免疫室自我鉴定总结范文

免疫室自我鉴定总结篇1

关键词：医学免疫学；教学改革；临床医学专业

1医学免疫学教学现状及存在的问题

医学免疫学的教学内容繁多，包括理论和实验两大块，主要从免疫系统、免疫细胞及免疫分子方面讲授免疫学的基本原理、生理和临床意义以及在临床疾病诊断、预防和治疗中的应用。近年来，免疫学的发展日新月异，新的发现和技术层出不穷，由曹雪涛主编的《医学免疫学》已更新至第7版，但在教学过程中仍存在不少问题：①教学内容陈旧，未能紧跟免疫学研究的前沿进展；②教学方式单一，仍是以教师为主体的课堂式教学；③医学免疫学实验教学普遍存在实验内容陈旧、实验操作过于简单、教学模式单一、学生积极性差等问题［3，4］。这在很大程度上限制了学生主观能动性的发挥，也无法培养学生分析和解决问题的能力。为提高医学免疫学的教学质量和教学效果，有学者提出在医学免疫学实验课中增加自主实验设计内容，开阔学生的科研思维［5，6］。这说明科研可促进医学免疫学的实验教学。此外，也有学者提出将科研融入医学免疫学的教学，以培养学生的科研思维和创新能力［7］。然而，如何通过科研反哺教学途径提高临床医学专业的医学免疫学教学，尚无具体的教学改革措施。因此，我们结合本教研室多年来的教学实践，从医学免疫学的理论和实验教学两方面对科研如何反哺教学进行改革和探索。

2科研反哺临床医学专业医学免疫学理论教学改革

医学免疫学是临床医学专业学生必修的基础专业课。我校医学免疫学有72个学时，包括56个理论学时和16个实验学时。本教研室一直很重视临床医学专业本科生的医学免疫学理论教学；在加强师资队伍培养的同时，定期开展教学讨论，研讨如何将科研反哺医学免疫学的理论教学。

2．1将医学免疫学的重大发现以科研故事方式应用于理论教学

医学免疫学的理论主要来源于科研实践。为提高临床医学专业学生的学习兴趣和积极性，将医学免疫学的重要知识来源以科研故事的方式呈现给学生是不错的方法。例如，在讲解胸腺是T淋巴细胞发育成熟的重要器官时，可向学生阐述其发现过程：1961年Miller和Good等发现小鼠新生期切除胸腺或新生儿先天性胸腺缺陷，其外周血和淋巴器官中淋巴细胞数量明显减少，致使免疫功能缺陷。由此确定T淋巴细胞的发育和成熟依赖于胸腺，T来自胸腺Thymus的第一个字母。通过这样的讲述，学生对T细胞的发现及胸腺的作用就有了较好的认识。在讲解补体一章时，可向学生介绍1895年JulesBordet如何开拓了补体学领域以及1899年Ehrlich对补体的命名（存在于正常血清中、对热敏感的成分是抗体发挥溶菌或溶细胞作用所必需的补充条件）。听完这些研究发现后，学生对补体的理化性质及功能会有初步的认识，进而对补体成分和复杂的补体激活途径产生兴趣。因此，以科研故事的方式讲解医学免疫学理论知识是科研反哺教学的重要途径。此外，通过讲解免疫学重要知识的发现过程，能让学生熟悉书本知识的来龙去脉，了解科学研究的基本方法，有利于培养学生的科研思维。

2．2教师的科研反哺医学免疫学理论教学

本教研室教师均具有自己的科研方向，这为科研反哺教学提供了重要的前提条件。在医学免疫学理论教学过程中，教师结合自己的科研能极大地提升教学效果。例如，在讲解细胞因子的功能时，可向学生介绍在科研过程中，研究者经常在体外加入某种或某些细胞因子促进免疫细胞的分化成熟，如利用GM－CSF可促进骨髓细胞向粒细胞增殖和分化；用TGF－β可促进naveT细胞向调节性T细胞（Treg）分化。在讲解白细胞分化抗原和分化群（clusterofdifferentiation，CD）时，教师可根据自己的研究方向，结合流式细胞术说明CD分子在科研中的重要作用，加深学生对白细胞分化抗原及CD分子概念的理解。此外，教师可将最新的研究进展与教材中的知识结合起来，开阔学生的视野，激发学生的求知欲。因此，将教师的科研融入医学免疫学的理论教学能很好地提高临床医学专业的教学质量。

2．3采用PBL教学使科研反哺医学免疫学理论教学

医学免疫学理论教学的效果有赖于良好的教学方法［8］。除了课前制作精美的PPT课件外，我们主要采用PBL（problem－basedlearning）教学使科研反哺医学免疫学理论教学。一方面，鼓励学生积极思考；另一方面，激发学生的学习动力和兴趣。此外，本教研室教师会选择一些高质量的综述或重要研究文献，布置1－2个问题，让学生根据提供的题目去查阅相关文献，获得教学内容相关的知识。采用PBL教学能很好提高学生的自主学习能力和科研思维能力。

3科研反哺临床医学专业医学免疫学实验教学改革

医学免疫学实验教学是理论联系实际的纽带，是医学免疫学课程的重要组成部分，不仅可加强学生对医学免疫学理论知识的理解和记忆，同时还可培养学生的科研思维能力和实践操作能力［9］。为提高临床医学专业学生医学免疫学的实验教学，本教研室在2010年组织编写了全国高等医学院校实验教学规划教材《医学免疫学实验》，并在2016年做了修订。现阶段，我校医学免疫学的实验教学开设了凝集沉淀反应（ABO血型的鉴定）、免疫标记技术（ELISA法检测乙肝“两对半”）、天然免疫功能检测（中性粒细胞的小吞噬实验、溶菌酶的溶菌作用、溶血反应等）和细胞免疫功能的检测（PBMC的分离和E花环实验、流式细胞术、淋巴细胞的转化实验等）等医学免疫学实验。这些经典的免疫学实验不仅能加深学生对理论知识的理解，也能培养学生分析和解决问题的能力。为进一步提高实验教学的效果，我们从科研反哺教学角度进行了如下教学改革探索。

3．1采用科研思维进行医学免疫学实验教学

首先，在临床医学专业学生进行实验前，向学生介绍实验的基本原理、实验目的、方法、步骤以及注意事项。在此阶段通过多问“为什么”，鼓励学生积极思考。然后，由指导老师引导学生进行实验，同时要求学生详细记录实验过程中所遇到的问题，对自己的实验结果进行分析并给出相应的结论。最后，由指导老师进行评价和总结，要求学生撰写较为详细的实验报告。在实验报告中，需要学生以科学研究的方式呈现实验结果、结果分析、实验结论及改进措施。通过鼓励学生思考实验现象背后的原理和实验失败的原因，能够激发学生的学习热情，提高学生对理论知识的认识，并能锻炼学生的科研思维能力。

3．2指导学生进行实验设计和开展研究课题

目前，免疫学技术种类繁多。鉴于实验条件和场所的局限性，对于一些复杂的实验技术和仪器操作，我们也会通过示范性实验教学使学生有个直观的了解和认识。同时，指导老师会给出若干实验项目（如单克隆抗体的制备与鉴定、细胞凋亡的检测、树突状细胞的体外分化及鉴定等），要求学生在课后通过查阅相关文献进行合理的实验设计。然后，由指导老师对学生所提交的实验设计内容开展课堂讨论、总结和评价。实验中心针对临床医学专业学生开放实验室。在指导老师的帮助下，学生可对自主设计的实验进行操作。此外，我们鼓励临床医学专业学生参加学校每年举行的大学生研究性学习和创新性实验设计项目的活动，开展医学免疫学相关的研究课题。在教师的指导下，采用TBL（team－basedlearning）法组建研究小组，让学生分工合作，查阅相关文献，撰写项目申请书，进行实验，分析实验结果并撰写研究论文。指导学生开展免疫学相关研究课题不仅可促进医学免疫学的实验和理论教学，还可扩宽临床医学专业学生的知识面、培养学生的科研思维、提高学生的创新能力。

3．3建立科研反哺医学免疫学教学的考核评价体系

免疫室自我鉴定总结篇2

【关键词】 免疫细胞化学 形态学分析 腹水 腺肿瘤 胸腔积液

0　引言

胸腹腔积液是常见的临床征象，病因复杂. 对积液进行脱落细胞学检查，可以判定疾病的性质，但普通染色片有时对高分化腺癌和增生性间皮细胞不易鉴别. 应用免疫细胞化学对积液中脱落细胞进行标记，并结合细胞形态学定量分析，在二者鉴别诊断中有较高的应用价值［1-2］. 我们对我院近年来良恶性胸腹水各30例采用免疫细胞化学SP法标记和计算机形态学定量分析，探讨免疫细胞化学和形态学观察在胸腹腔积液细胞学诊断和鉴别诊断中的意义.

1材料和方法

1.1材料

良性组(A组)30例，其中18例结核性胸水，胸部CT检查诊断为结核，痰中结核杆菌阳性;12例肝硬化腹水，腹部B超诊断为肝硬化，肝功谷草转氨酶升高，乙肝系列表面抗原阳性.男15例，女15例，年龄18~71（平均45.4）岁.恶性组(B组)30例，其中15例血性胸水，支气管镜或胸膜活检病理证实为肺腺癌;15例腹水，胃镜或B超诊断为胃癌或卵巢癌.男21例，女9例，年龄39~79（平均59.7）岁.

1.2方法

新鲜胸腹水沉淀5 min后，留取沉淀部分约10 mL，在自动涂片离心机(日本樱花精密机械有限公司产品)离心10 min (2100 r/min)，弃上清液，将沉淀在载玻片上的细胞均匀涂在常规HE染色的玻片，每例一张，在抹有APES载玻片上涂片，每例3张，稍干后，一张常规涂片放入950 mL/L乙醇中固定15 min，HE染色. 对其所示细胞在CMIAS真彩色病理图像分析系统(北京航天大学图像中心与空军总医院图像开发组产品，CMIAS型，WINDOW98软件)下测细胞核、浆的面积，核浆比例，细胞周长，平均直径，圆度，形状因子.置于40倍镜下观察，选择细胞密集重叠较少的区域采图，分割，编辑，统计，获得脱落细胞形态学原始数据. 对重叠细胞、红细胞或淋巴细胞予以弃除. 在同一制片、同种染色及光照条件下，每例测定分析细胞50个，校正因子1.1. 抹有APES的涂片稍干后，即放入乙醚乙醇液(1∶1)中固定15 min，水洗. 固定后的涂片先用蒸馏水冲洗，再用PBS冲洗3次后，滴加A液(50 mL/L正常羊血清)适量，在室温、湿盒内各封闭10 min，37℃孵育1 h，PBS冲洗，每次5 min，再依次滴加BC液(二抗及SP液)，室温放置30 min. 免疫细胞化学染色采用SP法，一抗及其工作浓度分别为CEA(1∶350)，EMA (1∶150)，vimentin(1∶40)(均购自北京中山生物技术公司). PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性胸腹水涂片作阳性对照. 结果按照每张涂片的阳性细胞比例及着色深浅计分进行判定分析. 阳性细胞所占比例判断，无着色0分，1/3以下着色为1分，1/3~2/3为2分，2/3以上为3分. 阳性强度，无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分. 2项相乘0分为-，1~3分为+，4~6分为2+，7~9分为3+；将-视为阴性、+视为弱阳性、2+视为阳性、3+视为强阳性.

统计学处理：数据用x±s表示，计数资料组间比较采用χ2检验，计量组间比较采用t检验，所有统计学分析均用SPSS8.0软件完成.

2结果

A组涂片中以增生性间皮细胞和淋巴细胞为主，间皮细胞单个散在或成片排列，大小略不一致，细胞核呈圆或卵圆形、多居中，核膜清楚，染色质匀细，有小核仁，胞质丰富，淡伊红色. B组涂片，癌细胞呈团、腺样、乳头样或散在（图1），细胞大小不一，互相拥挤，核大，大小形状不一致，核膜厚，染色质粗且分布不均匀，核仁明显，胞质较少，内可见空泡. 可有病理性核分裂像. 免疫细胞化学染色结果A，B两组有差别（图2，3，表1）， A，B两组细胞形态学定量分析测定结果也有差别（表2）.表1良性和恶性两组免疫细胞化学SP法阳性表达（略）表2良性和恶性两组细胞形态学定量分析(略)

3讨论

癌胚抗原（CEA）是一组酸性糖蛋白. 广泛存在于各种上皮源性肿瘤，尤其是各种腺癌细胞中表达阳性，体腔间皮细胞中不含CEA，因而是鉴别腺癌和增生性间皮细胞的重要生物学标记物［3-4］. 上皮膜抗原（EMA）在腺癌中呈阳性表达，间皮细胞呈弱阳性可配合其他指标鉴别诊断. 波形蛋白（vimentin）是间叶源性肿瘤标记物，绝大多数上皮源性肿瘤为阴性表达，间皮细胞为阳性. 因而可区分腺癌与增生性间皮细胞. 我们的实验结果与文献报告一致［5］. 说明选用一组组织特异性抗体进行免疫细胞化学表达，在胸腹水中腺癌细胞和增生性间皮细胞鉴别诊断方面有重要作用. 新近研究认为［6］，CEA蛋白在胸腹水鉴别诊断的价值有差异，对良、恶性胸水鉴别有重要价值，而对良、恶性腹水鉴别价值较低. 其中原因可能有：①恶性腹水多由肝癌、卵巢癌等引起，而CEA在这些肿瘤中表达较低. ②部分恶性腹水是因静脉或淋巴回流受阻以及肿瘤而引起的低蛋白血症，而无肿瘤细胞浸润腹腔. 本文B组15例恶性胸水和15例恶性腹水中癌细胞对CEA表达均为阳性，其阳性率高于文献报道［5-6］，可能因观察例数较少. vimentin在间皮细胞中表达率较低，可能与离心等对细胞质影响有关. EMA在腺癌中呈阳性表达，而间皮细胞则为弱阳性，因此，免疫细胞化学用于良、恶性胸腹水的鉴别诊断，提高了阳性诊断率.

传统细胞学诊断主要依据细胞的大小、形态、结构、细胞的产物（如粘液）等. 恶性细胞有细胞核的改变（如核增大、深染、核浆比失调，染色质分布不均匀等），细胞互相拥挤等. 有一定的主观性. 信息技术的发展为细胞学诊断的数字化客观评价提供了可能. 本研究以胸腹水中脱落细胞为对象，定量测定其中细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径和形状因子，发现恶性胸腹水中腺癌细胞明显高于良性胸腹水中的增生性间皮细胞，具有统计学意义(P0.05)，可能与图像预处理(如分割等)，灰度等原因有关.由于高分化腺癌与增生性间皮细胞的形态学参数阈值缺乏统一标准，尚待进一步研究，因此，图像分析对良恶性胸腹水的鉴别仅提供参考，仍需结合光镜下细胞的形态特点和免疫细胞化学结果. 总之，免疫细胞化学在良恶性胸腹水鉴别诊断中有重要价值，形态学定量分析可提供参考，二者综合分析对鉴别腺癌和增生性间皮细胞具有重要作用，是提高胸腹水阳性诊断率的有效途径之一.

【参考文献】

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免疫室自我鉴定总结篇3

【摘要】 目的: 制备并鉴定口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法: 以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠， 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合， 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选， 有限稀释法克隆， 直至所克隆的细胞能够100％的分泌抗体， 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果: 免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选， 共获得5株抗pET28a3D的mAb， 其亚类鉴定3株为IgG1 ， 2株为IgG2b， 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK21细胞中的3D抗原均特异性结合， 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论: 成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb ， 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。

【关键词】 口蹄疫病毒; 非结构蛋白3D; 单克隆抗体; 原核表达

口蹄疫(footandmouth disease， FMD) 是由口蹄疫病毒(footandmouth disease virus， FMDV)引起的偶蹄动物的急性、 热性、 高度接触性传染病， 世界动物卫生组织将其列为A类传染病之首， 该病一经暴发就会给畜牧业生产造成巨大的经济损失， 严重影响了政治、 经济的稳定发展， 世界各国都高度重视对该病的防控， 完善的诊断和检测技术体系是控制和消灭该病的关键。检测非结构蛋白抗体的ELISA方法不受血清型限制， 因此在疫情普查、 筛查感染动物、 防制效果评价和恢复无FMD状态等方面具有重要的应用。

FMDV的3D蛋白是具有469个氨基酸的病毒RNA依赖的RNA聚合酶， 又称病毒感染相关性抗原， 没有型特异性， 在FMDV所有非结构蛋白中， 3D抗原性最好， 检测3D的ELISA方法具有与检测结构蛋白的ELISA方法相当的特异性、 准确性和敏感性， 是评价动物是否接触过抗原的重要指标， 在检测中具有重要的应用前景［1-4］。

本实验利用原核表达的3D蛋白制备单克隆抗体（mAb）， 为建立更为完善的ELISA诊断方法和检测技术以及进一步研究3D蛋白的结构和功能提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料 O/China99口蹄疫病毒、 BHK21细胞株、 牛抗FMDV高免血清均为本实验室保存， Sp2/0骨髓瘤细胞为兰州市市肿瘤医院惠赠， 3D蛋白原核表达重组菌由刘湘涛研究员惠赠， SPF级雌性3～4周龄BALB/c小鼠购自兰州生物所， 福氏佐剂、 聚乙二醇(PEG)1450溶液、 HAT、 HT 以及四甲基联苯胺(TMB)、 HRP 标记羊抗小鼠总IgG、 mAb亚型鉴定试剂盒均为Sigma 产品; RPMI1640 培养基、 新生牛血为Hyclone公司产品， FITC标记羊抗小鼠IgG购于KPL公司， HI Trap rProtein G FF， 1 m蛋白纯化柱为Amersham公司产品， NiNTA Purification System购于Invitrogen公司， 其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 重组pET28a3D蛋白的表达、 纯化及活性鉴定 按文献［5］所述方法表达3D蛋白， 将可溶性表达的3D蛋白按NiNTA Purification System操作说明书进行纯化， 用SDSPAGE电泳鉴定纯化产物的纯度， 用Western blot鉴定其特异性。Western blot方法参照文献［6］进行: 以牛抗FMDV高免血清为一抗， Sigma公司辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗， DAB染色。

1.2.2 3D mAb的制备 （1）小鼠免疫: 取纯化的抗原按100 μg/只加等体积弗氏完全佐剂背部皮下注射， 2周后用弗氏不完全佐剂第2次免疫， 剂量、 注射部位同前， 2周后以不加佐剂的等量抗原于后肢内侧皮下注射， 1周后采尾静脉血测抗体效价， 取抗体水平较高的小鼠于1周后尾静脉加强免疫1次， 在此之后第3天融合。（2）阳性杂交瘤细胞株的建立: 采用常规的PEG融合的方法取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板， 取融合后第10～15天的细胞培养上清进行间接ELISA检测， 选择检测结果为强阳性的克隆扩大培养， 同时用有限稀释法至少连续克隆3～5次， 直至所克隆的细胞能够100%分泌抗体。将能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞扩增培养后， 冻存于液氮中。

1.2.3 腹水的制备 将0.5 mL降植烷注射到10周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠的腹腔， 1周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔， 7～10 d后， 当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水， 4℃， 12 000 g离心10 min后， 0.45 μm滤器过滤后用G蛋白柱纯化， 加500 mL/L甘油分装备用。

1.2.4 mAb效价滴定 间接ELISA方法鉴定， 用纯化的pET28a3D抗原包被ELISA板， 腹水从100倍开始做梯度稀释， 同时以Sp2/0腹水做同等稀释度对照。

1.2.5 mAb的生物学特性鉴定 (1)亚型鉴定: 用IgG亚类鉴定试剂盒Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（Sigma公司)鉴定， 按说明书中的捕获ELISA方法操作。(2)稳定性测定: 将阳性杂交瘤细胞体外连续传代培养3个月， 每隔10 d检测1次细胞上清液的ELISA抗体效价。同时分别复苏冻存1个月， 2个月， 3个月的阳性杂交瘤细胞， 用间接ELISA法测定细胞培养上清的抗体效价。(3)mAb的位点分析: 用ELISA叠加实验进行位点分析。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板， 加入100 μL mAb1， 37℃， 1 h， 洗涤3次， 加入100 μL mAb2， 37℃， 1 h， 洗涤3次， 加入羊抗鼠IgGHRP， 37℃， 1 h， 洗涤5次， 加入底物显色， 终止反应后测定A值。按照如下公式计算叠加率AI: AI=［A(1+2)-A1］/A2×100%。式中A1为mAb1的A值， A2为mAb2的A值， A(1+2)为mAb1叠加mAb2的A值。若AI>10％， 说明被测的2株mAb的抗原结合位点不同， AI≤10％则结合位点相同或相近。(4)特异性鉴定: ①Western blot: 将原核表达的pET28a3D蛋白和灭活的O/China99株感染的BHK21细胞裂解液分别进行SDSPAGE电泳， 然后按常规方法转印到硝酸纤维素膜光滑面上， 将膜置于封闭液中， 4℃， 过夜， PBST洗涤5次后分别置于5株杂交瘤细胞上清中， 设置阳性对照(免疫鼠血清)、 阴性对照(正常鼠血清)， 37℃作用1 h， PBST洗涤5次， 置于工作浓度的HRP标记羊抗鼠IgG溶液， 37℃作用1 h， PBST洗涤5次， 最后用TMB避光显色， 水洗终止反应。②间接免疫荧光: 接种FMDV O/China99于长满单层的BHK21细胞， 50 mL/L CO2、 37℃培养10 h， 弃去上清， 用洗涤液（PBS10 g/L BSA）洗涤1次， 37 g/L多聚甲醛室温固定10 min， 洗涤3次; 加入50 mmol/L NH4Cl， 室温作用10 min， 充分洗涤， 吸干残液; 加入杂交瘤细胞培养上清， 37℃作用1 h， 洗涤3次， 吸干残液; 加入工作浓度的羊抗鼠IgGFITC， 37℃作用1 h， 洗涤3次， 加200～300 μL 20 mL/L甘油PBS， 荧光显微镜下观察， 同时设立BHK21细胞作为阴性对照。

2 结果

2.1 重组pET28a3D蛋白的纯化及活性鉴定 纯化蛋白经SDSPAGE分析， 在相对分子质量（Mr）约44 000处有一条明显的蛋白带(图1A)， 与预期相符， 并且无明显的杂带， 这说明提纯的抗原较纯。Western blot结果显示， 纯化的原核表达抗原能够很好的识别FMDV感染的动物血清， 具有良好的反应性（图1B）。图1 3D蛋白的纯化及活性鉴定

A: 3D融合蛋白的SDSPAGE纯度鉴定; B: 3D蛋白的活性鉴定. M: 蛋白markers; 1: 纯化的pET28a3D蛋白; 2: pET28a3D蛋白的Western blot分析.

2.2 pET28a3D蛋白mAb杂交瘤细胞株的建立 以表达的重组蛋白免疫小鼠， 经细胞融合及5次克隆化， 阳性率达到了100%， 共得到5株稳定分泌抗3D蛋白的杂交瘤细胞株， 分别命名为: 1A6、 1B2、 1E5、 7H4和7C2。

2.3 抗体效价滴定结果以及亚类鉴定 结果如表1所示， 5株mAb的腹水抗体效价均高于105， 达到mAb腹水制备的要求。表1 mAb效价测定及亚类鉴定结果

2.4 mAb的生物学特性鉴定

2.4.1 稳定性鉴定 连续传代培养和按期复苏的杂交瘤细胞， 其上清的抗体效价一直稳定， 表明杂交瘤细胞能稳定分泌mAb。

2.5.2 位点叠加分析 表2结果显示， 其中1B2、 1E5、 7C2之间的叠加值均小于10％， 为识别同一个表位的抗体， 1A6和7H4与以上3株抗体的叠加值均大于或接近于10%， 识别不同或相近的表位， 且mAb1叠加mAb2与mAb2叠加mAb1的AI值相差较大， 但表位判定结果一致。表2 5株mAb位点叠加分析结果

2.5.3 特异性鉴定 （1）Western blot: 图2所示， 在Mr约44 000处有一条明显的蛋白带， 这表明所筛选出的5株mAb能与原核表达的3D蛋白发生特异性反应; 图3中在Mr约52 000和72 000处各存在明显的蛋白带， 分别与自然的FMDV 3D和3CD蛋白大小相符（2）间接免疫荧光: 在FMDV感染的BHK21细胞细胞质中均检测到很强的荧光（图4）， 而未感染FMDV的细胞检测结果为阴性， 这与GarcíaBriones等［7］所得结论一致。

3 讨论

高度纯的抗原是获得特异性mAb和提高筛选阳性率的关键。原核表达系统虽然没有蛋白翻译后的糖基化、 磷酸化等加工修饰过程， 不能完全反应蛋白的天然构象， 但是由于原核表达系统操作简便、 重组蛋白产量高、 可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化等诸多优点， 而且目前许多实验室已经利用原核表达的抗原成功的制备了能够识别自然蛋白的mAb［8， 9］， 因此， 本试验采用原核表达的重组3D蛋白免疫小鼠。

本实验在制备mAb的基础上利用叠加ELISA进行了抗原表位的初步研究， 若两种mAb的结合位点较远， 则将无干扰现象， 若结合位点较近或存在部分重叠， 则有干扰现象。运用叠加ELISA分析， 初步判定这5株mAb中有2株为同一表位， 其他为不同表位， 且mAb1叠加mAb2与mAb2叠加mAb1的A值基本相近， 虽然所测AI值差别比较大， 但表位判定结果基本一致。

本实验的目的是制备能识别自然3D蛋白的mAb， Western blot和间接免疫荧光结果显示所制备的5株mAb不但能与原核表达的3D蛋白特异性的结合， 而且能与自然3D蛋白发生特异性的结合， 这为我们建立基于mAb的间接捕获ELISA或竞争ELISA诊断方法、 研发新型的多重NSP抗体荧光检测技术以及进一步研究FMDV 3D的功能、 揭示FMDV的致病机制提供重要工具。

参考文献

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免疫室自我鉴定总结篇4

【摘要】

目的: 制备Clusterin（CLU）多克隆和单克隆抗体(mAb)， 并进行特性鉴定。方法: 以成人肝cDNA 表达文库为模板， 构建重组表达质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU。GSTCLU 融合蛋白在大肠杆菌中表达， 被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb。采用ELISA法和 Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性。采用Western blot， 间接免疫荧光， 免疫组化鉴定mAb的特异性。结果: GSTCLU 融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54000处呈现明显表达条带。Western blot鉴定表明， 制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52000和58000的CLU蛋白。获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU 蛋白， 其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白， 4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白。结论: 成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb， 为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础。

【关键词】 Clusterin 原核表达 多克隆抗体 单克隆抗体

[Abstract] AIM: To prepare rabbit polyclonal antibodies (pAb) and mouse monoclonal antibodies (mAbs) against human clusterin(CLU) and characterize these antibodies’ properties. METHODS: CLU fragment was amplified from human liver cDNA library， and recombinant expression vectors pGEX4T1CLU and PET32aCLU were constructed. GSTCLU fusion protein was expressed in E.coli and then used as the immunogen. Properties of antiserum against human CLU were identified by ELISA， Western blot， and the mAbs against human CLU was characterized by Western blot， indirect immunofluorescent staining and immunohistochemistry staining. RESULTS: The GSTCLU fusion protein was highly expressed with a molecular weight of 54000. Western blot analysis proved that the rabbit pAb could specifically recognize 52000 and 58000 proteins in human liver total protein. All of the nine established mAbs recognized recombinant human CLU protein， two of which specifically bound to proteins in the cytoplasm of HepG2 cells and four of which specifically bound to proteins in the cytoplasm of adult liver tissue. CONCLUSION: pAb and mAbs against human CLU were successfully prepared， which will provide efficient tools for functional studies of CLU expressed in human tumors.

[Keywords]clusterin; prokaryotic expression; polyclonal antibody; monoclonal antibody

Clusterin（CLU）是一种普遍存在的异源二聚体硫酸化糖蛋白， 其基因定位于人类染色体8p21， 含449个氨基酸， 相对分子质量（Mr）为75000～80000。它主要存在于细胞质中并被分泌到细胞内环境， 由于CLU mRNA不同的剪切翻译， 形成sClusterin（sCLU）和nClusterin（nCLU) 2种变体， 分别发挥抗凋亡和促进凋亡的作用[1， 2]， 因其功能多样化， 又名为 TRPM2， SGP2， XIP8， ApoJ (apolipoprotein J)， SP 4040。在生理条件下， 主要参与脂质转运、 组织重建、 细胞与基质间相互作用及细胞凋亡等生物学过程[3]。在病理条件下， 近年来众多的研究结果表明， CLU 在肾细胞癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生、 发展过程中起重要的癌基因作用[1， 4]。并且它的表达还受与肿瘤生长相关的多种细胞因子的调控， 如1，25二羟维生素 D3、 转化生长因子β1、 电离辐射等。但是目前， CLU基因在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。我们主要从构建重组表达载体入手， 获得其融合表达蛋白后， 免疫家兔和BALB/c小鼠， 制备抗CLU抗血清和CLU的mAb， 并进行特性鉴定， 为进一步研究CLU的功能及其在肿瘤的发生、 发展及治疗中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 成人肝cDNA表达文库购自Cloneteck公司。大肠杆菌BL21感受态菌株， pGEX4T1和PET32a购自Amersham公司。限制性内切酶BamH I和Xhol I， ExTaq酶、 T4连接酶等购自TaKaRa公司。PCR回收试剂盒， 质粒提取试剂盒购自Omega Biotek公司。BALB/c小鼠和2.0～2.5 kg雄性大耳白兔子购自军事医学科学院动物中心。小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0来自军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室。Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCult biotechnology b.v. 公司。鼠抗GST标签mAb， HRP羊抗鼠IgG， HRP羊抗兔IgG， FITC羊抗鼠 IgG， ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Poly Helper购自北京吉比埃生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CLU 抗原的制备和纯化 根据Human Protein Reference Database中提供的CLU的氨基酸序列， 并结合应用生物信息学软件DNAstar lasergene 7.1(DNA*公司)的表位分析， 综合设计引物。在其上游引物设计BamH I 酶切位点， 下游引物设计Xhol I 酶切位点， 片段全长750个碱基（201～449氨基酸）， 以成人肝cDNA表达文库为模板进行PCR反应。回收扩增的目的片段并分别与经BamH I和Xhol I双酶切后的pGEX4T1和PET32a载体， 进行连接， 转化大肠杆菌， 阳性克隆经测序正确后抽提质粒， 进行诱导表达。CLU在BL21细菌中表达形式为包涵体， 表达后进行了复性和纯化。

1.2.2 GSTCLU融合蛋白的Western blot分析 将重组菌菌体蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后将蛋白质转移至PVDF 膜上。封闭液封闭后， 加入鼠抗GST mAb与膜上的蛋白进行抗原抗体反应后， 用HRP羊抗鼠 IgG进行检测， ECL显色， 至目的条带染色清晰时终止反应。

1.2.3 兔抗人CLU抗血清的制备 将纯化的CLU融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后， 每只家兔皮下多点注射融合蛋白 600 μg; 初次免疫4周后加强免疫1次， 接下来1周后耳缘静脉采血检测抗体效价。2周后颈动脉采血， 分离血清， 分装后置-20℃保存。

1.2.4 兔抗CLU血清的特性鉴定 (1)ELISA检测抗血清效价: ELISA检测板用HisCLU融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。按1∶4梯度稀释抗血清每孔加入 100 μL(阴性对照为正常兔血清代替兔抗CLU血清， 空白对照为TBST代替兔抗CLU血清)， 37℃孵育30 min洗涤3次后， 加入1∶6000稀释的HRP羊抗兔 IgG， 37℃孵育30 min洗涤3次后进行TMB显色。(2)Western blot检测CLU融合蛋白: 将纯化后蛋白经120 g/L SDSPAGE凝胶电泳后， 并转膜， 依次加入兔抗人CLU血清及HRP羊抗兔 IgG， ECL显色后观察结果。(3)Western blot检测抗CLU抗血清: 将肝匀浆总蛋白以12 g/L的浓度上样， 经120 g/L SDSPAGE凝胶电泳后， 并转膜， 依次加入按1∶10000稀释的兔抗人CLU多克隆抗体及HRP羊抗兔 IgG， ECL显色后观察结果。设阴性对照为正常兔血清代替抗CLU抗血清， 空白对照为TBST代替抗CLU抗血清[5]。

1.2.5 鼠mAb的制备 3只6～8周龄， 质量为17～21 g的BALB/c小鼠。将人GSTCLU融合蛋白80 μg溶于250 μL生理盐水并与等体积弗氏完全佐剂进行充分乳化， 对BALB/c小鼠进行皮下和腹腔注射。首次免疫4周后进行第2次免疫， 免疫剂量减半， 并与等量弗氏不完全佐剂充分乳化。第2次免疫后7 d， 经尾静脉采血， 用ELISA法测定血清抗体的效价。加强免疫3 d 后， 取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。用间接ELISA法筛选， 有限稀释法克隆化， 并按常规方法制备mAb 腹水[6]。

1.2.6 抗CLU mAb的特性鉴定 （1）mAb的腹水效价及Ig亚类的测定: 腹水中mAb的效价采用间接ELISA法测定。采用Hbt小鼠mAb分型试剂盒测定杂交瘤细胞培养上清中抗CLU mAb的Ig亚类。（2）mAb的特异性鉴定: Western blot检测， 将纯化后GSTCLU和HisCLU融合蛋白加入还原性SDSPAGE上样缓冲液中， 于100℃变性10 min。取4 μL进行120 g/L SDSPAGE， 并转膜， 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清及HRP羊抗鼠IgG， ECL显色后观察结果。设阴性对照为正常鼠血清代替杂交瘤细胞的培养上清， 阳性对照为融合鼠血清代替杂交瘤细胞的培养上清。间接免疫荧光检测， 将 HepG2细胞以1×108/L的浓度铺6孔板， 培养48 h后， 40 g/L多聚甲醛（10 g/L TRIton）固定10 min（PBS洗涤3次）; 羊血清封闭（37℃， 30 min）; 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清（4℃过夜， PBS洗涤3次）; 滴加1∶200稀释的 FITC羊抗鼠 IgG（室温孵育30 min， PBS 洗3次）; 加染核试剂 Hochest（室温孵育30 min， PBS 洗3次; 800 g/L甘油封片， 镜检拍照。免疫组化染色， 将成人肝脏组织石蜡切片， 常规脱蜡至水， 30 mL/L的H2O2封闭（室温30 min）， 10 mmol /L的柠檬酸盐缓冲液中微波加热修复（92℃～98℃， 15 min）， 羊血清封闭（37℃， 30 min）， 依次加杂交瘤细胞培养上清（4℃孵育过夜， TBST洗涤3次）及Poly Helper（37℃孵育30 min， TBST洗涤3次）， HRP羊抗鼠 IgG（同上孵育及洗涤后）， 加DAB显色， 经苏木素复染、 脱水、 透明及封片后， 观察结果。

2 结果

2.1 GSTCLU 融合蛋白的表达与鉴定 SDSPAGE电泳检测， 观察到含重组质粒pGEX4T1CLU和PET32aCLU的菌经IPTG诱导后， 与大肠杆菌BL21 空菌对照相比在Mr约54000和47000处均出现1条新的蛋白带， 其大小与预测的CLU融合蛋白的Mr相一致， 表达量约占菌体总蛋白的50%～60%， 融合蛋白主要以包涵体的形式表达（图1A）。通过Western blot检测， 应用抗GST的抗体能够在相应位置检测到GST和GSTCLU融合蛋白（图1B）。

图1 CLU融合蛋白的SDSPAGE和Western blot分析（略）

Fig 1 SDSPAGE and Western blot analysis of CLU fusion protein

A: 1: Protein marker; 2: GSTCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 3: HisCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 4: Lysates of E.coli BL21. B: 1: Blank PGEX4T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 2: GSTCLU fusion protein expressed in E.coli BL21.

2.2 兔抗CLU抗血清的特性鉴定 ELISA 检测板用HisCLU融合蛋白以1 mg/L的浓度包被。间接法检测抗体的效价为1∶512000。用兔抗CLU抗血清对融合蛋白进行Western blot实验， 证实在Mr约54000和47000处各有一特异性的条带， 说明表达的CLU蛋白具有较好的免疫学活性。Western blot分析显示兔抗CLU 多抗可以在肝匀浆总蛋白中检测到Mr为52000和58000的蛋白条带， 这与Human Protein Reference Database中报道的CLU 2个变体的Mr一致。阳性对照（pGEX4T1载体在大肠杆菌中表达后的菌体蛋白代替HisCLU 融合蛋白）在相应位置出现Mr为26000阳性条带， 阴性对照（兔免疫前血清代替兔抗CLU抗血清）在相应位置无条带（图2）。

图2 兔抗CLU抗血清特异性的Western blot鉴定（略）

Fig 2 Characterization of specificity of rabbit antiserum against CLU by Western blot

1: GSTCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 2: HisCLU fusion protein expressed in E.coli BL21; 3: Blank PGEX4T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 4: Lysates of E.coli BL21; 5: Protein marker; 6: Adult liver proteins.

2.3 杂交瘤的细胞株的建立及Ig亚类的测定 经细胞融合， 筛选及克隆化， 获得9株能稳定分泌抗CLU mAb的杂交瘤细胞株（FAF052、 FAA054、 FBE063、 FDC067、 FAF056、 FCG105、 DF103、 DC0957和DG025）。Ig亚类的测定结果显示， mAb 均为IgG1亚类。

2.4 mAb的特异性鉴定 (1)Western blot显示: 杂交瘤FAA054、 FAF052、 FBE063、 FCG105、 DF103、 DG025、 DC0957的培养上清能同时检测到GSTCLU和HisCLU， 表明这7株mAb可特异地识别CLU蛋白。(2)间接免疫荧光检测， 将HepG2细胞以1×108/L的浓度铺6孔板， 培养48 h后， 依次滴加杂交瘤细胞的培养上清， 4℃过夜后， 加FITC羊抗鼠IgG， 在荧光显微镜下观察， 只有杂交瘤FCG105和DC0957的培养上清在HepG2细胞质中呈现明显的绿色荧光(图3)。(3)免疫组化染色， 用分泌抗CLU杂交瘤细胞的培养上清检测成人肝脏组织， 杂交瘤FCG105、 DC0957、 FAF052、 FDC103在肝细胞质中有CLU的表达(图4)。提示了此7种抗CLU的mAb中， FCG105、 DC0957具有更好的稳定性， 敏感性和特异性。mAb特异性鉴定结果（表1）。

图3 CLU 在 HepG2细胞中表达的间接免疫荧光染色检测（略）

Fig 3 Detection of CLU expression in HepG2 cells by indirect immunofluorescence staining (×400)

A: Negative control: normal mouse serum (1∶1000); B: Culture of supernant of hybridoma cell FCG105.

图4 成人肝组织中CLU表达的免疫组化染色检测（略）

Fig 4 Detection of CLU expression in adult liver tissue by indirect immunohistochemistry staining (×400)

A: Negative control: normal mouse serum (1∶1000); B: Culture of supernant of hybridoma cell FCG105.

表1 抗 CLU mAb特异性鉴定（略）

Tab 1 Characterization of antiCLU mAb specificity

3 讨论

CLU 基因定位于人类染色体8p21， 含有1651个碱基， 编码449个氨基酸的糖蛋白， 是一种多功能蛋白。生理条件下， CLU蛋白主要参与脂质转运、 组织重建、 细胞与基质间相互作用及细胞凋亡等生物学过程。病理条件下， CLU 蛋白在乳腺癌组织中表达上调， 可以通过抑制细胞凋亡而促进肿瘤发展， 已被证实与该肿瘤侵袭性的生物学行为有关[5]。Miyake等[7]研究发现， CLU基因mRNA水平的上调与膀胧癌术后复发及预后密切相关; 在肾癌 ACHN 细胞株中， CLU 基因导入可以明显增强肿瘤细胞的转移能力[1， 8]。近年来研究结果显示， CLU 基因可通过抗细胞坏死或抗凋亡机制， 发挥细胞保护作用， 从而促进肿瘤生长。Yamanaka等[9]应用反义寡核苷酸阻断前列腺LNCaP细胞株中CLU基因表达， 发现诱导了LNCaP细胞的凋亡和增加其化学敏感性。Trougakos等[10]应用RNA干扰技术(siRNA)转染肿瘤细胞， 证实CLU基因在mRNA转录后的沉默， 可以显著诱导细胞凋亡; 然而针对特异性CLU变体的siRNA， 将产生不同的作用效果， 针对特异性sCLU的siRNA的敲除， 将增加细胞毒素制剂的功效; 而针对nCLU的siRNA的敲除， 将发挥其针对各种化学治疗的细胞保护作用。最近研究显示， 通过下调体外培养的恶性肿瘤细胞中CLU基因表达， 可以增强抗癌药物顺铂(cisplatin)诱导细胞凋亡的能力， 从而提高顺铂的化疗敏感性[11]， 提示CLU基因有望成为临床治疗恶性肿瘤的新基因靶点。但是目前， CLU 基因在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。

本研究中， 我们利用原核表达技术， 表达了 GSTCLU和HisCLU融合蛋白， 并以GSTCLU为免疫原， 以HisCLU为检测原（排除单抗筛选时GST标签蛋白的干扰）， 免疫家兔和BALB/c小鼠成功制备了兔抗CLU抗血清和9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株， 其亚类均为IgG1。对其进行了特异性分析， 实验结果显示免疫兔血清中产生了抗CLU和GST的抗体， 这些抗体可特异识别重组表达的CLU蛋白， 并可特异识别天然状态下的CLU蛋白; 9株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株中， mAb FAF052、 FBE063、 FAA054、 FCG105、 DF103、 DG025、 DC0957在Western blot检测中能特异性识别CLU蛋白， mAb FCG105、 DC0957可用于间接免疫荧光染色检测细胞中表达的CLU蛋白， 其主要定位于细胞质中， mAb FCG105、 DC0957、 FAF052、 FDC103可用于免疫组化染色检测CLU在成人肝脏组织肝细胞质中的表达。由于抗CLU抗血清和mAb对CLU具有很好的识别特性， 因此为进一步研究CLU在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制提供了必要的工具。

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免疫室自我鉴定总结篇5

本文所称的母猪繁殖障碍，是指由于致病因素（而非品种差异等生理因素）所致的母猪产仔数量减少和仔猪质量下降的各种症状总称。这些致病因素包括病原微生物、寄生虫、饲料毒素、营养缺乏、配种技术不当、饲养不规范和环境条件等因素。病原微生物和寄生虫引起的繁殖障碍，是由于病原可经过胎盘传播。这些因素之间可互相协同呈现累加作用，使病程更加严重。因此，要采取综合防控措施，降低母猪繁殖障碍，提高母猪的产仔数，实现提高每头母猪提供育肥猪数量，提高养猪效益；减少母猪头数，降低饲料和能源消耗，部分减少粪污排放造成环境治污压力，促进养猪可持续发展。追求母猪“单产”成绩，是国际上养猪发展趋势，也是我们的努力方向。

一般地，在确保正常营养需求和基本饲养条件下，不同品种和生产胎次母猪的产仔数量和仔猪的初生重、断奶重也有差异（资料：中国畜禽遗传资源志～猪志，国家畜禽遗传资源委员会组编，中国农业出版社，2011 年5 月，第一版）。因此，在判定母猪的繁殖成绩是否正常时，必须考虑到品种的差异。或者，与不同时期的生产成绩相比，或者与同期不同生产线（但母猪胎次和饲养条件相同）的生产成绩相比，具有明显差异，才能怀疑是否发生繁殖障碍。也就是说，有比较数据，才有初步结论。

一、疾病因素

（一）猪瘟

猪瘟（慢性型）：病原为猪瘟病毒弱毒株或母猪免疫失败，感染了猪瘟病毒强毒。母猪妊娠阶段感染猪瘟病毒，病毒通过胎盘感染胎儿，随后发生流产、产死胎和木乃伊胎；或者新生仔猪出现先天性震颤，无法正常吸吮乳汁，逐渐衰弱死亡，猪瘟病变特征不显著。此外，同窝仔猪对随后的猪瘟疫苗免疫应答低下，猪瘟免疫抗体水平合格率低，或者参差不齐，原因是仔猪在胎儿期的生长发育过程中不断接触猪瘟疫苗，产生了免疫耐受。使用感染公猪的带毒精液，也是本病的传染源之一。

确诊主要依赖实验室检测，结合临床表现来判断。采集母猪扁桃体，制备组织涂片或冰冻切片，通过免疫荧光试验检测猪瘟病毒抗原；或者从扁桃体中提取核酸，通过RT-PCR，检测猪瘟病毒E2 基因片段， 猪瘟野毒株使用引物对【F1---CCTGACGCCACGATT，R 1 … G G G G A C T C C （ G ）TTGCATATTTTT（T）， 扩增片段大小为315bp】， 猪瘟疫苗毒株C- 株使用引物对是【F2---TGATGAATAGAACCCAAGCAG，R2---TATCAAGCAGATGAGGAATGCAA，扩增片段大小为923bp】，可以区分野毒与疫苗毒。应用扁桃体检测，应该注意样品采集时间与猪瘟疫苗免疫的间隔时间。

用免疫荧光试验和RT-PCR（ 如不采用上述引物）检测，应分别在免疫后14 d 和38 d 采集，否则很难判断阳性信号是由疫苗毒还是感染野毒引起。检测流产胎时，使用上述两种方法，出现阳性信号，在排除实验室污染后，就可以认为是野毒感染，而非疫苗毒株，因为，我国的猪瘟疫苗毒株不能通过胎盘感染。

预防本病主要是选择抗原含量足够的优质猪瘟疫苗，采用合理的免疫程序，才能达到预防目的，同时注意与蓝耳病弱毒疫苗的免疫时间相差1 周以上，以免降低猪瘟疫苗效果。母猪可以采用普免2 次/年或跟胎免疫，普免对母猪免疫效果影响不大，但不同分娩时间所产仔猪如果采用同一免疫程序，则效果有影响。仔猪免疫程序要结合母源抗体水平而定。对于检出野毒的母猪，建议直接淘汰，不再使用。注意加强公猪精液中猪瘟病毒的检测，杜绝使用含病毒的精液。对于我国重点种猪场，建议实施猪瘟根除计划，确保本场种猪和出售种猪的健康状况。

（二）伪狂犬病

病原为疱疹病毒科伪狂犬病毒。病毒可感染多种动物，猪场中的鼠类是主要的病毒携带者，家猪与带毒野猪的接触，增加感染机会。本病引起母猪繁殖障碍，其临床症状有四种：（1） 各种妊娠阶段母猪发生流产，产死胎和弱仔；母猪无其他明显临床表现；（2） 母猪返情，屡配不孕，可见子宫内膜炎；（3） 新生仔猪发病死亡，日龄越小，死亡率越高，仔猪主要表现为呼吸困难，转圈运动、共济失调，临死前尖叫，口吐白沫。剖检可见肺炎、脑膜脑炎；病程较长者，可见扁桃体、肝脏和脾脏出现坏死灶。此外，伪狂犬病毒也可以引起保育阶段、生长阶段和育肥阶段猪的呼吸道症状和神经症状、公猪感染后精液质量下降等临床表现，但不是本文所讨论范围。

诊断本病主要通过检测野毒抗体（gE 抗体）和从病料中扩增gD基因和gE 基因来判定。免疫猪群感染野毒后，仍可产生gE 抗体，此时猪群的生产指标未见明显下降。但在我们所见的另外案例，gE 抗体阳性猪群可出现显著的上述临床症状。因此，gE 抗体阳性可来自感染猪群和发病猪群两种类型。由于病猪可排出大量病毒，免疫猪仍可发生感染，但不出现临床症状。如在70 日龄前仔猪检出gE 抗体，则需要谨慎下结论，该仔猪不一定感染野毒，而是仔猪从感染母猪的乳汁中获得了gE抗体。需要提醒的是，在PCR 检测时，由于gD 基因是疫苗毒株和野毒共有的保守基因，虽然扩增产物为阳性，无法区分疫苗毒和野毒，只有当能扩增出gE 基因，才能判定野毒感染。

当前，根据我国该病发生的现状，预防本病主要通过免疫接种，其优点是提高猪群感染所需的病毒载量，并降低感染猪的病毒排出量。正常的免疫程序是：种猪接种3 ～ 4次/ 年，仔猪出生后1 ～ 2 天内滴鼻免疫，在50 ～ 60 日龄肌注免疫。

选育种猪在配种前免疫一次，以后按照每年3 ～ 4 次免疫。发病时，全群（含种猪）紧急接种，出生仔猪滴鼻和肌注同时免疫。滴鼻接种的优点是建立局部黏膜免疫、克服母源抗体干扰和减少排毒量，在疾病爆发时，尤其推荐滴鼻免疫。平时，建议猪场检测群体免疫合格率，在gE 抗体阴性的前提下，群体gB 抗体阳性率应达到95% 以上。其他预防措施还有定期灭鼠，运猪车辆充分消毒后确保干燥，保证消毒效果。

目前，我国新发猪伪狂犬病是由抗原和毒力方面都发生变异的野毒株引起，但尚无证据表明这是不同疫苗毒株重组引起。两种不同基因缺失毒株之间的重组条件是两种病毒均使用高剂量（107.0TCID50） 同时接种一种细胞，才有可能产生缺失片段互补的重组毒株。在我国临床实际中，猪场一般不会在同一头猪同时注射两种疫苗。我国目前使用的疫苗都是gE 基因缺失疫苗或TK/gE 缺失疫苗。临床上，不可能发生gE 基因回复突变的伪狂犬病毒株，因为没有重组的分子基础和接种条件。

（三）猪繁殖与呼吸综合征

病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒，核酸类型是RNA，具有高度变异和重组的特性。国内外有两种类型毒株，即美洲株和欧洲株。我国主要流行美洲株，也发现野毒与疫苗毒株重组的毒株，值得注意。自2006 年我国发生高致病性蓝耳病以来，以NSP2 基因中缺失90bp 为特征的变异毒株占优势。近年来证实，NSP2 缺失区域与病毒的高毒力无关，而是与病毒ORF5 基因中的糖基化位点有关。病毒具有持续感染特点，使诊断和防控该病较为困难。

本病临床症状是：（1） 母猪发热，随后发生流产，产死胎和弱仔。传播速度很快，即“流产风暴”。母猪耳部皮肤变紫蓝色（即蓝耳表现，但少见）和腹部、臀部皮肤片状发红（非点状出血） ；（2） 哺乳仔猪和保育仔猪呼吸道症状，剖检见间质性肺炎，肺门淋巴结严重出血。

实验室诊断依据是：用病猪的含病毒血清、肺脏和淋巴结作为病毒分离材料，接种Marc-145 细胞；由于病毒在肺泡巨噬细胞中持续存在，因此，也可用于在血清抗体与病毒血症（RT-PCR 检测）均为阴性时，作为实验室最终确认试验用猪是否为“真正的蓝耳病毒阴性”的样品，临床上可用于确认猪群是否带有病毒的依据。采用RT-PCR检测病原时，ORF7 基因较为保守，常作为诊断靶基因，而ORF5 基因变异较大，作为毒株进化和同源性比较的扩增靶基因；Nsp2 基因则作为传统毒株和变异毒株的鉴别标志，但不是毒株致病性高低的判定依据。

抗体检测主要依靠ELISA 试剂盒，免疫荧光试验较少使用，中和试验不做为常规诊断的方法，但可作为免疫效果的评价方法之一。目前尚无法区分疫苗毒株抗体与自然感染抗体、也无法区分传统毒株和变异毒株之间的抗体，因此，抗体检测对于个体的诊断价值不大，但是，可根据猪群不同样品S/P 值的变动范围，可初步确定猪群是否处于蓝耳病活跃状态。综合考虑猪群是否处于病毒血症、发生猪群繁殖障碍问题，可以判定猪群的蓝耳病状态（阴性群、感染稳定群或活跃群），作为决策是否使用疫苗的依据。

防控本病的方法依赖综合防控。免疫预防在不同猪群的效果似乎有差异，对于处于活跃状态的猪群是有所帮助的，能稳定和控制疫情；一般是母猪每年免疫3 ～ 4 次，仔猪在10 ～ 14 日龄免疫。感染稳定场主要是对后备猪群免疫，排毒期结束后再混群。阴性猪群建议不免疫，而应重点强调生物安全措施，尤其是车辆消毒、投入品中蓝耳病毒的监测。目前，我国有3 种传统毒株弱毒疫苗（Ch-la、R98 和VR-2332 毒株）和3 种变异毒株致弱的活疫苗（JAX-1R、HuN4、TJM株）。疫苗的选择原则是根据本地毒株ORF5 序列同源性高低确定疫苗毒株。由于毒株之间可能发生重组，不推荐在同一猪场中使用两种不同毒株制备的活疫苗。除了免疫预防外，多点饲养是最有效的管理措施，可切断蓝耳病毒在母猪群和仔猪群之间的循环传播。运输车辆的合理消毒（ 醛类消毒剂、消毒后车辆干燥） 是切断病毒在猪场之间传播的重要环节。

（四）日本乙型脑炎

病原为日本乙型脑炎病毒。根据日本乙型脑炎病毒E 基因和全基因组序列特征，发现目前疫苗毒株属于基因3 型，而流行毒株是基因1型。免疫血清能中和同一基因型毒株的能力优于中和异种基因型毒株。

临床症状：感染母猪流产、产死胎和木乃伊胎，以产死胎为主。死胎脑部发生液化性坏死，肉眼可见脑腔积聚液体。公猪睾丸肿大或单侧萎缩，临床上以单侧睾丸病变多见。发病母猪和公猪体温升高，出现神经症状如嗜睡。本病多见于炎热季节，蚊虫滋生，经蚊虫叮咬而传播。

诊断：用间接血凝抑制试验检测未免疫猪血清，如抗体阳性，可判定为感染；病原学诊断主要是通过RT-PCR 扩增该病毒E 基因是否存在。检测样品是流产胎儿的脑组织。目前，血清学诊断和病原学诊断，尚不能区分野毒感染和弱毒苗免疫产生的抗体。

我国目前使用猪乙型脑炎活疫苗预防本病。在每年3 月份，蚊虫滋生前，母猪和公猪接种。免疫期6 个月。在炎热地区，如海南和福建等地区，建议在9 月份再免疫一次。我们在临床上发现，少数公猪使用乙脑活疫苗后，睾丸炎性肿大，精液品质下降。考虑到国外人医上只允许使用灭活疫苗，为保证免疫的安全性，本人建议公猪使用灭活疫苗；考虑到获得更好的交叉保护，应该加快研制并推广新基因型毒株的灭活疫苗。

本病为人兽共患病，如不采取预防措施，人群往往在猪群发生乙脑之后一个月发病，因此，在处理临床病例时要做好个人卫生防护。

（五）猪细小病毒病

本病病原为猪细小病毒，核酸类型为DNA，不同分离毒株的致病性高低不同，能凝集红细胞。本病主要发生于初胎母猪，发生流产，产死胎和木乃伊胎，但临床常见产木乃伊胎。发生繁殖障碍时，母猪无其他临床症状。细小病毒是猪圆环病毒2 型的协同致病因子，仔猪如发生细小病毒与猪圆环病毒2 型混合感染，将加重圆环病毒病的临床严重程度。

实验室诊断：鉴于本病毒对环境抵抗力较强，猪群中广泛存在，利用血凝和血凝抑制试验检测抗体的临床诊断意义不大，主要依赖从死胎中扩增或分离出细小病毒，并结合临床病程经过，才能做出诊断。免疫接种是预防本病的主要措施。目前我国市面上使用的疫苗多为灭活疫苗，通常在初胎母猪配种前1～ 2 个月完成1 ～ 2 次免疫。公猪可免疫2 次，间隔3 ～ 4 周。此后无需再免疫。

（六）猪圆环病毒病

猪圆环病毒2 型感染引起的猪圆环病毒相关疾病包括仔猪断奶衰竭综合症和皮炎肾病综合症等常见疾病类型（不在本文讨论范畴）。但是，猪圆环病毒2 型也可引起母猪繁殖障碍，而且，可在不同妊娠时期发生。母猪可能出现皮炎，胎儿主要表现心肌肥大；新生仔猪可出现先天性全身震颤，无法吮乳。公猪感染后，经精液间歇和持续排毒达51 天（ 如感染PCV2a） 和81 天（PCV2b），带毒精液也成为传染源之一。我国目前猪圆环病毒2 型的流行基因型是PCV2b。重组病毒也有所报道。

诊断本病主要依靠PCR 检测病毒是否存在，并结合临床症状，可确诊。由于PCV2 较难适应细胞，病原分离不作为常规诊断方法。抗体检测可作为非免疫群体的监测手段。预防本病主要是免疫产前1 个月母猪。多点饲养不能解决猪圆环病毒病的控制。

（七）猪流产衣原体感染

猪流产衣原体是导致母猪流产的常见病原之一。妊娠母猪感染后一般无明显的临床症状，仅在怀孕后期突然发生流产、早产、产死胎、木乃伊胎或弱仔，流产的胎儿水肿、头颈部和四肢出血，肝脏坏死肿大；公猪多表现为尿道炎、睾丸炎、附睾炎等，精液品质差，精子活力明显下降；仔猪感染后主要表现为体弱、精神不振、食欲差，肺炎、发育不良，死亡率高等症状。猪流产衣原体也可以感染牛、羊、马、兔、鼠等，流产母猪的胎膜、羊水和流产胎儿具有很强的传染性。孕妇密切接触患病动物则可能感染而导致流产。

实验室诊断：衣原体诊断的主要方法是鸡胚接种试验，也可将病猪的胎盘、阴道拭子或其它病变组织直接抹片，或者将接种病料鸡胚的卵黄囊膜制成抹片，姬姆萨染色观察是否有包含体的存在。..OIE 推荐的诊断方法是直接免疫荧光试验，有商品化的试剂盒。我们国内湖北省农科院畜牧兽医研究所和中国农科院兰州兽医研究所分别研制了商业化的间接血凝试剂盒，已广泛应用于衣原体病的血清流行病学调查。治疗可采用四环素、强力霉素、土霉素、金霉素、泰乐菌素等抗生素类药物，首选四环素。注射猪流产衣原体灭活苗是预防猪的衣原体病的主要措施。

（八）猪弓形虫病

本病由刚地弓形虫引起，母猪出现急性死亡，或者发生流产、产死胎。育肥猪可发生急性败血症而死亡。猫和其他猫科动物是本病原的终末宿主，猪食入了感染猫排出的包囊或卵囊而感染。母猪（或/和育肥猪）高热稽留，呼吸困难，耳部和腹部皮肤出现大量淤血斑，病猪急性死亡。剖检见间质性肺炎、肝脏和脾脏肿大，腹股沟和肠系膜淋巴结肿大、切面灰红色。诊断本病主要是用流产胎儿组织做涂片，姬姆萨染色观察滋养体形态，也可通过检测抗体而做出诊断。可通过在饲料中定期添加磺胺类药物来预防控制和治疗本病，同时，饲养场内不准饲养家猫。

二、饲料因素

（一）玉米霉变（黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮中毒）

由于贮藏不当或在收割时处于梅雨季节，玉米中滋生黄曲霉和寄生曲霉等，产生黄曲霉毒素（AFT），猪进食含此玉米的饲料后可诱发中毒。母猪AFT 慢性中毒的早期症状为食欲下降，精神萎靡，消瘦，产奶量降低等，有时还出现便血，胎儿死亡或畸形。发生AFT 中毒后，应立即停喂以霉变玉米为原料的饲料。治疗主要是采取保肝、解毒、排毒、利尿等措施，如拌料或饮水补充复合维生素，静脉注射葡萄糖注射液、维生素C 注射液、速尿和安钠咖注射液。

玉米赤霉烯酮（ZEN） 是一种类雌激素的霉菌毒素，主要由镰刀菌产生，能引起动物流产、死胎、返情等生殖异常现象。青年母猪对ZEN 的敏感性最强，饲料中含0.1～ 0.15 mg/kg 即可引起中毒，母猪中毒的主要症状有乳腺增大、子宫和阴户肿胀，卵巢萎缩，严重者甚至阴道和直肠脱垂。ZEN 还可导致公猪睾丸萎缩、性欲减退、乳腺肥大。对玉米赤霉烯酮中毒尚无特效药治疗，主要是停喂霉变的饲料。总结起来，黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮中毒分别引起妊娠母猪早期流产和母猪假发情（配种后发生返情）。

（二）蛋白质和维生素A 缺乏

饲料蛋白质是含氮化合物的总称，称为粗蛋白，由蛋白质、氨基酸、含氮有机物和氨化物等组成。当日粮中缺乏蛋白质，猪生长缓慢和繁殖性能降低，仔猪则出现血清蛋白质水平降低，贫血，全身水肿，肝脏脂类浓度增加；公猪性欲减退，精子畸形和活力不足，影响配种繁殖，使受胎率与产仔数下降。母猪发情不正常，排卵数减少，受精卵与胚胎早期死亡，发生死胎、流产及产后泌乳力弱等。怀孕和哺乳母猪的日粮饲料应含粗蛋白质14% ～16% ；仔猪饲料中粗蛋白质应不低于18% ：育肥猪日粮粗蛋白质以12%～ 14% 为宜；种公猪日粮粗蛋白质的含量15% ；不同原料的蛋白质含量和质量都不一样，蛋白质含量高和各种必需氨基酸比例恰当，饲料的营养价值才高。

维生素A 又称视黄醇，是一种脂溶性维生素。饲料中缺乏维生素A 时，母猪发情异常，不发情或推迟发情，妊娠母猪出现流产、产弱仔、死胎和畸形胎等。仔猪缺乏维生素A 则造成仔猪消化不良、腹泻、皮肤表面干燥、失明、神经机能紊乱、四肢行走困难、继发肝炎等，严重时可引起死亡。预防母猪维生素A缺乏症，应加强饲养管理，给予全价平衡饲料，饲料中含有充足的维生素A 和胡萝卜素，适时补充青绿饲料。母猪发病后可在饲料中添加多维和青绿饲料，同时也可用维生素A 制剂、鱼肝油等注射或口服，每日1 次，连用数天。

三、母猪发情鉴定与配种

正确鉴定母猪发情并适时配种，是避免母猪繁殖性能低下的辅助措施。在规模化猪场中，鉴定母猪发情多采用直接观察法，即观察母猪阴户红肿、排出黏液，兴奋，当试情公猪出现时，呆立不动，接受公猪或其他猪的爬跨。按压母猪腰部，母猪站立不动，即“静立反射”。此外，外激素测试并结合“静立反射”，也可做出鉴定。地方品种发情表现较明显。发情鉴定时需要注意是否是“假发情”。人工授精是规模化猪场常用的配种方法，一般采用重复配种。需要强调的是，公猪精液密度、活力等受精液稀释剂质量的影响。母猪配种后，多采用B 型超声诊断仪检查，确定是否配种成功，随即进入妊娠阶段的管理，主要是饲料配方合理、避免打斗、及时免疫接种等，在此，不再赘述了。

四、结论

从技术角度分析，引起母猪繁殖障碍的因素较多，但母猪品种和群体胎次结构、饲料营养水平和猪场管理因素的影响是长期和持续的，其影响是全局的。传染病和寄生虫病的影响往往是突发性事件，从发病母猪胎次、季节性和特征性症状等可以做出初步诊断，但确诊依赖实验室的抗体水平检测与分析，病原分离鉴定是最终的诊断依据，但是，无论是病原分离还是抗体水平分析，都要注意区分免疫抗体与野毒抗体、疫苗毒株与野毒株；由于动物感染病原的普遍性，即使分离出病原或PCR 扩增出野毒基因，仍需要与临床表现相结合，才能做出有临床意义的诊断，进而采取针对措施，预防相应疾病引起的繁殖障碍。

此外，企业要创造和谐的劳资双方关系，使员工体面劳动、有尊严生活，进而激发出认真负责和积极的工作态度，是所有技术措施能否不折不扣落实的关键，归根结底，人是生产力中最活跃因素，也是最重要的因素，忽视这一点，任何的先进技术都不能发挥其作用。

免疫室自我鉴定总结篇6

目的: 构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体并在cos?7细胞中表达, 为钩端螺旋体dna疫苗的研究和开发奠定基础。方法: 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中pcr扩增出目的基因, 双酶切构建重组质粒pcdna3.1?lipl32。脂质体转染法将重组质粒转染cos?7细胞, 通过rt?pcr、 western blot检测目的基因的表达。结果: 成功构建了lipl32基因的真核表达载体, 并在cos?7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论: 赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达, 为钩端螺旋体dna疫苗的应用提供了实验依据。

【关键词】 钩端螺旋体 外膜蛋白lipl32 真核表达

由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（简称钩体病）是一种世界范围内广泛分布的共患自然疫源性疾病, 严重危害人类健康和农牧业生产[1]。我国是钩端螺旋体病高发国家, 遍布三十多个省、 市、 自治区。近几十年来已有数次大规模的流行, 对我国农牧业生产和农民身体健康造成极大危害。尽管近年来钩端螺旋体病总体发病率和死亡率有所降低, 但是一旦自然条件发生变化（如洪灾、 地震等）, 极有可能造成局部或全面爆发流行。加上近年来流行菌群的更迭, 缺乏敏感的早期诊断方法和广谱高效的疫苗, 钩端螺旋体病仍然严重威胁着我国人民尤其是农民的健康。钩端螺旋体菌型复杂, 仅致病性钩端螺旋体就有23个血清群、 200个以上的血清型, 我国至少可以确定有26个国际新血清型, 是世界上血清群型最多的国家。而目前广泛使用的钩端螺旋体灭活疫苗诱导的免疫保护不完全, 保护时间短, 菌型间交叉免疫保护性弱。因此, 开发广谱、 高效、 持久的新型疫苗势在必行。本研究室率先在国内外进行钩端螺旋体dna疫苗的研究, 曾将钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因制备dna疫苗, 免疫动物后发现该dna疫苗具有明显的免疫保护作用[2]。lipl32是钩端螺旋体含量最多的外膜蛋白, 在钩端螺旋体的致病、 免疫保护过程中可能起着十分重要的作用[3]。本研究即以赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因为目的基因, 构建其真核表达载体并转染哺乳动物细胞, 旨在为钩端螺旋体dna疫苗的研究和开发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 钩端螺旋体017株, 本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒pcdna3.1、 宿主菌e.coli dh5α、 cos?7细胞本研究室保存。pcr试剂盒购于takara公司; 限制性核酸内切酶、 dna连接试剂盒及反转录试剂盒为晶美公司产品; 脂质体转染试剂、 trizol购自invitrogen公司; dna提取试剂盒、 胶回收试剂盒、 细胞可溶性蛋白提取试剂盒、 6×his单克隆抗体（mab）、 dab显色液购自tiangen公司; β?actin多克隆抗体购于精博生物技术公司; 二抗（羊抗鼠igg?hrp及羊抗兔igg?hrp）为北京中衫公司产品; 其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 钩端螺旋体017株基因组的提取 参照terpstra等[4]方法并略加修改。

1.2.2 lipl32基因pcr扩增 根据genbank数据库中lipl32基因的序列设计引物, 上游和下游分别引入kpn i和ecor i的酶切序列。p1: 5′?cgggtaccgaaggagagtctatgaaaaaac?3′, p2: 5′?gctgccgccaccgccggatccgccaccgccgcttccac?cgccaccccggaattccttagtcgcgtcagaagc?3′（划线部分分别是kpni和ecori酶切位点）（invitrogen公司合成）。pcr反应体系: 按takara公司primerstartmhs dna polymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板, p1、 p2为引物, 98℃变性10 s, 55℃退火5 s, 72℃ 90 s, 30个循化。取pcr产物进行80 g/l琼脂糖凝胶电泳, 胶回收试剂盒回收目的基因。

1.2.3 重组载体的构建和鉴定 将载体pcdna3.1、 lipl32基因分别用kpn i和ecor i限制性核酸内切酶双酶切后, 胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接4 h。转化宿主菌e.coli dh5α, 挑取阳性克隆摇菌、 提取质粒进行双酶切、 pcr鉴定, 同时将重组载体送invitrogen公司测序。空载体pcdna3.1转化e.coli dh5α方法同上。

1.2.4 转染质粒的提取 分别挑取重组成功的单克隆菌落和空载体菌落于10 ml lb培养基中37℃振荡培养过夜（amp 50 mg/l）, 次日提取质粒, 电泳鉴定及紫外分光光度法测定质粒的纯度和浓度, -20℃备用。

1.2.5 cos?7细胞的复苏和培养 从液氮罐中取出细胞, 迅速解冻, 加到含100 ml/l小牛血清rpmi1640培养液中。37℃、 50 ml/l co2孵箱培养, 待细胞生长达80%汇合时, 以2.5 g/l胰酶消化传代。

1.2.6 cos?7细胞的脂质体转染 将对数期生长的cos?7细胞按105个/孔接种至6孔板中, 培养24～36 h至细胞生长达80%汇合时转染。按lipofectaminetm2000说明书进行。分别用rpmi1640培养液稀释重组质粒pcdna3.1?lipl32、 空载体pcdna3.1和lipofectaminetm2000脂质体。将脂质体和dna混合后室温静置15 min。转染细胞用无血清的rpmi1640培养液洗涤2次, 然后逐滴加入所制备的脂质体dna混合物。重组质粒转染组和空载体转染组分别转染6孔。留1孔仅加rpmi1640培养基作空白对照。37℃、 50 ml/l co2孵箱中培养6 h后弃转染液, 加入2 ml含100 ml/l小牛血清的rpmi1640培养液继续培养48 h收获瞬时转染细胞。稳定转染细胞株的筛选参照文献[5]。将转染细胞转移至培养瓶中加入g418至浓度为800 mg/l,同时设对照（未转染过的cos?7细胞）一瓶, 培养至对照组细胞大部分死亡, 将g418浓度降至400 mg/l, 继续培养至细胞80%汇合, 收获稳定转染细胞。

1.2.7 rt?pcr检测lipl32基因在cos?7细胞中的表达 rna的提取按照trizol法进行, 提取的rna经电泳检测后, 按反转录试剂盒说明书进行反转录。pcr体系和反应条件同1.2.2, 仅将模板换成cdna。为排除dna污染, 以重组质粒转染细胞所提rna为模板, 体系和反应条件同上做pcr扩增。同时作内参gapdh的pcr扩增。

1.2.8 western blot鉴定目的基因在cos?7细胞中的表达 收获稳定转染的cos?7细胞, 按细胞可溶性蛋白提取说明书操作收获细胞可溶性蛋白。将收获蛋白sds?page电泳后, 转至pvdf膜, 以加6×his mab（1∶200）为一抗; 以加羊抗鼠igg?hrp(1∶5000)为二抗, dab显色, 同时做β?actin的对照。空载体pcdna3.1转染组western blot检测方法同上。

2 结果

2.1 赖型钩端螺旋体017株lipl32基因的pcr扩增 扩增出一特异性条带, 约810 bp（图1）。

图1 钩端螺旋体017株lipl32基因的pcr扩增（略）

fig 1 pcr product of lipl32 amplified from leptospira strain 017 genomic dna

m: dna marker; 1: product for lipl32.

2.2 lipl32真核重组质粒的构建和鉴定 挑取阳性克隆摇菌提取质粒经80 g/l琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后, 用kpn i 和ecor i双酶切鉴定并以提取质粒为模板, p1、 p2为引物进行pcr扩增, 空载体pcdna3.1作对照。双酶切结果示该重组质粒含有一810 bp左右的片段, pcr结果示该重组质粒能扩增出目的片段, 而空载体pcdna3.1未能扩增出, 测序结果和genbank中lipl32基因序列比对, 100%匹配, 表明重组质粒构建成功(图2)。

2.3 转染质粒的提取 琼脂糖电泳显示, 大部分dna呈超螺旋构型, dna a260/280=1.8～1.9, 适合转染。

2.4 脂质体dnacos?7细胞的瞬时转染和稳定株的筛选 由于脂质体对细胞有毒性, 转染后细胞有部分形态皱缩或死亡, 培养液中可见结构破坏后的碎点。加入高浓度的g418后, 转染和未转染的细胞均出现大量皱缩变性细胞, 至第5天未转染组细胞几乎全部死亡, 质粒转染组尚有活细胞存在, 降低g418浓度继续培养1周, 得到稳定转染的细胞株。

图2 lipl32基因真核重组质粒的构建及鉴定（略）

fig 2 construction and identification of the eukaryotic recombinant vector

m: dna marker; 1: plasmid pcdna3.1; 2: recombinant plasmid(pcdna3.1? lipl32); 3: plasmid pcdna3.1 digested with ecor i; 4: recombinant plasmid(pcdna3.1? lipl32) digested with ecor i; 5: recombinant plasmid digested with kpn i and ecor i ; 6: pcr product amplified from recombinant vector with primer p1 and p2; 7: pcr product amplified from plasmid pcdna3.1.

2.5 质粒转染的cos?7细胞rt?pcr检测 分别提取重组质粒转染组、 空载体转染组和空白对照组细胞rna, 进行rt?pcr检测。结果, 重组质粒转染组能扩增出目的基因, 而空载体转染组和空白对照组均未能扩增出目的基因。同时, 以提取重组质粒转染组细胞的rna为模板进行pcr扩增也未能扩增出目的基因, 表明目的基因能在cos?7细胞中表达（图3）。

图3 rt?pcr检测lipl32基因在cos?7细胞中的表达（略）

fig 3 expression of lipl32 gene in cos?7 cell by rt?pcr analysis

m: dna marker; 1: rt?pcr with rna from cos?7 cell with recombinant plasmid; 2: rt?pcr with rna from cos?7 cell with plasmid pcdna3.1; 3: rt?pcr with rna from cos?7 cell without transfection; 4: pcr with rna from cos?7 cell with recombinant plasmid.

2.6 lipl32基因表达的western blot鉴定 重组质粒转染组western blot分析显示在mr 30000左右出现一特异性的条带, 和预期目的蛋白的mr吻合, 而空载体转染组未出现阳性条带, 表明重组质粒转染组细胞有目的蛋白的表达(图4)。

图4 重组质粒转染cos?7细胞后目的蛋白表达的western blot鉴定（略）

fig 4 western blot analysis of the expressed target protein after transfection

m: protein marker; 1: recombinant plasmid transfection group(with 6×his monoclonal antibody as first antibody); 2: plasmid pcdna3.1 transfection group(with 6×his monoclonal antibody as first antibody); 3: recombinant plasmid transfection group(with β?actin multiclonal antibody as first antibody); 4: pcdna3.1 transfection group(with β?actin multiclonal antibody as first antibody).

3 讨论

本研究室曾将钩端螺旋体多个基因制备成钩端螺旋体dna疫苗, 免疫动物后攻击试验证明这些dna疫苗有一定的免疫保护效应, 说明应用dna疫苗预防钩端螺旋体病是可行的[2, 6]。由于钩端螺旋体血清型众多, 要研制具有广谱的dna疫苗, 必须选择在众多血清型中相对保守以及具有免疫保护性的基因。研究证明, 钩端螺旋体的外膜蛋白是钩端螺旋体的重要毒力因子, 由于其位置的特殊性, 在钩端螺旋体的黏附、 致病、 免疫保护等过程中可能起着重要作用。lipl32是钩端螺旋体中含量最多的外膜蛋白, 基因序列高度保守, 血清型之间的同源性高达93%～99%。已证明该蛋白具有增强钩端螺旋体溶血素的溶血功能, 被称为溶血素相关蛋白?1（hap?1, hemolysis associated protein?1）[7]。2001年branger等[8]构建腺病毒lipl32重组载体并免疫沙鼠, 结果沙鼠诱导产生了强烈的交叉免疫保护效应。为了避免腺病毒潜在的安全隐患, 作者又用puc表达载体和lipl32构建重组载体对沙鼠进行dna免疫, 结果也诱导产生了交叉免疫保护效应[9]。提示由该基因构建的dna疫苗可能具有极高的开发和应用价值。本研究中即以lipl32基因为目的基因, 以pcdna3.1为载体, 构建真核重组载体。由于载体pcdna3.1含有cmv强启动子, 可以使目的基因得以有效地表达, 且其氨苄青霉素抗性基因中含有2个拷贝的免疫刺激dna 序列( immuno?stimulatory sequence, iss, 又称cpg dna), 该序列对dna疫苗有很强的佐剂作用, 有利于提高机体的免疫效应。转染哺乳动物细胞时, 我们选用了转染效率高、 对细胞毒性小的脂质体转染法。转染细胞后通过g418压力筛选得到了稳定转染株, 有利于下一步对目的基因表达的鉴定。转染后的基因表达与否, 取决于表达的载体、 宿主细胞及目的蛋白的性质等。通过rt?pcr和western blot检测可分别从转录和翻译水平对目的基因的表达进行检测。本研究中通过rt?pcr检测发现lipl32基因可以在cos?7细胞中有效表达。另外, 在设计引物时, 我们去掉了lipl32基因的终止密码, 使得pcdna3.1载体中的6个组氨酸得到表达, 有利于western blot分析时用6个组氨酸标签蛋白的mab进行检测, 提高了检测的特异性和敏感性。通过western blot鉴定发现, 在mr 30000左右有一特异性的阳性条带, 和预期目的蛋白的mr吻合, 而在对照组未出现目的条带, 表明目的基因在细胞中得到了表达。

综上所述, 我们成功地构建了赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体并转染哺乳动物细胞, 通过rt?pcr和western blot检测证实目的基因能在哺乳动物细胞中表达, 为下一步进行动物试验奠定了基础。

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免疫室自我鉴定总结篇7

关键词：食品、微生物检测、快速检测技术

食品病原微生物检测是保障食品安全的重要组成部分，依靠采用培养基增菌培养、分离、生化鉴定及革兰染色镜检等传统检测方法，对实验室技术人员的专业技术、操作技能以及工作经验要求极高，操作步骤复杂繁琐，检测周期长，灵敏度低，准确性差，容易出现假阴性或假阳性结果。近年来，微生物快速检测技术发展迅速，运用分子生物学、电子技术、生物化学、免疫学等技术对微生物进行分离、鉴定和计数，与传统检测方法相比，更快、更方便、更灵敏、更准确。

一、主要食品微生物快速检测技术

1 分子生物学技术

（1）PCR技术

通过大量复制目的菌的高度保守的一段或几段特异性DNA并确认这些DN段的大小来完成检测，如果样品中存在目的菌，就能复制出有关特异性DN段，而复制特异性DN段靠聚合酶链反应―PCR技术。

该技术已大量运用到食品微生物检测领域，并形成标准化，如SN/T 1632.2-2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第3部分:荧光PCR方法》、DIN 10135:1999《沙门氏菌聚合酶连锁反应（PCR）检验方法、ISO 20837:2006《食品和动物饲料微生物学―聚合酶链反应（PCR）检测食源病原体―定性检测用样品的制备》

目前利用PCR技术检测病原菌的商品化仪器有被AOAC、USDA-FSIS、Health Canada、AFNOR等权威机构认可的BAX@全自动病原菌检测系统，可检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特菌等致病菌，此外还有RiboPrinter@微生物鉴定系统，可鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌等致病菌在内的1400多种细菌。

在1996年由美国AB公司推出的实时荧光定量PCR仪，与常规PCR仪相比，它具有特异性更强、有效解决PCR产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。

（2）核酸探针技术

核酸探针是指带有标记的特异DN段。根据碱基互补原则，核酸探针能特异性地与目的DNA杂交，最后用特定的方法测定标记物。探针标记方式为放射性标记、非放射性标记，具有直观、准确等特点，基于核酸探针杂交的基因芯片技术，虽然其灵敏度与PCR技术相当，但其具有高通量、多参数、高精确度和快速分析等特征，所以备受青睐。我国已将此技术引入到行业标准中来，如SN/T 1543-2005《食源性致病菌基因芯片鉴定方法》。

2 免疫学技术

（1）荧光抗体法

用荧光物质标记抗血清的抗体，即抗抗体。使用荧光显微镜观察样品中的目的菌-荧光标记抗体结合物或目的菌-抗体-荧光标记抗抗体结合物来判断结果。在食品微生物检测领域内，国内使用的较多是mini-VIDAS全自动荧光酶标免疫测试系统，该系统已被AOAC、AFNOR等权威机构认可，可检验沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌O157、葡萄球菌肠毒素等。

（2）免疫酶技术

以酶标记抗体或抗抗体，抗原与酶标记抗体，或抗原-抗抗结合物与酶标记抗抗体特异性结合。根据酶反应有色反应的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在及其数量。常用酶技术分为固相免疫酶测定技术、免疫酶定位技术和免疫酶沉淀技术。在食品微生物检验领域内，国内使用比较多的有Reveal@大肠杆菌O157：H7检测系统、Reveal@沙门氏菌检测系统及GeneQuence@李斯特氏菌检测试剂盒、金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒等。

（3）免疫磁珠技术

用连接抗体的磁珠捕捉增菌液中的目的菌，然后将捕捉到的抗原即目的菌划线于选择性平板，观察菌落。或用荧光或酶标记的抗抗体进行检测。或用聚合酶链式反应技术进行进一步检测。此技术在ISO 166654:2001《食品和动物饲料微生物学―大肠杆菌O157基准检验方法》上得到了应用。目前可利用该技术对沙门氏菌、大肠杆菌0157、大肠杆菌0145、大肠杆菌O111等进行测试。

（4）免疫层析技术

该技术是一种膜固相免疫测定技术。滴加在膜一端的样品溶液受膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般。移动过程中被分析物与固定于膜上某一区域的抗原或抗体结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后通过标记物的显色来判定实验结果。以胶体金为标记物的实验称为胶体金免疫层析技术，该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，可对食品中大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、布氏杆菌、霍乱弧菌等进行检测。

（5）其它免疫技术

细菌直接计数法主要包括流式细胞仪(flow cytometry，FCM)和固相细胞计数(solid phasecytometry，SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量鉴定。目前已经建立了细菌总数、致病性沙门氏菌、大肠埃希氏菌等的FCM检验方法。

3.其它技术

即用型纸片法

3M公司的perrifilmTMPlate@系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数。由RCP Scientific Inc公司开发上市的Regdigel@系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品。3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。

二、食品微生物快速检测技术的局限性

快速检测技术的评估结果表明，其对于某类食品的性能优于其他食品，很大程度上是由于食品成分干扰所致，有些食品成分对于快速检测方法中所应用的技术是比较麻烦的。例如在采用PCR技术时，食物中的高蛋白、高脂肪对Taq酶具有抑制作用，可能导致检测结果假阴性。同时PCR操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果。

三、结束语

随着某一快速检测技术更加频繁的使用，其好处与局限性同时变得更加明显，使用者在选择这些快速检测技术时，应考虑此技术的准确性、特异性、实用性、稳定性、灵敏度以及采用此技术的供应价格、认可程度和售后服务等因素，综合判别后进行选择。

参考文献：

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[4]吴清平，等.食源性致病菌免疫及分子检测新技术研究进展［J］.

免疫室自我鉴定总结篇8

【摘要】 目的: 筛选出高抗原性的口蹄疫病毒（FMDV）抗原表位组合体， 为能有效启动细胞免疫、 高广谱性的口蹄疫植物疫苗的研究提供研究基础。方法: 通过化学方法合成O、 A型口蹄疫病毒的5个T细胞表位基因和2个B细胞表位基因单链， 采用套叠PCR的方法将T或是B细胞表位基因分别融合成融合体T或B， 利用同尾酶的性质将融合体T和B连接成3种不同融合方式的串连体， 即5′TBT3′、 5′TTB3′和5′BTT3′; 利用马铃薯X病毒(potato virus X， PVX)载体在烟草叶片中表达各串连体基因、 融合体T基因、 融合体B基因和O型口蹄疫病毒的VP1基因; RTPCR检测各基因在烟草(N.benthamiana)叶片中的转录水平; 间接ELISA及Western Dotblot 检测表达产物的抗原性。结果: 各抗原基因在烟草叶片中成功获得了表达， 表达产物的抗原性因不同的融合方式而呈现差异， 其中以5′TBT3′的融合方式为最高， 5′BTT3′次之， 再是5′TTB3′， 但都高于VP1基因的表达产物， 更高于融合体T或B基因的表达产物。结论: 通过融合口蹄疫病毒的多个表位基因有可能找到一种研制有效启动细胞免疫反应广谱抗口蹄疫病毒的基因工程疫苗的方法， 且T、 B细胞表位的不同组合方式对免疫活性很可能存在一定的影响。

【关键词】 口蹄疫病毒; 表位; 马铃薯X病毒; 烟草

口蹄疫（foot and mouth disease， FMD）是由口蹄疫病毒 (footandmouth disease virus， FMDV) 引起一种偶蹄动物共患的急性、 热性、 高度接触性传染病， 被国际兽医局列为头号A类传染病［1］。该病传播途径多、 传播速度快， 多血清型， 曾多次在世界发生大流行， 研制一种有效启动细胞免疫反应广谱抗病毒的疫苗是成功地防控FMD的先决条件。

人们对FMDV抗原表位进行了广泛的研究， 已经在VP1除外的其他结构和非结构蛋白上发现了某些确实能引起淋巴细胞扩增、 加强体液免疫的肽段。我们利用基因工程的手段表达这些表位基因来研制口蹄疫基因工程疫苗。在植物中表达抗原基因是一种安全、 廉价的基因工程疫苗生产方式， 目前已有较多成功的报道［2-4］。利用马铃薯X病毒载体在烟草叶片中表达抗原基因是一种快速、 安全的表达系统， 被广泛应用在利用稳定表达系统（核遗传的表达系统）之前检测研究设计的可行性分析及多种应用性的研究中［5， 6］。本研究我们在合成已经确认的T或B细胞表位基因的基础上， 将其进行融合和串连， 利用马铃薯X病毒载体在烟草叶片中表达不同的串连体基因、 FMDV VP1基因等， 快速、 准确地确定各表达产物的抗原性的免疫活性， 为通过核遗传来稳定表达抗原基因、 研制高效的植物疫苗提供可靠的依据。

1 材料和方法

1.1 材料 E．coli DH5α: 常规克隆宿主菌， 本实验室保存; pMD18T Vector购于TaKaRa 公司; 马铃薯X病毒载体(PVX)PGR107(Kanr)及农杆菌GV3301＋PLICSa(辅助质粒， 四环素抗性， Tetr)由英国Sainsbury实验室David Baulcombe惠赠。A和O型口蹄疫全毒株的标准血清(抗小鼠)购自中国农业科学院兰州兽医所; 山羊抗小鼠(IgGAP)及显色底物购自华美生物工程公司产品购自脱脂奶粉: 完达山乳品有限公司产品， 其他化学试剂均为国产分析纯。本生烟草(N.benthamiana)由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕研究员惠赠。

1.2 方法

1.2.1 各抗原表位基因单链及引物的合成(TaKaRa公司合成)

1.2.1.1 各表位基因单链合成 采用豆科植物偏爱密码子合成A、 O型口蹄疫结构蛋和非结构蛋白上的7个T、 B细胞表位基因: （1）A型FMD 3A蛋白上的21～35 aa位氨基酸， AAIEFFEGMVHDSIK， T细胞表位， 命名为T1; （2）A、 O型FMD 3C蛋白上保守的196～210 aa位氨基酸， RSMLLKMKAHIDPEP， T细胞表位， 命名为T2; （3）O型FMD VP2蛋白上的49～68 aa位氨基酸， SGLETRVVQAERFFKTHCYD， T细胞表位， 命名为T3; （4）O型FMD VP3蛋白上的81～100 aa位氨基酸， LAAKHMSNTFLAGLAQYYTQY， T细胞表位， 命名为T4; （5）O型FMD VP4蛋白上的20～40 aa位氨基酸， TQLGDNAISGGSNEGSTDTTS， T细胞表位， 命名为T5; （6）A型FMD VP1蛋白上的138～160 aa位氨基酸， TDGPRRGDMGSLTARAAKQLPAS， B细胞表位， 命名为B1; （7）O型FMD VP1蛋白上的137～160 aa位氨基酸， GESPVTNVRGDLQVLAQKAARTLP， B细胞表位， 命名为B2。

1.2.1.2 各表位基因融合引物的设计与合成 （1）所有T细胞表位基因融合引物设计: 据套叠PCR技术在基因融合中的应用原理［7］， 设计10条基因片段融合引物（P1、 P2…P10）及2条载体构建引物， 为了各个表位基因在表达成肽段后不相互干扰， 在引物P1P10上引入柔性氨基酸丝氨酸(Ser， TCC)/甘氨酸(Gly， GGA)， 或柔性氨基酸天冬氨酸(Asn， AAT)/甘氨酸(Gly， GGA)对应的核苷酸序列; P15、 P16为载体构建引物， 分别引入Cla Ⅰ、 Ava Ⅲ 和Sal Ⅰ、 Pst Ⅰ酶切位点(Ava Ⅲ和Pst Ⅰ为同尾酶)（2）2个B细胞表位基因融合引物设计: 同理设计4条引物， P11、 P12扩增B1基因， P13、 P14扩增B2基因， 在引物序列中引入酶切位点同时在2个B表位基因上引入TCCGGA序列， 融合后在2个B表位之间加入丝氨酸(Ser， TCC)/甘氨酸(Gly， GGA) 使表达成肽段后不相互干扰发挥作用， 在P11 和P14上分别引入Cla Ⅰ、 Ava Ⅲ 和Sal Ⅰ、 Pst Ⅰ酶切位点。（3）FMDV VP1基因的引物， P17（引入Cla Ⅰ）和P18（引入Sal Ⅰ）。（4）据PVX载体序列设计引物1701和1702。

1.2.2 克隆基因的PCR扩增

1.2.2.1 Klenow 酶对各表位基因单链的延伸 将合成的各表位基因片段， 100℃变性3 min， 在冰上迅速冷却， 按如下体系加入反应物， 37℃延伸30 min; 使用Boehringer Mannheim公司的High Pure PCR Product Purification Kit回收各基因片段。

1.2.2.2 各T细胞表位基因的串连PCR扩增 以不同的引物组合（P1、 P2…P10）为引物， 分4次PCR(用Pfu高保真酶进行)将5个T细胞表位基因融合后， 再用P15、 P16为引物进行PCR， 加入相应的酶切位点， 用1.2.2.1的方法回收， 回收产物命名为T。

1.2.2.3 2个B细胞表位基因的串连PCR扩增 以P11、 P12/P13、 P14为引物， 分2次PCR将2个用B细胞表位基因融合并引入相应的酶切位点， 用1.2.2.1的方法回收， 回收产物分别命名为B。

1.2.2.4 PCR扩增FMDV VP1基因 以P17、 P18为引物， 以本实验室构建的pBIVP1为模板进行PCR; 用1.2.2.1的方法回收， 回收产物分别命名为VP1。

1.2.3 各PCR产物的克隆、 转化与测序分析 将各PCR产物（T、 B和VP1）与pMD18T Vector 载体连接， 构建克隆载体（pMDT、 pMDB和pMDVP1）， 分别转化大肠杆菌， 经PCR及酶切鉴定后， 阳性克隆送TaKaRa公司作测序分析。

1.2.4 植物病毒载体的构建 利用同尾酶连接反应技术构建植物病毒载体。以同尾酶Ava Ⅲ和Pst Ⅰ在克隆载体pMDT和pMDB上进行相应的3次酶切， 连接和转化及鉴定， 获得不同串连方式的中间载体; 各中间载体及克隆载体pMDVP1和马铃薯X病毒表达载体， 分别用Cla Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切， 以酶切后回收病毒表达载体的大片段与各目的片段连接、 转化， 以载体引物1701和1702为引物对各重组子进行鉴定; 提取阳性重组子的质粒， 电激转化法转化农杆菌感受态细胞， PCR法鉴定获得阳性农杆菌工程菌株， 方法见文献（王关林和方宏筠， 2002）。

1.2.5 烟草的侵染 活化农杆菌工程菌株， 采用注射渗透法侵染烟草植株， 注射完毕后， 置于28℃培养箱中培养。

1.2.6 利用RTPCR检测目的基因的转录水平 利用RNA提取纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司产品）提取烟草叶片的总RNA， 采用RTPCR试剂盒（Boehringer Mannheim 公司）进行反转录; PCR以载体引物1701和1702为引物， 凝胶电泳分析PCR产物。

1.2.7 点杂交及ELISA检测目标蛋白的免疫原性 采用改良的丙酮沉降法提取烟草叶片总蛋白， 测定总蛋白浓度; Western Dotblot 的杂交及显色和ELISA， 方法参照文献（王关林和方宏筠， 2002）， 每个样品加2个孔。一抗为A、 O型口蹄疫全毒株的标准血清。

2 结果

2.1 基因单链的合成 合成各表位基因的序列为: T1: 5′GCAGCAATTGAGTTCTTTGAGGGCATGGTGCATGATAGCATTAAG3′; T2: 5′AGGAGCATGCTTCTTAAAATGAAGGCACAT

ATTGATCCAGAGCCA3′; T3: 5′AGCGGCCTTGAGACCAGAG

TGGTGCAGGCAGAGAGATTCTTCAAGACCCATTGCTACGAT3′; T4: 5′CTTGCAGCAAAGCATATGAGCAACACCTTCCTTGCAG

GCCTTGCACAGTACTACACCCAGTAC3′; T5: 5′ACCCAGCTTGGCGATAACGCAATTAGCGGCGGCAGCAACGAGGGCAGCA

CCGATACCACCAGC3′; B1: 5′ACCGATGGCCCAAGAAGAG

GCGATATGGGCAGCCTTACCGCAAGGGCAGCAAAGCAGCTTC

CAGCAAGC3′; B2: 5′GGCGAGAGCCCAGTGACCAACGTGA

GAGGCGATCTTCAGGTGCTTGCACAGAAGGCAGCAAGAACCC

TTCCA3′。

2.2 病毒表达载体的构建 通过一系列的套叠PCR技术融合5个T细胞表位基因片段， 组合后的片段命名为T（大小约240 bp）; 或是融合2个B细胞表位基因片段， 组合后的片段命名为B（大小约为150 bp）; PCR扩增O型FMDV VP1基因， 克隆和测序分析， 获得各目的基因; 再经相应的酶切及连接、 转化、 鉴定分析， 获得6种含不同融合方式的串连体， 单独T或是B表位基因片段， 或是FMDV VP1基因的中间表达载体（图1）。

图1 中间表达载体构建的框架

Fig 1 The schematic representation of the intermediate expression vector， PVX

1-6: The expression vector， PVXTTB， PVXTBT， PVXBTT， PVXB， PVXT， PVXVP1， respectively.

2.3 PCR鉴定各中间表达载体转化农杆菌株 利用电激转化农杆菌株GV3301＋PLICSa， 转化重组的农杆菌株用病毒表达载体上的引物1701、 1702进行菌落PCR鉴定， 结果如图2所示， 表明成功获得了6种含植物病毒载体的农杆菌工程菌株。

2.4 RTPCR检测目的基因的转录水平 在农杆菌株侵染烟草后第2天， 提取各侵染叶片的总RNA， 进行反转录合成cDNA， 再以载体引物扩增获得的PCR产物跑胶检测， 结果如图3所示。从图3A中可见， A1、 A2泳道分别出现大小约250 bp和150 bp的条带， 分别对应为T片段和B片的大小; A3-5泳道都出现大小约700 bp的条带， 为酶切连接方式融合的各抗原基因片段（BTT、 TTB、 TBT）对应大小; B7泳道出现约690 bp大小的条带， 与VP1基因片段的大小基本一致， 由此说明各被检测的烟草叶片样品对应泳到都出现了与预期大小相同的电泳条带， 而阴性对照（B8）没有出现， 证明各抗原基因在烟草叶片中获得了转录水平的表达。

2.5 抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析 提取所有被侵染烟草叶片的总蛋白， 测定总蛋白的含量， 并稀释到相同的浓度（约为每毫升蛋白提取液含总蛋白0.350 mg）。取这种总蛋白进行Western Dotblot 及间接ELISA。从图4中杂交斑点的颜色深浅可以初步推测融合表达的多表位肽段的抗原性明显高于单个融合体T或B的表达产物; 各串连体的表达产物在与A型FMDV的标准血清杂交反应中， 免疫反应强度均略高于O型口蹄疫外壳蛋白VP1。将上述蛋白溶液进行间接ELISA检测， 以A或O型口蹄疫全毒株的标准血清为一抗， 每个样品进行2个重复， 在450 nm的波长下读取A值。为研究多表位串连体表达产物所具免疫活性的广谱性， 将分别与A和O型FMD全毒株的标准血清反应所获得的4个A值求平均值得各抗原表位的A， 不同的抗原或不同的组合方式有不同的A， 分别为BTT: 0.2415; TTB: 0.189; TBT: 0.2895; VP1: 0.167; T: 0.1495; B: 0.141; 空载体: 0.041。结果不仅证明了由Western Dotblot 实验推测出的结论， 而且可以看出不同的方式组合在抗原性上存在一定的差异， 以TBT的融合方式为最高， BTT次之， 再是TTB， 但都高于VP1或单独的T、 B细胞表位。

3 讨论

FMDV是一种变异广泛、 多血清和亚型的病毒， 目前有临床效果的疫苗是其灭活疫苗， 但一种型的灭活疫苗只能预防此型FMDV， 对其他型甚至是其他亚型就“力不从心”了， 研究一种广谱抗各型口蹄疫的疫苗对防治口蹄疫至关重要。本研究我们通过人工合成多个关键的抗原表位基因， 并对其采用不同方式的融合表达， 期望找到一种高免疫原性的表达方式或是关键的表位， 为研究一种广谱抗病毒的疫苗提供新思路。从融合表位基因的表达产物与A、 O型FMDV全株的标准血清的免疫反应来看， 其效果好于外壳蛋白VP1， 在一定程度上支持了融合表达多表位基因的设想， 但其在动物体内的免疫反应效果还有待动物实验的结果来证实。FMDV感染寄主后是在寄主的细胞中进行复制和组装， 因此诱导产生记忆性T细胞从而在病毒感染的短时间内启动细胞免疫反应， 这对清除病毒很重要， 研究中合成的多数是T细胞表位基因， 至于其免疫效果更有待于动物实验来证实。

至于在融合肽中T细胞表位和B细胞的不同位置对其免疫原性的研究不多。Esther等寻找位于FMDV非结构蛋白上的T细胞表位时， 曾经试着将O型FMDV VP1上的137～156位氨基酸的肽(B细胞表位， 命名为B)与3A上的21～35位氨基酸的肽(T细胞表位， 命名为T)按先后两种不同的顺序融合(TB和BT)， 免疫实验中发现TB的融合方式免疫原性高于BT。总之， 我们采用3种方式融合， 初步认为TBT的融合方式免疫原性好， 其确切的效果及作用机制有待于进一步研究。

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