免疫组化染色范文

免疫组化染色篇1

[关键词] BrdU；免疫组织化学染色；胰酶抑制剂；牛血清白蛋白；漂片法

[中图分类号] R392-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）02（b）-0016-03

Improvement in technique of BrdU immunohistochemical staining by bleach section

GUO Jingjing1 SHAN Lidong2 WU Gang3

1.Department of General Surgery, Huashan Hospital Baoshan Branch of Fudan University, Shanghai 200431, China;

2.Department of Neurobiology and Medical Psychology, School of Preclinical Medicine and Biological Sciences,Medical School of Suzhou University, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China;3.Department of General Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China

[Abstract] Objective To reduce the tissue slice breakage, explore the technique of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) immunohistochemical staining by blocking buffer in bleach section. Methods BrdU, which was detected by ABC immunohistochemistry on bleach section of brain slides, was used to incorporate the new born cells which were promoted proliferation by motor-driven wheel running. The different blocking effects of Goat serum, trypsin inhibitor and bovine serum albumin were compared in the process of immunohistochemistry. Results In the group of motor-driven wheel running in the dentate gyrus of the hippocampus in rats, the number of BrdU-positive cells was more than the control group. The breaking rate of slides was reduced obviously, especially in the groups with bovine serum albumin and trypsin inhibitor, after being added different blocking reagents. But cells in trypsin inhibitor group were appeared without specific staining. Conclusion Bovine serum albumin is preferable blocking buffer.

[Key words] BrdU; Immunohistochemical staining; Trypsin inhibitor; Bovine serum albumin; Bleach section

5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞周期的S期掺入到增殖或分裂细胞的核内，只要细胞不消亡，BrdU 将永久地存留在胞核DNA 中，且在体或离体都能通过免疫组织化学的方法检测到，可用于标记BrdU暴露期间进行DNA合成的细胞[1]。故BrdU阳性细胞可被看作是具有增殖活性的细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：SD大鼠，雌雄不拘，体重220~230 g，苏州大学实验动物中心提供。试剂：BrdU（ Roche Diagnostic Co.）。

1.2 分组

踏转轮运动对成年大鼠海马齿状回细胞增殖的影响。实验分两组，①踏转轮运动组：转轮速度为10 m/min，每天训练2次（09:00，15:00），每次训练30 min，连续6 d；②对照组：动物置于转轮中，速度为0。放置次数与时间同运动组。在染色过程中每一组又分为三个亚组，分别为加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组。

1.3 BrdU标记

踏转轮运动的第4天开始给药，于每次运动前1 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg，美国ROCHE公司），2次/d，连续3 d。末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，进行BrdU染色。

1.4 BrdU免疫组织化学

切片经2 mol/L HCl（室温30 min）变性， 用0.01 mol/L PBS 充分漂洗后转入0.1%胰酶中（37℃ 15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分别加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组，室温下30 min, 然后加入小鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶200，Biosource）室温孵育16 h，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），转入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室温孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入亲和素生物素试剂（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室温孵育2 h，最后用含0.03% H2O2的0.05% DAB显色3~5 min， 0.01 mol/L PBS终止显色。常规脱水、透明、封片。镜检BrdU阳性细胞计数。

1.5 统计学方法

随机选取每只大鼠位置相同的5张不连续切片，光学显微镜下（×200）计数每张切片双侧海马齿状回颗粒细胞层（granular cell layer，GCL）免疫反应阳性细胞数。阳性细胞的均数作为统计数据，以均数±标准差（x±s）表示。用SPSS 10.0软件作方差分析（one-way ANOVA）检测组间差异性。

2 结果

2.1 踏转轮运动对成年大鼠齿状回细胞增殖的作用

经过6 d的踏转轮运动训练后，各组BrdU阳性细胞见图1。免疫组织化学结果显示，海马齿状回BrdU阳性细胞数，对照组为（22.55±1.91）个/切片，踏转轮组为（57.89±1.90）个/切片，两组相比差异有高度统计学意义（P < 0.001）。由此可见，踏转轮运动可增加BrdU阳性细胞，促进齿状回细胞增殖。

a、a′为对照组， b、b′ 为踏转轮组。a、b分别是a′、b′的高倍视野

图1 踏转轮运动6 d后海马齿状回BrdU阳性细胞数

2.2 不同的封闭液对组织片染色效果的影响

末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，将切片随机分成三组。在染色过程中，这三组分别加入羊血清、胰酶抑制剂和牛血清白蛋白作为封闭液和终止胰酶作用的抑制剂。各组BrdU阳性细胞如图2所示。免疫组织化学结果显示，三种方法均能使BrdU着色，但各组的本底颜色和非特异性着色程度不同：羊血清组中虽然阳性细胞与非特异性着色细胞有明显区别，但非特异性着色细胞显色度较深，且遍布整个视野。胰酶抑制剂组阳性细胞与非特异性着色细胞也有明显差异，而且非特异性着色细胞显色度较浅，整个本底相对较为干净、清爽。牛血清白蛋白组几乎见不到非特异性着色细胞，本底颜色非常淡。

除了本底颜色和非特异着色的观察外，笔者还重点观察了组织切片的破损情况。实验结果显示：牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组无切片破损，而羊血清组有少部分脑片破损。细胞计数显示：羊血清组为（23.22±2.38）个/切片，胰酶抑制剂组为（22.54±2.12）个/切片，牛血清白蛋白组为（23.14±3.12）个/切片，各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

自从20世纪末神经干细胞发现以来，其目前已经成为神经科学研究的热点之一。而研究在体或移植后的神经干细胞的增殖、迁移、分化中常用的标记新生细胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前两者在细胞增殖时整合入细胞以后，即使在细胞静止期仍能表达；后两者是细胞增殖过程中表达的内源性蛋白，当细胞处于静止期时，它们并不表达。因此，BrdU和3H是常用的追踪细胞的标记物，而BrdU的检测又较3H更为方便、简单，所以BrdU是最为常用的标记细胞增殖的标记物。

丰富环境对神经发生有影响，而在各种环境因素中，运动对其影响较为显著[4-5]。本课题的前期研究建立了踏转轮运动的模型[6]，并发现运动对神经发生的作用具有强度依赖性，这早于国内外的相关报道[7-8] 。故本课题选用运动作为促进细胞增殖的方法，观察了不同的染色方法对切片及结果的影响。

组织切片BrdU染色时，常用的方法有贴片法和漂片法。漂片法与贴片法相比有一定的优点：前者能使抗体从两侧渗透，更有利于抗体与抗原充分反应，相应的在洗片时，也能使未结合的抗体充分漂洗干净；漂片法比贴片法所使用的抗体数量少，而且必要时抗体还可以回收，重复利用。标本量大时，漂片法比贴片法更省时、省力。但是，用漂片法进行BrdU染色时，由于在加入抗体前要用盐酸和胰酶对脑片进行预处理，经过处理（尤其是胰酶处理）后，进行染色的脑片极易破损，从而导致整个染色过程无法正常完成，或最终所得到的脑片极少。因此，在本实验中针对胰酶的消化作用，笔者分别选用了与二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制剂来抑制（或终止）胰酶的消化作用。

羊血清是免疫组织化学中常用的封闭液，但是，在本实验中并未取得预期的成果，虽然羊血清能终止胰酶的消化作用，但并未能有效地封闭非特异性染色。其原因目前仍不清楚，有待进一步研究。胰酶抑制剂（取自火鸡蛋清）组和牛血清白蛋白组非特异性染色较少，尤其是牛血清白蛋白组。其原因可能是二者的成分单一，纯度较高。

[参考文献]

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免疫组化染色篇2

在恶性淋巴瘤的诊断与分型中,免疫组织化学染色标记作为辅助诊断的手段越来越重要,甚至已经成为不可缺少的方法之一。目前,在临床病理诊断中使用免疫组化方法主要是在石蜡包埋组织中进行。在组织固定、包埋等处理过程中很多抗原被封闭。部分抗原需要按照抗体使用指南中的方法来做抗原暴露修复,组织中的部分抗原仍然不能完全暴露,由此造成假阴性,从而影响正确诊断。笔者在临床应用免疫组化技术过程中,体会到将部分组织切片采用抗原双次修复的办法[1],让仅一次抗原修复,封闭抗原未能充分暴露的组织能够得到有效的表达。降低了假阴性和假弱阳性,提高了淋巴瘤诊断与分型的准确率。

1 资料与方法

1.1 一般资料 挑选中山大学附属第五医院病理科 2007~2009年淋巴瘤病例37例,其中最终诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的共有23例,套细胞淋巴瘤的共有9例,结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型的共有5例,性别:男20例,女17例,年龄35~72岁。将石蜡组织标本切片后分2组 A组:热修复组;B组:热修复联合胰酶修复组。

UItraSenSitire Tm S P免疫组化试剂盒(A:内源性过氧化酶阻断剂;B:动物非疫血清;C:生物素标记的二抗;D:链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶)。Trypsin 胰蛋白酶修复液 、PBS冲洗液pH7.4。0.01%柠檬酸中性缓冲修复液、日本产家用微波沪、DAB显色剂。鼠抗人单抗CD3、鼠抗人单抗CD45RO、鼠抗人单抗CD20、鼠抗人单抗CD79a、鼠抗人单抗CyclinD1、鼠抗人单抗CD5、鼠抗人单抗CD56。(以上试剂均购自福建迈新试剂公司)

1.2 方法 ①组织常规固定脱水石蜡包埋切片脱蜡至蒸馏水冲洗 PBS冲洗3 min×3次;

②滴加内源性过氧化酶阻断剂15 minPBS冲洗3 min×3次;

③A组:切片放入柠檬酸修复液盒中置微波沪里修复。100℃微波1~2 min、40℃微波3 min修复,取出修复盒、室温下自然冷却。PBS冲洗3 min×3次;

B组:切片在A组修复的基础上进行第二次修复:滴加0.1%胰酶修复液15 min,PBS冲洗3 min×3次;

④甩去PBS冲洗液,切片同时分别滴加血清15 min;

⑤甩去血清,滴加相应抗体,湿盒置37℃温箱中,孵育2~3 h,取出室温下PBS冲洗3 min×3次;

⑥滴加生物素标记二抗,15 min,PBS 3 min×3次;

⑦滴加链霉菌抗生物素蛋白 过氧化酶15 min,PBS冲洗3 min×3次;

⑧滴加DAB显色剂,显色(约5 min)后将切片用水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。

2 结果

光镜下观察两组中每一例淋巴瘤的肿瘤细胞胞浆及胞膜,以大于10%的肿瘤细胞胞浆或胞膜出现清晰的棕黄色颗粒为阳性标准,结果如下:

①23例弥漫性大B细胞淋巴瘤组中,CD20用A方法修复的阳性率为34.78%,B方法修复的阳性率为100%;CD79a用A方法修复的阳性率为30.43%,B方法修复的阳性率为91.30%;CD3及CD45RO为T细胞标记,肿瘤细胞不表达。

表1

CD20及CD79a在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的

阳性表达率

分组A方法B方法

CD208/23(34.78%)23/23(100%)

CD79a7/23(30.43%)21/23(91.30%)

注:P值

②9例套区淋巴瘤组中,CD5用A方法修复的阳性率为33.33%,B方法修复的阳性率为88.89%;CyclinD1用A方法修复的阳性率为22.22%,B方法修复的阳性率为88.89%;CD3及CD45RO为T细胞标记,肿瘤细胞不表达。

表2

CD5及CyclinD1在套区淋巴瘤中的阳性表达率

分组A方法B方法

CD5*3/9(33.33%)8/9(88.89%)

CyclinD1**2/9(22.22%)8/9(88.89%)

注:*p值

以上结果经统计学分析均有统计学意义,说明在B细胞淋巴瘤中弥漫性大B细胞淋巴瘤及套区淋巴瘤的诊断免疫组织化学染色中,使用双次抗原修复法修复CD20、CD79a及CD5、CyclinD1的阳性率显著高于一次抗原修复法,同时做T细胞标记,两种修复方法均不易产生假阳性。

笔者还对本科室的5例结外NK、T细胞淋巴瘤,鼻型病例进行同样比对,发现CD56用A方法修复的阳性率为60%,B方法修复的阳性率为100%;由于CD45RO在NK/T细胞淋巴瘤中的表达不稳定,所以用方法修复对比没有差异性;CD20及CD79a为B细胞标记,肿瘤细胞不表达。由于样本数小,不适宜做统计学分析,陈列在此仅供参考!

3 讨论

恶性淋巴瘤的病理诊断与鉴别诊断是临床病理诊断中最困难的领域,随着免疫学的发展,免疫组织化学技术不仅在诊断方面提供了有力的依据,而且在具体分型及指导用药方面也起着重要作用。但由于淋巴结本身的结构特点及在石蜡标本制作过程中,组织中的一些抗原容易被封闭,导致免疫标记表达不理想或阴性表达,从而混淆诊断医师的思路,延长诊断时间,甚至误诊!笔者在学习了免疫组化染色中抗原双重暴露法后[1],应用于恶性淋巴瘤的诊断。

长期临床工作中,笔者发现修复的时间与方法不到位时,组织中抗原无法完全暴露。常规应用高温微波修复,设定温度100℃修复10~15 min,组织中部分抗原能够暴露,但薄切的组织切片会破碎、脱落,影响观察诊断。经反复、设定多个修复时间段实验(15、10、5、3、1 min),发现高温100℃修复1~2 min,组织切片形态完整,此时继续再用40℃温度,保持3 min修复,组织中抗原能达到一定限度的暴露。部分淋巴瘤肿瘤标记表达较困难,我们用(温度100℃时间1~2 min;温度40℃时间3 min)在微波炉中进行热修复后,再用0.1%胰酶修复15 min。通过两次修复后,组织中抗原与抗体结合点位增多,免疫标记敏感性进一步加强,组织中抗原充分暴露。同时又没有破坏免疫标记的准确性和特异性。组织染色后,假阴性表达减少,为医生提供了准确的辅助诊断信息,确保淋巴瘤诊断与分型的准确性。

参考文献

免疫组化染色篇3

[关键词] 抗原修复方法；肾活检；石蜡切片；免疫荧光染色

[中图分类号] R692.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）05（c）-0190-02

免疫荧光技术又被称为荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种，具有特异性强、敏感性高、速度快等特点，在肾穿刺活检的病理诊断中具有很大的意义。选取该院2013年2月―2013年9月间确诊为肾小球疾病的患者为研究对象，主要探讨了不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该院共接收30例经确诊为肾小球疾病的患者，男性14例，女性16例，年龄在19～64周岁之间，平均年龄为（41.5±13.4）周岁。其中有9例患者属于IgA肾病，8例患者属于局灶节段硬化性肾小球肾炎，6例患者属于轻度系膜增生性肾小球肾炎，4例患者属于膜性肾病，3例患者属于系统性红斑狼疮。将每例患者的肾活检标本分别制成采用10%福尔马林固定的2 μm厚石蜡切片，和2 μm厚的冰冻切片，冰冻切片为对照组，石蜡切片为研究组，并将研究组的标本随机分为胰酶抗原修复组、无抗原修复组、高压加热抗原修复组，分析和对比两组的免疫荧光染色结果，两组患者的年龄、性别、病程、病史等一般资料，数据差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂准备 仪器准备：1个湿盒、1个电高压消毒锅，和3个过酸立式染缸。所有标本均采用型号为Nikon，80i的荧光显微镜进行观察。试剂为：由丹麦DAKO公司生产的异硫氰荧光素标记的免抗人IgA、IgG、IgM、C1g、C3、Fib，和福州迈新生物技术公司生产的胰酶，以及采用自配制的枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液，3%过氧化氢溶液、PBS液。

1.2.2 修复方法 先将所有标本进行常规处理。将玻片进行特殊处理后浸泡在多聚赖氨酸中，取出干燥备用。然后进行连续切片2 μm，裱于载玻片上，将其置于60 ℃上进行烤片，5 h后取脱蜡水对标本进行清洗，采用PBS缓冲液反复清洗数次，取3%过氧化氢溶液将标本的过氧化物酶进行去除，处理时间一般为10 min。最后，按照研究组的3种抗原修复方法分别进行免疫荧光染色。

①无抗原修复组。标本进行常规处理后，放置待用。

②胰酶抗原修复组。将常规处理后的标本在37 ℃的恒温箱子里采用0.25%的胰酶进行孵育，当15 min以后再用蒸馏水对标本进行反复冲洗两次，将标本上的胰酶冲洗干净。

③高压加热抗原修复组。将枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液倒入过酸立式染缸中，再将立式染缸放进电高压消毒锅中，盖上锅盖，打开压力阀，将过酸立式染缸中的枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液煮沸，然后打开锅盖，将常规处理好的标本放入枸橼酸-枸橼酸盐缓冲液中，将电高压消毒锅进行密封，并盖上锅盖和关紧压力阀，再次进行加热，直到电高压消毒锅开始喷气，并喷气两分钟后，将电高压消毒锅的电源关闭，打开压力阀和锅盖，然后将锅内的过酸立式染缸取出，于常温下放置20 min，冷却待用。

研究组所有标本均进行不同的修复方法处理后，用蒸馏水反复冲洗两次，再用PBS缓冲液清洗两次，每次清洗时间为3 min，清洗完成后将标本擦干，与冰冻切片一起放入准备好的湿盒内，取相应的抗体10 μL分别滴入标本上，在保持37 ℃的恒温下进行孵育，1 h后，再次取PBS对标本进行清洗2次，最后取甘油进行封片处理。用荧光显微镜观察染色结果。

1.3 观察指标

观察和比较两组的有效肾小球数和荧光抗体IgG、IgA、IgM、C1q、C3的沉积位置。根据荧光抗体的沉积位置和荧光强度进行评定标本的阳阴性，阴性（-）：采用低倍镜无法看见荧光，采用高倍镜似可见荧光；弱阳性（+）：采用低倍镜似可见荧光，采用高倍镜可见荧光；阳性（++）：采用低倍镜可以明显的看见荧光，采用高倍镜荧光非常清晰；较强阳性（+++）：在低倍镜下荧光非常清晰，在高倍镜下荧光表现为耀眼；强阳性（++++）：在低倍镜下荧光表现为耀眼，在高倍镜下荧光表现为刺眼。

1.4 统计方法

所有数据均采用统计学软件SPSS17.0进行分析和处理，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组有效肾小球数比较

两组标本所观察到的有效肾小球数均≥3个，两组数据差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

在肾疾病的诊断过程中，肾活检组织免疫的检查起到诊断标志性的作用，在肾活检组织免疫的检查中，主要分为冰冻切片免疫荧光染色检查和石蜡切片免疫荧光染色检查。但是在传统的验证中，由于福尔马林固定会使标本的蛋白质产生交联的现象，抗原决定簇被封闭，因此，传统认为福尔马林固定的石蜡切片并不适合进行肾活检标本的免疫荧光染色。经文献[2]发现，事实上抗原先将标本进行抗原修复后，再对标本进行石蜡切片的免疫荧光染色处理，可以达到临床诊断的效果。

该研究通过分析了不同抗原修复方法对肾活检标本的免疫荧光染色结果，以及比较了无抗原修复组、高压加热抗原修复组、胰酶抗原修复组，分别与对照组冰冻切片的免疫荧光染色结果，结果显示：研究组中无抗原修复组的染色效果比对照组较差（P

综上所述，胰酶抗原修复组的免疫荧光染色结果最好，与冰冻切片的结果基本相符，因此，冰冻切片的免疫荧光染色标本无肾小球的时候，可以采用胰酶抗原修复作为补救措施。

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免疫组化染色篇4

【摘要】

目的 观察抗体质量和封闭方法对肾小管免疫组织化学非特异性反应的影响，探讨其控制方法。方法 采用免疫组织化学SP法检测肾脏血管平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，SMA），对比观察不同公司的抗体及不同封闭方法对肾小管非特异性免疫组织化学染色的影响。结果 各组采用正常山羊血清封闭，不同抗体检测结果可见：1号抗体组，肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，且在肾脏皮质区内远曲小管为重；2号抗体组，染色结果与1号抗体基本相同；3号抗体组，肾脏组织中血管平滑肌细胞内均呈棕黄色着色，肾小管上皮细胞内未见着色。各组分别采用正常山羊血清、5%BSA、25%蛋清液及正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后的染色结果可见：1号抗体组，采用正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后，肾小管上皮细胞染色强度减轻；2号抗体组，在使用不同封闭液的各组间，未见差别；3号抗体组，肾小管上皮细胞内未见着色，其中，25%蛋清+正常山羊血清混合封闭的效果最佳。结论 在免疫组织化学技术中，选择适当的封闭液和抗体是有效控制非特异性染色的重要因素。

【关键词】 免疫组织化学；肾小管；非特异性；平滑肌肌动蛋白

Abstract: Objective To explore the method to suppress the nonspecific immunoreaction of renal tubules. Methods A comparative investigation was carried among the antibodies from different companies and different blocking in the rat kidney by means of Streptavidin-peroxidase technique. Results The results using normal goat serum blocking showed that there were diffuse yellow granullar staining in renal tubule epithelium， and more powerful staining were found in distal convoluted tubule of kidney cortical in No.1 antibody group than that in other groups. The staining profile in the No.2 antibody group was the same as No.1 group. There were yellow staining in vascular smooth muscle cell of kidney， and no staining in renal tubule epithelium in the No.3 antibody group. The results using different blocking including normal goat serum，5% BSA，25% egg white， and mixing liquor of normal goat serum with 25%egg white showed that the staining intensity in renal tubule epithelium was lessen used the mixed liquid in the No.1 antibody group. There were no significant difference among the different blocking in the No.2 antibody group. There was no staining in renal tubule epithelium in the No.3 antibody group. The best immunostaining was observed in the group with mixed blocking liquid， normal goat serum with 25% egg white. Conclusion It is an important factor for immunohistochemistry to select the blocking liquid and the antibody to suppress the nonspecific reaction.

Key words: immunohistochemistry; kidney; nonspecificity; α-Smooth muscle actin

免疫组织化学技术作为研究蛋白质在细胞原位分布的一种常用方法，具有特异性强、灵敏度高等优点，能够直接进行定性和定量的形态观察，为疾病的诊断、鉴别诊断和发生机制等研究提供有力的手段，是一项不可缺少的技术［1］。但由于多种原因，免疫组化染色常出现非特异性染色，甚至干扰正常的染色结果。由于肾小管具有丰富的内源性过氧化物酶、生物素等成分，在免疫组织化学染色中容易出现非特异性染色，严重影响结果的判断［2］。本研究采用免疫组织化学SP法染色，对比观察不同公司的兔抗鼠血管平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin，SMA）单克隆抗体及四种封闭方法对肾小管非特异性免疫组织化学染色的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

取正常SD大鼠肾脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度5μm，常规HE染色，观察肾脏组织学结构。SMA单克隆抗体为商品化产品，分别购自博海生物公司、博奥森公司、迈新公司； SP即用型羊抗兔试剂盒购自博奥森公司。其它配套试剂和常规试剂均为通用的商品化产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

按照抗体来源分为1、2、3号抗体组；按照封闭方法分为正常山羊血清、5%牛血清白蛋白（BSA）、25%蛋清、正常山羊血清+25%蛋清混合液共4组。

1.2.2 免疫组织学方法

切片脱蜡、水化；柠檬酸盐缓冲液微波修复，自然冷却后，PBS洗涤，3%H2O2室温孵育10min，PBS洗涤，封闭液20min，甩去勿洗，加入SMA单克隆抗体(1∶100)室温孵育2h，PBS洗涤，生物素化二抗室温孵育20min，PBS洗涤，辣根酶标记的链酶卵白素室温孵育30min，PBS洗涤；DAB显色，苏木精复染、脱水、透明、封片。以正常山羊血清封闭作为常规封闭方法，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 结果判断

在显微镜下观察切片染色情况，阳性结果为淡黄色到棕褐色，定位于平滑肌细胞质，以血管平滑肌细胞阳性、肾小管阴性作为染色成功的标准；平滑肌细胞不着色为染色失败的标准；具有肾小管染色者为非特异染色的标准。根据染色结果，对不同公司来源的抗体和不同封闭方法的染色结果进行评价。

2 结果

2.1 肾脏组织学观察

肾脏结构清晰，肾小球分布正常，主要集中在肾脏皮质，肾小球大小均匀，毛细血管结构清楚，无系膜细胞和内皮细胞的增生。近曲小管、远曲小管和集合小管分布正常，上皮细胞结构清晰，无细胞变性和坏死，肾小管腔无蛋白管型以及蛋白性物质。肾脏间质和肾盂正常，无明显充血和水肿及炎症反应。入球动脉和出球动脉清晰可见，具有1-2层平滑肌细胞，可见内皮细胞，无血管壁的玻璃样变性。小叶间动脉、弓状动脉和叶间动脉分布正常，管壁平滑肌细胞清晰可见，未见血管壁增厚以及血管炎症反应。

2.2 不同来源抗体染色结果

均采用正常山羊血清封闭，免疫组织化学染色结果可见，1号抗体组，肾脏组织血管平滑肌细胞内可见黄色细颗粒状着色，同时，在肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，且在肾脏皮质区内远曲小管为重（图1A，见封3）；2号抗体组，肾脏组织血管平滑肌细胞内均可见呈弥漫分布的棕黄色着色，在肾小管上皮细胞内也可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，并以远曲小管上皮细胞为重（图1B，见封3）；3号抗体组，肾脏组织中血管平滑肌细胞内均呈棕黄色着色，使各级血管轮廓清晰可见，肾小管上皮细胞内未见着色，背景基本干净（图1C，见封3）。

2.3 不同封闭方法染色结果

分别采用正常山羊血清、5%BSA、25%蛋清液及正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后的免疫组织化学染色结果可见，1号抗体组在5%BSA、25%蛋清液封闭后，肾脏血管平滑肌细胞内可见局灶性细颗粒状黄色着色，着色均比较浅淡，使血管轮廓不清晰，而在肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，尤其是远曲小管着色最重。采用正常山羊血清+25%蛋清混合液封闭后，肾小管上皮细胞染色强度减轻，表现为浅黄色细颗粒状着色（图2A，见封3）；2号抗体组，肾脏组织血管平滑肌细胞内均可见呈弥漫分布的颗粒状棕黄色着色，同时在肾小管上皮细胞内可见弥漫性棕黄色颗粒状着色，在使用不同封闭液的各组间无明显差异（图2B，见封3）。3号抗体组，肾脏组织中血管平滑肌细胞内均呈棕黄色着色，各级血管轮廓清晰可见，肾小管上皮细胞内未见着色，背景干净，其中，25%蛋清+山羊血清混合封闭的效果最佳（图2C，见封3）。

3 讨论

免疫组织化学是在蛋白质水平上定位观察的一种常用技术，应用范围非常广泛［1－2］。但是，免疫组化又是多步骤、多因素决定其结果的方法，存在很多干扰因素，甚至会导致结果的误判和误诊。影响免疫组化结果的诸多内外因素中，富含内源性过氧化物酶、内源性生物素的组织，以及一抗的质量问题是引起非特异染色、影响免疫组化结果的常见原因。

在代谢旺盛的含有丰富线粒体细胞的组织中，如肾脏、肝脏、甲状腺等，其所含的内源性生物素蛋白结合物广泛存在于细胞质中，着色后出现足以以假乱真的阳性结果，引起误判，有时会严重影响结果的正确判断。本研究结果也发现肾小管的非特异染色，通过采用25%蛋清+正常山羊血清混合封闭能够明显减少肾小管非特异性免疫组织化学染色，这与以往的研究报道基本一致［1］。

在本实验中我们发现，除上述因素外，在免疫组化技术中，抗体的敏感性、特异性及检测系统的选择和应用也是控制非特异性染色的重要因素，与有关研究一致［3］。抗体的特异性是指一种抗体只能结合某一种组织上刺激该抗体产生的特定抗原表位而引起免疫反应。事实上，任何组织的免疫表型都非常复杂，因此组织中相似的抗原表位，即共同表位与抗体的交叉反应也是混淆免疫组化结果的重要原因，所以在抗原抗体反应中，抗体的特异性就显得特别的重要。此外，在选择适宜的抗体时，也应考虑到其敏感性。一般而言，单克隆抗体的特异性较多克隆抗体高，但多克隆抗体的敏感性比单克隆抗体高，所以，要想得到满意的染色结果，应该综合考虑到抗体的特性。本实验可以看到，使用3号抗体的各组中，选择不同的封闭液进行封闭，血管平滑肌细胞均出现特异性染色，而肾小管上皮细胞未见非特异性着色。而在使用1和2号抗体的各实验组中，尽管使用了各种不同的封闭方法对其非特异性进行控制，但是效果不佳，肾小管上皮细胞均仍然出现非特异染色。提示选择优质抗体也是有效防止肾小管免疫组化非特异染色，保证免疫组化质量的重要因素。

参考文献

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［2］王永军，黄瑾，杨会钗，等.免疫组织化学染色中消除内源性生物素的方法研究［J］.河北医科大学学报，2008，29(3):453.

免疫组化染色篇5

【摘要】  目的通过对大蒜素治疗和未治疗弓形虫感染小鼠免疫组织脾淋巴细胞数、肠系膜pp结数、肠内皮淋巴细胞数（iel）及对再攻击感染免疫力测定，了解大蒜素对免疫功能的影响。方法将小鼠分成治疗组、感染组和对照组，用5×104个/只rh株弓形虫速殖子经口感染小鼠，当天用大蒜素治疗，1次/d，持续14 d，治疗后0，2，4，6，8，10，12周断颈处死小鼠，记数脾淋巴细胞、肠系膜pp结、肠内皮淋巴细胞数（iel），并用1×106个/只速殖子再次感染小鼠，观察存活情况。结果在观察的时间段内，肠系膜pp结数无明显变化，脾淋巴细胞数、iel数治疗组高于感染组和对照组，以治疗后4，6，8周差异具有显著性（p＜0.05)。对再攻击感染免疫力测定结果显示，治疗组存活率高于感染组和对照组，差异具有显著性（p＜0.05)。结论大蒜素治疗经口感染弓形虫速殖子小鼠后，能刺激免疫组织增生，提高对再攻击感染存活率。

【关键词】  大蒜素； 弓形虫； 感染； 免疫组织； 存活率

刚地弓形虫(toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生虫，可感染包括人在内的大部分宿主。急性感染阶段，速殖子在体内迅速增殖，机体对其免疫应答主要为ifn-γ介导的细胞免疫［1］。慢性感染是由于弓形虫由速殖子转为生长缓慢的包囊状态［2］，从而在宿主体内长期存在。在免疫抑制的个体中，如化疗病人、aids患者，弓形虫是一种重要的机会致病原，它可由慢性感染再燃而引起严重病变。为研究大蒜素在改善低剂量强毒株速殖子感染小鼠的免疫组织应答和存活情况，进行了此项实验，探讨通过调节免疫应答平衡来恢复免疫力的机制。

1   材料与方法

1.1  弓形虫rh株购自天津医科大学寄生虫学教研室，由河北大学医学部实验中心保种。

1.2 动物

spf级balb/c小鼠购自河北医科大学，由河北大学医学部实验中心动物室繁殖，8周龄。颗粒饲料喂养，自然光照、自由进食饮水。

1.3 药物

大蒜素，针剂，30 mg/支，上海禾丰制药有限公司产品，批号070802。

1.4 分组126只balb/c小鼠，随机分成感染组、治疗组和对照组，每组42只。rh株弓形虫速殖子5×104个/只经口感染小鼠，对照组灌服生理盐水，治疗组感染当天给大蒜素80 μg/只，1次/d，连续14 d，感染组灌服生理盐水替代。

1.5  指标及测定方法

1.5.1 脾t淋巴细胞分离与计数将脾置于300目不锈钢网上研磨，用pbs洗涤离心，淋巴细胞分离液分离试管内中层白色膜状淋巴细胞；用2%台盼蓝染色，计数淋巴细胞。

1.5.2 小肠pp结分离与计数摘取小肠，置于5%fbs-pbs中，计数小肠浆膜表面pp结数目(通常在肠系膜附着处对侧，丘状隆起，色泽较白)。

1.5.3 小肠上皮内淋巴细胞（iel）分离与计数将去除pp结和冲洗肠液后的小肠剪成1～2 cm的小段，并纵行剪开，将洗过的肠段悬浮在含edta的pbs烧杯中，37℃磁力搅拌1 500 r/min×30 min。300目不锈钢网过滤，再用内装脱脂棉过滤，过滤后2 500 r/min×8 min离心，沉淀物用percoll密度梯度离心法将iel与肠上皮细胞分离。用微量移液器吸出白色雾状iel层，2%台盼蓝染色后计数iel。

1.5.4 对再攻击感染免疫力测定取对照组、感染组和治疗组各42只共126只小鼠，于实验第8周用1×106个/只速殖子再次感染小鼠，观察至43周结束，记录活动情况、计算存活率。

2  结果

2.1 脾t淋巴细胞数变化在观察的实验周期中，对照组小鼠脾淋巴细胞总数无明显变化，感染组、治疗组在感染后第2周开始增生，第4周达高峰，第6周降至对照组水平，第4周明显高于对照组(p<0.01)。结果见表1。　表1  小鼠脾淋巴细胞数（略）

2.2 小肠pp结数变化在观察的实验周期中，各组小鼠小肠pp结数目均无明显变化，治疗组平均为8.60个，感染组为8.34个，对照组8.46个，3组比较无显著差异（p＞0.05)。结果见表2。

2.3 小肠上皮内淋巴细胞（iel）数变化实验周期内对照组小鼠iel数量有轻微变化，但无显著性。感染组和治疗组显著增生，第4周有显著性差异，随后逐渐下降，第8周降至对照组水平。第4，6周组间比较有显著性差异(p<0.01)。结果见表3。表2  小肠pp结数目（略）表3  小鼠小肠上皮内淋巴细胞（iel）数（略）

2.4  再攻击感染存活率治疗组小鼠存活率显著高于感染组和对照组(p<0.01)。见表4。表4  各组小鼠存活率（略）

3  讨论

   

弓形虫是细胞内寄生虫，感染机体后主要引起细胞免疫，t细胞在此免疫中具有很重要的作用［3］，脾脏是人体最大的淋巴器官，脾t细胞对外来抗原或疫苗刺激的增殖性反应代表机体系统免疫应答水平。freyre  a ［4］等用弓形虫卵囊经口感染孕猫进行免疫研究发现，感染后猫出现严重的临床表现，甚至是致死性的威胁，肠系膜淋巴结发生病理变化是在第6天左右。barragan a ［5］等用弓形虫包囊口服感染小鼠，发现能透过生理屏障感染其他部位，诱导肠道应答高峰在感染后第6天并持续至第7，8天。陈光认为“大蒜素能抵抗弓形虫速殖子进入细胞，特别使抑制在细胞内增殖作用明显，机理是诱导虫体凋亡和直接杀死，通过调节免疫应答平衡来恢复免疫力的”。

   

为与包囊感染发生的免疫应答进行对比，观察不同毒力虫株和感染方式的进程及后果，我们实验采用强毒株rh株速殖子经口感染小鼠，结果显示：治疗组、感染组、对照组脾t细胞和小肠上皮内淋巴细胞（iel）数在第4，6，8周有显著性差异，各组小鼠小肠pp结数目无明显变化，说明经口感染速殖子也能有效刺激脾t细胞增生，并且大蒜素加强了这种增生能力，小肠pp结不是靠数量的增多发挥免疫作用的，主要是组织结构的变化促使功能加强，肠道黏膜免疫效应部位iel是体内最大淋巴细胞群［6］，因其特殊的定位而成为黏膜表面抵抗病原体入侵肠道的首道免疫屏障，增生明显、持续时间长，是效应部位发挥免疫的主要组织［7］，当抗原再次暴露于接触过低剂量强毒株速殖子感染小鼠的免疫组织时，应答迅速，使存活率明显提高，特别是大蒜素增强了免疫能力［8］。

【参考文献】

  　［1］nguyen td, bigaignon g, markine-goriaynoff d, et al. virulent toxoplasma gondii strain rh promotes t cell一independent overproduction of proinflammatory cytokines il 12 and gamfna-interferon［j］. t med microbiol， 2003，10(52):869.

［2］刘涛，徐秀菽，叶红兵，等.弓形虫隐性感染动物模型的建立［j］. 贵州医药，2001,25(12):1122.

［3］殷国荣，韩剑峰，刘红丽，等.经口感染弓形虫诱导的小鼠肠道黏膜t细胞亚群变化［j］.中国寄生虫病防治杂志，2004，17(4):199.

［4］freyre a,falcon j,correa o,et al. fetal toxoplasma infection after oocyst inoculation of pregnant rats［j］. parasitol res, 2003, 89(5): 352.

［5］barragan a, sibley l d.migration of toxoplasma gondii across biological barriers［j］. trends microbiol,2003,11(9): 426.

［6］刘红丽，殷国荣，沈嬿琼，等.小鼠过继转移致敏小肠iel抗弓形虫感染［j］.热带医学杂志，2005，5(1): 15.

［7］holmgren j, czerkinsky c. mucosal immunity and vaccines ［j］. nat med, 2005, 11(4 suppl): 45.

免疫组化染色篇6

【关键词】 西双版纳地区； 热带雨林气候； 免疫组化； 影响

doi：10.14033/ki.cfmr.2017.2.027 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）02-0053-02

病理诊断的金标准发展至今，其辅助手段也随之得到了良好的发展，如免疫组化就是最好的辅助手段，但免疫组化很娇嫩，对地域的要求因海拔的不同而有所改变，所以要根据不同的地域控制时间的长短，不断提高其质量，使它更好地为诊断服务[1]。免疫组织化学技术的原理是对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究的技术[2]。已有研究表明：修复液的温度和作用时间对修复效果有决定性的作用，温度越高修复时间越短，在昆明地区（海拔为1800 m左右）修复时间为30 min，但在低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min[3]。

1 材料与方法

1.1 实验地气候

本实验在海拔550 m、大气压为94.29 kPa、水沸点97 ℃～98 ℃、西双版纳景洪市进行。西双版纳位于北纬21°10'～22°40'，东经99°55'～101°50'，最高海拔2429.7 m，最低海拔477 m，相对高差1952.7 m。是世界上北回归线附近保存最为完好、面积最大的热带雨林。景洪市属于低海拔（约500 m），年平均气温（18 ℃～21 ℃）高，湿润（年降雨1100～1900 mm）的地区，笔者率先在西双版纳州成功开展了第1例免疫组化，并通过笔者所在科2013年至今开展的200多例免疫组化结果对照，并与其他地区进行比较。

1.2 材料

10%中性甲醛固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，组织分别为鼻咽鳞状细胞癌、甲状腺状癌、胃神经内分泌癌、淋巴结反应性增生。各蜡块分别切片5 μm，按照免疫组化步骤（Elivision法，试剂来源于Dakota公司）。

1.3 免疫组化操作过程

（1）石蜡涂片脱蜡和水化后，用PBS（PH714）冲洗3次，每次3 min。（2）根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。（3）每张涂片加50 μl 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。（4）每张涂片根据需要加50 μl的第一抗体（如CD20、CD3、CD45RO、CD45RB、TdT，MPO、CD5、CD56、CD79a、CD43、CD5、CD10），室温下孵育60 min。（5）除去PBS液，每张涂片加50 μl聚合物（polymer enhancer），室温下孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min。（6）除去PBS液，每张涂片加50 μl酶标抗鼠/兔聚合物（polymerized HRP-AntiMs/RbIgG），室温下孵育30 min PBS冲洗3次，每次3 min。（7）除去PBS液，每张涂片加50 μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3～10 min。（8）自来水冲洗，苏木紫复染，盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。（9）涂片经过梯度酒精脱水干燥，用DAE显色，中性树胶封固。

2 结果

修复时间20 min时（此时间为Dakota公司在其他地区用的传统时间），组织着色，阳性结果不显著，背景清晰；修复时间19 min时（比传统时间少1 min）组织已经着色，阳性结果不肯定，背景清晰；修复时间21 min时（比传统时间多1 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，而且组织无脱落，修复时间22 min时（比传统时间多2 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，但组织已部分脱落，具体见表1。镜下表现如下，

图1：胃神经内分泌癌SYN免疫组化染色，pH 9.0，1 mmol/L EDTA中煮沸30 min，胞浆强阳性染色，部分区域组织脱落（×200）。图2：

淋巴结反应性增生CD20免疫组化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在柠檬酸修复液中高压煮沸20 min，胞膜强阳性染色，背景清晰（×200），图3：鼻咽低分化鳞癌HCK免疫组化染色，pH 6.0，0.11 mmol/L柠檬酸修复液中煮沸20 min，胞浆强阳性染色，部分区域组织脱落（×200），图4：甲状腺状癌免疫组化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在柠檬酸修复液中高压煮沸20 min，胞膜强阳性染色，背景清晰（×200）。

3 讨论

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性[4]。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色DAB显示为棕黄色颗粒）[5]。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量[6]。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测[7]。抗原的修复通常有物理修复及化学修复，目前的国内根据不同的抗体主要的修复方法有：高温高压.胰酶修复、胃蛋白酶修复、EDTA修复，免疫组化技术都要求在高温高压下进行的[8]。随着精准医疗的理念，免疫组化也走进了大大小小的医院，成为诊断的好朋友。目前市场上的试剂很多，选择适合自己的很重要，也要根据自己地区的实际情况探索最佳方法。

本验结果显示，高温高压修复法是一种比较实用的抗原修复方法，特别是对于标本数不是特别多的基层医院。只是要根据本地区的海拔不同有所不同，要找到适合时间才能有好的效果。在低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min，可以推广运用。

参考文献

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免疫组化染色篇7

【关键词】前列腺增生；前列腺肿瘤； 病理检查； 免疫组织化学

前列腺增生症（benign prostatic hyperplasia， BPH） 是老年男性的常见疾病，其中25%有症状的BPH需手术治疗，目前常用的手术方法是行经尿道前列腺电切术（TURP）。研究报道，前列腺增生术后标本中可能伴有前列腺癌（prostate cancer， PCa）。而临床送检标本多为前列腺碎块组织，如何在无数碎块组织的诊断中不漏诊Pca，尤其是一些疑难病例，这是病理医生必须解决的问题。为此，本文针对送检BPH碎块组织的取材、制片及诊断方法做一探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 收集本院2009年至2012年临床诊断为前列腺增生的经尿道前列腺电切术后碎块组织标本738例，年龄38岁到87岁，平均为71岁。选用CK34βE12、P63、P504S、PSA、PSAP等抗体，抗体均从北京中杉生物公司购买。

1.2 方法 前列腺碎块组织标本经常规取材、脱水、浸蜡包埋后，切片、HE染色，显微镜下观察病变。对可疑病例进行免疫组化染色，其方法如下：石蜡切片脱蜡至水，PBS液冲洗。用PH为6.0的柠檬酸盐缓冲液对组织抗原进行修复。3% H2O2室温下孵育10min，PBS液冲洗。滴加正常山羊血清工作液，室温孵育20分钟，倾去液体。滴加稀释好的一抗（1：50）50ul，4℃孵育过夜，PBS缓冲液冲洗。滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育15分钟，PBS冲洗。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育15分钟，PBS液冲洗。DAB显色，自来水冲洗，以苏木素复染细胞，中性树胶封固切片。

1.3 免疫组化染色结果判断 CK34βE12、P504S、PSA、PSAP以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，P63以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性，无棕黄色颗粒出现即为阴性，出现微灶性或散在棕黄色颗粒为可疑阳性。

2 结果

2.1 BPH术后标本中的PCa病例 在738例临床送检前列腺增生电切术标本，共发现有恶性病例89例（12.0%），其中88例为PCa病例，另有1例为非奇金氏淋巴瘤。经常规HE染色后直接诊断为PCa的有69例，可疑病例41例。41例可疑病例经免疫组化染色后，其中19例诊断为PCa，1例诊断为非奇金氏淋巴瘤。

2.2 相关免疫标记在PCa中的表达 CK34βE12在腺泡基底细胞胞浆异性着色，P63在腺泡基底细胞胞核上特异性着色，P504S、PSA、PSAP在PCa中癌细胞中呈阳性表达，具体表达情况见图1。

3 讨论

BPH是老年男性常见疾病，其治疗方式多为经尿道前列腺电切术，所送病理活检组织为前列腺碎块组织。有资料报告，PCa患者前列腺内都有BPH结节状病变，有的结节内同时会有腺癌和部分癌变或不典型增生腺体上皮细胞，说明PCa与BPH有一定形态学联系[1]。Sakr等[2]报道年龄在40岁～49岁的男性病人中，发现组织学可以诊断为PCa的发生率高达34%；而在30岁～39岁组中则为27%，但均无临床症状，故早期发现PCa有着重要的作用。赵宏等[3]报道BPH术后有7例发现了PCa。但要在无数碎块小组织中判断是否隐匿有癌灶，对病理技术及诊断均有一定的要求。

就临床送检前列腺碎块组织标本，在常规取材及诊断方面应注意一下几点：1）碎块组织标本应全部送检，以免漏诊。2）每一包埋盒不要放太多组织，避免脱水不好、包埋不平而影响切片质量，建议每一盒最好不要超过8块。3）应做连续切片，王刚等[4]报道前列腺标本间隔5 mm切片，偶发癌的比例为27%，如果切片间隔2～3 mm，偶发癌的比例达到41%。4）镜下观察前列腺碎块组织标本时一定要细心，不能漏看任何一小块组织，对明确的病例可以直接报告为PCa，对疑为癌的病例应做进一步检查。本研究中，经常规HE染色后能直接诊断为癌的病例有69例，另有疑为癌病例41例。

对于可疑病例，目前最常用的检查方法是免疫组化染色。针对前列腺癌的诊断及鉴别诊断，常用的抗体有CK34βE12、P63、P504S、PSA、PSAP、PSMA。其中CK34βE12、P63可以观察到基底细胞是否存在，有助于前列腺癌的诊断，P504S、PSA、PSAP、PSMA在Pca中表达阳性，而BPH中表达阴性。研究认为CK34βE12在前列腺癌中的染色具有不确定性，对于少数病例，仅用CK34βE12来说明基底细胞的存在或缺失具有局限性，应联合应用P63检测基底细胞[5-6]。PSA对PCa有很强的特异性，但其敏感性却不佳，有少数PCa病例不表达该标记物。PSAP比PSA敏感性强，特别是在低分化的PCa上。然而，有一些专家称有5%的低分化PCa是不表达这两种抗原的，PSMA在识别这部分并不表达PSA和PAP的低分化PCa上特别有用。有报道称PSMA对PCa的阳性检出率要明显高于PSA（分别为94.28%、78.57%）[7]。最近有研究认为SPON2能发现PSA阴性的PCa病例，是一个敏感性及特异性均好的免疫标记[8]。应用免疫组化技术，用34βE12、P63染基底细胞，用P504S、PSA、PSAP、PSMA染癌细胞，并用PSA、PSAP、PSMA与其它恶性肿瘤进行鉴别，能够提高PCa、BPH诊断的准确性。

综上所述，对临床送检的前列腺碎块组织标本，病理医生一定要从取材、切片及诊断多方面做好工作，以免漏诊PCa病例。对于可疑病例，一定不能放过，应联合应用多种免疫标记进行免疫组化染色，排除有无癌变。

参考文献：

[1] 李兆鉴，吴显钊.前列腺癌47例临床分析[J].临床泌尿外科杂志，1987，12：375.

[2] Sakr WA，Haas GP，Cassin BF，et al.The frequency of carcinoma and intraepithelial neoplasia of the prostate in young male patients[J].J Urol，1993，150（21）：379-395.

[3] 赵宏，赵振东，谢锡滨. 良性前列腺增生术后前列腺癌的早期诊断[J]. 西部医学. 2007， 19（6）：1124-1125.

[4] 王刚，周利群，那彦群.良性前列腺增生术后前列腺偶发癌10年回顾性分析[J].中华泌尿外科杂志，2005，26（2）：117-119

[5] Shah RB，Zhou M，LeBlanc M，et parison of the basal cell-specific markers，34betaE12 and p63，in the diagnosis of prostate cancer[J].Am J Surg Pathol，2002，26（9）：1161-1168..

[6] 李彬，程慧敏. 前列腺癌与良性前列腺增生的免疫组化结果比较及意义[J]. 临床医药实践， 2009， 18（12）， 2256-2258.

[7] Li H，Zeng H，Liu WP，et al.Expression of prostatic specific membrane antigen and prostatic specific antigen in prostatic adenocarcinoma tissue[J].China J Exp Surg，2002，19（3）：232-234.

免疫组化染色篇8

【关键词】子宫肿瘤;腺瘤样瘤;免疫组织化学

腺瘤样瘤是生殖系统所特有的一种少见的良性肿瘤,对其组织来源曾有争论,现经免疫组织化学和电镜研究已认同为间皮来源,发生在子宫的腺瘤样瘤则来源其浆膜间皮细胞[1,2]。由于该瘤临床表现和术前检查无特征性,极易发生临床和病理上的误诊和漏诊[2,3]。笔者对15例子宫腺瘤样瘤临床病理及免疫表型进行观察分析,探讨其组织发生、病理学诊断和鉴别诊断。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院2006年1月至2009年11月间因子宫良性肿瘤或瘤样病变行子宫切除术或肿瘤剜出术患者1087 例,年龄34~57 岁,平均45.6 岁。临床表现为月经异常者8例,痛经或伴月经异常者4例,3例无自觉症状,但经体检或B超检查发现盆腔包块或子宫肌瘤。经病理诊断为子宫腺瘤样瘤15例,占本院同期子宫良性肿瘤和瘤样病变的1.38%(15/1087)。术前均因发现盆腔包块、月经不调、或(和)伴下腹胀痛而诊断子宫肌瘤或(和)子宫腺肌病行子宫切除术13例,单纯肿瘤剜出术2例。

1.2 方法 标本均采用4%甲醛固定,取材、常规脱水、石蜡包埋切片,HE 染色,镜检观察及免疫组织化学染色与特殊染色。免疫组织化学染色:采用EnVision二步法进行染色,所用抗体波形蛋白(Vim)、细胞角蛋白(Ckpan)、间皮细胞(MC)、内皮细胞标记(CD34)和S 100蛋白(S 100)均购自长岛试剂公司。

2 结果

2.1 巨检 15例中见肿块8 例或瘤样增生区3 例,直径最大4.0 cm,最小0.8 cm。大部分肿块边界清楚,而瘤样增生区边界欠清,无论肿瘤边界清楚与否均不易剥离;肿块或瘤样增生区位于肌层8例,宫角部5例,宫底浆膜下2 例。肿瘤均为单个结节,无包膜,切面实质性,灰白灰红色。

2.2 镜检 ①光镜:肿瘤由大小不等、形态不一的小管状及腔隙样结构组成(图1),内衬扁平或立方上皮,有的如淋巴管瘤样结构,腔内可见淡蓝色物质及脱落细胞。肿瘤中还散在大小不等空泡细胞,空泡大时整个细胞呈印戒细胞或脂肪细胞样。瘤细胞边界欠清,胞浆丰富嗜酸性或淡染,核中等大小圆形或卵圆形,可见核仁。无细胞异型性及核分裂相。肿瘤间质为增生的平滑肌组织及不等量的致密或疏松的纤维组织,与周围平滑肌组织不形成假包膜样明显界限;②电镜:肿瘤细胞具有明显的微绒毛、桥粒和张力丝,细胞间隙扩张;③阿辛蓝 过碘酸雪夫染色(AB PAS):肿瘤细胞胞质和腔内内容物AB阳性表达,经透明质酸酶消化后呈阴性表达;④免疫组化染色:肿瘤细胞Vim、Ckpan和MC呈阳性表达(图2~4);CD34和S 100呈阴性表达。

图1 肿瘤由形态不一、大小不等的腔隙组成

图2 免疫组化Vim染色阳性

图3 免疫组化Ckpan染色阳性

图4 免疫组化MC染色阳性

3 讨论

腺瘤样瘤是一种少见的发生于男女生殖道的特有的良性肿瘤,男性好发于附睾、精索,女性好发于子宫、输卵管、卵巢。子宫腺瘤样瘤的发生率统计不一,1982 年Tiltman报告[4]占同期子宫良性肿瘤12%,1993 年张霸泽等报告[5]为3.1%,云径平等[3]报告为5.8%,本组资料统计为1.38%。发生率不同可能是由于本病缺乏特异的临床表现,常伴有子宫多发性肌瘤和腺肌病,巨检时如不是剖开每个瘤体仔细观

DOI:10.3760/cma.j.issn 1673 8799.2010.05.155

作者单位:277102山东省枣庄市立医院病理科(张亚 ), 妇产科(孙强)

察,易被忽略或无报告。为了避免漏诊,区别三者很重要,主要是巨检取材时,子宫腺瘤样瘤切面略呈灰黄色,见裂隙状结构,无肌瘤的编织状结构和假包膜样结构,与肌层边界欠清,手触之滑腻感,肿块往往靠近浆膜下尤其宫角处浆膜下。此外,有文献提出女性生殖系统腺瘤样瘤以输卵管最常见[6],而本组子宫腺瘤样瘤发生率为1.38%,输卵管却未见发生,故作者认为子宫为女性生殖系统腺瘤样瘤最常见部位。巨检取材如果不进行仔细的剖面检查,对每个瘤体都作取材报告,就易造成漏诊。笔者认为在巨检取材时的大体观察也非常重要,子宫腺瘤样瘤切面呈灰黄色,不如肌瘤时呈灰白色; 可见裂隙样结构,质地较平滑肌瘤软,编织状结构不如平滑肌瘤明显;与周围平滑肌组织分界欠清,无包膜。尤其在多发性子宫肿瘤时,注意与平滑肌瘤鉴别并多取材可以提高检出率。

关于子宫腺瘤样瘤的起源一直有所争论,有中肾管、苗勒管、血管、淋巴管、间皮起源等各种学说[7 8]。本研究支持肿瘤系间皮来源的观点,肿瘤多位于浆膜下,部分区域见肿瘤与间皮相连;免疫组化染色示Vim和CKpan阳性表达,间皮细胞标记MC阳性表达,AB 染色经透明质酸酶消化后呈阴性表达(分泌透明质酸)。

本瘤诊断主要靠病理学检查,因其形态学多样性,对其病变特点不熟悉,易误诊为子宫的其他良恶性病变,如平滑肌瘤、脉管瘤或肌瘤变性等,甚至误诊为血管平滑肌瘤、血管平滑肌脂肪瘤、腺肌瘤等[3,9]。由于肿瘤无包膜,与周边肌层分界不清,加上管腔内黏液或瘤细胞胞质空泡,易误诊为腺癌或印戒细胞癌等[3]。肿瘤有3 种类型:①丛状型:由索状或巢状的立方形细胞组成,胞质嗜酸性,在部分胞质内见有空泡;②腺管型:可见大小不一的腔隙,被覆立方细胞,有时可见刷状缘;③脉管型:管腔被覆扁平细胞[9]。对照上述标准,本组大部分表现为脉管样形态。

总之,子宫腺瘤样瘤的临床症状缺乏特征性,肿瘤体积较小,病理组织形态多样性,并且易伴发子宫平滑肌瘤和子宫腺肌病等病变,伴同病变可干扰子宫腺瘤样瘤的正确发现。提示对子宫多发性肿块应进行全面取材,尤其应重视对酷似小肌瘤样肿块的取检,有利于提高子宫腺瘤样瘤的检出率。

参考文献

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[2] 赵学军,王忠英,刘伯宁.子宫腺瘤样瘤11 例临床病理分析.实用妇产科杂志,2004,20(2):98 99.

[3] 云径平,吴秋良,梁小曼,等.应用组化及免疫组化方法诊断子宫腺瘤样瘤.癌症,1998,17(2):102 104.

[4] Tiltman AJ.Adenomatoid tumors of uterus.Hisiopathology,1980,4:437.

[5] 张霸泽,王三锡.10 例子宫腺瘤样瘤临床病理分析.肿瘤,1993,13(4):190.

[6] Wheeler JE.Disseases of the fallopian tube.In:Kurman RJ.Blaustein’spathology of the femal gential tract.4th ed.NewYork:Spring Verlag,1994:546 547.

[7] 年,杜心谷,刘伯宁.妇产科病理学.上海医科大学出版社,1996:59 180.

[8] 黄维清,纪萍,魏红军.20 例和附睾腺瘤样瘤的临床病理、特染及免疫组化观察.河北医学,2001,7(5):388 390.