理组之间差异有非常显著性(F=217.48,P<0.0001),其中A与B、C、D组之间,B与C、D组之间差异 有显著性(P<0.01),C、D组之间差异无显著性(P>0.01)。在晚期治疗组,A组的荷瘤重量明显重于B、C、D组,用成组设计单因素方差分析及q检验各处理组之间差异有显著性(F=154.99,P<0.0001),其中A与B、C、D组之间差异有显著性,但B、C、D组之间差异无显著性(P>0.05)。

2.3 各组的生存期 如表2。

表2 荷瘤小鼠的生存期略

从表中可以看出,在预防治疗组,B、D两亚组各有一只小鼠于接种肿瘤78天、82天死于肿瘤外,这两组其余小鼠均获长期生存(>90天),且均无肿瘤生长。A、C两组均有肿瘤生长,且生存期明显短于B、D两组。A、C组之间和B、D组之间差异无显著性,差异来源于A、C组与B、D组之间。

在早期治疗组,B、D组生存期较A、C组明显延长,其中B与A、C组和D与A、C组之间差异有显著性。A、C组 之间差异有显著性,B、D组之间差异无显著性。

在晚期治疗组,B、D两组生存期较A、C组长,其中B与A、C组之间,D与A、C组之间差异有显著性,A、C组之间和B、D组之间差异无显著性。

由此可见,以自身肿瘤提取物HAC70作为肿瘤疫苗,可引起个体持久的抗肿瘤效应,既可预防肿瘤的攻击,又对机体已存在的肿瘤有明显的抑制作用,并延长动物的生存期。

3 讨论

当今全球范围内,恶性肿瘤的发病率和死亡率仍居高不下,肺癌位居其首。尤其是肺腺癌,因其血行转移很早,且对放化疗不敏感,给其治疗带来极大的困难,成为目前国内外医学界急待攻克的难题。而肿瘤的生物治疗作为一门新兴技术,得到人们越来越多的关注。近来研究发现,很多肿瘤细胞表面都有抗原表达 [1,2] 。从肿瘤细胞提取的热休克蛋白多肽复合物(HAC),含有多种肿瘤的相关抗原,不需分离肿瘤特异性抗原 [3~5] ,肿瘤抗原活化的多个CTL克隆,其杀瘤效应和特异性明显高于其他效应细胞 [6] 。以HAC免疫机体的生物疗法无疑给肺癌,尤其是肺腺癌的治疗开辟了光明前景。

试验通过体外小鼠腺癌LA795细胞培养,获得湿重16g细胞。联合应用ADP-Agarose亲和层析,DeAe-52离子交换层析、透析、离心及蛋白质浓缩等方法,获得了纯度较高的HAC70(纯度大于95%)。将获得蛋白质应用到LA795-T739小鼠肺腺癌肿瘤模型,研究HAC70的抗瘤效果。结果显示:HAC70不仅能预防LA795肿瘤的攻击,而且能抑制和杀灭肿瘤细胞,提高动物的生存期,且未见毒副作用。

根据现在对肿瘤疫苗的定义,肿瘤疫苗与预防传染病传统的疫苗不同,其不但具有预防作用,同时还具有治疗作用。其实质为特异性主动免疫,是利用肿瘤细胞(或肿瘤抗原)或/和修饰过的肿瘤细胞物质,诱导机体的特异性抗肿瘤活性细胞,以阻止肿瘤细胞的生长、扩散和复发。其预防和治疗作用的强弱从根本上取决于疫苗抗原性的大小和特异性程度 [7~9] 。

热休克蛋白范文第10篇

【关键词】 胃癌;HSP27;幽门螺杆菌

热休克蛋白又称应激蛋白,是生物细胞在生理应激或病理状态等环境因素刺激下所产生的一类蛋白质。按分子量可分为HSP27、HSP60、HSP70、HSP90等几个重要成员。在细胞内分别有特定表达位置和功能。本实验研究不同胃黏膜病变中HSP27的表达,探讨他们之间(HSP27、幽门螺杆菌、胃癌)的关系及在胃癌发生发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1入选我院2008年9月至2009年9月的胃镜150例。其中男性82例,女性68例,年龄20~78岁之间。幽门螺杆菌检查阳性者104例,阴性46例。病理诊断为:浅表性胃炎30例,消化性溃疡30例,萎缩性胃炎30例,不典型增生30例,胃癌30例。

1.2 方法

1.2.1 HSP27阳性判断标准 免疫组化S-P方法对胃黏膜组织进行染色,DAB显色细胞浆出现棕色颗粒,为阳性。根据显色程度为:阴性(-):阴性细胞60%,以中等强度及强阳性表达为病例[1]。

1.2.2 幽门螺杆菌阴性判定 ①细菌学培养;②生化反应鉴定;③革兰染色。以上3种方法均阳性者判定为幽门螺杆菌感染,否则为阴性。

1.2.3 试剂 鼠抗人HSP27单克隆抗体(购自中杉金桥试剂)、S-P9000免疫组化试剂盒广谱(购自中杉金桥试剂)、DAB显色剂(购自中杉金桥试剂)、PBS冲洗液(中杉金桥试剂)。

1.3 统计学分析 采用χ2检验(P

2 结果

2.1 HSP27在不同病变胃黏膜中的表达

HSP27在浅表性胃炎及消化性溃疡中的表达多为弱阳性或中等程度表达的阳性,阳性率分别为30%及36.67%;在萎缩性胃炎,不典型的增生及胃癌中的表达主要是中等及强阳性表达,阳性率分别为66.67%、73.33%及76.67%,过表达率分别为40%、50%及56.67%,胃癌分别与浅表性胃炎、消化性溃疡比较:χ21=13.125、χ22=9.773,P均0.05。见表1。

2.2 HSP27在幽门螺杆菌患者中的表达 HSP27在幽门螺杆菌阳性患者中阳性率的表达(55.77%),高于幽门螺杆菌阴性患者(26.09%)的表达,两者比较有统计学意义(P

2 讨论

HSPS是细胞受应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白,与肿瘤的发生、增殖及分化有关。按分子量不同分为4种类型,每组的HSPS的分布及功能有所不同。HSP27是人体最常见分子量最小的热休克蛋白。研究表明胃黏膜在接触各种外源性刺激和内源性因素后将迅速合成HSPS,以发挥对胃黏膜细胞的保护作用。Correa等曾提出胃癌形成,发展的多阶段模式:即浅表性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-不典型增生-胃癌,其中肠上皮化生和不典型增生是胃黏膜良性病变向恶性病变的前奏,属于慢性增生性疾病。本研究发现:HSP27在浅表性胃炎-消化性溃疡-萎缩性胃炎-不典型增生-胃癌组织中的表达阳性率呈递增趋势,(分别为30%、36.67%、66.67%、73.33%、76.67%),其中胃癌阳性率与过表达明显高于浅表性胃炎及消化性溃疡(P

幽门螺杆菌感染是慢性胃炎和消化性溃疡发病的主要相关病因,与胃癌及胃黏膜相关性淋巴组织恶性淋巴瘤的发生亦有关[2]。我们主要观察胃癌患者及胃黏膜病变患者HSP27的表达及其与幽门螺杆菌感染的相关性,表明HSP27的过度表达与胃癌、幽门螺杆菌感染的严重程度密切相关, HSPS及HSP27的过度表达可能发生在胃癌发生发展的过程中,从中推断可以通过对HSP27及HSPS表达的反应对幽门螺杆菌感染的状况进行预测,同时对肿瘤分化程度、耐药性及预后都能提供一定的帮助。

参 考 文 献

[1] 郭建成,张学庸,杨云生等.热休克蛋白70在人胃癌中呈过度表达.癌症,1999,18(1):45-46.

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