细胞核范文

细胞核篇1

细胞核中有核糖体，核膜表面附有核糖体。核仁的主要功能是rRNA的合成、加工和核糖体亚基的装配，所以必然会有一点的，但是合成以后就会释放到细胞质里去。另外核糖体由大亚基和小亚基组成，所以核仁能装配核糖体亚基广义上来说就是核糖体了。

按核糖体存在的部位可分为三种类型：细胞质核糖体、线粒体核糖体、叶绿体核糖体。

核糖体主要存在于细胞质中，粗面内质网上。

细胞核中有RNA，有的是mRNA。rRNA。tRNA等。其中mRNA是由DNA转录得来的。

（来源：文章屋网 ）

细胞核篇2

[关键词] 细胞核的功能细胞核的结构

一、导入新课

创设情景：播放视频草履虫的生殖、应激性、变形虫的取食运动和人体白细胞吞噬病菌的过程。

师：同学们想一想：他们在进行生命活动的时候，究竟是细胞中的哪部分结构起着决定性的作用呢？通过前面的学习，我们知道细胞作为生命系统中最小的结构层次，其内部每时每刻都在进行着各种精确而有序的生物化学反应，这又是受谁的控制呢？（停顿片刻），这就是我们今天要学习的，系统的控制中心：细胞核（板书）

二、讲授新课

师：细胞核在细胞的生命活动是如何起作用？为了研究这个问题，科学家们做了很多实验，今天我们就沿着科学家走过的足迹，去看看他们是如何进行科学探究的。（屏幕显示：科学探究的基本步骤，教师简单解说）

师：（黑白美西螈图片）美西螈是一种两栖类动物，根据肤色可分为美西螈和白美西螈两种，于是科学家们提出这样一个问题：美西螈的肤色是由细胞核还是细胞质控制的呢？

生：是细胞核控制的。

师：这个假设是否正确还需用实验来证明，下面我们看科学家是如何证明的，请同学读教材52页资料1。

生：学生朗读。（幻灯片展示美西螈核移植图解）

师：（教师解释核移植技术）根据这个实验能否充分证明假设是正确呢？

生：不能。

师：如何再设计实验使实验结果更具有说服力呢？

（学生小组讨论）

生：将白美西螈胚胎细胞的核取出，移植到黑美西螈的去核的卵细胞中，看植入核的卵细胞发育成的美西螈的肤色。

师：通过两组实验的对比，使实验更加的严密，这样可以得出结论：美西螈的肤色是由细胞核控制的。

师：（幻灯展示伞藻图片）伞藻是单细胞的绿藻，分为帽、柄和假根，其中细胞核位于假根部位，根据帽形可分为伞形帽和形帽，伞藻再生性很强，即帽切除之后，很短时间内能够生出新的帽，是什么决定了帽的形态呢？如何设计一个实验证实自己的假设呢？

（学生小组讨论）

生：将两种伞藻帽切除并且去掉核，再分别植入另外一种的细胞核，看看他们分别再生出哪种形态的帽。

师：（幻灯放映伞藻核移植图解）你很有发展成科学家的潜质，非常好。这样就可以说明细胞核决定了伞藻帽的形态建成，但是科学家们当时并没有直接想到利用核移植来验证，而是先做了两种伞藻嫁接的实验（展示实验过程图解），同学们分析一下，这个实验能否证明就是细胞核决定了伞藻帽的形态呢？为什么？

（学生小组讨论）

生：不能，因为假根部分还有部分细胞质存在，所以不能排除细胞质的影响。

师：回答得非常精彩，（掌声鼓励），同学们还记得初中学过的科学家们利用类似的核移植方法诞生的动物明星――多莉吗？（幻灯显示：克隆羊多莉诞生的过程图解）下面有哪位同学能结合图解，描述一下多莉的诞生过程？

生：学生回答，教师适当补充。

师：非常棒！小多莉虽然是由C羊生出来的，但多莉长得像谁？为什么？

生：像 B 羊，因为多莉的细胞核来自 B 羊。

师：结合前面的资料分析和多莉的产生过程，我们能看出生物体的性状遗传主要是由细胞核决定的。这与细胞核中的什么物质有关呢？

生：DNA，DNA 是遗传信息的载体，主要分布在细胞核中。

师：因此可以说，细胞核是遗传信息库。（板书：一、功能：遗传信息库）

师：以上的资料说明细胞核与细胞的遗传有关，那细胞核与细胞的代谢活动是否关系呢？我们看资料2。

生：读教材52页资料2。

师：（屏幕展示过程图解）结合图解能得出什么结论？

生：细胞核与细胞的分裂、分化有关系。

师：细胞核还与细胞其他的生命活动有关系吗？科学家用变形虫做了一个这样的实验。

生：认真阅读教材53页资料3。（学生边读，教师边播放图解）

师：既然无核部分即将死亡，有核部分能正常生活，为什么科学家还要将有核一半中的核钩出来，然后再移植回去，这样做的目的是什么呢？

（学生小组讨论）

生：这样做可以使实验更加严密，因为细胞质内有大量的细胞器，很可能通过切割使两部分的细胞器分布不均，造成了无核的部分没有细胞器也就不能再继续生存下去。

生：细胞质中也有少量的 DNA 和 RNA 在一定程度上也能影响生物体的生命活动。

师：回答的太棒了，那人的成熟红细胞还能生长分裂吗？为什么？

生：不能，因为没有细胞核。

师：综合这些资料，找同学概括一下，细胞核具有什么功能？

生：细胞核是细胞遗传和代谢的控制中心。（板书）

师：我们知道结构决定功能（板书），细胞核有如此重要的功能，它的结构又是怎样的呢？给同学们3分钟时间阅读课本53页细胞核的结构并完成学案（细胞核结构表格略）。

师：接下来给同学们5分钟时间，认真阅读54页第一自然段，看一下作为遗传信息载体的染色质和染色体有什么区别和联系，并完成学案（染色体与染色质比较的表格）。

总结：正是因为细胞核中储存着遗传信息这张蓝图，细胞才得以进行物质合成、能量转换和信息交流，完成生长、发育、衰老和凋亡。请同学们完成下面的概念图。

细胞核篇3

[关键词] 骨髓间充质干细胞；髓核细胞；共培养

[中图分类号] R681.5；R329 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2012）06-0006-04

Co-culture induces human bone marrow-derived mesenchymal stem cell differentiation and modulation of the nucleus pulposus cell phenotype

ZHAO Chencheng1 MA Xun2 ZHANG Ming1 MAN Xiaoxu1 GUAN Xiaoming1

1.Department of Orthopaedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Orthopaedics, Shanxi Academy of Medical Sciences & Shanxi Great Hospital, Taiyuan 030001, China

[Abstract] Objective To investigate the interaction between human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) and nucleus pulposus cells (NPCs) from both nondegenerate and degenerate discs during in vitro co-culture, and make a comparison. Methods The isolation and identification of BMSCs and NPCs were performed on bone marrow blood and nucleus pulposus from either disk degeneration patients or scoliosis patients. Five groups were designed as follows: A group (BMSCs group), B group (degenerated NPCs group), C group (nondegenerated NPCs group), D group (BMSCs with degenerated NPCs co-cultured group) and E group (BMSCs with nondegenerated NPCs co-cultured group). The mRNA expressions of collagen Ⅱ, SOX-9 and aggrecan of these two types of cells were assessed using quantitative real-time PCR after 7 days. Results Compared with A group, the mRNA expressions of collagenⅡ, SOX-9 and aggrecan significantly upregulated in D and E groups. Compared with E group, the mRNA expression was upregulated in D group (P ＜ 0.05). Compared with B group, the mRNA expression of D group increased (P ＜ 0.01). Compared with C group, the mRNA expression of E group also increased (P ＜ 0.01). Conclusion During co-culture process, the interaction between BMSCs and NPCs can stimulate BMSCs and differentiate to a NP-like phenotype; Compared with nondegenerate NPCs, co-culture with degenerate NPCs can more significantly stimulate BMSCs differentiating to a NP-like phenotype. At the same time, BMSCs can regulate both nondegenerate and degenerate NPCs.

[Key words] Bone mesenchymal stem cells; Nucleus pulposus cells; Co-culture

椎间盘退变导致的腰痛是骨科的多发病，临床常用的保守治疗以及手术治疗能够缓解症状，但并不能改变椎间盘退变的事实。目前，针对椎间盘退变的生物学修复的细胞移植治疗为治疗这一疾病提供了一种新的思路[1]。其中，通过移植骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）来延缓、修复椎间盘退变成为研究热点[2]。有学者已经在动物实验中证明，体外共培养时，BMSCs和髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）的相互作用能促使BMSCs向类髓核表型分化同时促进NPCs分化增殖和特征性物质表达。这为BMSCs移植治疗椎间盘退变提供了理论依据。本实验将人BMSCs分别与人正常及退变NPCs进行共培养，研究其类髓核分化效应及其对NPCs表型的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验主要仪器及试剂：5%CO2培养箱（Heraeus）、倒置相差显微镜（Olympus）、超净工作台（上海净化仪器厂）、Transwell小室（Corning）、PCR仪（Applied Biosystems公司7300）、FC500流式细胞仪（Beckman Coulter）；Ⅱ型胶原酶（Solarbio）、胰蛋白酶（Solarbio）、DMEM培养基（杭州四季青）、胎牛血清（杭州四季青）、PCR检测试剂盒（上海生工）。

材料：人退变椎间盘髓核组织来源于腰椎退变手术患者，正常椎间盘髓核组织来源于先天性脊柱侧弯手术患者，患者及其家属知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1 人NPCs的获得、培养及鉴定 无菌条件下取出髓核组织，2 h内送至实验室，PBS液洗净，超净工作台下将髓核与纤维环及纤维环交界区用眼科剪分离，将髓核剪碎至组织块＜1 mm×1 mm×1 mm，0.2%Ⅱ型胶原酶37℃水浴箱中消化2 h，PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶溶液37℃水浴箱中消化15 min，PBS洗涤3次。用添加20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，冲洗3次，加入培养液均匀吹打，计数后将细胞接种于底面积为25 cm2的培养瓶中，在37℃、体积分数5%的CO2培养箱中开始原代培养，隔2～3 d换液。原代培养细胞达到90%融合时，加入0.25%胰酶，加入少许培养液，用吸管吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。计数后将悬液按1∶2分装入培养瓶中继续培养。选取原代细胞行细胞爬片，进行Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定。

1.2.2 人BMSCs的获得、培养及鉴定 将采集的骨髓血加入等体积的添加20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，接种于底面积为25 cm2的培养瓶中，在37℃、体积分数5%的CO2培养箱中开始原代培养，每隔3 d半量换液。倒置相差显微观察。1周左右观察到细胞开始贴壁生长。此后每2～3天全量换液。待细胞接近90%融合后，以PBS冲洗2次，加入0.25%胰酶/0.02% EDTA溶液2 mL，静置于37℃培养箱孵育5 min，见细胞由梭形回缩为球形时加入FBS 2 mL终止消化，PBS洗涤离心2次，加入完全培养液重悬细胞后1:3传代到新的培养瓶中。选取第3代细胞，流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD44、CD14。

1.2.3 新式分层共培养模型的建立 取上述培养至第3代的BMSCs，接种于去掉挂臂的Transwell 6孔板底部（1×104个/cm2），将第3代NPCs接种于去掉挂臂的Transwell 6孔板上层插槽中（1×104个/cm2），中间以聚碳酸酯透水膜（孔隙0.4 μm）分隔（使细胞不能通过，但BMSCs分泌的细胞因子可以通过半透膜）。同时取普通6孔培养板，设置BMSCs单独培养组及NPCs单独培养组，各组细胞接种密度均为1×104/cm2。37℃、5%CO2的培养箱中培养，均培养至7 d。每3天换液1次。

1.2.4 RT-PCR法检测各组细胞相关基因的mRNA表达 收集各孔细胞，以Trizol试剂裂解细胞。抽提细胞总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录为cDNA，然后进行PCR扩增。RT-PCR分别扩增SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达量，引物由上海生工设计，序列如下：Ⅱ型胶原上游序列：5’-GCTCGCACCTGCAGAGACCTG-3’，下游序列：5’-GTCCACACCGAATTCCTGCTCG-3’；聚集蛋白聚糖上游序列：5’-ATGCCCAAGACTACCAGTGG-3’，下游序列：5’-TCCTGGAAGCTCTTCTCAGT-3’；SOX-9上游序列：5’-TCCTCAGGCTTTGCGATTT-3’，下游序列：5’-TGCTCGGGCACTTATTGG-3’；β-actin上游序列：5’-GGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’，下游序列：5’-GGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’。按照上海生工荧光定量PCR试剂盒说明进行两步法PCR扩增：stage1预变性，Reps：1，95℃ 30 s；stage2 PCR反应，Reps：40，95℃ 5 s，60℃ 30 s。

1.3 主要观察指标

①NPCs和BMSCs的形态观察及BMSCs细胞表面标志物的流式鉴定及NPCs Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定。②RT-PCR法检测各组细胞SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据用（x±s）表示，多个样本均数两两比较使用LSD-t检验，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察及鉴定结果

细胞培养1周左右开始观察到贴壁生长，贴壁细胞呈现长条形、漩涡形（图1）。取第3代细胞行流式细胞术鉴定细胞表面标志物，呈现高表达CD44、低表达CD14，符合BMSCs细胞特点[3]。取第3代细胞共培养7 d后，可观察到共培养组BMSCs较单独培养组细胞密度明显变大，细胞间伸出伪足相互接触。

2.2 NPCs形态学观察及鉴定结果

细胞培养3 d左右可见贴壁细胞。贴壁细胞呈现梭型、多角形（图2）。取第3代细胞行Ⅱ型胶原染色，结果阳性，符合NPCs特点[4]。取第3代细胞共培养7 d后，可观察到共培养组细胞在细胞密度上明显变大，细胞聚集生长，细胞间伸出伪足相互接触。

2.3 RT-PCR检测结果

共培养7 d后，与BMSCs单独培养组相比，共培养组的BMSCs的SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达明显增强（P ＜ 0.05），其中相较于BMSCs与正常NPCs共培养组，BMSCs与退变NPCs共培养组中BMSCs的SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达增强（P ＜ 0.05）（图3）。与NPCs单独培养组相比，共培养组NPCs的SOX-9、聚集蛋白聚糖Aggrecan与Ⅱ型胶原蛋白的mRNA表达明显增强（P ＜ 0.01）（图4）。

3 讨论

椎间盘退变首先是髓核细胞的退行性改变，表现为髓核细胞和细胞外基质Ⅰ、Ⅲ胶原增加，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原等物质减少，髓核细胞数减少且被成纤维细胞替代，从而导致含水量降低，椎间盘功能减弱、丧失[5]。于是椎间盘退变的细胞治疗主要集中在植入新细胞替代已退变髓核细胞的功能或修复原有髓核细胞的退变。BMSCs具有多向分化潜能，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等[6]，同时具有低免疫原性[6]及容易获得、扩增的特性。这些特性使得BMSCs成为移植治疗椎间盘退变理想的种子细胞。目前，体外研究多集中在摸索和研究刺激诱导条件，使人或动物的BMSCs向NPCs分化。其中研究BMSCs与椎间盘细胞共同培养，成为研究热点。

通过共培养来研究BMSCs修复退变椎间盘主要集中在两方面，其一为BMSCs对NPCs的调节作用的研究。共培养时，BMSCs对NPCs在细胞增殖、分化过程中起着重要的调控作用。Yamamoto Y等[7]将兔BMSCs与NPCs直接接触共培养，发现共培养后NPCs的细胞增殖、DNA合成、蛋白聚糖合成都较单独培养的NPCs有明显的上调。Richardson SM等[8]将人BMSCs与NPCs共同培养也获得了相似的结果。但由于细胞混合培养，纯化分选困难，会对结果造成干扰。方忠等[9]将骨髓间充质干细胞和正常髓核细胞分层共培养，同样证明骨髓间充质干细胞能促进髓核细胞增殖分化。以上结果表明BMSCs能通过对NPCs的调节作用，在椎间盘修复中起作用。但究竟BMSCs是通过何种途径对NPCs发挥其调节作用，目前尚无明确结论。其二为对BMSCs具有潜在的分化为类髓核细胞能力的研究。Sakai D等[10]把分离培养的BMSCs种植到Atelocollagen凝胶支架上，再自体移植到椎间盘组织中，结果显示移植后细胞存活并成功繁殖，发育成与椎间盘细胞相似的纺锤形细胞。将BMSCs与正常NPCs体外共培养发现[8]，BMSCs中髓核标记基因（SOX-9、aggrecan、Ⅱ型胶原等）表达显著增加，提示共培养时的相互作用能作用于BMSCs，使其发生类髓核分化，从而可能通过替代原有椎间盘细胞的作用来延缓以及修复椎间盘退变。但是目前的共培养研究多是正常NPCs与BMSCs共培养的研究。在临床实际应用中，均是对处于不同退变程度的椎间盘进行移植修复，髓核细胞的生物特性已经发生改变，BMSCs能否通过对NPCs的调节作用及实现类髓核分化修复退变椎间盘需要进一步研究。

本实验分别选用人正常以及退变的NPCs与BMSCs做共培养研究，更具有临床意义。结果显示BMSCs与退变NPCs共培养时依然有明显的调节作用以及类髓核分化效应，说明对于退变的椎间盘组织而言，基于细胞移植的治疗依然有效。这对于临床上开展通过BMSCs移植治疗椎间盘退变具有一定的指导意义。此外，与未退变的NPCs与BMSCs的共培养进行比较，结果显示退变的NPCs与BMSCs共培养时，其促进BMSCs向类髓核表型分化的能力更强，这进一步加强了对于临床上开展通过BMSCs移植治疗椎间盘退变的理论支持，同时这可能对于临床上将来开展BMSCs细胞移植的移植时机选择有一定意义。

本实验选用去掉挂臂的Transwell小室作为共培养的载体，该系统上层插槽底膜为聚碳酸酯透水膜（孔隙0.4 μm），这使BMSCs分泌的一些因子能够通过半透膜起作用，同时半透膜的存在又能将两种细胞分隔开来，利于细胞的观察以及之后细胞的分离和结果的检测。而去掉挂臂的Transwell小室较传统Transwell小室能够更有效地模拟椎间盘内的微环境，能使共培养的细胞之间充分接触，从而使细胞间的相互作用更加明显。

本实验所选取的样本例数偏少，大样本量的研究应该更具说服力。对于共培养时BMSCs与NPCs之间相互作用的具体机制并不清楚，接下来我们会针对细胞间相互作用的具体机制进行研究。

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细胞核篇4

【摘要】 目的 研究佛波酯 (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA) 对人食管癌细胞的影响。方法 细胞增殖试验采用MTT法和细胞计数的方法，细胞核形态的测量采用计算机辅助的图像分析系统，分别测量计算细胞核面积(NA)、核周长(NP)、最大直径(Dmax)、 最小直径(Dmin)、核浆比(NPA)、核轴比(NAR)、核形状因子(NRF)等。结果 TPA没有抑制人食管癌Eca109细胞增殖和改变细胞核形态。 结论 TPA对人食管癌Eca109细胞可能没有促分化作用。

【关键词】 佛波酯；食管癌细胞；细胞核形态

Effects of TPA on proliferation and nuclear morphometry of human esophageal cancer Eca109 cells

【Abstract】 Objectives To investigate the effects of 12-O-tetradecanoy lphorbol-13-acetate (TPA) on human esophageal cancer Eca109 cells. Methods The sensitivity of TPA to Eca109 cells was determined with MTT assay and counting cell numbers. After the cells were stained with HE，the measurements of nuclear morphometry were performed with computer-assisted image analysis system. Results TPA did not inhibit the cells proliferation and decrease the nuclear size. Conclusions TPA may not induce Eca109 cells to differentiate.

【Key words】 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)；esophageal cancer cell line；nuclear morphometry

Human esophageal cancer is one of the most common solid tumors in China. Due to its high metastatic potential and the frequent onset of resistance to chemotherapy，it is one of the major causes of death by neoplasia in the country. The present chemotherapy of cancer uses agents that are usually toxic to normal cells. On the other hand，induction of cellular differentiation may supplement the use of non-cytotoxic drugs in several forms of neoplasia，like the successful use of all-transretinoic acid (ATRA) in the treatment of acute promyelocytic leukemia.

Plant diterpine phorbol esters，particularly the phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)，are among the most potent tumor promoters known and their effects range from stimulating DNA synthesis through activating gene expression to producing alterations in membrane properties and constituents. TPA can also potentiate the differentiation of various tumor cells in culture and in vivo of human beings. TPA can induce differentiation and inhibit the growth of a number of malignant cell types，including myeloid leukemia［1］，breast［2］，prostate［3］，colon［4］，and brain［5］. Other report showed that TPA could not induce human hepatoca?

rcinoma cell line to differentiation［6］. Because of its efficiency in vivo［7］，we are interested in its effects on human esophageal cancer cells. Here，we report the effects of TPA on proliferation and nuclear morphometry of human esophageal cancer Eca109 cells.

1 Materials and methods

1.1 Chemicals TPA purchased from Sigma Chemical Co. was dissolved in ethanol and stored at -20℃.The stock solutions were diluted with Hanks’ buffered salt solution. The final concentration of ethanol in the incubation mixtures was 0.1% or less.

1.2 Cell Growth Studies Human esophageal cancer cell line Eca109 was kindly provided by professor Bai jingxiu，Zhengzhou University. The cells were maintained in RPMI 1640 medium with 10% fetal bovine serum (FBS) in the presence of antibiotics，penicillin (100 units/ml)and streptomycin (100units/ml). All cells were cultured at 37℃ in a humidified atmosphere containing 5% CO2. The medium was replaced after 3 days. The cells were routinely subcultured twice a week.

Cells were plated in either flasks (25cm2) or 96-well plates. TPA was added 24 hours after seeding，when the cells were attached to the surface of the containers. An equivalent volume of ethanol was added to the controls and had no effect on growth. After removing the cells from the flasks by trypsinization they were counted using a hemocytometer，fixed with 70% ethanol and stained by H.E. When the cells were plated into a 96-well microplate，the culture medium containing different concentrations of TPA was replaced 24 hours later. After 3-5 days of incubation，cell viability was evaluated by MTT assay.

1.3 Nuclear morphometry measurements Measurements of nuclear morphometry including nuclear area (NA)，nuclear perimeter (NP)，maximal diameter (Dmax)，minimal diameter (Dmin)，nuclear plasma ratio (NPR)，nuclear axis ratio (NAR)，nuclear roundness factor (NRF)，were performed with computer-assisted image analysis system MPIAS-500 (QingPing Image Engineering Company，Tongji University). Two fields were selected at random from each case for the measurements. Each field was viewed under a ×100 oil-immension lens and displayed on the screen of a color video image processor. The images of 50 nuclei of the tumour cells per field were outlined with a drawing pen，and the data were processed by a computer in the system，which calculated the parameters. In the end all the mean values of each case were calculated.

1.4 Statistical Analysis The data were expressed as means±SD. Statistical analysis was performed by SPSS 10.0 software. The criterion for statistical significance was taken as P <0.05.

2 Results

Effect of TPA on cell Growth. The growth of Eca109 cells was not arrested by TPA at non cytotoxic concentrations. As shown in Table 1 and Fig.1，TPA even increased the cancer cell numbers，though there were no significance between TPA groups and the controls.

Table 1 Cell numbers of TPA treatments onEca109 cells (x±s)

Fig.1 MTT assay of TPA treatments on Eca109

cells.TPA concentration was 1.6×10-8 mol/L

The nuclear features were measured on microphotographs using a commercially available software. Table 2 summarizes the results. TPA might decrease the cells size but no significant difference with the control group.

Table 2 Measurements of nuclei morphometry after TPA treatments (x±s)

3 Discussion

Our results show that Eca109 human esophageal cancer cell is a cell type which does not respond to exposure to TPA by growth arrest (Table 1 and Fig.1). A marked change in cell morphology was not observed. On comparison of the different human cell systems in which phorbol esters cause growth arrest，the behavior of the Eca109 cells appears to resemble that of SMMC7221 human hapatoma cells［6］ and HT29 human colon cancer cells［8］. Even in T cell leukemia TPA could induce Jurkat and Molt3 cells to differentiate but could not induce CCRF-CEM and CCRF-HSB2 cells to differentiate. The reasons are not known.

Morphometric analysis has been used successfully as a diagnostic and prognostic criterion in patients with malignancies［9］.Many investigators have sought an accurate and reproducible parameter that will allow accurate prediction of adjunctive immunotherapy or chemotherapy when appropriate［10］.These morphometric studies have provided valuable information. We used quantitative morphometry to investigate the shape difference of neoplastic nuclei from esophageal cancer cells with or without treatment of TPA. TPA did not clearly change the shape of the cells nuclei，but it did change other cells’ nuclei which were found in our laboratory (data not shown). This result is possibly consistent with that of TPA on cells proliferation. When TPA induces tumor cells to differentiation，it has antiproliferation function. If tumor cells proliferate actively，differentiation may stop at least temporarily. The reasons that TPA did not influence the proliferation and nuclear morphometry of esophageal cancer cells are possibly connected to the diversity and cellular distributions of protein kinase C (PKC) on the cells. Protein kinase C (PKC) is a family of phospholipid-dependent serine-threonine kinases that play important roles in the signal transduction and in the regulation of cell growth and differentiation［11］.At least eleven isoforms of PKC have been isolated so far，showing diversity in their structures，cellular distributions，and biological functions［12］.PKC is also the receptor for the potent tumor-promoting phorbol esters，which can substitute for DAG in PKC activation. Reports also showed that different PKC subtype was involved in the differentiation of different tumor cells during TPA treatments［13］. Therefore，the distributions and the activity of PKC in Eca109 cells might be different with other tumor cells and have different signal transduction systems. So TPA might have different effects on different tumor cells. Further studies about the distributions and active status of PKC subtypes on human esophageal cancer cells may not only provide useful information on selection effective differentiation-inducers but also contribute to elucidation of the molecular mechanism involved in their differentiation and tumorigenicity.

References

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9 Hamilton PW，Wyatt JI，Quirke P，et al. Morphometry of gastric carcinoma：its association with patient survival，tumour stage，and DNA ploidy. J Pathol，1992，168(2)：201-208.

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细胞核篇5

[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构

[中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-40-04

一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。核移植（NT）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代。随着胚胎工程技术的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培育出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有标志意义的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上报道了他们利用体细胞核移植技术，用成熟绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一实验充分证明了高度分化的体细胞仍然具有全能性，人们可以利用体细胞，通过体细胞移植技术获得基因型与供体细胞基因型基本相同的子代个体。成为了生物学以及遗传学发展史上一个重要的里程碑事件。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等用卵丘细胞作为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的应用研究提供了方法。应用这项技术，2006年我国学者李善刚博士应用成纤维细胞作为核供体成功地培育出克隆家兔，在此基础上他又进一步将转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，成功培育出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技术推向新的高度。

1体细胞核移植的主要方法

具体来讲，体细胞核移植技术主要包括受体细胞的去核、核供体细胞的准备与选择、细胞周期的调控、细胞融合、重组胚胎细胞的激活以及培养等步骤。

1.1受体细胞的选择

在哺乳动物体细胞核移植的实验中，可以作为受体的细胞主要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母细胞；（3）去核的早期胚胎细胞，其中MⅡ期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需要的各种细胞因子在MⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分充足。在细胞分裂过程中，结合在DNA上的各种细胞因子如转录因子等从DNA螺旋轴上脱离下来，与此同时胞质中的大量重组因子即可与DNA螺旋轴结合，从而促进基因重组的发生。另外一方面，因为选择合适卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否能够成功产生巨大的影响，故细胞培养的时间也特别重要，实验中一般多选择培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为大量的实验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。

1.2受体细胞去核的方法

先要对受体细胞进行去核，才能进行供体核的移植。受体细胞去核必须完全，如果去核不完全，一方面可能导致重组的胚胎细胞染色体形成非整倍体或多倍体从而使克隆直接失败，另一方面也可能使卵母细胞产生异常分裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的早期死亡从而使克隆最终失败。所以是否完全使卵母细胞去核，是保证核移植所形成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个体的前提条件。为了减少实验中的干扰因素，可以通过缩短体外操作的时间并快速而准确的去除受体细胞核以避免孤雌发育。大体上受体细胞去核的方法可以分为两种方法，即化学去核法和机械去核法。具体有以下几种操作方法（1）盲吸法：这一方法的优点是不用借助于其他的化学物质，但此法耗费时间较长、易影响细胞质空间结构故对卵母细胞损伤比较严重，所以技术要求较高，不同动物去核率相差也较大，应用较少；（2）半卵法：这个方法是应用特制的卵母细胞切割刀，将卵母细胞切割成为两个半卵，然后丢弃含有极体的那一半半卵细胞，用两个不含极体的半卵细胞与供体细胞核进行融合，构建核移植胚胎。（3）化学试剂去核法：这种方法的原理是利用蔗糖或者脱羰秋水仙碱等化学试剂的作用，使受体细胞能够自行排出第二极体，从而实现去核的目的，但目前还不清楚化学试剂是否对受体细胞造成损伤；（4）挤压法及点压法：此两种方法均是利用固定管固定住细胞，使细胞染色于特定位置，然后挤压透明带，用去核针取出第一极体，再用荧光染料Hoechest33342染色后观察其去核率。点压法是挤压法的改进方法，优点是对卵母细胞胞质的损伤较小，在去核操作的过程中不用更换去核针，节省了时间，有效的提高了去核效率；（5）纺锤体探测技术：此法去除细胞核的方法是将卵母细胞放置于Spindle-view偏振光系统的倒置显微镜下，受体卵母细胞的纺锤体区域较其它部位明亮，从而清楚显示其染色置，而后再用去核针通过显微镜下操作去核，以利于去核的操作准确完全。（6）透明带膨胀辅助去核法：此法是先用去核针吸入适量操作液后稍施正压，使吸入的操作液平缓流出，推进去核管，使透明带逐渐膨胀，然后用去核针将细胞核取出，此法的优点是缩短了去核操作的时间并且显著地提高了去核操作后卵母细胞的生存率。（7）离心去核法：这个方法的原理是根据细胞质的密度小于细胞核，通过离心的方法将没有透明带的细胞核甩向一侧进而脱离卵母细胞。该方法的缺点是必须去除透明带，不利于之后核移植胚胎的发育。

1.3供体细胞选择与核的移植

实验中可用于核供体的细胞很多，主要有胚胎干细胞（ES细胞）、卵丘细胞、颗粒细胞、支柱细胞、细胞、乳腺细胞、神经细胞以及成纤维细胞等，其中最主要的是两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。影响核移植成败的一个重要因素是受体与供体细胞的细胞周期同步化发育，早期的研究认为要使体细胞核移植成功必需使供体细胞处于GO期，获得GO期细胞主要是通过两种方法：选择细胞类型或者人工诱导的方法。Inoue等研究人员在小鼠的核移植实验中发现，移植的效率较大的受到供体细胞的细胞类型以及其基因型的影响。近年来许多科研人员通过实验发现把没有经过休眠诱导的处于细胞周期中G1期、G2期以至于M期的细胞作为供体细胞进行核移植也可以获得成功。将供体细胞核移植进入受体细胞的常用方法主要可分为融合法以及注射法两类。其中融合法中目前最常用的是电融合的方法，这是因为电融合的方法具有细胞损害较小、可重复性好而且融合的效果较好等明显的优点，所以逐渐被广大的研究人员所应用。电融合方法的原理是通过细胞在强电场短时间的作用下，使细胞膜产生一过性的击穿，当电流使两个相邻的细胞膜接触的区域发生击穿时，两侧的细胞膜就可以在击穿的瞬间发生接触并融合成为一个细胞。注射法一般分为透明带下注射和胞质内注射。透明带下注射是把整个供核细胞注射至受体细胞卵周隙，这就需要在注射后还需使供体细胞与受体细胞进行融合。胞质内注射一般是用压电一陶瓷微注射系统，直接把供体核注入胞质内。

1.4卵母细胞的激活

因为缺少了受精这一步骤，在以成熟的卵母细胞作为受体的核移植实验中，缺少了自然受精过程中受精卵的激活过程，所以必须进行人工激活核移植后重构的卵母细胞从而促使其进一步分化发育。根据激活时期的不同，可分为移核前激活、移核时激活、移核后激活三种不同的时期。使卵母细胞激活的方法可以分为化学或者物理刺激的方法两类。激活方法目前应用较多的有钙离子载体A23187激活和离子霉素激活、乙醇激活、蛋白质合成抑制剂激活、氯化锶激活、提取物激活、蛋白质磷酸化抑制剂激活以及电脉冲激活、联合激活等。虽然卵母细胞可以被以上的各种化学物质以及物理刺激的方法激活，但是却不可避免地在激活的同时也造成受体细胞一定程度的损害，影响胚胎的发育。所以，是否能够尽快地探索出对卵母细胞损伤较小并且激活效率高的激活方法对体细胞核移植技术最终能否成功尤为重要。

2体细胞核移植技术的应用前景

体细胞核移植技术作为细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，应用前景必然是特别广阔的甚至是我们一时无法估量的！其潜在的经济效益是十分巨大的，随着这项技术的不断发展、逐步完善，必将带来生物学以及医学领域的一场深刻变革。这项技术在生物学方面如在保护濒危动植物物种、新物种的培育、优良畜种培育以及转基因动植物生产方面前景十分广阔。另外，这项技术在医疗卫生领域同样具有巨大的应用潜力和发展前景。尤其在医疗卫生领域，可能为机体损伤修复、器官移植乃至遗传性疾病、老年性疾病的治疗等打下坚实的基础，有着不可估量的作用，所以值得科研人员持续关注并为体细胞核移植技术的不断完善发展付出不懈的努力。

3目前存在的问题

细胞核篇6

【摘要】  目的  探讨经自体外周造血干细胞移植治疗急性单核细胞白血病的疗效。方法  1例14岁急性单核细胞白血病患者接受自体外周造血干细胞移植。采用粒细胞集落刺激因子（g-scf）动员外周血干细胞, 预处理选用环磷酰胺（ctx）和马利兰(myleran)。0天回输单个核细胞。观察症状体征变化及造血重建情况。结果  动员获得单核细胞数为4.98×108/kg, +12d粒系植入, +16d巨核系植入。结论  自体外周造血干细胞移植治疗急性单核细胞白血病有效。

【关键词】  自体造血干细胞移植  急性单核细胞白血病

        急性白血病是造血组织中某一血细胞系统过渡增生，侵润到各组织器官，从而引起一系列临床表现的恶性血液病。造血干细胞移植是至今为止治疗血液系统恶性疾病最有效的方法之一,也是目前唯一可能根治多种血液恶性疾病如白血病的治疗手段。我院于2010年7月为1例急性单核细胞白血病患者进行自体外周造血干细胞移植, 目前移植后18d, 效果良好, 现报告如下。

        1  资料和方法

        1.1病例资料  患者，女，14岁。主因“确诊急性单核细胞白血病10月”入我院，患者于2009年10月因发热、关节疼痛，查血常规 wbc 24×109/l、血红蛋白 85g/l、血小板 20×109/l，骨髓象示急性单核细胞白血病。给予da方案化疗4次，症状消失，血常规及骨髓象均获完全缓解。

        1.2 自体外周造血干细胞动员、采集与纯化  给予粒细胞集落刺激因子(g-csf)150ug×5d后，用cs-3000血细胞分离机采集外周血，每次分离12000ml外周血，得单个核细胞3.24×1010个，将其置于10%二巯基乙醇、20%人血白蛋白、70% imdm保养液中，于-196℃液氮中冻存。

        1.3 具体方案  我院采用bycu方案：myleran 1mg/(kg·d)×4d, d-8～d-5，ctx 60 mg/(kg·d) ×2d, d-4～d-3，于0 天回输自体外周造血干细胞, 回输单个核细胞数4.98×108/kg。细胞活性为92.3%。

        1.4 支持治疗  预处理同时给予水化碱化及美司钠预防出血性膀胱炎，止吐、镇静、保肝、营养心肌等支持治疗。移植后给予静脉营养、浓缩红细胞悬液和单采血小板等支持治疗。

        2  结果

        2.1 造血重建  患者于移植后+3d外周血白细胞降至0.13×109/l, 持续3天，移植后12d 外周血白细胞1.14×109/l、中性粒细胞0.61×109/l，中性粒细胞植入(>0.5×109/l) , 16d血小板39×109/l，血小板植入(>30×109/l),脱离红细胞和血小板输注。

        2.2 预处理后不良反应及应对  移植前-3d～-1d, 患者心率100-125次/分，移植后+9d～+14d心率100-110次/分，考虑为环磷酰胺副作用及贫血所致，给予营养心肌及输血治疗后好转。患者于移植后+9d口腔黏膜出现溃疡，给予口泰、碳酸氢钠、碘甘油、雾化吸入交替局部治疗，3天后溃疡愈合。患者未出现发热、出血性膀胱炎等不良反应。

        3  讨论

        造血干细胞移植（hsct）是对骨髓功能摧毁或原发缺陷的患者静脉输注造血干、祖细胞以重建骨髓功能的一种治疗手段。自体外周血干细胞(pbsc)是骨髓造血重建重要的干细胞来源。其主要具有以下优点：（1）无供者来源问题；（2）无移植物抗宿主病，并发症少，移植相关死亡率低；（3）费用较低。

        近年来, aml预后得到显著改善。目前按细胞遗传学特性将aml分为高、中、低危三组。aml中的低危组,预后良好,不必在第一次完全缓解（cr1）期移植,可在复发或第二次完全缓解（cr2）期时进行移植；aml中的高危组, 化疗的长生存率很低, 应尽早在cr1期移植；aml染色体核型正常者,为中危组,亦推荐在cr1期进行造血干细胞移植。对1或2个疗程诱导不能完全缓解的aml患者,也应尽早进行造血干细胞移植。aml患者在cr1后,经适当巩固强化治疗如无hla匹配同胞供者,应争取行auto-hsct。

        结合上述理论，我院对该患者进行了自体外周血干细胞移植，预处理bucy方案选择恰当，且通过积极全面的支持治疗，未出现化疗后不良反应。移植后的造血恢复良好, 粒系于移植后12d植入, 巨核系于移植后16d植入。通过本例移植，我们认为，在aml患者身体状况良好，无明显心肝肾等疾病，且无hla配型相合供者的情况下，可考虑自体干细胞移植，这给部分aml患者提供了一个新的治疗方案。 

参 考 文 献

[1] 徐岚,胡炯,等.造血干细胞移植治疗血液恶性肿瘤的生存分析 [j].肿瘤,2007,27(4):312.

细胞核篇7

摘要在CIK细胞的培养过程中加入卡介菌多糖核酸，研究其对CIK细胞体外增殖及杀瘤活性等方面的影响.CCK8检测结果发现低浓度卡介菌多糖核酸处理的CIK细胞相比对照组（生理盐水），细胞增殖能力和杀瘤效果都显著上调.RTqPCR结果显示卡介菌多糖核酸处理后的CIK细胞毒活性相关因子（Granzyme B， IFNγ， TNFα和TNFβ）mRNA的表达相比对照组都有提高.这些结果可为培养具有更高效杀瘤活性又能大量扩增的CIK细胞提供新思路.

关键词卡介菌多糖核酸；CIK；细胞增值；杀瘤活性

中图分类号Q78文献标识码A文章编号10002537（2017）02003306

The Impact of BCGPSN on the Activity of CIK Cells

HUANG Zhaoqin1， SU Renxiang1， ZHONG Beifen1， HAN Huimin2， GU Zhixin2， YAN Donglan2， XIN Xiu2， YUAN Li2， HU Xiang1，2*

（1.Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of State Education Ministry of China，

College of Life Science， Hunan Normal University， Changsha 410081， China；

2.Jiuzhitang Limited Share Company Postdoctoral Workstation， Changsha 410205， China）

AbstractThe BCG polysaccharide and nucleic acid （BCGPSN） was added to CIK cells to study CIK cells responses on the proliferation and tumoricidal activity in vitro. CCK8 results showed that the CIK cells treated with low dose BCGPSN， compared with control group （normal saline）， were significantly enhanced on the proliferation and tumoricidal activity. RTqPCR results revealed that the expression of CIK Granzyme B， IFNγ， TNFα， TNFβ mRNA of BCGPSN group was higher than that of the control group. These results lay the foundation for how to cultivate a large number of CIK cells with high tumoricidal activity， and provide new ideas for the therapy of antitumor adoptive immunity.

Key wordsBCGPSN； CIK cell； cell proliferation；tumoricidal activity

盒灾琢鲅现匚：θ死嘟】担目前常规的手术和放化疗治疗方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，过继免疫治疗法因具有符合生理、低毒和高效等优点成为重要的肿瘤辅助治疗手段[1].其中，细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinduced killer cells， CIK细胞）是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤免疫治疗领域的一种新选择[24].CIK是以CD3+CD56+ T细胞为主的异质细胞群，兼有 NK 细胞和 T 细胞的特征.在功能上，CIK 一方面拥有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有 NK 细胞非 MHC 限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微[5].CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于多种外源性细胞因子的刺激，但何种因子组合为最佳尚无定论，因此研究如何进一步提高CIK的增殖和杀瘤活性已经成为抗肿瘤的过继免疫细胞生物治疗的一个热点[6].

卡介菌多糖核酸（BCG polysaecharide and nucleis acid，BCGPSN）是在卡介苗的基础上，通过热酚法提取卡介菌中的多糖、核酸，混合而制成的免疫活性物质，是我国首创的具有自主知识产权的新型免疫调节剂[78].BCGPSN 能诱导多种免疫细胞的活化，调节多种细胞因子的分泌，可作为一种较好的肿瘤辅助治疗手段[9].

由于卡介菌多糖核酸能提高机体免疫力并且辅助提高肿瘤治疗效果，同时CIK细胞亦是肿瘤过继免疫治疗的有效方法，且国内外还没有BCGPSN联合CIK进行研究的相关报道，因此本课题将两者结合起来研究.为研究卡介菌多糖核酸的生物活性及药理作用，在CIK细胞的培养过程中加入卡介菌多糖核酸，研究其对CIK细胞的体外增殖及对肝癌细胞的毒活性（杀瘤活性）方面的影响，并且探讨其对CIK细胞毒活性相关因子表达的影响.

1.材料与方法

1.1材料

淋巴细胞分离自健康志愿者外周血.SMMC7721肝癌细胞系于上海中科院购买，本实验室长期保存.斯奇康卡介菌多糖核酸注射液（1 mL/支）购自湖南九芝堂制药公司.人血液淋巴细胞分离液购自佳和生物.采血针、采血管、生理盐水购自长沙市第四人民医院.人源CD3单抗购自北京同立源生物科技有限公司，人白介素（IL2）买自江苏金丝利药业有限公司.DMEM培养液、RPMI1640和GTT551培养液，以及胎牛血清均为美国Gibco公司产品.青霉素链霉素溶液产自碧云天.

1.2方法

1.2.1CIK细胞分离及原代培养采集健康志愿者血液20 mL，平衡温度至室温.取50 mL离心管若干，将血样转移至离心管，用生理盐水稀释至30 mL，充分吹打均匀.将稀释后的血样缓缓加入另一管装有15 mL 淋巴细胞分离液的上方，形成上下两相.22 ℃，390 g离心30 min（加速1，刹车0）.离心后血浆层与分离液之间有白膜层可见，分别收集上层血浆和中间白膜层至新的离心管.于收集白膜层的离心管中加入RPMI1640至45 mL，混匀，22 ℃，1 000 g离心10 min（加速9，刹车9）.重复上一步骤两次，离心速度分别改为400 g和201 g，最后一次离心之前取20 μL混匀的细胞悬液进行台盼蓝染色计数，参照《细胞计数SOP》.离心后重悬细胞，按细胞数5×106个/mL加含有500 μg/L CD3 mAB， 1 000 U/mL IL2和10%FBS的GTT551培养基诱导培养成CIK细胞.

1.2.2肿瘤细胞培养在37 ℃，5%CO2及90%相对湿度的细胞培养箱中用DMEM完全培养液（含10%胎牛血清和100 mg/L青链霉素溶液）培养SMMC7721细胞.

1.2.3CCK8 检测细胞增殖活力将培养7 d的CIK细胞数调整至2×106 个/mL，于96 孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液50 μL，设实验组和对照组，对照组为生理盐水组，实验组分为5组，分别加入卡介菌多糖核酸终浓度为1，10，50，100，200 mL/L的培养基各50 μL，每个浓度4个平行对照孔，置于细胞培养箱中处理细胞72 h，加入10 μL CCK8溶液，4 h 后用酶联免疫检测仪检测OD450值A（吸光度的大小与活细胞的数量呈正比）.并对数据进行统计学分析.以BCGPSN 浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，作细胞增殖曲线.

1.2.4肿瘤杀伤实验将培养9 d的CIK细胞均分为两组，分别为对照组和实验组，对照组为生理盐水组，实验组为培养基终浓度为10 mL/L的卡介菌多糖核酸，置于细胞培养箱中处理细胞72 h（至12 d）.另外，在CIK细胞培养11 d时，将培养至对数生长期的SMMC7721细胞调整细胞密度为1×105 个/mL，于96孔板中铺板每孔100 μL细胞悬液，培养箱中培养24 h.CIK培养至第12天进行CIK杀伤肿瘤细胞实验，弃去SMMC7721旧的培养液，分别按n（效应细胞）/n（靶细胞）为5∶1，10∶1和20∶1调整两组CIK细胞至相应数目加入SMMC7721细胞孔中，每个比例3个复孔，同时设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，于细胞培养箱中培养4 h. 4 h后每孔加入10 μL CCK8溶液，细胞培养箱中孵育4 h，酶标仪测定OD450值A.计算杀伤率：杀伤率（%）=[1-（实验组A值-单独效应细胞组A值）/单独靶细胞组A值]×100%.

1.2.5细胞总RNA的提取及cDNA的合成

（1）卡介菌多糖核酸处理CIK细胞：调整培养至第9天的CIK细胞数目至2×106 个/mL，于6 孔平底细胞培养板每孔加入细胞悬液1 mL，设实验组和对照组，实验组加入卡介菌多糖核酸终浓度为10 mL/L的培养基1 mL，对照组加入生理盐水，置于细胞培养箱中培养72 h.

（2）RNA提取及反D录：按TRIZOL法提取CIK细胞总RNA，按照Takara反转录试剂盒说明书操作，将RNA反转录成cDNA.

1.2.6实时定量PCR

（1）引物的设计与合成：根据GenBank中基因的序列，查找文献并用Primer Primer 5 软件设计CIK相关毒活性因子Granzyme B，TNFα，TNFβ，IFNγ，Actin（内参）基因引物（见表1）.将设计好的目的引物序列发给上海生工公司合成.

（2）引物验证：引物合成后，加入灭菌水溶解至10 μmol/L.先做一个普通PCR检测引物是否能克隆出目的片段，PCR反应体系如表2，按照体积从大到小加溶液至总体积为20 μL.

PCR体系加完后用枪轻轻混匀，放入PCR仪扩增片段.扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，重复29个循环，最后72 ℃延伸5 min.用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应完成后产物.

（3）荧光定量PCR：反应体系见表3，共30 μL，具体操作按照Takara SYBR RTqPCR产品说明书进行.

1.2.7统计分析数据以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件及Graphpad软件进行方差及显著性分析，检验水准（P）设为0.05.

2结果与分析

2.1CIK细胞形态观察

CIK细胞即细胞因子诱导的杀伤细胞，它是从人血液分离出来的单核淋巴细胞经IL2和CD3单抗等细胞因子诱导培养产生的以CD3+CD56+ T细胞为主的异质细胞群.CIK是一种悬浮细胞，相比癌细胞其体积较小.经过适应期的CIK细胞随着培养时间延长，细胞数量对数生长且会形成细胞球，细胞体积在7～12 d时有所增大，之后几乎不变.图1是显微镜下不同时期的CIK细胞形态，A～D分别对应从人血中分离后培养至1，4，7，11 d的CIK细胞.

2.2卡介菌多糖核酸对CIK细胞增殖的影响

在CIK细胞培养至第7天时，加入不同浓度的卡介菌多糖核酸处理细胞72 h，然后用CCK8试剂盒检测CIK细胞活性.分析数据结果，以不同BCGPSN浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作量效曲线图，结果如图2所示.由图可知，随着BCGPSN浓度的增加，吸光度呈现先升后降的趋势，在BCGPSN浓度增加到10 mL/L时，CIK活细胞数目最多，吸光度最大且明显高于未加药组，统计分析差异有意义（*p

2.3卡介菌多糖核酸对CIK细胞杀伤活性的影响

为了验证卡介菌多糖核酸对CIK细胞杀瘤活性有影响，笔者将培养至第9天的CIK细胞加入卡介菌多糖核酸处理72 h（至12 d），再进行CIK杀伤SMMC7721肿瘤细胞实验.杀伤率统计结果如图3.结果显示，无论是实验组还是对照组，随着效靶比增大CIK细胞杀伤肿瘤效果增强；相比对照组，实验组CIK细胞在效靶比为5∶1和10∶1时杀伤率有显著提高（*p

2.4BCGPSN对CIK细胞毒活性相关因子RNA表达的影响

收集生理盐水和10 mL/L的卡介菌多糖核酸处理72 h的两组CIK细胞，提取RNA反转录成cDNA，做荧光定量PCR检测CIK细胞毒活性相关因子的表达.琼脂糖凝胶电泳检测CIK细胞RNA质量，可看到28S和18S两条清晰的带，如图4.RTqPCR结果显示BCGPSN实验组CIK细胞Granzyme B（颗粒酶B），TNFα，TNFβ的mRNA表达量较对照组明显升高（*p

Mark：DNA standard marker；1：对照组CIK细胞RNA；2：BCGPSN实验组CIK细胞RNA.

3讨论

卡介菌多糖核酸是从卡介菌中提取的核酸、多糖等活性物质混合而成的免疫增强剂，具有调节机体免疫水平、增强机体抗感染和抗过敏的能力[10]，还可促进T 淋巴细胞的增殖与活化及辅助提高机体内NK杀伤活力[11].於敏等[12]研究表明卡介菌多糖核酸能显著提高断奶仔猪外周血淋巴细胞分化增殖，推测其可通过直接作用于外周血淋巴细胞从而增强个体免疫力.本研究结果表明低浓度卡介菌多糖核酸可显著促进体外培养的CIK细胞增殖分化，而在机体免疫应答过程中，T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活、分化、增殖起着重要的作用，因此，卡介菌多糖核酸或可通过直接作用于人周血淋巴细胞从而增强机体免疫力.

卡介菌多糖核酸影响CIK细胞的体外增殖及CIK杀伤肝癌细胞的特点尚无报道.SMMC7721肝癌细胞为本实验室常用细胞系，材料易得且细胞个体大、生长较快易于实验，因此在此文中笔者选择其作为CIK的靶细胞进行杀伤实验.研究发现经BCGPSN处理后的CIK细胞相比对照组杀瘤效果有明显增加，在效靶比为5∶1和10∶1时杀伤率有显著提高，在靶效比为20∶1时杀伤率也比对照组稍高，表明卡介菌多糖核酸能提高CIK的杀伤能力.

CIK杀伤肿瘤细胞的具体机制还并不清楚，根据之前相关的文献报道，笔者猜测可能与相关毒活性因子的表达相关，于是做荧光定量PCR检测了实验组和对照组处理后的CIK细胞Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ的表达，结果发现这几类因子的RNA表达水平的确有所提高.Granzyme B，TNFα，TNFβ和IFNγ这几种因子在CIK细胞杀瘤过程中发挥着重要作用，本研究也证实了其RNA表达升高促进了CIK杀瘤效果.为了进一步验证它们在蛋白水平的表达，后续将购买TNFα和IFNγ的ELISA试剂盒以检测其在CIK细胞的胞外分泌情况.

颗粒酶B（Granzyme B）是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞颗粒中丝氨酸蛋白酶家族中发挥杀伤作用的主要效应分子，它能进入靶细胞，激活caspase级联反应，迅速引起靶细胞DNA的断裂，使细胞快速凋亡[13].因此，它是杀伤细胞的标志性分子之一.

肿瘤坏死因子 （Tumor Necrosis Factor， TNF ）是一类重要的细胞因子，包括TNFα和TNFβ两类，TNFα由巨噬细胞和淋巴细胞分泌产生，而TNFβ则由活化的T细胞分泌[14].TNF具有广泛的生物学活性，对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，还能刺激T细胞、B细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞使其功能增强.本研究结果显示，相比生理盐水对照组，卡介菌多糖核酸能显著提高TNFα及TNFβ的mRNA表达量.

γ干扰素（Interferonγ，IFNγ）是I型o助T细胞（Th1细胞）的标志性细胞因子，能抑制肿瘤细胞分裂，增强巨噬细胞及 NK 细胞的杀伤性.另外γ干扰素还可增加巨噬细胞对抗原的吞噬，调动机体免疫系统，提高NK细胞对靶细胞的杀伤以及T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活，增强机体抗肿瘤免疫应答能力[15].

CIK是目前应用最广泛的肿瘤过继免疫治疗细胞，因其治疗效果与细胞输注剂量、效应细胞比例和对肿瘤细胞毒性有着密切关系，因此提高其体外的增殖效率和毒性是首要解决的问题.本研究证实低浓度下的卡介菌多糖核酸能促进CIK细胞增殖，又能提高CIK的杀瘤效果，说明卡介菌多糖核酸可以作为一种较好的肿瘤辅助治疗药物.另外CIK细胞杀瘤效率提高的同时相关毒活性因子的表达也增加，揭示其可能是杀伤肿瘤细胞的途径之一，这也为进一步研究CIK杀伤肿瘤细胞机制奠定基础，为抗肿瘤过继免疫治疗提供一些新思路.

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细胞核篇8

【摘要】 目的： 研究CD147， VEGF在单核细胞来源的泡沫细胞中的表达动力学的， 探讨CD147，VEGF与动脉粥样硬化的关系. 方法: 以氧化型低密度脂蛋白诱导，建立人单核细胞系（U937细胞）分化的泡沫细胞模型， 通过油红O特殊染色的形态学鉴定. 将U937 细胞在不同浓度氧化型低密度脂蛋白（oxLDL， 0，25，50，100，200 mg/L）条件下培养48 h；在100 mg/L oxLDL条件下，在培养的不同时间点（0，6，12，24，48 h）分别收集泡沫细胞和培养上清，采用流式细胞术检测细胞膜表面CD147，ELISA检测培养上清中VEGF的表达和RTPCR检测mRNA表达水平. 结果: CD147及VEGF表达出现最高峰时的oxLDL浓度分别为25 mg/L和50 mg/L；与100 mg/L的氧化型低密度脂蛋白作用6， 48 h后，CD147，VEGF表达分别出现最高峰；VEGF mRNA水平出现最高峰时，oxLDL作用浓度及时间分别为200 mg/L，48 h. CD147mRNA水平出现最高峰时oxLDL作用浓度及时间分别为25 mg/L，6 h，此后，mRNA水平不变. 结论: VEGF及CD147在单核细胞来源的泡沫细胞表达均升高; CD147表达上调早于VEGF，低浓度oxLDL促进CD147表达，高浓度促进VEGF的表达; U937泡沫细胞中VEGF的mRNA水平与oxLDL的作用浓度及时间成正相关，泡沫细胞中CD147的mRNA与oxLDL的作用浓度及时间无关.

【关键词】 CD147；血管内皮生长因子类；泡沫细胞；动脉硬化

0引言

泡沫细胞（foam cells）是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，其主要来源有两个，一是血液单核细胞，二是血管中膜平滑肌细胞. 一般认为在动脉粥样硬化形成的早期，血液中单核细胞进入内皮下间隙，在内膜下被氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、炎性介质等激活后分化为巨噬细胞，后者通过其表面的清道夫受体吞噬oxLDL形成泡沫细胞，并逐渐演变成脂纹及粥样斑块［1］. 动脉粥样硬化不仅是脂代谢紊乱的过程，也是炎症反应的过程. 因此，泡沫细胞是粥样斑块中重要的炎症细胞［2］. 长期的慢性炎症性疾病可导致机体内免疫分子、炎症因子等炎性介质水平明显升高［3］. 不但可调节机体免疫反应，而且能够作用于外周组织导致一系列致动脉粥样硬化代谢功能改变［4］. 研究表明，在泡沫细胞形成过程中CD147分子及VEGF的表达上调. 此外，新近在动脉粥样硬化斑块中也检测到CD147分子及血管内皮生长因子（VEGF）等炎症介质， 提示其可能参与了动脉粥样硬化的发生［5-6］. 鉴于CD147分子及VEGF在炎性斑块中的作用，且目前鲜有对其在泡沫细胞形成过程中表达变化的研究，我们建立人类单核细胞（U937）源性泡沫细胞模型［7］，进一步探讨CD147，VEGF等炎性介质在动脉粥样硬化发生中的作用.

1材料和方法

1.1材料低密度脂蛋白（LDL） 及VEGF的ELISA 检测试剂盒（CHENICON，US）；硫代巴比妥酸（TBA）（南京建成生物工程研究所）； FITC标记小鼠抗人CD147（R＆D，US）. FACS Calibur(BectomDiekinson， Franklin Lakes， NJ)流式细胞仪.

1.2方法

1.2.1oxLDL 的制备将LDL 置于含10 μmol/L CuSO4的磷酸缓冲液（PBS）中， 37℃透析12 h后，在1 g/L EDTA的PBS中透析24 h， 0.2 μm 微孔滤膜过滤除菌备用. 用硫代巴比妥酸物质的含量鉴定oxLDL，氧化后每毫克胆固醇中丙二醛含量为38.7 μmol/g.

1.2.2细胞株及泡沫细胞模型的建立U937 细胞株系人类单核细胞系，由中国科学院上海细胞生物研究所提供，在含100ml/L胎牛血清的RPMI1640 培养基中悬浮生长，置于50 mL/L CO2培养箱中培养. 将细胞稀释至5 ×1012/L，种于24孔板中每孔1 mL，分别与不同浓度oxLDL（0， 25， 50， 100， 200 mg/L）共孵育24 h. 将相同密度的U937细胞与oxLDL(100 mg/L) 共孵育不同时间（0， 3， 6， 12， 24， 48 h）. U937泡沫细胞形态通过新配制的3 ml/L油红O染色鉴定，胞质内出现红染颗粒的为脂质染色阳性.

1.2.3细胞膜表面CD147流式检测将孵育后细胞悬液，经PBS洗涤2次后调整细胞密度为1×109/L. 取100 μL细胞悬液加FITC标记的小鼠抗人CD147 mAb 2.5 μL，充分震荡混匀后室温避光静置20 min. 经PBS洗涤后，再加入300 μL的PBS. 通过FACSCalibur流式细胞仪检测，使用CellQuest（BectonDickinson）软件分析.

1.2.4ELISA检测VEGF 分泌含量按照试剂盒操作步骤，以RPMI 1640培养基作为空白，将不同浓度的VEGF 标准品在酶标仪（美国BIOIAD公司出品）中检测并绘制VEGF 标准曲线. 将各组细胞离心，上清进行ELISA 检测，通过标准曲线查得相应VEGF含量.

1.2.5CD147及VEGF mRNA 水平检测Trizol提取总RNA，以2 μL RNA作为模板进行逆转录，PCR扩增，以GAPDH作为内参照. VEGF引物序列：上游5′ CTGCTGTCTTGGGTGCATTG 3′，下游5′ GGCCTTGGTGAGGTTTGATCCG3′，扩增产物为334 bp; GAPDH引物序列上游 5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′，下游5′AGATCCACAACGGATACTT3′，扩增产物为360 bP. PCR反应条件：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，持续25个循环. CD147引物序列: 上游5′ACATCAACGAGGGGGAGACG3′， 下游5′GGCTTCAGACAGGCAGGACA3′，扩增产物为480 bp. PCR反应条件：94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸90 s，持续25个循环.

统计学处理：采用统计软件包进行数据分析，计量数据用x±s表示. 组间均属比较用方差分析及Dunnettt两两比较检验，P

2结果

2.1U937泡沫细胞的鉴定光镜下对照组细胞（U937）内无红染颗粒，而处理组细胞体积增大，细胞质内可见较多的红染颗粒，提示细胞内脂质成分增加.

2.2CD147分子在U937泡沫细胞膜表面表达的变化流式细胞术显示，与对照组（U937细胞）相比，U937泡沫细胞膜表面CD147表达的平均荧光强度升高. 浓度作用曲线显示，当 oxLDL 作用浓度为25mg/L时，U937泡沫细胞膜表面CD147表达强度出现最高峰， 较对照组升高约1.6倍（P

2.3U937泡沫细胞中VEGF的表达ELISA检测显示，细胞培养上清中VEGF的蛋白分泌含量与oxLDL作用浓度成正比. 浓度曲线表明U937细胞在与200 mg/L oxLDL作用后，VEGF分泌水平达峰顶，较对照组升高约2.1倍（aP

2.4CD147及VEGF mRNA的表达水平RTPCR结果显示，当U937细胞与25 mg/L oxLDL的作用后CD147 mRNA表达水平最高，之后其水平保持不变. 当oxLDL的作用浓度为200 mg/L时VEGF mRNA表达水平最高（图6）. U937细胞与oxLDL 100 mg/L作用6 h后CD147 mRNA表达最高，之后其水平保持不变. 作用48h后VEGF mRNA表达最高（图7）.

3讨论

动脉粥样硬化是一个以修饰的脂质、单核细胞及富含胆固醇酯的泡沫细胞聚集为特征的复杂的病理过程，目前认为动脉粥样硬化也是一个慢性炎症反应过程［8］. 在粥样斑块中，泡沫细胞不仅是一种清道夫细胞，也是一种炎症调节细胞. CD147及VEGF蛋白及mRNA水平在泡沫细胞中的上调，提示在在粥样斑块中，CD147及VEGF可能参与了泡沫细胞形成的炎症反应过程［9］. CD147是一种新发现的细胞表面黏附分子，又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer．EMMPRIN)，可以刺激成纤维细胞的几种MMP的合成，参与基质的降解［10］. Young［9］等通过免疫组化在人动脉内膜粥样硬化斑块富含巨噬细胞的区域中检测到CD147分子. 在人心衰模型中，CD147与a3β1整合素形成复合体，通过外部信号及上调局部MT1，MMP的表达诱导MMP的产生从而降解基质，引发斑块的破裂促进心衰的发生. 这些研究提示，CD147分子可能在动脉粥样硬化的发生中有着非常重要的作用［9］. 是迄今为止发现的唯一具有特异性促进血管内皮细胞有丝分裂作用的生长因子， 并具有增加血管通透性的作用. VEGF的增加促进了动脉粥样硬化斑块内的血管形成，由于在血管形成的过程中， 细胞粘附分子等产生增加， 且由此促进炎性细胞对血管壁的粘附， 进而加重动脉粥样硬化， 并形成恶性循环［11］.

转贴于 我们建立人类单核细胞（U937）源性泡沫细胞模型［6］，采用流式细胞术、ELASA及RTPCR等方法检测，分析CD147，VEGF在U937泡沫细胞中的表达变化. 研究发现， CD147表达出现最高峰时的oxLDL浓度为25 mg/L，作用时间为6 h. 这表明短时间低浓度oxLDL可能促进单核细胞中CD147的表达， 之后CD147表达逐渐降低， 表明CD147的上调可能是单核细胞对oxLDL刺激后短期的急性反应，CD147可能在早期的泡沫细胞形成过程中起到了重要的作用. 与之相反， VEGF表达出现最高峰时的oxLDL浓度为200 mg/L，作用时间为24 h. 相比CD147，VEGF表达出现最高峰时需要较高浓度的oxLDL及较长的作用时间. 这表明VEGF的表达可能滞后于CD147，VEGF可能是在动脉粥样硬化的发生中继CD147上调之后持续发挥作用的炎症因子. CD147，VEGF在单核细胞来源泡沫细胞中不同表达提示oxLDL可能是通过不同信号通路调节VEGF与CD147在单核/巨噬细胞中的表达. 此外，我们还发现单核细胞与低浓度oxLDL（25 mg/L）共孵育后CD147蛋白及mRNA表达上调，但此后随着oxLDL浓度的增加，泡沫细胞表面CD147分子逐渐减少，而在此过程中其mRNA水平则保持不变. 推测这可能是由于CD147分子从泡沫细胞膜表面脱落所致. 这些假设还需要在今后的实验中进一步研究.

长期慢性炎症可导致机体内一些免疫分子及细胞因子的水平明显升高，不但可调节机体免疫反应，而且能够作用于外周组织加速动脉粥样硬化的发展［2，12-13］. 如类风湿关节炎、红斑狼疮等. 但免疫分子、炎症因子等炎性介质促进动脉粥样硬化发生的其机制目前尚不甚清楚. 我们通过研究CD147，VEGF在单核细胞来源的泡沫细胞中的表达的变化，推测其表达可能通过与oxLDL的浓度时间依赖关系，从而发挥其生物学功能. 充分认识这些机制将有助于进一步阐明炎性介质在动脉粥样硬化中的发病机制.

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