细胞化学元素范文
时间：2023-10-17 22:59:11
细胞化学元素篇1
【关键词】 T淋巴细胞亚群； 微量元素； 反复呼吸道感染
Correction between the T Lymphocyte Subsets， Trace Elements and Children with Recurrent Respiratory Tract Infection/JIAN Min， LI Jun-xin， LIU Chao.//Medical Innovation of China，2016，13（04）：061-064
【Abstract】 Objective： To explore the relationship between the trace elements， blood T lymphocyte subsets， and children with recurrent respiratory tract infection. Method： 68 children with recurrent respiratory tract infection from December 2013 to January 2015 in the hospital were chosen as observation group， and 68 healthy children at the same period were selected as control group. The level of blood trace elements and blood T lymphocyte subsets was detected and compared by atomic absorption spectrometry and flow cytometry between the two groups. Result： The zinc， ferrum， calcium， and CD3+， CD4+， CD4+/CD8+ of the observation group was significantly lower than that of the control group， while CD8+ was higher， with significant difference （P
【Key words】 T lymphocyte subsets； Trace elements； Recurrent respiratory tract infection
First-author’s address： Qingdao Women and Children’s Hospital， Qingdao 266034， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.04.018
反复呼吸道感染（Recurrent respiratory tract infection， RRTI）是儿科常见病、多发病，其病程长、病情反复难愈，易导致许多并发症，对患儿的生长发育和智力发育极为不利。其病因及发病机制尚未完全明确，除与先天性免疫缺陷和遗传因素有关外，目前认为与微量元素的缺乏及人体的免疫功能紊乱有关[1-2]。本文通过比较RRTI患儿和健康儿童外周血T淋巴细胞亚群及全血微量元素水平，探讨儿童RRTI与微量元素的关系及了解RRTI患儿免疫功能的变化状态，为本病的预防及治疗提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2013年12月-2015年2月本院收治的0～7岁RRTI患儿68例为病例组，男32例，女36例，平均年龄（3.2±1.2）岁；其中缓解期患儿33例，发作期患儿35例。所有入选病例均符合中华医学会儿科分会制订的RRTI诊断标准[3]。同时选取在本院门诊查体的健康儿童68例为对照组，男34例，女34例，平均年龄（3.0±1.5）岁。两组儿童均排除先天性心脏病、佝偻病、贫血、肺及气管等疾病，采血前3个月内均未使用过免疫调节剂。两组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 仪器与方法 微量元素的检测应用原子吸收光谱仪及其配套试剂（北京博晖公司生产，BH5100S）进行检测。外周血T淋巴细胞亚群检测应用流式细胞仪（美国BD公司生产，BD FACSCANTO TM Ⅱ）收获细胞，由multiSET软件自动分析得出CD3+、CD4+、CD8+细胞在外周血中的百分率及CD4+/CD8+比值。
1.3 统计学处理 使用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，P
2 结果
2.1 RRTI组与对照组T淋巴细胞亚群水平比较 RRTI组CD3+、CD4+及CD4+/CD8+均低于对照组，CD8+高于对照组，比较差异有统计学意义（P
2.2 RRTI组与对照组微量元素比较 RRTI组血锌、铁、钙浓度均低于对照组，比较差异具有统计学意义（P0.05）。RRTI发作期血锌、铁、钙浓度与缓解期比较均降低，差异有统计学意义（P
3 讨论
RRTI是指1年以内发生上、下呼吸道感染的次数频繁，超出了正常范围。RRTI患儿大多存在呼吸道解剖异常、呼吸道吸入、免疫缺陷病、先天性心脏病等基础疾病。研究[4-5]表明，小儿免疫系统发育不成熟，免疫功能紊乱是RRTI的主要原因之一。目前，判断细胞免疫功能常用的方法是T淋巴细胞亚群检测[6]。人体内有两种主要的T细胞，分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD4+T细胞是辅助诱导性T细胞亚群（Th细胞），辅助B细胞、其他T细胞及巨噬细胞的免疫应答，产生抗体并且促进抑制性T细胞、细胞毒性T细胞的增殖与成熟及激活巨噬细胞清除细胞内病原体。CD4+细胞减少说明B细胞产生免疫球蛋白减少以及细胞免疫功能低下；CD8+是抑制性细胞（Ts）或细胞毒性细胞（Tc）亚群，在免疫调节方面起负反馈作用，可抑制过度的免疫反应，在维持免疫耐受方面有重要作用，其数量增多表示免疫受到抑制；CD4+/CD8+比值表示Th与Ts之间功能平衡的状态，是人体免疫系统内环境稳定最重要的指标，其降低提示Th细胞功能相对不足，Ts细胞功能亢进，人体细胞免疫功能降低[7-8]。T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+通过直接作用和分泌细胞因子相互诱导、相互抑制形成T细胞网络，在维持免疫稳定和人体免疫应答的调控方面具有重要作用。研究表明，各种致病因子侵入人体后，既能使患儿体内的T淋巴细胞大量凋亡，使其数量减少，又能诱发T淋巴细胞亚群分化异常，引起人体细胞免疫功能的紊乱，使病情很难控制，甚至出现恶化[9-10]。常克萍[11]研究发现，CD4+细胞降低是RRTI发病机制的重要环节。易著文[12]研究发现，RRTI患儿免疫异常者占20.9%～36.0%。张志刚等[13]还报道CD4+/CD8+每降低1个单位，RRTI风险增加16.1。本研究发现，RRTI组CD3+、CD4+细胞百分率、CD4+/CD8+比值均明显低于对照组，而CD8+细胞百分率则高于对照组，提示RRTI患儿免疫功能异常和紊乱，细胞免疫功能低下。RRTI缓解期和发作期之间比较，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+存在明显差异说明RRTI患儿细胞免疫状态有明显的变化规律，且与其所处分期相关，因此可作为疾病发展转归的有效判断因子。其可能的机制是受病毒感染的RRTI患儿，其Th细胞遭到侵犯，CD4+细胞分化受阻，破坏增加，而Ts细胞活化，CD8+数量增多，造成免疫功能紊乱；同时免疫器官受到病毒侵犯，造成总T淋巴细胞减少，功能障碍，免疫功能降低甚至受到抑制，从而继发细菌感染，免疫功能进一步减低，使呼吸道感染反复发生。值得关注的是，本研究发现RRTI患儿发作期及缓解期均存在CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+异常，而非RRTI的呼吸道感染恢复期T淋巴细胞亚群已恢复正常[14]。这说明非RRTI的急性呼吸道感染的患儿，其细胞免疫功能低下与失调是暂时性的；而RRTI患儿不仅存在细胞免疫功能异常，且该异常为一持续过程。
微量元素作为人体内酶、维生素、激素等活性物质的重要组成成分，在维护人体的正常代谢和生命体征中起着至关重要的作用，尤其对于正处于发育期的儿童更是必不可少的。微量元素在体内含量较少，却具有很大的生物活性，其缺乏或过量都将严重影响儿童的生长发育、智力水平及免疫功能[15]。铜、锌、钙、镁、铁是人体必需的微量元素，也是人体最容易出现失衡的微量元素[16]。铁参与核酸和蛋白质合成，其缺乏将引起整个人体的生理紊乱。缺铁或隐性缺铁可抑制抗体产生，干扰溶菌酶的活性，使白细胞杀菌功能减弱，降低对感染的应答效能，易发生RRTI[17-18]。文献[19]证实，缺铁会直接损伤淋巴细胞的生成，造成外周血淋巴细胞绝对数降低，Th细胞和Ts细胞比值减少。淋巴细胞在隐性缺铁阶段已有下降，其中以CD4+下降最为显著；淋巴细胞增殖反应低下，CD4+分泌IL-2、IL-6减少，从而减弱了迟发型变态反应，降低了淋巴细胞转化率。缺铁还可使RBC-C3b数目和/或活性降低，导致红细胞对外源性致病原的黏附清除能力减弱。缺锌主要损伤细胞免疫，也可同时伴较严重的体液免疫损伤。锌参与核酸、蛋白质和能量的代谢及氧化还原过程，有利于免疫细胞的分裂和增殖。缺锌时，胸腺、淋巴结萎缩，使淋巴细胞功能减弱，免疫细胞发育受到障碍，从而降低人体免疫功能和白细胞杀菌作用。研究证实，锌缺乏与儿童腹泻、肺炎等感染性疾病密切相关，因此合理补锌可促进儿童免疫细胞的发育和分化增殖，提高人体的免疫应答[20]。钙能增加气管、支气管的纤毛运动，促进吞噬细胞的游走、吞噬，增强呼吸道清除功能。免疫球蛋白的生成及细胞因子的释放都离不开钙离子。钙能增加血管的致密度，降低其通透性，在肌肉应激、细胞粘着等生理过程中都起着非常重要的作用。缺钙不仅引起儿童佝偻病，还可使细胞因子的活性降低（如IL-1、IL-5、IL-6、TNF-α），从而破坏淋巴细胞的功能，导致人体免疫功能降低，机体易感染性增大而发生RRRI[21-22]。本研究结果显示，RRTI组锌、铁、钙均低于对照组，比较差异有统计学意义；RRTI组铜略高于对照组，镁低于对照组，但差异均无统计学意义，说明微量元素的变化与RRTI的发生有一定关系，尤其是锌、铁含量明显低于对照组，提示锌、铁缺乏可导致患儿身体防御功能下降而易患感染，积极补充锌、铁可使人体免疫状态得到一定的改善。RRTI组发作期锌、铁、钙均低于缓解期，说明微量元素与病情严重程度密切相关，可将其作为监测疾病、干预治疗效果的重要参考指标。
综上所述，外周血T淋巴细胞亚群和全血微量元素与RRTI的发病和治疗密切相关。RRTI患儿抵抗力降低，消耗增加，吸收和利用微量元素的功能受到障碍，而微量元素的缺乏又引起T淋巴细胞亚群比例失衡，机体免疫功能降低，导致机体对外界抗感染能力的减弱，以至反复感染。因此，对RRTI患儿进行抗感染治疗同时，应积极改善和提高患儿免疫功能并建议检测微量元素，及时补充缺乏的微量元素，对RRTI的治疗和预防可起到积极的作用。
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细胞化学元素篇2
【摘要】 目的 探讨参麦注射液对大鼠皮层神经元内质网应激诱导凋亡的保护作用。方法 体外培养SD乳鼠皮层神经元细胞，免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度，流式细胞术AnnexinV、PI双标检测凋亡率及活性caspase3、9表达，Western印迹免疫分析GRP78、细胞色素C蛋白、Bcl2蛋白表达，Fura2/AM法荧光分光光度计检测细胞内钙浓度（〔Ca2+〕i）。结果 SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养，2 μmol/L毒胡萝卜素作用神经元24、48 h细胞凋亡率分别是17.88%、21.38%，参麦治疗组分别是7.42%、8.16%，两组差异显著(P
【关键词】 细胞凋亡；内质网应激；caspase；Bcl2；参麦注射液
【Abstract】 Objective To observe the protect effects of Shenmai (SM) injection on endoplasmic reticulum stressinducing rat cortical neuronal apoptosis. Methods Primary cortial neurons were cultured in vitro and NSEpositive cells were detected by immunofluorescence staining and immunohistochemistry. The percentage of apoptotic cells and protein expression of caspase3，9 were determined by flow cytometric analysis. Protein levels of GRP78， cytochrome C， Bcl2 were assessed by immunoblotting. Intracellular free calcium concertration 〔Ca2+〕i was measured with fluorophotometry. Results Cortical neurons of neonate rats could be cultured in vitro， the percentage of apoptosis induced by thapsigargin after intervened for 24 and 48 h was 17.88% and 21.38% respectively. GRP78 and cytochrome C protein levels were elevated in cortical neurons in response to thapsigargin. The expression of caspase3 and 9 were activated and the protein level of Bcl2 was decreased. SM significantly decreased the percentage of neuronal apoptosis and increased the expression of Bcl2， reduced neuronal 〔Ca2+〕i and the expression of caspase3 and 9， inhibited the leakage of cytochrome C.Conclusions SM has effect of antineuronal apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in vitro， which might be related to decreasing intracellular free calcium concentration.
【Key words】 Apoptosis；Endoplasmic reticulum stress；Caspase；Bcl2；Shenmai injection
凋亡是脑缺血后神经元死亡的一种重要形式。凋亡信号途径包括外源性、内源性/应激途径。缺血后神经元的凋亡发生是一个多环节调控过程，其中包括基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、热休克蛋白表达受阻、脂肪酸与自由基形成、蛋白酶激活等过程，但脑缺血后神经元凋亡发生的确切机制目前还不十分清楚。内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，内质网在应激状态下，可迅速诱导凋亡。毒胡萝卜素(thapsigargin)为不可逆性内质网钙ATP酶抑制剂，可诱导内质网应激。本研究旨在探讨大鼠皮层神经元内质网应激诱导细胞凋亡机制以及参麦注射液的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
新生SD大鼠（出生24 h内）由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鄂）20040007。高糖DMEM、神经元基础培养液、B27、胎牛血清、马血清购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶、L多聚赖氨酸购自Sigma公司；Annexin VFTTC购自Bender MedSystems公司；Fura2/AM购自晶美生物公司；活性caspase3、caspase9试剂盒购自BioVision公司；AntiGRP78多克隆抗体购自Stressgen公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz公司；神经元特异性烯醇化酶(NSE)组化试剂盒购自北京中山公司；其他均为市售分析纯。参麦注射液由人参、麦冬组成，每支10 ml，含生药0.5 g，批号为0807046，正大青春宝药业有限公司出产。
1.2 仪器
CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus日本)；全自动酶标分析仪 （Thermo electron corporation Multiskan MK3，美国）；流式细胞仪(FACSCLSR，BectonDickton，美国)；F2000型双波长荧光分光光度计(Hitachi 850，日本)。
1.3 分组与给药
实验分为阴性对照组 (正常培养神经元)，毒胡萝卜素组(神经元基础培养液中加2%B27，加2 μmol/L毒胡萝卜素24～48 h)，参麦治疗组(神经元基础培养液中加2% B27，2 μmol/L毒胡萝卜素，参麦注射液10 ml/L 24～48 h)。
1.4 皮层神经元培养
取出生24 h以内SD大鼠皮层于冷解剖液(4℃)中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成≤1 mm3的组织块，入0.1%胰酶液，37℃水浴消化20 min，加种植培养液 (DEME中添加10%胎牛血清，10%马血清，pH 7.2～7.4) 终止消化并吹打，细胞悬液经200目滤网过滤，获得单细胞悬液，1×106/皿的密度接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天换维持培养液(神经元基础培养液中加2% B27），培养3～5 d半量换液，7～10 d用于实验。
1.5 神经元的鉴定
免疫组织化学染色标记NSE(北京中格公司产品)和IgG免疫荧光染色(FITC标记的兔抗鼠IgG 1∶2 000稀释)鉴定神经元。
1.6 参麦注射液对原代神经元活力的影响
神经元活力测定采用MTT法。取前述原代神经元(细胞计数达1×106/ml)，按每孔100 μl 接种于96孔板，培养5 d后随机分组，设置空白对照组 (用来调零，只加培养基，不加细胞)、阴性对照组 (药物浓度为零，加细胞，加培养基)、治疗组 (加参麦注射液，加细胞，加培养基)，治疗组参麦注射液终浓度10 ml/L。分别继续培养1、2、3 d，每孔加入MTT 15 μl，37℃孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO 100 μl，室温下放置10 min。待镜下观察紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR400 ELISA读数仪测定MTT吸光度值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。
1.7 流式细胞分析仪检测神经元凋亡及caspase3、9活性
取上述分组培养的神经元经胰蛋白酶消化后在4℃离心5 min，去上清后细胞沉淀用冷PBS洗2次，加195 μl结合缓冲液悬浮细胞，然后加入Annexin VFTTC 5 μl，室温避光孵育10 min，结合缓冲液洗3遍，190 μl结合缓冲液重悬细胞，加10 μl (20 μg/ml) PI (终浓度1 μg/ml)，上机检测，重复3次。取上述各组及阴性对照组细胞 (正常培养的细胞培养液中加1×106/ml caspase3、9抑制剂共孵育) 消化、重悬，取300 μl细胞悬液于EP管中，每管分别加入1 μl FITC标记的caspase3、9，37℃ 5% CO2恒温细胞培养箱孵育1 h，3 000 r/min离心5 min，弃上清，0.5 ml缓冲液重悬细胞，3 000 r/min离心5 min，弃上清，300 μl缓冲液重悬细胞，上机检测，重复3次。
1.8 GRP78、Bcl2、细胞色素C免疫印迹分析
各组细胞按照总蛋白提取试剂盒操作提取总蛋白，按蛋白定量试剂盒说明定量。免疫印迹操作参照Elyaman等〔1〕的方法进行。每组实验重复3次。利用激光扫描光密度分析法半定量测定细胞GRP78、Bcl2、细胞色素C水平变化。
1.9 荧光分光光度计测钙浓度
准备细胞数为106～109/L，细胞存活率90%以上。负载Fura2/AM：将细胞与2 ml负载液及10 μl Fura2/AM一起于37℃孵育30 min。无钙清洗液洗涤细胞后荧光测定。37℃恒温测定荧光强度，连续测定340、380 nm波长激发光交替激发时，510 nm发射新的荧光强度F，同时记录荧光强度比值R(R=F340/F380)。校正参数Rmax为饱和时产生的最大荧光比值，以10% TritonX100测得。Rmin为游离时的最小荧光比值，以5 mmol/L测得。自身荧光以未孵育Fura2/AM的细胞同法测量，计算〔Ca2+〕i时减去。细胞胞质游离钙浓度〔Ca2+〕i计算：〔Ca2+〕i=Kd(RRmin)/(RmaxR) Ff2/Fb2。其中平衡常数Kd在37℃时为224 nmol/L，R为340、380 nm荧光强度比值(F340/F380)。校正参数分别为游离时形成的最大、最小荧光比值，Ff2与Fb2分别为游离与饱和380 nm荧光强度。
1.10 统计学处理
数据以x±s表示。应用SPSS 12.0软件进行组间t检验。
2 结 果
2.1 原代神经元培养
2.1.1 正常神经元的形态观察
接种后2 h，部分细胞开始贴壁，贴壁细胞呈圆形；4 h后，贴壁细胞渐多，个别细胞开始伸出突起；24 h后，大部分细胞已贴壁，可见光滑的突起，胞体小，折光性较暗，周围有光晕；第3天，神经元胞体增大，突起延长并出现分支，形成稀疏的网络，神经元以多极神经元为主，胞体呈三角形、锥形或椭圆形，也有双极神经元；第5天，神经元胞体进一步增大，突起增粗、增长，末端分叉明显，已交织成网，胞体和突起晕光明显，立体感强；第7天，神经元生长旺盛，胞体大，突起长，分支连接成网，见图1。
2.1.2 原代神经元培养鉴定
取培养7 d的皮层神经元经NSE染色后，计数NSE阳性细胞数占细胞总数的百分数为(97.2±4.1)%(n=5)，故可认为是纯神经元培养，见图1。
2.2 参麦注射液对原代神经元活力的影响
MTT比色分析显示，10 ml/L参麦治疗组1～3 d神经元的OD值高于阴性对照组，与阴性对照组比较，参麦治疗组细胞活力显著高于阴性对照组(P
2.3 参麦注射液对毒胡萝卜素诱导的神经元凋亡的影响
正常培养大鼠皮层神经元经2 μmol/L毒胡萝卜素诱导后，细胞凋亡明显增加，24 h凋亡率为17.88%，至48 h凋亡率为21.38%；参麦治疗组在2 μmol/L毒胡萝卜素诱导的同时加用参麦注射液，培养至24 h凋亡率为7.42%，至48 h凋亡率为8.16%。两组对比，参麦治疗组细胞凋亡率显著低于毒胡萝卜素组(P
2.4 参麦注射液对活性caspase3、9表达的影响
在原代培养的神经元经2 μmol/L毒胡萝卜素作用24、48 h，活性caspase3、9的表达明显，加用10 ml/L参麦注射液，两者表达均明显下降(P
2.5 GRP78、细胞色素C、Bcl2免疫印迹分析
2 μmol/L毒胡萝卜素24、48 h，神经元GRP78免疫活性明显增加，参麦治疗组GRP78活性减低，两组相比，GRP78免疫活性变化无统计学意义(P>0.05)。2 μmol/L毒胡萝卜素24、48 h，神经元细胞色素C表达增加，而参麦治疗组表达减低，两组比较细胞色素C表达治疗组显著低于毒胡萝卜素组(P
2.6 神经元〔Ca2+〕i浓度的测定
静息状态下原代培养神经元〔Ca2+〕i浓度为（74.4±0.6）nmol/L，原代培养的神经元经2 μmol/L毒胡萝卜素作用24、48 h，〔Ca2+〕i浓度为 (134.4±0.6)、(165.5±0.7) nmol/L。与静息状态对照组相比，毒胡萝卜素组神经元〔Ca2+〕i 明显高于阴性对照组(P
3 讨 论
多种细胞信号途径、应激状态可以引起细胞凋亡。触发细胞凋亡的分子机制包括：细胞外环境中必要的生存信号的丢失，兴奋性中毒，氧化应激，严重的DNA损伤，细胞器机能障碍，受体介导的死亡信号途径〔2〕。近年来，内质网作为线粒体凋亡途径的调节器越来越受到重视〔3〕。毒胡萝卜素可以诱导多种细胞发生内质网应激和细胞凋亡〔4〕，作为内质网应激标志物的分子伴侣GRP78在内质网发生应激时表达上调〔5〕。本实验提示神经元发生了内质网应激，而对照组只有很少表达；且caspase3、9均参与了毒胡萝卜素诱导的神经元凋亡机制。内质网也是细胞内Ca2+的重要储存场所，在细胞内Ca2+稳态、细胞功能维持以及细胞内信号传导等过程中发挥重要作用。内质网的Ca2+稳态改变和内质网非折叠或非正确折叠蛋白质的堆积均可引起内质网应激反应，如果内质网Ca2+稳态改变或/和非折叠蛋白质反应得不到纠正，将最终诱导细胞凋亡。
毒胡萝卜素作用位点是抑制内质网膜Ca2+ ATP酶，诱导胞浆内Ca2+浓度上升和内质网储存钙的下降，从而引起内质网应激，诱导凋亡。本实验发现，原代培养神经元在毒胡萝卜素作用下，胞浆〔Ca2+〕i浓度明显升高，并高于对照组。细胞凋亡是复杂的过程，线粒体途径、死亡受体途径、内质网等细胞器途径之间存在着复杂的交叉串话。Bcl2蛋白家族，包括Bcl2、Bax、BAD等，对凋亡起着重要的调节作用〔6〕。我们通过免疫印迹检测在内质网应激时，Bcl2免疫活性降低，细胞色素C表达增加。可能在细胞遭受应激反应时，内质网应激激活的相关caspase是凋亡的早期事件，随后导致线粒体外膜通透性增加，细胞色素C释放到胞浆，进而促进凋亡复合体的形成，激活效应caspase，引起凋亡。体外培养的大鼠皮层神经元凋亡机制中各途径之间的联系还有待进一步研究。
参麦注射液是化裁于古方生脉饮的中药注射制剂，主要生药成分是红参、麦冬，人参的有效成分是人参皂甙和人参多糖，具有清除氧自由基、抗脂质过氧化等作用，对缺血缺氧时代谢活动和微循环有保护作用，麦冬含有麦冬黄酮、维生素A、铜、锌等多种抗氧化物质，具有直接减少氧自由基产生或通过提高细胞内抗氧化酶活性抑制自由基、降低脂质过氧化作用〔7〕。研究表明〔8，9〕参麦注射液能显著减轻氧自由基对细胞的损伤，改善细胞能量代谢，降低脂质过氧化，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具有减轻脑细胞缺血损伤及抗细胞凋亡的作用。本实验发现，参麦注射液和毒胡萝卜素同时作用于皮层神经元，24、48 h细胞凋亡率明显减少，神经元胞浆Ca2浓度较实验组明显降低，同时实验组Bcl2免疫活性增强，细胞色素C表达较对照组减少。因此参麦注射液对体外培养大鼠皮层神经元有抑制凋亡的作用，且其抑制凋亡的作用是多个环节起作用的结果。
参考文献
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细胞化学元素篇3
【关键词】 间充质干细胞 人脐血 分化 神经元
间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC) 是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞， 最先发现于骨髓， 随后在脐血和其他组织中也发现了MSC。研究报道MSC在体外诱导条件下不仅可分化为成骨细胞、 成软骨细胞、 脂肪细胞和成肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞［1］， 而且还能跨胚层横向分化为神经细胞［2］。我们在分离培养人脐血MSC的过程中发现部分脐血MSC在体外培养多次传代的过程中未经诱导表现为类似神经元的形态， 因此采用RTPCR和免疫细胞化学的方法对脐血MSC能否表达神经元特异性抗原标记进行检测。
1 材料和方法
1.1 材料 淋巴细胞分离液（1.077 g/mL）购自中科院天津血液病研究所; DMEMLG培养基购自Sigma公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 青/链霉素、 谷氨酰胺、 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA购自Gibico公司; 鼠抗人CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC、 HLADRPE单克隆抗体(mAb)及同型对照购自Coulter公司; 鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase， NSE）和神经丝蛋白（neurofilament， NF）mAb工作液， EliVisionTM Plus试剂盒购自北京中杉生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增引物 根据GenBank上登录的NSE、 NF基因序列设计， 由上海生工生物工程有限公司合成。NSE引物为: 5′gaagaaaaggcctgcaactg3′， 5′ccaggtcagcaatgaatgtg3′; NF引物为: 5′atcggtaaaggtgcacttgg3′， 5′tctacctccccattgacagc3′。扩增片段长度分别为157 bp和168 bp。
1.2.2 脐血标本的收集 脐血来源于南京军区福州总医院妇产科出生的健康足月顺产新生儿。产妇产前检查均正常， 脐血的收集均已征得产妇同意。无菌条件下采集脐血: 待胎儿娩出后， 在距离胎儿5～7 cm的脐带处进行双接扎， 剪断脐带， 穿刺脐静脉后抽取脐血， 每份30～80 mL， 抽取后注入100 mL， 经无菌处理， 加入333.4 nkat/mL肝素抗凝的生理盐水瓶中， 充分混匀。脐血采集后4 h内进行单个核细胞的分离。
1.2.3 脐血单个核细胞的分离 采用密度梯度离心法: 脐血30～80 mL用无菌的DHank’s液等体积稀释。取数个50 mL的无菌带盖离心管， 先加入1.077 g/mL的淋巴细胞分离液25 mL， 无菌滴管吸取稀释后的脐血25 mL， 离液面约1 cm处缓慢加入， 形成一明显的界面。2 000 r/min离心20 min， 小心吸取中间的白膜层。加入5倍体积的PBS缓冲液， 1 000 r/min离心10 min， 洗涤3次， 弃上清。所得单个核细胞用于细胞培养。
1.2.4 脐血分离细胞的培养和传代 参照骨髓MSC的培养方法［3］从脐血中分离出的单个核细胞以1.0×109/L的密度接种于含体积分数200 mL/L胎牛血清、 2 mmol/L谷氨酰胺、 1667 nkat/mL青/链霉素的DMEMLG培养液中， 置于37℃、 50 mL/L
CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。5～7 d后首次换液， 悬浮的细胞被去除， 可见瓶底有少量的贴壁细胞。换上新鲜的培养液继续培养。开始每隔5～7 d换液1次， 待细胞克隆出现、 扩大后根据培养液颜色的变化每3～5 d换液1次。待细胞克隆不再扩大生长时即开始传代， 加入2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA消化液， 37℃孵育6～8 min， 200 mL/L 的胎牛血清终止消化， 按1∶3的比例接种至新的培养瓶中继续培养。
1.2.5 脐血分离细胞的表面抗原检测 采用流式细胞术（FCM）检测: 选择P3代细胞， 抗体分别为CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC和HLADRPE。FCM检测后， 应用SystemⅡSoftware Version 3.0获取、 分析检测结果。
1.2.6 脐血分离细胞向神经元样细胞分化的检测 (1)RTPCR检测: P2和P10代细胞接种于6孔板， 培养达到80%以上融合后， 参照TRIzol RNA抽提试剂盒说明书抽提细胞总RNA， 按照Promega RTPCR试剂盒说明书合成细胞总cDNA（βactin作为内参照）。NSE、 NF基因片段的PCR扩增采用50 μL反应体系: 10×PCR缓冲液5 μL， dNTP 4 μL， 模板DNA（cDNA）5 μL， 上游引物（20 μmol/L）1 μL， 下游引物（20 μmol/L）1 μL， DNA聚合酶1 μL， ddH2O 33 μL。离心混匀， 94℃预变性5 min后， 按下列参数: 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 共30个循环。最后一个循环结束后72℃延伸5 min。(2)免疫细胞化学检测: 分别取P2代和P10代脐血分离细胞， 以5×106/L的密度接种于放置有消毒盖玻片的6孔板内， 每孔加入2 mL新鲜培养液， 制备细胞爬片。细胞贴壁后， 吸出培养液， 小心加入PBS轻轻冲洗2次后， 再加入40 g/L多聚甲醛室温固定15～20 min。PBS轻洗2次， 然后参照EliVisionTM Plus试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色。
2 结果
2.1 脐血分离细胞的培养和传代 原代培养的细胞刚接种时呈圆形， 48～72 h后开始有极少量细胞贴壁， 5～7 d后出现较多的贴壁细胞， 部分为成纤维细胞状的长梭形细胞和少量纺锤状细胞（图1A）。1～2 周后可见1～3个细胞克隆出现， 细胞排列成束状、 漩涡状或放射状（图1B）。2～3周左右细胞克隆不再向周围扩大， 按1∶3的比例传代后细胞扩增明显加快， 7～10 d达到90%以上融合， 为均匀一致的成纤维细胞状细胞。P2～P7代细胞增殖速度最快， 1∶3传代后3～5 d即达到90%以上融合， P8代细胞增殖速度开始变慢， P10代以后细胞增殖能力明显下降。相差显微镜下观察， P2代细胞表现为均匀一致的成纤维细胞样的形态， P3代开始偶见个别细胞表现为类似神经元的形态， 随着传代次数增加这种细胞的数量有增多的趋势。
图1 人脐血分离细胞的形态（×400）（略）
A: 培养7 d的分离细胞; B: 克隆化生长的分离细胞.
2.2 脐血分离细胞表面抗原的FCM检测 检测结果显示脐血分离细胞强表达CD29、 CD44、 CD105， 阳性细胞百分数分别为97.8%、 99.5%、 98.3%; 不表达CD34、 HLADR、 CD106， 阳性细胞百分数分别为0.09%、 0.82%、 0.12%（图2）。
2.3 脐血MSC向神经元样细胞分化的检测
2.3.1 RTPCR检测结果 P10代脐血MSC的RTPCR检测结果为: PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后， 在分子量100～200 bp之间出现预期的NSE、 NF的特异PCR扩增条带。P2代脐血MSC的RTPCR检测结果无NSE、 NF的PCR扩增条带。提示P10代脐血MSC有NSE、 NF mRNA表达， 而P2代脐血MSC无NSE、 NF mRNA表达（图3）。
图2 人脐血分离细胞的FCM检测（略）
图3 人脐血MSC向神经元样细胞分化的RTPCR分析（略）
1: 神经丝蛋白(P10); 2: 神经元特异性烯醇化酶(P10); 3: DNA marker (DL 2 000); 4: 神经丝蛋白(P2); 5: 神经元特异性烯醇化酶(P2).
2.3.2 免疫细胞化学检测结果 P2代细胞呈现均一的、 典型的成纤维细胞样的形态， 不表达NSE、 NF， 细胞胞质为均匀的蓝色。而P10代细胞中， 部分细胞表现为神经元样细胞的形态， 部分细胞为扁平、 宽大的形态， 均有不同程度的NSE、 NF抗原表达， 神经元样细胞胞质染成较浓的棕褐色， 而扁平、 宽大的细胞则染成浅棕色（图4）。
图4 人脐血MSC的免疫细胞化学检测 (×200)（略）
A: P10 MSC， 神经元特异性烯醇化酶 (+); B: P2 MSC， 神经元特异性烯醇化酶 (-); C: P10 MSC， 神经丝蛋白(+); D: P2 MSC， 神经丝蛋白(-).3 讨论
研究报道MSC在体外诱导条件下可分化为神经细胞， 诱导后MSC表现为神经细胞的形态， 并表达多种神经细胞的特异性抗原标记。而且有学者发现MSC可诱导分化为特殊类型的神经细胞， 如5HT敏感神经元［4］、 多巴胺能神经元［5］等。MSC的这种特性为其用于神经系统疾病的细胞替代治疗提供了可能， 但是对于MSC在体外诱导条件下分化为神经细胞的观点目前还存在争议。有学者认为MSC经化学诱导法诱导出现的神经元样细胞形态改变是细胞毒性损害、 胞质收缩、 细胞骨架改变的结果， 而不是真正的神经细胞［6］; 也有文献报道骨髓MSC在诱导前就已经能表达神经细胞标志物， 诱导后表达明显增加［7］。
目前虽然对MSC的研究较多， 但还没有公认的可用来鉴定MSC的专一的、 特异性的抗原标志。主要根据细胞形态、 免疫表型、 多向分化潜能进行鉴定。MSC表达的主要抗原标志有: （1）黏附分子， CD58、 CD44等。（1）整合素家族成员， CD29、 CD51等。（3）其它分子， CD90、 CD105等。不表达造血细胞的表面抗原标志CD34、 CD45等， 不表达组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLADR抗原等， 也不表达内皮细胞表面抗原标志CD31、 CD106等［8］。本研究从足月新生儿脐血中分离培养出的MSC为均匀一致的成纤维细胞样的形态， FCM检测强表达CD44、 CD29、 CD105， 不表达CD34、 HLADR、 CD106， 符合MSCs的抗原标志特征， 提示我们分离的细胞为MSC。
在培养过程中我们观察到脐血MSC在P8代以后增殖速度不断减慢， 而且在多次传代后少数细胞呈现类似神经元的形态， 提示MSC具有终末分化为神经元的可能。P2代细胞表现为均一的成纤维细胞样的形态， RTPCR 检测无神经元特异性抗原NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测无NSE、 NF蛋白表达， 说明这个时期的MSC中不存在神经元; 而P10代细胞则呈现不同的细胞形态， 部分细胞的形态类似于神经元， RTPCR检测有NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测也表明该类细胞能表达NSE和NF蛋白， 证明此时MSC中包含有神经元样细胞。本实验没有应用外源性诱导剂， 可以排除诱导剂对细胞形态的影响; P10代MSC不仅形态上与神经元相似， 还有神经元特异性抗原标记NSE、 NF的mRNA和蛋白表达， 进一步证实MSC有终末向神经元分化的可能。目前中胚层起源的MSC横向分化为神经细胞的确切机制尚不清楚， 基因芯片技术证实骨髓MSC不仅含有成骨细胞、 成软骨细胞、 成肌细胞等中胚层细胞的标志物基因， 还含有神经细胞的某些标志物基因， 一旦基因组中某些基因被细胞外微环境中的细胞因子所激活， 则可能向某些特定细胞分化［9］。本研究中MSC在体外培养和传代的过程中能表达NSE、 NF， 可能存在某种因素促使NSE、 NF基因激活。
然而我们的研究结果只能说明人脐血MSC有终末向神经元分化的可能性， 是否能分化为真正的神经元还需要进一步的实验如其他神经元特异性抗原标志的检测、 电镜检查和电生理学研究， 尤其是从功能上证实这些细胞能完成某种神经活动， 如形成突触联系、 建立神经反射等。这些研究对于人脐血MSC用于神经系统疾病的细胞治疗将具有重要的理论和实用价值。
参考文献
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细胞化学元素篇4
【关键词】槲皮素锗；多种肿瘤；细胞增殖
中药配伍学理论认为，中药中的作用成分不只是微量元素和有机分子，也是微量元素与有机分子的相互结合物。医学研究结果表明，多种金属离子与槲皮素螯合而成的配合物具有较高的稳定性，能够对肿瘤细胞生长起到抑制作用。本次临床研究对槲皮素锗抑制多种肿瘤细胞增殖的效果进行了分析，现报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1试剂氧化锗试剂，自制槲皮素，培养基为北京赛默飞世尔化学生物制剂公司生产的RPMI1640（HyClone），Signa公司生产的四甲基偶氮唑蓝（MTT），Signa公司生产的二甲基亚砜（DNSO），吉诺生物医药公司生产的胰蛋白酶，杭州四季青生物技术材料公司生产的胎牛血清（低内毒素，无噬菌体），SH4000312链霉素、青霉素（HyClone）；其他试剂选用分析纯。
1.1.2细胞株从中国科学院上海生命科学研究所细胞库中购买的人前列腺癌细胞PC3、人食管癌细胞EC9706、人肺腺癌细胞SPCA1、人子宫颈癌细胞Hela。
1.1.3仪器美国Dynex公司生产的Spectra Mr全波长酶标仪，德国莱卡公司生产的倒置显微镜，美国SM公司生产的二氧化碳培养箱，苏州冯氏实验动物设备公司生产的CJ2F超净工作台，日本岛津公司生产的UV240可见光紫外光光度仪，德国耐驰公司生产的STA 409型PC/PG差热分析仪，CHN Perkins400型元素分析仪，FTS 3000红外光谱仪。
1.2槲皮素锗的制备甲醇50 ml，氧化锗1 mmol，槲皮素1 mmol，调节甲醇钠pH值为8.5，用带冷凝管和磁力搅拌器的三口烧瓶，连续6 h回流加热。用硅胶G板对反应过程进行监控，完成反应后，停止回流。在聚酰胺层析柱中加入反应液，用水冲洗，用浓度不同的甲醇溶液进行梯度洗脱，将特定区间内的洗脱液收集起来，将有机溶液使用旋转蒸发仪蒸发，获得橘黄色固体物质，重新提取甲醇，以获得深橘黄色固体。元素分析所获得的固体，对目标产物实施热分析以及红外、紫外光谱分析鉴定，使用灭菌水将其调制为10 mmol/L的液体，并在4℃的冰箱中保存该原药储存液，使用前以RPMI1640培养基进行稀释，使用0.22 μm的微孔过滤液对其进行过滤处理。
1.3槲皮素锗对多种肿瘤细胞增殖的作用选择处于对数生长过程的PC3细胞、EC9706细胞、SPCA1细胞、Hela细胞，将细胞密度设置为每孔6×103个，在96孔板中接种，饱和湿度37℃、体积分数为5%的孵育箱中进行培养。发生细胞贴壁后，将培养液吸弃，用RPMI1640培养基稀释液的槲皮素锗加入实验组，浓度为10 μmol/L和100 μmol/L，再加入对照组溶剂中，每组6个复孔，每孔体积为200 μL。将培养板于72 h后取出，用倒置显微镜观察记录其形态学。分别加入20 μL/孔和5 g/LMTT后进行4 h培养，上清液吸弃后加入250 μL/孔DMSO，振荡10 min，保证结晶完全溶解，波长570 mm处的每孔光密度值用酶标仪进行检测。细胞增殖抑制率（IR）计算方法为：1（药物组光密度值/对照组光密度值）×100%。
1.4统计学方法通过SPSS 17.0软件对所有实验数据进行统计学处理，对患者数据资料进行χ2检验，计量数据用t检验，P
2结果
浓度不同的槲皮素锗对于多种肿瘤细胞增殖的作用效果对比差异统计学意义（P
3讨论
本次研究结果表明，锗和槲皮素在碱性环境下，能产生槲皮素锗的配合物，经过热分析、红外光谱分析、紫外光谱分析和元素分析，可确定为目标产物[1]。MTT实验结果显示，槲皮素锗合成物体外作用，对于人前列腺癌细胞PC3、人食管癌
作者单位：523808东莞，广东医学院中美联合肿瘤研究所
细胞EC9706、人肺腺癌细胞SPCA1、人子宫颈癌细胞Hela等多种肿瘤细胞的增殖过程具有明显抑制作用，且随着槲皮素锗浓度的提高[2]，抑制作用效果也会逐渐提高。槲皮素有助于耐药细胞在ADM中分布的恢复，但无法完全恢复肿瘤细胞自身耐药性，对化疗药物的敏感株和敏感性对比仍存在一定差异[3]，其原因可能是肿瘤细胞自身的耐药机制较为复杂，在同种类细胞中会同时出现不同的多种作用机制[4]。可见，槲皮素锗具有较好且较广泛的肿瘤抑制作用，可作为抗肿瘤药物进行开发研究[5]。
参考文献
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细胞化学元素篇5
【关键词】 大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物； 细胞，培养的
ABSTRACT: Objective To establish a primary culture method of the rat cortical neurons. Methods Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats. Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons. Results The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 grew quite well and the purity was about 85%. Conclusion The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.
KEY WORDS: cerebral cortex; neurous; disease models，animal; cells，cultured; nuride
中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤，为研究其具体的作用机理及防治措施，建立合适的体内外模型至关重要。神经元原代培养是研究神经元形态结构及缺氧、缺血、中毒、外伤等病理因素影响的重要方法之一，为进一步的研究提供良好的原代神经元生物学材料，笔者探讨大鼠大脑皮质神经元的原代培养方法。
1 材料与方法
1.1 试剂和动物
神经基础培养基(Neurobasal-A)、胎牛血清(FBS)、B27(美国Gibco公司)，左旋多聚赖氨酸(PLL，美国Sigma公司)，DF-12(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Amerisco公司)，NSE(Neuron-Specific enolase，神经元特异性烯醇化酶)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，UltraVision二抗试剂盒(美国Neomarker公司)，其他试剂为国产分析纯。新生健康SD大鼠(
1.2 皮质神经元原代培养
培养方法按参考文献［1-3］改进后进行。大鼠3只，75% 冷乙醇浸泡3~5 min，无菌条件下断头杀死，取出大脑，放入预冷的D-PBS平衡盐液中。在解剖镜下仔细分离去除脑膜及血管，分离出大脑皮质并剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm大小。组织块以0.25% 胰蛋白酶消化，并用含10%FBS的DF12完全培养基制成单细胞悬液，以1×106mL-1密度接种在经PLL处理过的培养瓶，于37 ℃、相对体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。细胞培养4 h后，将种植液(含10% FBS的DF12)全量换成含2%B27的Neurobasal-A培养基维持培养，以后每隔3 d以Neurobasal-A/B27半量换液。培养瓶包被方法:用0.01 mg/mL的PLL 37 ℃包被1 h，PBS洗2遍，直接接种。
1.3 形态学观察
将培养不同时间的神经元于LEITZ倒置显微镜下进行观察，注意神经元的生长状况。
1.4 免疫细胞化学鉴定
神经元培养4 d，弃去培养液;冷4％多聚甲醛固定20 min;3％H2O2阻断内源性过氧化物酶;封闭后滴加一抗NSE多克隆抗体(1∶200)，4 ℃过夜;加二抗(生物素标记羊抗免IgG)，室温孵育30 min;DAB显色;中性树胶封固，镜下观察。阴性对照实验用0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步骤同上。镜下随机选取30个视野，计数NSE阳性神经元的百分率。
1.5 电子显微镜观察
用玻璃瓶常规培养细胞至4 d时，以胰蛋白酶消化分离并收集细胞，迅速投入3 %戊二醛＋1.5 %多聚甲醛混合电镜固定液中，经1 %锇酸后固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，透射电镜下观察，注意神经元的超微结构。
2 结 果
2.1 细胞形态学变化
培养4 h细胞基本贴壁，呈圆形透亮，体积小，立体感强，偶见少数细胞伸出细小短突起。培养1 d，大部分细胞长出突起，长度约为胞体直径的1~2倍，偶见相邻突起相连接;胞体圆形或椭圆形，饱满，光晕明显(图1A)。培养2 d，细胞数目增多，突起增长(图1B)。培养3 d，胞体明显增大，呈圆形、椭圆形或锥体形，表面光滑，折光性强;突起明显增长，较多突起相连接(图1C)。培养4 d后，突起进一步增多、增长。培养6 d时，神经元胞体开始聚集，突起相连呈网络样生长(图1D)。培养7 d，胞体聚集更明显。随着培养时间的延长，神经元突起纵横交错，难以辨认突起的起源(图1E)。
2.2 神经元的免疫组织化学鉴定
取不同培养时间的细胞行NSE免疫组化染色发现:培养4 d以前的细胞含有较多的非神经元细胞，神经元阳性率低;培养5 d以后的细胞神经元阳性率增高，但其胞体开始聚集，甚至突起互相交错、难以辨认突起的起源，染色阳性的神经元形态不典型。取培养4 d的细胞进行染色，发现神经元的形态比较典型，阳性率也较高，其结果显示:NSE阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色，细胞核淡染，神经元胞体呈圆形、椭圆形或锥体形等，有较长的突起伸出，突起为单极、双极或多极(图2)。阴性细胞的细胞质和突起未呈棕色或棕褐色。计算NSE阳性细胞百分率，神经元数目可达85%以上。
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2.3 神经元的超微结构
常规条件下培养4 d的神经元超微结构最典型，在电镜下可见其细胞膜完整，细胞质含有丰富的核糖体、粗面内质网等细胞器;核大，呈圆形或椭圆形，常偏位，核膜完整，染色质分布均匀(图3)。
3 讨 论
神经元体外培养是神经元发育分化、神经再生、神经系统疾病的发生机制等众多研究领域的重要模型，该模型具有影响因素单一、机体复杂因素干扰少和结果易分析等优点。因此神经元体外培养随之成为神经科学研究领域的关键技术。在神经元的体外培养过程中应注意以下几个方面。
3.1 培养液的选取
培养液是否合适是神经元培养能否成功的关键因素之一。血清中含有多种蛋白质、多肽、激素、生长因子等营养物质能够促进神经元贴壁生长及对体外环境的适应，但血清对胶质细胞的增殖作用很强。在神经组织的分离细胞悬液中，除了神经元之外，还有一些非神经元细胞是无法完全去除的，包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等［4］。因此所采用的培养液应尽量减低非神经元细胞的存活力，提高神经元的纯度。
以往神经元的培养多采用DMEM培养基，并以抗有丝分裂剂阿糖胞苷来抑制神经胶质细胞的生长［3，5］，获得较高的纯度。但阿糖胞苷对神经元亦有一定的毒性，对其活性有不同程度的影响，并且大量胶质细胞死亡后的产物也不利于神经元的生长。故本实验选用富含神经元生长所需的各种营养物质的神经基础培养基，它被认为是神经元培养的良好基质［6］。本实验对神经元原代培养方法的改进之处在于:不用阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂，培养中不是全程使用有血清培养基，而是以有血清培养基(含10%胎牛血清的DF12培养基)作为种植液，种植培养4 h后，全量换为无血清限定性培养基(Neurobasal＋B27)维持培养。由于培养中不加入阿糖胞苷，避免了其毒性作用。其中种植液中所含的血清能够保证细胞基本贴壁，提高了培养细胞的存活率;而维持液中的Neurobasal-A+B27添加物不仅能够促进原代培养神经元的存活和生长分化，还能抑制非神经元的分裂增殖［1］，因此大大提高了神经元的纯度。实验结果发现采用此法培养神经元时，神经元的生长更接近体内自然环境，细胞状态良好，神经元突起间形成网络样的生长趋势，神经元培养4 d时的阳性率可达85%左右;电镜结果亦表明所培养的神经元超微结构完整、细胞器丰富。故笔者以为，此法不需使用抑制胶质细胞的药物，减少药物对神经细胞的损伤，培养的神经元活性较佳，可以推广应用。
文献报道用Neurobasal＋B27培养的神经元纯度高达90%甚至99%［1，7-8］，但本实验培养的神经元纯度仅为85%，相差甚远，可能是取材部位不同，或者取材不够准确、非神经细胞过多、神经元活性差，抑或细胞培养时间不同等因素的影响。笔者认为培养的神经元中含有少量的杂质细胞如胶质细胞等，使二者处于共存状态，更接近体内环境，更有利于神经元的生长;培养神经元纯度达85%已基本能满足体外研究的需要。
3.2 促贴壁物质的使用
用于培养神经元的瓶、皿及盖玻片宜用多聚赖氨酸、层粘连蛋白或鼠尾胶原预先包被。未用PLL等包被时神经细胞易聚集成团、基本不贴壁或仅有少数几个贴壁，无法继续培养。用PLL包被时，其浓度从0.01 mg/mL到0.25 mg/mL均可，本实验室曾用过0.01，0.025，0.1 mg/mL未发现有明显区别。但大剂量PLL对细胞有毒性，有时神经元生长缓慢可能与此有关，故在保证贴附的前提下，浓度越低越好。
3.3 细胞接种密度的选择
体外培养的神经元在缺乏外源性神经营养因子的情况下，存活率与接种的细胞密度尤为相关，接种密度过小时，神经元很难存活;而细胞密度过高时又可产生接触抑制，神经元的存活率也很低，且密度高时神经元间突起互相交错而不便于观察单个神经元体外发育过程中树突、轴突、生长锥、突触等亚细胞结构的变化。因此，选择合适的接种密度尤为重要。本实验经过较长时间的摸索发现，大鼠大脑皮质神经元以1.0×105cm-2 (1.0×106mL-1)的密度接种时生长状态较佳，笔者认为细胞培养至4 d时形态最典型可能与此接种密度有关。因此，不同实验室采用不同密度接种时，细胞出现典型形态的时间不一致，对细胞进行干预的时间随之而异。
3.4 杂质的去除
研究发现刚接种培养的神经元前2~3 d背景较脏，可见较多杂质，但并不影响神经元的生长，经换液后背景逐渐变清晰。神经元长到3~4 d时，杂质变少，取材干净及低速离心可减少杂质。此外，还应注意鼠龄、取材、消化、换液等问题。
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细胞化学元素篇6
目的： 探讨川芎嗪(TMP)对青霉素致痫大鼠大脑神经元内核转录因子-κBp65 (NF-κBp65)蛋白表达及神经细胞凋亡的影响。方法：使用青霉素致痫大鼠模型， 采用BL-410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层痫样放电， 待癫痫样放电稳定后， 腹腔注射TMP， 待其抑制作用最明显时， 取大脑切片，观察大脑神经元内NF -κBp65蛋白表达的变化。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对NF-κBp65蛋白的表达进行定量分析，并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果： TMP组大脑神经元内NF-κBp65蛋白表达的平均光密度及阳性面积率显著低于模型组， 差异有显著性 (P
【关键词】 川芎嗪 癫痫放电 神经元 青霉素 NF-κBp65
癫痫是以大脑神经细胞群反复超同步放电引起的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱为特征，以反复痫样发作为表现的临床征候群，其发病机制尚未完全阐明。癫痫致脑损伤已被许多动物实验和临床观察所证实，神经细胞凋亡是最近发现的癫痫脑损伤又一途径，虽出现较晚，但却能持续存在。川芎嗪， 化学结构为四甲基吡嗪( tet ramethylpyrazine，TMP)。TMP可抑制海马神经元的放电活动， TMP可明显抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及体重下降［1］，大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或保护作用［2，3］。TMP已被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病［4］的治疗。
NF-κB广泛存在于真核生物中，是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽，与免疫、肿瘤的发生发展、细胞凋亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系，是一种重要的核转录因子。目前，对NF-κB的研究已成为一个非常引人关注的领域［5］。
本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内NF-κBp65蛋白的表达及平均光密度及阳性面积率的变化影响，进一步探讨TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元作用的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 SD大鼠(由武汉大学医学院实验动物中心提供) ， 雌雄不拘， 体重200～ 250g。
1.1.2 实验药品及试剂 盐酸川芎嗪注射液(批号0107001) ， 常州制药厂生产；注射用青霉素钠( 批号00109306) ， 华北制药股份有限公司生产。
1.1.3 实验仪器 BL-410 生物机能实验系统， 成都泰盟电子有限公司生产；江湾I-C型立体定向器， 第二军医大学器材处生产。
1.2 方法
1.2.1 癫痫动物模型 实验选用健康SD大鼠，用10%乌拉坦以10m l·kg-1体重腹腔注射( ip ) 麻醉， 将动物固定在江湾I-2C型立体定向器上，于大脑左、右两侧前卤后3mm，矢状缝旁开3mm 行开颅手术， 暴露大脑皮层记录区域(2mm×2mm)，将银球电极置于左、右两侧的记录部位，信号输入置BL-410生物机能实验系统， 进行左、右两侧脑电记录。用浸有青霉素溶液的明胶海绵(200u/mm3)置于左侧大脑皮层表面， 诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电， 待癫痫放电稳定后， 移去明胶海绵， 用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。
1.2.2 试验分组及取材 将实验大鼠随机分为3组， 每组10只: ①A 组(对照组) ， 麻醉开颅手术1h后取大脑; ②B组(模型组)，青霉素诱发癫痫1h后取大脑； ③C组(TMP组)，青霉素诱发癫痫放电稳定后，再腹腔注射TMP(20mg·kg- 1)，待抑制作用最明显时取大脑。
1.2.3 HE染色 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚约4μm)及HE染色。
1.2.4 免疫组织化学S-P法检测NF-κBp65蛋白相关抗原
主要步骤：
① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
③ Bcl-2采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；
④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；
⑤ 一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；
⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；
⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为NF-κBp65的阳性对照组。
1.3 免疫组织化学结果判断
NF-κBp65相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。
采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对NF-κB p65蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。
1.4 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
NF-κBp65蛋白的表达： A组(对照组) 大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，NF-κBp65表达弱；B组(模型组)大脑皮层神经元胞浆内可见较多的棕黄色颗粒沉积，NF-κB p65表达强；C组(TMP组)大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，NF-κBp65表达弱。图像分析结果显示：A组(对照组) NF-κBp65蛋白表达的平均光密度为0.0934±0.0253；B 组(模型组) NF-κBp65蛋白表达的平均光密度为0.2421±0.0151；C 组(TMP组) NF-κB p65蛋白表达的平均光密度为0.0927±0.0235。A 组(对照组) NF-κBp65蛋白表达的阳性面积率为0.1838±0.0295，B 组(模型组) NF-κBp65蛋白表达的阳性面积率0.2985±0.0354，C 组(TMP组) NF-κBp65蛋白表达的阳性面积率为0.1792±0.0304。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q检验，B组(模型组) 与A组(对照组)、C 组(TMP组)之间NF-κBp65蛋白的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01)，A 组(对照组)与C组(TMP组)之间NF-κBp65蛋白平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05），见表1。
表1 各组NF-κB p65蛋白表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注： * A组与B组比较，（P＜0.01)；** B组与C组比较
（P＜0.01)；# C组与A组比较
（P＞0.05）。
3
讨论
青霉素致大鼠癫痫模型是一种极为有效的、操作简便的实验动物癫痫模型， 其癫痫放电持久稳定， 可以用作抗癫痫药物疗效及癫痫发病机制的研究。青霉素诱发的癫痫电活动是阻断了GABAa受体导致抑制神经网络功能失调而产生癫痫状态的。细胞凋亡(apoptosis)［6］是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。它是细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，引起内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的自然死亡。细胞凋亡的过程不导致溶酶体及胞膜的破裂，没有细胞内涵物外泄，所以不引起炎症反应。
细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程［7］。不仅为维持正常生理功能所必需，而且与某些疾病的发生密切相关。有研究认为［8］ ，癫痫引起脑神经元丢失以细胞凋亡为主。其发生的可能机制是: 凋亡刺激通过不同的受体包括NMDA、p75NTR等传入细胞内，引起凋亡相关基因如p53等的激活，促发细胞内一系列生化改变，如通过NMDA受体引起钙离子超载，激活Ca2+ -Mg2+依赖的核酸内切酶导致DNA断裂; p75NTR介导信号则可能与JNK激活有关，引起c- jun末端磷酸化。在中枢神经系统中［9］ ，NF-κB作为一种重要的"应激传感器"，可通过其活化形式进入细胞核结合于DNA上相应位点，上调c-fos、c-jun、p53等靶基因的转录，神经细胞进入激活状态。海马神经细胞活化即NF-κB /P65的核转位是PTZ点燃大鼠癫痫形成的重要机制之一［10］。且癫痫发作时，NF-κB激活可促进iNOS等表达产生大量活性氧和自由基，氧化应激及各种炎症介质又可再次活化NF-κB、活化蛋白-1 (AP-1)等，加速凋亡相关基因的表达，诱发神经细胞凋亡。但也有研究表明［11］ ，NF-κB活化可介导细胞保护反应，诱导抗凋亡蛋白表达。
目前， 已知川芎嗪有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抗脂质氧化、增加NO 等作用［12］， 其对中枢神经系统损伤的作用已有报告。癫痫作为一种常见的慢性临床综合征， 其发病机制一直是研究的焦点， 神经递质在其中起着不可忽视的作用。C2氨基丁酸(GABA ) 作为一种重要的抑制性神经介质， 可防止神经元过度的同步和持续的放电， 而癫痫样放电正是与一组神经元同时或快速反复放电的突然发生有关。有研究结果表明，青霉素的致痫机理是其能阻断GABA受体， 刺激谷氨酸释放，破坏细胞兴奋性和抑制性的平均， 使兴奋性相对增高。本实验结果显示， 腹腔注射TMP(20mg·kg-1) 能使青霉素致痫后大脑皮层神经元内NF-κB p65蛋白降低， 证明TMP能减少青霉素致痫后大脑皮层神经元的凋亡，使大脑皮层神经元维持正常结构。神经元结构正常， 脑内许多神经递质的合成才得以维持正常平衡状态， 神经元的兴奋性才能保持稳定状态。由此可以推测TMP抑制癫痫放电的作用机制可能是通过改善神经元的结构这一途径实现的。现已公认GABA作为脑内主要的抑制性递质， 具有抗癫痫的作用， 因此TMP可能是通过使神经元结构恢复正常而主要影响GABA这种递质的合成而起到抗痫作用的。TMP的有效成份能充分作用于脑组织，可能是通过其有效的抗氧化损伤和免疫调节功能间接影响了IGF-1、NF-κB的表达［13～15］，从而有效抑制炎症反应，稳定细胞膜，减轻细胞内钙超载，抑制细胞凋亡，促进神经细胞的存活。通过实验表明， TMP可明显使致痫大鼠脑组织NF-κB的表达降低，抑制神经细胞凋亡，促进细胞的存活，对神经细胞具有保护作用。但也有报告NF-κB促进细胞凋亡，细胞凋亡与NF-κB的关系仍需进一步研究。其确切机制还待进一步研究探讨。
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细胞化学元素篇7
关键词：神经元；原代培养；neurobasal培养基；B27；糖-氧剥夺；细胞模型
神经元细胞培养技术是一种常用的技术，广泛用于神经系统疾病的细胞模型[1]，可为神经系统的发病机制和神经保护性药物的筛选提供良好的平台。在以往关于缺血/缺氧脑损伤的研究中，主要集中在动物体内研究，虽然在体试验更接近动物的实际状态，但易受到其他因素影响。体外原代培养神经元细胞，可以得到比较均一的细胞，可根据实验要求控制神经元细胞的生成，有利于动态观察神经元细胞的形态学变化，从而避免了体内研究的许多复杂因素的影响[2]。
1资料与方法
1.1一般资料 出生后新24 h内的SD大鼠，购于新疆医科大学实验动物中心； Neurobasal培养液、B27培养基添加剂、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培养基（Hyclone）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（abcam公司）；多聚-L-赖氨酸、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。无血清培养基： Neurobasal培养基+2%B27培养基添加剂(50x)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+ 双抗(100U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，于冰箱4℃保存备用；多聚-L-氨酸包被液：用PBS液配制0.1 mg/mL多聚-L-氨酸溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。
1.2方法
1.2.1大鼠皮层神经元的分离和培养 取24 h内新生的SD大鼠，采用颈椎脱臼处死小鼠后，放入盛有75%酒精的烧杯中消毒1～2 min。在无菌的环境下用剪刀迅速断头，用预冷的PBS液中漂洗干净移入另一个装有预冷H-DEME的容器内，充分暴露大脑皮层，在显微镜下剥尽皮层的脑膜及血管，将皮层组织剪成碎组织块，向剪碎的组织中加入浓度为0.05%的胰酶在37°C下进行消化，15 min后 终止消化作用。使用1 mL进口枪头对组织进行反复吹打（10次），注意动作要轻柔，且不可产生气泡。 将吹打后的细胞悬液转移入15ml的离心管中于4°C离心 1000 rpm，5 min，使用配制好的培养液对细胞进行重悬。200目筛网过滤，以1×106个细胞/mL，接种于经多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM-HG培养液2 mL，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，4~8 h后用neurbasal+B27培养液换全液1次，以后每隔3 d半量换液1次。培养，4~8 h后用neurbasal+B27培养液换全液1次，以后每隔3 d半量换液1次。
1.2.2大鼠皮层神经元鉴定 免疫细胞化学方法验证神经元细胞的特异性和纯度皮层神经元培养到第7 d时，胞体发育饱满，取出爬片，选择NSE作为皮层神经元特异性标志物，按标准的免疫细胞化学染色法进行鉴定，按说明书步骤进行，以PBS缓冲液代替I抗作阴性对照。随机去3个视野计数阳性细胞百分数并照片。
1.2.3糖-氧剥夺损伤模型的建立 选取培养7 d的神经细胞，吸去培养基并用PBS液轻轻冲洗2遍，用95%氮气和5%二氧化碳气体饱和10 min后的无糖培养基造成缺糖环境，在充满氮气的37℃的细胞培养箱孵育45 min，然后换回原培养液，在37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育6 h。
1.2.4 Western blotting检测神经元细胞的NSE蛋白表达水平 分别提取对照组和糖-氧剥夺组神经元蛋白提取，煮沸变性，电泳2 h，封-闭1~2 h，加一抗NSE (1∶500)、4℃过夜，加HRP标记抗兔二抗孵育1~2 h（1∶30000），曝光rad凝胶成像系统分析结果。
1.2.5统计学方法 运用SigmaStat 3.5统计软件，进行单因素方差分析，实验数据用表示，以P
2结果
2.1 SD大鼠原代培养皮层神经元的形态学观察在倒置显微镜下观察，刚种植的皮层神经元呈圆形、体积小、透亮、单个散在分布，见表1。2 h后开始有贴壁，8 h后大部分已贴壁。3~4 d细胞已有明显的增长的突起，以多级神经元为主，胞体为三角形、梭形、椭圆形、椎体形几不规则形。5~6 d后神经元细胞体进一步变大，突起增粗，连接形成网络。7~8 d时，细胞体积继续增大，胞体饱满，突起分支增大，形成致密网络。14 d细胞数量开始减少。经过氧-糖剥夺后的细胞从形态学观察贴壁能力下降，细胞间隙增大，遮光性降低，少数细胞坏死。
图1 体外培养不同时间大鼠皮层神经元形态观察
2.2免疫组化染色的观察结果，见图2 取第7 d的神经元细胞，NSE免疫组化染色（DBA显色），胞浆和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的为阳性细胞，整个细胞都不被染色为阴性细胞，见图3C。在显微镜下进行观察，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元纯度为90%左右。
2.3 Western blotting测定对照组和糖氧剥夺损伤组中细胞NSE和β-actin表达（图3）糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低，差异无统计学意义（P
图2 皮层神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色（×400）
图3 各组中NSE蛋白的表达（*与对照组比较P
3讨论
体外培养神经元是较困难的原代培养技术，为成功培养出神经元，首先应选用新生（24 h内）大鼠，因为刚刚出生的大鼠的神经元和神经胶质细胞均为分化成熟，可较容易养活。其次是组织块的消化、分离和接种的过程。必须严格控制胰酶的浓度和消化时间，可采用胰酶低浓度，延长消化时间来达到消化均一的效果，尽可能的减少机械损伤。再次是培养基的选择。血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。无血清培养基neurobasal是较好的培养基。需要的添加剂为 B27，培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。
在体外培养神经元基础上氧-糖剥夺模型是模拟在体缺血模型，又称"离体缺血模型，大致可分为：化学缺血模型和氧-糖剥夺模型。化学模型如氰化物可抑制养花磷酸化，从而阻断了ATP的产生。氧-糖剥夺模型采用去氧处理过的无糖培养基孵育细胞，再放入缺氧箱，使细胞处于缺氧、缺糖状态。细胞缺氧比较均一。离体细胞模型的实验条件容易控制、恒定，却可以在损伤过程中评价细胞功能，离体药物评价和筛选可直接作用细胞。本课题组采用用95%氮气和5%二氧化碳气体饱和10 min后的无糖培养基造成缺糖环境，在充满氮气的37℃的细胞培养箱孵育45 min，然后换回原培养液，在37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育6 h，造成一根缺血再灌注损伤模型。经过氧-糖剥夺后的细胞从形态学观察贴壁能力下降，细胞间隙增大，遮光性降低，少数细胞坏死，并通过Western blotting检测NSE蛋白表达。NSE主要存在中枢神经系统和神经分泌细胞中。在缺血/缺氧致神经元细胞损伤中，干扰了神经元的代谢变化，神经元细胞膜的功能和结构受损，NSE从胞浆中释放至细胞外，则细胞中NSE含量下降，NSE的含量可敏感的反应神经元损伤程度。在对照组和模型组中NSE蛋白表达的差异比较，氧-糖剥夺模型组NSE蛋白明显降低，差异有统计学意义。表示达到了缺血缺氧目标，较好的模拟了急性缺血对细胞的损伤模型。
参考文献：
[1]乔治・阿德尔曼．神经科学百科全书 [M]．神经科学百科全书翻译编辑委员译[M]．上海:伊克豪伊萨尔出版社,上海科学技术出版杜,1992:1043-1050．
细胞化学元素篇8
关键词:固氮 施肥 粮食作物 细胞杂交
1.生物固氮研究的现状
生物的物质基础是由各种化学元素和化合物构成,其中有一种重要的大量元素,氮元素。虽然空气中有78%是氮气,但绝大多数生物不能直接利用空气中的氮气。特别是粮食作物,直接从土壤中吸收的氮素很少,每年都需要人类施加很多的氮肥来提供氮元素,但是这样会给环境带来很大的污染。因此,生物固氮是生命科学中的重大基础研究课题之一,它在生产实际中发挥着重要作用。为粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少对环境的污染和促进农业可持续发展。如果主要粮食作物水稻等能够自主固氮,就可以让粮食作物摆脱对化肥的依赖性,既节省能源,又能对环境友好。现在国内外很多学者都对提高生物固氮这一课题进行研究,也取得了很多成果。学者们是从研究固氮的基因和酶着手探索。而且有的学者已经成功分离提取得到了细菌的固氮基因。
2.提高水稻等农作物固氮能力的方案
固氮为什么会提高粮食作物的产量呢?我认为生物固氮能提供大量的氮元素,能合成主要的化合物蛋白质和核酸。其次,氮元素是合成植物光合作用必须的矿质元素,氮元素的保障,是植物提高光合作用的基础。所以,固氮作用可以提高粮食作物的产量。而在植物中,能自行固氮的植物主要是豆科植物,而且豆科植物能固氮的原因并不是豆科植物本身能固定大气中的氮气,而是与能自行固氮的细菌共生,从而达到固氮的效果。固氮细菌与豆科植物两者相互依赖,豆科植物为微生物提供营养,微生物固定大气中的氮气来供给豆科植物使用。自然界主要的固氮细菌有两大类:自生型和共生型。有的科学家从固氮生物体内分离出了固氮的基因,不过把这个基因通过转基因技术导入植物细胞内时,受体植物并没有表现出固氮能力。因此,我试想,能不能让水稻等粮食作物的受精卵细胞与微生物细胞融合,然后用缺少氮元素的培养基来对融合成功的融合细胞进行培养、筛选。具体的操论如下:
2.1选材
2.1.1在实验室里准备杂交水稻数株,在适宜条件下栽培,培养到开花期。待水稻植株授粉后从雌花子房中取出受精卵细胞备用。
2.1.2在实验室内,用含固氮菌(圆褐固氮菌)的土壤制备土壤溶液,用不含氮元素的培养基来选择出圆褐固氮菌,分离提纯后,培养备用。
2.2细胞融合
2.2.1利用纤维素酶和果胶酶去掉水稻的受精卵细胞的细胞壁,制得水稻受精卵细胞原生质体,并用荧光标记细胞膜;
2.2.2用肽聚糖酶去掉圆褐固氮菌的细胞壁,制得圆褐固氮菌的原生质体,同时也用不同的荧光标记细胞膜;
2.2.3用灭活的仙台病毒诱导两种原生质体融合,当然会使水稻受精卵与水稻受精卵原生质体融合、圆褐固氮菌与圆褐固氮菌原生质体融合和水稻受精卵与圆褐固氮菌原生质体融合,这时,就可以通过标记好的荧光来选择出有两种荧光标记的细胞,就是用来培养的融合细胞。
2.3筛选目的植株
将选出的融合细胞最先接种在完全培养基中,同时也要培养一些正常的授粉水稻,作为对照实验组。待培养基里的细胞分化出根和芽后(最好用液体培养基,便于水稻的移植),再移植到缺少氮元素的培养基中培养,培养基里的水稻植株与实验组除了在培养基里缺少氮元素外,其他条件都要保持一致。
2.4预期结果
2.4.1在缺少氮元素的培养基里的水稻全出现症状,最后全部死亡。说明没能培育出能自行固氮的水稻植株。
2.4.2如果在缺少氮元素的培养基里的水稻苗能比作为对照的正常水稻苗长势还要好,这些水稻苗就是能自行固氮的植株。
2.5扩大培养
利用选取出的目的水稻植株进行切碎,利用植物组织培养,先让离体组织脱分化,形成愈伤组织,再让愈伤组织再分化,可以培育出大量能自身固氮的水稻植株。
2.6分析
利用以上操作方法获得的能自身固氮的水稻,固氮性状到底是属于细胞质遗传还是细胞核遗传;是显性性状还是隐性性状。这也是我下一步将要进行的探索项目。
在上述实验操作过程中,水稻的受精卵细胞可换作其他的粮食作物的受精卵细胞,圆褐固氮菌也可换成其他的能固氮的细菌。个人认为根瘤菌是用来做细胞融合的最好的固氮菌,因为有的科学家认为,最初的根瘤菌也是自生型的细菌,可能是被植物的根系从土壤中捕获,然后逐渐进化,变成现在的与植物根系共生型的细菌。现在它是属于共生型的细菌,不能用培养基大量培养作为材料,所以我下一步将从探索如何培养共生型的根瘤菌入手。
以上就是我对如何提高水稻等粮食作物固氮能力的一点见解,由于作者经验和资质不足,而且所在学校没有足够的实验器材和相关设备,所以只能做作出理论上的探索。但其中肯定存在很多不足和不妥之处,望各位专家和同仁提出宝贵的意见。
参考文献:
[1]《全日制普通高级中学教科书(必修)生物》.人民教育出版社,2002年.
[2]《全日制普通高级中学教科书(选修)生物》.人民教育出版社,2002年.
[3]刘庆昌.《遗传学》.科学出版社,2006年.
[4]《植物组织培养》.中国农业大学出版社,2007年.