细胞凋亡范文

时间:2023-03-12 08:17:20

细胞凋亡

细胞凋亡范文第1篇

论文摘要: 细胞凋亡又叫细胞程序性死亡,是植物正常发育中必不可少的一部分,目前已成为植物细胞生物学研究的一个热点。本文对植物凋亡的一般特征、植物营养和生殖生长中的细胞凋亡以及植物-病原物互作中的细胞凋亡进行了综合评述,并对植物细胞凋亡研究的现实意义进行了探讨。

细胞凋亡是多细胞生物体在生理或病理条件下部分细胞所采取的一种由内在基因编程调节,通过主动的生化过程而自杀死亡的方式[1 ]。由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控,所以常常又称为细胞编程性死亡。细胞凋亡的现象最早是kree在1965年观察到的,经过进一步深入研究之后,他于1972年将其重新命名为细胞凋亡。之后近20年,细胞凋亡的研究主要集中在动物,人们越来越认识到细胞调亡在动物生长发育中、尤其在维持动物体内细胞和组织平衡、特化、形态建成和防病、抗病过程中的重要作用。同动物一样,在植物生长发育中也存在着细胞凋亡现象。但由于植物生长发育和细胞结构的特殊性,有关植物细胞凋亡的研究起步较晚。近年来,随着植物细胞凋亡的研究进展,人们逐渐认识到细胞凋亡是高等植物生长发育的必要组成部分,同时也是植物体度过不良环境的重要手段。目前,植物细胞凋亡的研究已成为近年来植物细胞生物学的新兴研究领域和热点之一。本文就植物细胞凋亡的一般特征、检测方法、在植物中的存在及意义作一综合阐述。

1 植物细胞凋亡的一般特征

经历细胞凋亡过程的细胞呈现一些典型的形态学变化,光学显微镜或 电子 显微镜观察可见:细胞体积缩小,染色质凝集、断裂、趋边化,细胞器解体、消失,细胞膜发泡形成凋亡小体(其中包含有凝集的细胞核断片和细胞器) [3.4]。随着研究的深入,分子生物学证据也逐步被阐明:细胞染色质dna 在核小体连接部位断裂,其片段大小为200bp的倍数,经琼脂糖凝胶电泳可见到特征性的dna 梯度(dna ladder) ,此特征还可以通过超速离心、末端标记电泳以及原位缺口翻译技术等进行定性、定量测定。细胞形态学和分子生物学的变化是细胞凋亡的重要诊断依据。

2 细胞凋亡的检测方法

2. 1 细胞形态学观察法

苏木素- 伊红(he) 染色法: 石蜡切片的he 染色是组织形态学检测的常规方法, 光学显微镜下细胞核呈蓝黑色, 胞浆呈淡红色。凋亡细胞在组织中单个散在分布, 表现在核染色质致密浓缩, 核碎裂等。

(1)电子显微镜。电镜观察,凋亡细胞染色质固缩,常聚集于核膜上呈境界分明的块状或新月形小体, 初期细胞可见完整的细胞器, 细胞膜完整, 凋亡小体形成。目前一致认为, 电镜下获得凋亡细胞特征性的形态学改变是判断细胞凋亡的最可靠依据。

(2) 荧光显微镜。对体外培养的活细胞经荧光色素处理, 可在荧光显微镜下观察细胞形态改变。常用荧光色素有吖啶橙、hoech st 33258或hoech st 33342、碘化丙啶(p i)、溴乙锭(eb)。前两种可分别进入活细胞和死细胞, 而后两种荧光素仅能进入死细胞。不同的荧光素使核着染不同颜色的荧光, 正常细胞呈均匀荧光染色, 而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光。

2. 2 反映凋亡细胞膜改变的方法:染料排斥法。

除了电镜能反映细胞膜完整性外, 还可用染料排斥法, 如台盼蓝、p i 等。坏死细胞膜破损, 被染料着染。而凋亡细胞细胞膜完整, 不被着染。但在体外培养的细胞最终也会发生继发性坏死。因此, 此法不能单独用来判断凋亡细胞。另一种方法是判断胞质膜的不对称性。在正常细胞膜上, 磷脂酰丝氨酸基团(ps) 位于胞内侧, 而在细胞凋亡早期膜上此基团则转向胞外侧, 以利于被吞噬。因此, 磷脂酰丝氨酸基团位置的改变, 可作为凋亡细胞的一个标志。

2. 3 反映脱氧核糖核酸有 规律 断裂的方法

细胞凋亡过程中,dna有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。

(1) 琼脂糖凝胶电泳法。细胞悬液经裂解消化按常规法提取dna后, 于含eb 的琼脂糖凝胶中进行电泳,正常细胞dna呈单一条带。细胞凋亡时呈典型的梯状条带,系180~ 200 bp 左右的及多聚核小体的梯状dna条带。坏死时则呈现模糊的弥散状条带。dna电泳法是判断细胞凋亡的经典方法. peg6000 诱导的小麦叶片[7] 、羟自由基诱导的烟草细胞[8] 、细胞色素c诱导的胡萝卜和烟草原生质体[9] 和乙烯诱导的胡萝卜原生质体[10]发生pcd 时均检测到dna 梯状条带。

(2) 流式细胞仪检测法。细胞发生凋亡时, 其细胞膜的通透性增加, 但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间, 利用这一特点, 被检测细胞悬液用萤光素染色利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞萤光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

( 3 ) 原位末端标记法( in situ end2l abeling,isel )。通过dna 多聚酶i 把已标记的核苷酸结合到dna 的单链断裂处, 以寻找有无ap 发生。标记的方法有同位素标记、荧光素标记、地高辛或生物素标记等。

(4) 原位切口平移法( in situ n ick t ran slat ion, is2n t )。利用dna 多聚酶将核苷酸整合到ap 细胞内断裂的dna 3′羟基末端, 同时水解5′末端,以修复dna。若用已标记的核苷酸, 即可显示出有断裂dna 的细胞。该法同样也可用于细胞悬液中ap 的观察。

( 5) 末端转移酶介导的缺口末端标记法(tdt 2m e2diated x2du tp n ick end labeling, tun el )。末端转移酶(tdt ) 介导的x2du tp 缺口标记法是目标原位检测ap 最为敏感、快速、特异的方法, 其具有广泛的应用前景。末端转移酶(tdt ) 可催化在dna 片段的3′羟基末端合成多核苷酸聚合物的反应, 即dna 片段加尾。利用末端转移酶(tdt ) 将标记的脱氧核苷酸转移到dna 缺口或3′羟基末端上, 通常所用的核苷酸为du tp, 标记物为地戈辛、生物素、荧光素等。

(6) el isa 法。对ap 细胞内dna 片段的检测还可用el isa 法。悬浮细胞经裂解, 高速离心去除核的成分后, 取上清加入已包被有抗组蛋白抗体的反应板, 反应后再加酶标抗dna 抗体, 若上清中含断裂的dna片段, 则可通过此双抗体夹心法得以检出[11]。

3 植物发育过程中的细胞凋亡

萌发的种子中的糊粉层、维管束的木质部、生殖器官的组织(如花药和子房)及根冠等组织中均有细胞凋亡的发生[12]。虽然在细胞水平上, 与细胞凋亡相关联的水解酶的激活、一些蛋白的失活以及核dna的断裂都可以经常观察到, 但是这些现象的发生机制到近来才有所了解。

3.1 导管的形成

导管是由排列有序的死亡的导管分子(tracheary elements, tes)构成。王雅清和崔克明[ 13 ]对杜仲木质部导管分化的研究证明,其分化过程也发生了细胞凋亡。所有这些研究都表明木质部导管分化与细胞凋亡有密切关系。玉米生长过程中在一定条件下根部皮层细胞崩溃死亡形成通气组织, 而通气组织与植物的同化、呼吸、蒸腾作用都有密切关系[14 ].

3.2 单性花的形成

许多单性花植物在花原基分化时存在雌蕊和雄蕊原基细胞,在后期发育的特定阶段雌蕊或雄蕊原基细胞出现细胞凋亡,从而最终形成单性花。

3.3 大、小孢子的形成和发育

大多数种子植物中, 大孢子母细胞减数分裂形成4 个大孢子。仅有1 个能发育成雌配子体, 其余的3个大孢子退化。例如, 蕨类植物大孢子母细胞减数分裂产生4个大孢子, 这4个大孢子通常呈线型或t型排列, 仅有1个能继续发育成雌配子体, 其余3个都死亡。对其超微结构的研究表明,其退化解体过程也符合细胞凋亡的基本特征[15] 。

3.3 雌雄配子体的发育

植物中雌雄配子体的发育有细胞凋亡参与其中。裸子植物雄配子体发育过程中, 原叶细胞的退化和雌配子中颈细胞、腹沟细胞的消失及珠心细胞的衰退也是细胞凋亡的结果。在被子植物雌配子体(胚囊)发育过程中,珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程是细胞凋亡[16].

3.4 胚的发育

在胚性细胞分化和发育过程中,存在着细胞凋亡[17]。植物的胚由受精卵发育而成, 在胚的形成过程中,助细胞、反足细胞和胚柄细胞都因发生细胞凋亡而消失。胚柄由受精卵第一次分裂形成,当胚发育到一定阶段,胚柄发生细胞凋亡, 形态上表现为质壁分离, 原生质体固缩。单子叶植物的种子中, 在胚和胚乳之间有一层或几层排列整齐的糊粉层细胞, 含大量糊粉粒。胚胎发育早期由胚柄提供营养形成种子, 后期则通过糊粉层细胞形成分泌组织, 分泌水解酶, 水解胚乳成分, 种子萌发后, 糊粉层功能完成, 便开始凋亡,是典型的细胞凋亡。在种子萌发过程中,其他胚乳和无胚乳种子子叶中一些贮藏细胞也会发生类似的细胞凋亡, 没有这些细胞凋亡,幼苗就不能正常生长发育, 会因饥饿而死亡。

3.5 根冠细胞的死亡

根冠位于根尖的顶部,是由许多薄壁细胞组成的冠状结构。在根的发育过程中,根冠细胞不断脱落,并由顶端分生组织不断产生新的细胞,从内侧补充使根冠细胞得以保持定数。对根冠细胞脱落的研究证明,其脱落过程是典型的细胞凋亡。正是这些细胞的主动死亡,才保证了根顶端分生组织在生长过程中避免与土壤磨擦而受伤,进而保证了根的正常发育。对玉米根尖进行低温胁迫或用细胞毒素类药物如放线菌d、秋水仙碱处理后,这些根尖分生组织细胞同样具有dna ladder、染色质和细胞核浓缩等特征,说明环境因子和药物也可诱导根尖细胞发生凋亡[19.20] 。

3. 6  叶发育过程中的细胞凋亡

在叶子的发育过程中,叶缘的各种裂、齿和叶片中的空洞(如龟背竹叶片) 的形成等都是由于相关部位细胞的凋亡所造成的。此外,对叶片衰老过程的研究发现,衰老起始时,叶绿体首先被自体吞噬,此后水解酶、rna 酶等活性上升,而且以液泡内半胱氨酸蛋白酶活性最为显著[21 ] ,这些都是细胞凋亡的特征。因此,叶子脱落前叶片的衰老过程也是pcd。

4 环境胁迫诱导的植物pcd

4. 1  植物超敏反应中的pcd

超敏反应(hypersensitive response hr) 是植物被病原物侵染后所引起的适应性反应,其中的细胞死亡被证明是细胞凋亡。在植物超敏反应中,dna 片段化,特征性切割核小体的核酸酶被激活等生理生化特征和凋亡小体等形态特征都被证实。

4. 2  盐胁迫诱导的pcd

无机盐kcn、nacl 、cacl2 和一些重金属离子等在一定条件下均可诱导植物细胞出现与动物细胞凋亡类似的特征。宁顺斌[22]等人的实验证明烟草、玉米的根尖在高盐(nacl 500mmol/ l)处理后,出现明显的dna 梯状电泳图谱。林久生和王根轩[23]用20%peg溶液(-0.63 mpa)对小麦根系进行渗透胁迫,在小麦叶片dna琼脂糖凝胶电泳图谱上观察到明显的梯状dna 条带,表明peg处理诱发了dna核小体间的断裂,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的3’oh末端标记法(tunel)检测出现阳性结果。

4. 3  活性氧与植物细胞凋亡

活性氧是一类具有强氧化能力的物质,主要包括超氧化物、过氧化氢、羟自由基等,各种逆境条件,包括冷害、渗透胁迫、低氧、臭氧、紫外线等导致的植物细胞凋亡最终都与活性氧的产生有关。当细胞外一些信息如辐射、高温等通过细胞活性氧传入细胞引起其脂质过氧化或与细胞凋亡有关基因的表达时,细胞也会凋亡[24]。陈明等[25]研究发现以一氧化氮(no)供体硝普钠(snp)处理小麦可以明显提高ros 清除酶,如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等活性,从而清除因盐胁迫产生的氧自由基或活性氧ros,或直接清除ros来保持细胞处于还原状态。

5 研究植物细胞凋亡的意义及展望

导管细胞的退化死亡、筛管细胞原生质的自溶,形成了植物体的输导组织;这些细胞死亡之前,细胞内物质可被其他细胞回收利用,这是植物能够独立营养的一个特性,叶片衰老死亡即是适应营养重新分配的结果,但这个过程却影响了农产品的产量。因此,要搞清植物细胞凋亡的发生程序,对粮食生产及作物储藏技术改良都具有重要的现实意义。在超敏反应中,被病原体感染的宿主细胞采取主动死亡的方式,从而限制感染部位病原菌的生长,阻止病原菌的传播,以达到防病抗病的目的。这种植物自身的主动抗病反应,若在植物抗病育种中加以应用,使植物能够自动、有效地抵抗病原物的侵染,就可以减少农药的使用,避免环境污染,从而提高人类生活质量。

由于植物细胞凋亡的同步性很低、凋亡时间很短,同时由于细胞内各种因子相互作用,调控机制及其复杂,使分子生物学技术应用于细胞水平的研究存在很大困难。近年来,利用非细胞体系来研究细胞凋亡的模式的建立和应用弥补了上述不足。有研究表明[26],利用非细胞体系研究细胞内复杂的生化活动具有独特的优越性,在细胞周期调控、dna 复制、核小体与染色质构建等研究中发挥了重要作用。非细胞凋亡体系的建立与利用,在很大程度上促进了人们对植物细胞凋亡生化和分子机制的研究,为植物细胞凋亡研究开辟了新途径。

随着植物细胞凋亡的研究的逐步深入,发现植物细胞凋亡需要研究的方面还很多。植物体发生细胞凋亡的机理还不清楚,植物细胞中与细胞凋亡有关的基因研究还远没有动物深入。尽管许多实验表明植物细胞凋亡与动物是相似的,但分子水平共同特征少,目前仅发现少数几个基因参与植物细胞凋亡的过程[27] 。研究过程中常局限于某一特定现象,很少有将这些现象和植物发育的具体过程联系起来,加上植物生长周期较长,给研究带来一定困难。植物细胞凋亡的研究如果能与植物的 经济 利用联系起来,将具有重要实践价值。如能发现诱导果实发育中细胞凋亡发生的因子,通过人为调控,改变生长发育期,提高果品产量和品质,则将会极大地推动果树 现代 化生产的 发展 。

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细胞凋亡范文第2篇

【中文图书号】d919.4

【文献标识码】b

【文章编号】1007—9297(20__)03—0232—03

自1972年由kerr等提出细胞凋-l~?(apoptosis)的

概念后。人们对细胞凋亡现象进行了广泛深入研究。

随着医学分子生物学的不断发展,细胞凋亡已成为

医学界研究的热点之一。现已证实,在缺血一再灌注

损伤、创伤感染、全身炎症反应(sirs)、多脏器功能

障碍综合征(mods)、退行性变以及中毒等中均存

在细胞凋亡的情况。目前,我国法医界已经开始利用

细胞凋亡理论和技术。进行法医毒理病理学方面的

研究。f 卅

、细胞凋亡

(一)细胞凋亡的概念

细胞凋亡又称程序性细胞死亡(pr0grammed cell

death pcd),是在一定的生理或病理条件下,细胞按

照自身既定程序主动结束生命的一种死亡形式。是

由一些特殊信号刺激细胞内在固有的死亡程序所诱

发的细胞主动死亡现象。细胞凋亡是细胞衰老、死亡

的正常生理过程,然而,许多致病因素也能导致凋

亡,被称之为病理性细胞凋亡。

(二)细胞凋亡与坏死的区别

坏死(necrosis)是细胞受到强烈理化或生物因

素作用引起细胞无序变化的死亡过程。首先膜的通

透性增加,细胞外形不规则变化,内质网扩张,核染

色质位移,细胞核和线粒体肿胀,溶酶体破坏,细胞

膜破裂,胞浆外溢,坏死的细胞被巨噬细胞吞噬,引

起周围组织不同程度的炎症反应。

凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号,

环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化

的死亡过程。首先是染色质的凝集,嗜碱性染色增

强,细胞核崩解。线粒体保持形态正常。最后细胞收

缩变圆,胞体变小,染色质固缩,凝集至核膜周边,胞

浆浓缩,内质网扩张并与细胞膜融合,核仁裂解,细

胞皱缩,继之细胞内陷将细胞分割成大小不等的、多

个具有膜包囊的细胞凋亡小体fapoptotic micro—

body)。他们从细胞表面出芽脱落,并被吞噬细胞、上

皮细胞吞噬。由于此过程不发生溶酶体、线粒体及细

胞膜破裂,没有细胞内涵物外溢,故不引起炎症反应

和周围组织次级损伤。

(三)细胞凋亡的基因调控

细胞凋亡是一系列基因的激活、表达、调控的结

果。调控基因主要通过死亡受体途径(如fas/fasl

受体一配体系统)介导,引起caspases激活导致细胞

凋亡,这是大多数细胞凋亡的形式。有研究发现,有

些促凋亡基因如bax即使在caspases失活的情况

下仍可介导线粒体损伤,使线粒体膜通透性增加,释

放细胞色素c导致细胞凋亡。这表明线粒体是介导

细胞凋亡另一途径。另外。也可通过内质网途径发生

凋亡

[作者简介]张海东(1969一),男,汉族,山东人,医学学士,副教授,副主任法医师,研究方向:法医病理学;

tel:+86—10—68633318。e—mail:zhd_ zzw@126.com

法律与医学杂志20__年第14卷(第3期)

调控基因包括促进细胞凋亡的基因和抑制细胞

凋亡的基因两大类阁。凋亡促进基因(apoptosis on)包

括野生型p53,ice,tgfb,fas,c—myc,ced一3,ced-

4。bax等。凋亡抑制基因(apoptosis of)包括bc1-2,

rb.ced一9,突变型p53等。

二、细胞凋亡与中毒

(一)细胞凋亡的毒理学意义

细胞凋亡不仅是多细胞体的生命过程,也是机

体受外源物质侵害时的一种病理性防御反应。外源

化学物质作用于机体,其毒性呈现一定的剂量一效应

关系和时间一效应关系,而这种s形曲线同样出现在

外源物质诱导凋亡的过程中。在一定剂量范围内,外

源化学物质作用于细胞并不直接杀死细胞,而只是

引起细胞损伤,使这些细胞获得了激活内在程序性

自杀机制的能力,最终导致细胞凋亡,且凋亡细胞数

与毒物的剂量和作用时间呈明显s形关系曲线。而

当毒物作用超过细胞负荷能力,它便会象机体发病

那样表现出“病态”一坏死,从而引发一系列的继发

损害。[61

(二)细胞凋亡的毒理学研究

近年来。在一些中毒实验研究中已发现存在细

胞凋亡的现象。韦献良等同研究发现海洛因成瘾大

白鼠脑组织广泛出现神经元凋亡。并认为这是海洛

因成瘾致脑细胞神经元死亡的主要形式。

saleh等[81在低剂量对氧磷中毒鼠模型中发现

有典型细胞凋亡的特征。田英平等[9】在大鼠急性甲

胺磷中毒的模型研究中发现存在膈肌细胞凋亡,由

此,推测膈肌细胞凋亡可能是急性有机磷中毒、呼吸

肌麻痹发生和呼吸肌功能不全的原因之一。王英鹏

等㈣对有机磷中毒后的动物迟发性神经病变中细

胞凋亡的变化进行了研究,发现在母鸡三磷酸甲酯

中毒模型中出现腰髓前角神经元细胞凋亡现象。说

明通过凋亡引起神经元功能损伤在有机磷中毒后迟

发性神经病中起重要作用。曾明等[11】对乐果对小鼠

骨骼肌的细胞毒性和凋亡诱导效应进行研究,发现

乐果对离体骨骼肌细胞具有明显的细胞毒性。并诱

导骨骼肌细胞的凋亡,可能在有机磷农药中毒中间

型综合征(ims)的发病过程中发生作用。

井玲等[ 21报道,在氟化钠中毒大鼠中,氟化钠

致肝细胞凋亡,且在氟中毒肝脏病变中扮演重要角

色。呼亚伟等[ 31研究发现氟中毒可导致肝、肾细胞

凋亡,p53参与并介导细胞凋亡。邢德利等㈣研究认

为,过量氟致大鼠脑细胞增殖能力下降和细胞凋亡

· 233 ·

增高。与氟神经毒性作用机制有关。

piantadosi等旧在大鼠一氧化碳(co1中毒研究

中发现。co中毒后鼠大脑内既有脑细胞坏死,又有

脑细胞凋亡的现象。刘菲等[ 61在其实验研究中得

出。co中毒致大鼠脑细胞凋亡,可能是co中毒致

脑损伤的病理机制之一。刘颖菊等旧研究发现急性

co中毒可引起小鼠大脑皮层、海马、纹状体等部位

脑细胞凋亡,凋亡细胞在3天后明显增加,5~7天达

到高峰,14天后恢复正常,同时可诱导促凋亡基因

fas、fasl蛋白表达,表达高峰在中毒后3~2天,早

于凋亡发生的时间。认为中毒所致迟发性脑病可能

与脑细胞凋亡有关。刘福佳等[18】通过观察co中毒

后小鼠海马细胞凋亡和凋亡相关因子bcl一2、bax和

caspasa一3蛋白表达变化。进一步探讨了co中毒迟

发性脑病的发生机制。

朱万琴等[ 91在大鼠醋氨酚中毒研究中报道。醋

氨酚所致肝细胞凋亡,随中毒剂量增大,肝细胞凋亡

数增多。同时伴大量肝细胞坏死。认为肝细胞凋亡过

度同样是肝细胞损伤的一种方式,可能是肝细胞坏

死的主要机制。

dusinska m 等研究发现。百枯草中毒后大量

超氧阴离子自由基的产生导致强烈外源性氧化应激

反应。直接引起肺组织细胞dna的损伤而致细胞

凋亡明显增加。另外,杨俊慧等[21】发现在卡那霉素

耳中毒后耳蜗毛细胞存在凋亡。在耳蜗损害中起重

要作用。

(三)细胞凋亡的法医毒理病理学研究

程亦斌等[ 】通过建立小鼠毒鼠强中毒的实验模

型。通过常规h-e染色及凋亡细胞检测技术对小鼠

毒鼠强急、慢性中毒后脑、心、肝、肾等器官的病理学

改变进行系统研究分析,发现急性大剂量毒鼠强中

毒后,在组织细胞尚未来得及大量发生凋亡的前提

下,机体已因阵发性或持续性痉挛抽搐而死亡,但其

发生凋亡的细胞数仍较正常对照组为多,只尚未达

到高峰。慢性中毒组小鼠在中毒后的不同时间段内,

脑、心、肝、肾等器官凋亡细胞数均高于正常对照组

及急性中毒致死组,且同一器官的凋亡细胞数在不

同中毒时间段内有所差异;不同器官的凋亡细胞数

的峰值在不同中毒时间段内亦有所不同。认为慢性

毒鼠强中毒,在临床症状不明显及法医毒物分析难

以检测的情况下,应用凋亡细胞检测技术可成功检

测出机体的主要器官的病理学改变,表明小剂量、慢

性中毒对机体仍有一定的影响。

· 234 ·

以后,雷怀成等 分别对乌头碱中毒的心肌细

胞、肝细胞和肾小管上皮细胞凋亡的观察。发现大鼠

在中毒后的不同时间段,心肌细胞、肝细胞和肾小管

上皮细胞凋亡数均高于正常对照组,且同一器官的

凋亡细胞数在不同时间段差异有显著性。提示在乌

头碱中毒临床症状不明显及毒物分析难以检测的情

况下.应用凋亡细胞检测技术可成功检测出心肌细

胞、肝细胞和肾小管上皮细胞的病理学变化。

三、结语

许多资料表明.外源性化学物质可以诱导或抑

制细胞凋亡,凋亡又与细胞生物学、免疫学等多种重

要的生物学科和医学学科相关联。我国法医毒理学

具有鲜明的特色旧,有许多毒物的中毒机制等方面

仍需进一步探讨。上述法医学研究结果为毒理学、法

医毒理病理学及临床医学提供了较为系统的资料,

为今后其他类似毒物的法医毒理病理学研究提供了

新方法和实验依据。

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细胞凋亡范文第3篇

关键词:细胞凋亡;肿瘤发生;Warburg效应;癌基因

中图分类号:Q784文献标识码:A文章编号:1007-7847(2015)01-0001-05

Transformation of Apoptotic Pathway:Development-Biological Concept of Tumor Formation

XIAO Jing-ping

(College of Life Sciences,South China Agricultural University,Guangzhou510642,Guangdong,China)

Abstract:Oncology directed by oncogene regime has been progressing rapidly,yet cancers have been becoming the first place killers of human beings.It is not technology backward but the direction of research that contributes to such a paradox.In 1950s,Otto Warburg carried out pioneer works about the latency period of cancer from the stand point of metabolism,discovering the well known aerobie glycolysis.Since the establishment of oncogene regime in 1970s,the emphasis of research has been turned to blown cancers.The rapid development of molecular oncology has explained in depth the standard point of view of this regime,resulting in an concept of fatalism that everybody bears on cogenes,contradicting to the evolution principle of natural selection.Recent discoveries that some apoptosis promoting factors,or the tumorsuppressors,promoted tumor formation,taking to get her with some featuress hared by bothearly apoptosis and tumorigenesis,and two-faced nature(promoting both apoptosis and on cogenesis)of certaing rowth factors,led to an ewconcep to the latencyperiod of cancetrans form ation of apoptotic pathway in to on cogenesis.It is concluded that if the majorresea rchresources could be redistributed to the exploration of latency period on the basis of the achievement of molecular oncology.an effective strategy of cure and prevention might be developed so that malignant cancers could be effectively detected and treated while they still are cancer precursors.

Keywords:apoptosis;oncogenesis;Warburgeffect;oncogene

当今在肿瘤学领域里,癌基因理论研究迅猛发展,各类信息呈爆炸式累积。然而,反观临床方面,癌症却日益增长为人类的头号杀手。我们认为,形成这种严峻局面的原因主要不在先进的分子水平的技术层而上。而是指导癌症研究的方向出了问题。为此,首先检讨了癌基因论的得失;然后重温了Warburg关于癌潜伏期的开创性研究;接下来讨论了基于发育生物学的细胞凋亡途径转向假说(下文简称凋亡转向apoptosis transformation)及其实验依据;最后,提出关于在代谢论和癌基因论成就的基础上,将主要研究资源重新配置到癌潜伏期的建议。

1癌基因论

1.1癌基因论的贡献和矛盾

20世纪70年代,随着分子生物学的迅猛发展。在癌细胞中发现了基因变异。在这个突破性的发现引领下,以原癌基因(prooncogene)为基石的癌基因论建立了起来,成为发展分子肿瘤学的里程碑[1]。概括来说。癌基因论有两大贡献:

1)在分子水平上深入揭示了癌细胞的本质。癌基因论的成熟概念认为,癌是一种基因病,由体细胞突变引发而无序增长的单细胞克隆所构成,值得注意的是,这种体细胞突变是随机地发生在整个基因组内的只有在偶然情况下,突变发生在一系列而不只是单个有关基因时,DNA受损细胞才可能逐渐发展成癌[2],因此,并不存在单一的致癌基因变异(cancer causing alteration),而只有一系列的涉癌基因变异(cancer contributing alteration)。由此可见,从一个DNA受损细胞蜕变为癌的概率实际上是较低的。这就是为何估计癌变会有一个长达十几年,乃至数十年漫长潜伏期[3、4]。这是一个重大的理论上的突破,给人们带来了从分子水平上早期诊断,以及通过细胞操作根治癌症的期望。在临床上也出现了一些高科技治疗方法

2)在分子水平上推动了发育生物学的发展。事实上,许多在发育上的重要生长因子,首先是作为癌基因被发现的。例如,首批定性为抑癌因子的p53。最初被认为是癌基因。后续的实验才发现。当初合成供试p53的cDNA,其模板mRNA是从肿瘤细胞中提取的[3]。另外,同为首批定性为抑癌因子的Rb其最初被发现时也认为是癌基因[3]。另一个有意思的例子则是cMyc的行为。这个众所周知的癌基因,后来证明它的发育生物学功能是促进细胞分裂,而且在DNA受损细胞修复失败后,立即扩增促进p53依赖的细胞凋亡途径。它的促癌功能只有在p53或抗细胞凋亡因子,如Bim,失效时,才会表现出来[4]。

1.2发育生物学上的视角错位

这里所谓的视角错位,指的是癌本位观点。即:在观察肿瘤发生时,单从癌体而不是从整体出发;在分析理解累积的信息时,只从癌细胞而不是从肿瘤发育的全过程着眼。癌本位视角在研究方向上的偏差,主要表现在以下两个方面:

1)不符合系统发育学,也就是进化论的原理。众所周知,肿瘤发生是高度分化细胞朝着低分化胚性细胞的退化过程。然而进化论的基本法则是物竞天择,适者生存。因此人们不禁要问,在严酷的自然选择压力下进化生存过来的高等动物。其基因组中为何会出现导致细胞退化,并可能威胁生命的原癌基因?其实,大量事实已经证明,所谓原癌基因无一不是细胞高度分化所必须的生长调节基因。由于在癌细胞中发现了它们的偶然性变异。便倒过来将它们称之为原癌基因(甚至癌基因),无疑是出于癌本位视角。这种错位阻碍了对癌症起源的深入探索,并在人们心理上造成极大危害,产生了某种宿命的恐癌症。如前所述。即便是某个调节基因偶然发生了变异使细胞进入癌潜伏期,但要蜕变为癌细胞尚需经历一系列基因变异,其概率是不高的,而且即便是漫长的潜伏期也始终是处于良性状态。并不可怕。癌症之所以成为第一杀手。主要是人们把主要的研究资源投入到了癌细胞出现以后,令研究者竞相去发现新的所谓癌基因,以致等到难以对付的癌细胞形成后,才去研究其治疗方法。尽管这样做也是十分必要的。却给了一系列调节基因的涉癌变异以充分的时问,错过了容易防治的,漫长的良性潜伏阶段。

2)对大量分子信息缺乏发育生物学的整合。癌基因论已从初始的“一种原癌基因诱发一种癌”发展为“致癌变异(alteration)通过阶联式信号转导途径(signaling cascade)传导致癌信息”:再进一步发展为“诸多涉癌变异途径形成了线路网络(Circuit network),通过彼此之间对话确定癌变结果[3]。这是肿瘤学的重大发展。然而问题是,致癌信息累积越来越多,网络也越来越复杂,而研究者面对这种局面已经显得有些束手无策了。借用Weinberg的形象的表述,研究者几乎被淹没在难以消化的海量信息之中了[3]。这表明,如果不跳出分子水平,就无法深入理解分子信息的整体意义。如同生态学,在了解不同类型植物群落内物种间的关系后,还需将不同群落整合起来,才能发现从分化的岩石表而形成的低等植物物群落,逐步发展为雨林群落顶级社会(climax)的原理――植物演替规律(plant succession)。同理,任何高等动物的生长发育也都是分阶段进行的,细胞癌变也不例外。通过漫长的潜伏期的不同阶段,癌体的出现便是这个过程的顶级、癌基因论虽然在顶级成癌阶段获得了大量突破性信息,但是如果放弃了潜伏期的研究,便无法真正理解诸多信息对癌细胞起源的意义,对成癌阶段的理解也是有限的。不幸的是。Warburg对潜伏期的开创性研究方向已完全被癌基因论所取代?一提起这位大师,人们就从有氧糖酵解一词的字面上认为他的贡献是,发现了癌细胞在有氧条件下却运行糖酵解途径其实,这并非是他的原意。

2重温Warburg对癌潜伏期的开创性研究

1956年。Warburg在SCIECE上发表了一篇题为《On the Origin of Cancer Cells》(《论癌细胞的起源》)的著名论文[5]。他在概括了有关研究后,得出了一个开创性的结论:癌细胞的漫长潜伏期,在代谢上是受损伤的有氧呼吸(aerobic respiration)途径被无氧发酵(anerobic fermentation)途径逐步取代的过程、习惯上被称为aerobic glycolysis(有氧糖酵解)。现在这个词已被广泛理解为癌细胞在充分的有氧环境下却运行糖酵解途径,并认作癌细胞的代谢标志:这虽然并不算错,却偏离了Warburg对癌症潜伏期的开创性研究。重温这篇经典论文的价值,可概括它有以下几层意义。

1)癌潜伏期有两个阶段:第一阶段是,机体细胞的有氧呼吸途径受到不可逆转的胁迫性损伤;第二阶段是,受伤细胞在长期生存竞争中,其中一部分因能量匮乏而消亡。另一部分则因发酵途径的增长弥补了能量损失而生存下来。他给予此潜伏期的代谢特征一个肿瘤学术语――有氧糖酵解,并定义为,受胁迫伤害的有氧呼吸和增长的替补无氧发酵相互作用的过程。

2)由于发酵是低等生物的呼吸途径,它促进高度分化的细胞退化为低等生物细胞形态,也就是自由生长的癌细胆:有氧呼吸受损细胞的癌变速度取决于其发酵代谢增长的速度,这正是老鼠的癌变速度快于人类的原因。事实上,癌细胞的发酵呼吸值非常接近野生繁殖的酵母菌Torula。

3)多数癌细胞潜伏期都存在一个“休眠癌(sleeping cancer)”阶段。它们在形态上接近于癌细胞,但发酵速率尚未完全补偿ATP的损失,是最容易接受治疗的时期,可以把这个状态理解为癌前体(cancer precursor)。

4)Warburg强调,细胞癌变过程的有氧发酵是毋容置疑的。因此,只有理解了有氧呼吸为何受损,以及大量增长的发酵从何而来。我们才能了解癌细胞的起源。任何对生命过程的解释如果能还原为物理和化学过程,这种解释就是不可替代的。因此,他认为任何致癌剂的突变如果不能理解其代谢机理,就只是一句“空话”而已。显然。彼时的Warburg尚未领会到分子生物学的威力。他的这番道理现在应该倒过来说:如果没有分子生物学的深入研究,他的有氧糖酵解之谜是无法揭露的。现在已经充分证明,生长因子p53的一个重要功能是调控呼吸链和糖酵解的运行。它的突变正是Warburg效应的分子机制[6、7]。

尽管癌基因论的发展已彻底淡化了Warburg关于癌潜伏期的研究,然而分子肿瘤学的蓬勃发展却将其重新引进研究者的视野:因为人们不仅逐渐意识到所谓癌基因不过是生长调节基因的偶然性涉癌变异,而且还进一步发现所渭的癌基因和抑癌基因大都具有双刃性(two face function):既能促进细胞凋亡,又可在不同条件下促进肿瘤发生。然而究竟是什么条件使得这些因子的抑癌功能转向为促癌呢?这个问题引导研究者重新思考细胞癌变的早期,也就是潜伏期的特征,并且启发他们用发育生物学观点去整合代谢和分子的广泛信息。

3细胞凋亡转向(apoptosis transformation)假说

基于对细胞凋亡与肿瘤发生的关系分析,我们于2009年在本刊上提出了一个关于肿瘤发生的细胞凋亡转向假说[8]。认为肿瘤并非源于所谓原癌基因变异产生的癌基因,而是由于细胞凋亡途径前期发生了导致发生肿瘤的转向的变异。这个看似匪夷所思的推测,却在各个层次陆续找到了重要支持。

3.1形态发生的证据

细胞凋亡与肿瘤发生都源于不能修复的DNA受损细胞癌基因论的一个基本原理是:由抑癌基因产物所引发的细胞凋亡和致癌基因诱导的肿瘤发生。是两个完全相互拮抗的途径,细胞凋亡功能的抑制是肿瘤发生的必要条件。然而这个原理却屡屡被肿瘤学各个层次发现的矛盾事实所动摇。主要表现在肿瘤发生与细胞凋亡前期有诸多相似之处。必须特别强调的是,尽管凋亡途径与肿瘤发生均源于DNA受损细胞。但对受损细胞的命运来说,两者完全不是等价的选项。细胞凋亡是保证高度分化动物正常发育必要的本能。没有细胞凋亡机制,就不可能有高度分化的高等动物。因为,及时清除那些基因组不正常的细胞,保护机体细胞DNA的完整性并按照其蓝图增殖和分化,对高等动物的正常生长发育是不可或缺的。因此。一旦DNA修复失败,受伤害细胞就会立即启动细胞凋亡途径,令反常细胞自尽。至于肿瘤发生,则只是偶然性的病变过程:只有在凋亡途径初期,某些调控因子,主要是既能促凋亡又能促癌变的双刃因子,偶然发生了涉癌变异,阻挡了凋亡过程的继续发展,方有可能发生癌变。这便是细胞凋亡转向假说提出的基本依据。

3.2代谢类型的证据

细胞凋亡和癌变细胞线粒体内均出现不同程度的Ca2+离子超载和氧化磷酸化功能受阻。有趣的是,细胞凋亡是一个消耗ATP的途径。在呼吸链的细胞色素C被剥离,有氧呼吸受阻后,其ATP只能依靠糖酵解供应[9、10]。显然,这很类似肿瘤发生过程的Warburg效应:其实早在60年前。Warburg就曾强调,如果细胞的呼吸代谢受到强烈的破坏而被杀死,就不可能发生被有氧糖酵解驱动的细胞癌变。只有在细胞的有氧呼吸受到一定程度的伤害但不致死时,才可能运行有氧糖酵解[5]。由于当时尚不知细胞凋亡一事。Warburg将有氧糖酵解现象归因于细胞外环境较弱的胁迫强度。其实。从细胞内环境来看,有氧呼吸受到强伤害而致死,更可能是细胞凋亡效应,而不致死的有氧呼吸伤害,则发生在因前期细胞凋亡途径发生了转向。得以幸存的线粒体之中。

3.3分子肿瘤学的证据

2011年。Chen等在一个关于CD95的实验中,意外地发现这个众所周知的促细胞凋亡的抑肿瘤因子,却促进了肿瘤发生[11]。无独有偶,紧接着Tang也发现另一个抑肿瘤因子,p53也有同样的反常行为[12]。对这种与传统基因论完全矛盾的现象,细胞凋亡转向假说却能给以预测。这表明,这些意外发现并非偶然性个案,而是有其机理基础的事件:它反过来也支持了凋亡转向假说二这种似非而是观象(paraclox),它的分子基础乃是不断发现的,既促细胞凋亡又促癌变的双刃生长因子。众所周知的,cMyc[4]、p53[13]、APC(adenomatous polyposiscoli)[14、15]、EGFR(epidermal grouthfactor receptor)[16]等等,都具有这种双刃性:我们推测,癌潜伏期基本上就是p53一类双刃因子从启动细胞凋亡到发生突变转而促进癌变的过程。这是个长期复杂且有反复的过程。受一系列双刃囚子变异的调控。现仅选几个常见的双刃因子。对它们作为细胞凋亡途径转向枢纽可能的作用方式,进行简要的归纳,并示于图1。1)发生凋亡途径转向的关键是防止氧化磷酸化已经受损的线粒体破碎,以阻止凋亡程序的继续发展。线粒体的命运决定于其下游中来自同一家族的促凋亡因子Bax等和抑凋亡因子Bcl-2等的相互作用[5、7];2)当DNA受损细胞的修复失败后,cMyc便扩增,并激活依赖p53的凋亡途径(图1a),正常情况下。APC增进线粒体膜的通透性,释放促凋亡因子,使线粒体解体和凋亡程序继续进行(图1b),3)然而,在偶然情况下,APC基因被截短,此变异体便反过来促进Bcl-2的抑凋亡功能。阻止了线粒体的解体[14、15];另一方面,扩增的cMyc虽可激活依赖p53的凋亡途径,但在凋亡途径受阻后,又可反过来束缚住促凋亡因子Bax的作用,协同APC变异体阻止线粒体的解体,并使处于细胞凋亡前期的细胞(pro-apoptotic cell)存活下来并恢复增殖(图1c)[1、4],产生异常的克隆群体.自此,前期细胞凋亡途径便转向进入了漫长的癌潜伏期;4)最终,促凋亡基因p53发生了点突变,成为促癌因子[14],自此,癌细胞的出现便只是个累积必要的致癌变异所需的时间问题了。

应该指出,细胞凋亡转向是个多因子参与的复杂过程,不止一种作用方式。以上方式是根据常见因子的行为所做的某种推测性的归纳。只是提出一个值得进一步实验研究的课题

4结束语

综上所述,我们初步得出以下结论:

1)当今肿瘤防治之忧不在先进的技术层面。而在研究方向。由癌基因论推动的分子肿瘤学的迅猛发展,反过来却暴露出癌本位视角的错位问题。回顾从代谢观发展到癌基因论的历史,现在站到了必须用发育生物学原理整合两者的成就的起点上了。研究重点也应从潜伏期到成癌期又回到深层次的潜伏期。

2)初步认为,癌潜伏期是DNA受损细胞蜕变为癌前体的漫长过程。其实质在发育生物学上是细胞凋亡途径转向。在代谢上则是有氧糖酵解。由于能同时调控此二过程,多功能因子p53的行为是潜伏期发展的决定因素。p53的累积和下游途径由于分别受到cMyc、APC、EGFR等双刃因子变异的控制。可令DNA受损细胞得以生存并进行克隆增殖。其中个别细胞的p53基因突变,使之不可逆转地通向恶性肿瘤。此后,癌细胞的蜕变只是累积足够的致癌变异和ATP补偿所需的时间问题了。这是个随机的,或快或慢的过程。不过,以上讨论还只是从大量累积的信息中可以粗略窥见的,潜伏期的某种可能的分子作用力方式。并不排除由CD95[12]、Wnt[14]和HIF[17]等所诱导的,其他凋亡途径转向方式。

3)毋庸置疑,成癌细胞的治疗研究必须坚持,但是应把资源主要投在长期的、良性的潜伏期的研究上来。这样,就有希望发展出某种新防治策略,当威胁生命的癌症尚处于潜伏期癌前体阶段,就进行诊断和处理,

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细胞凋亡范文第4篇

细胞凋亡是普遍存在于多细胞生物体内的一种自发、主动的细胞死亡过程,是生物体维持细胞数量相对稳定的固有机制。这一机制若有障碍或发生异常,就有可能引发肿瘤或其他病变。而肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾病,若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡,肿瘤细胞就有可能停止生长,因而中药诱导肿瘤细胞凋亡已成为一条很有希望的治疗肿瘤的新途径。目前常用的诱导肿瘤细胞凋亡的中药有:

1.中药单方制剂

全蝎水浸液提取物可诱导HL――60细胞凋亡,凋亡比例随药物浓度增高而上升,土贝母对体外培养的人肾颗粒细胞癌细胞RLC―310的生长具有明显抑制作用,并能诱导癌细胞凋亡。

2.中药复方制剂

国内外医学界先后报道十全大补汤、六君子汤、人参养荣汤、小柴胡汤、当归补血汤等具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用,并认为诱导肿瘤细胞凋亡是其抗癌机制之

日本学者对小柴胡汤的研究最为细致。他们用小柴胡汤的几种水溶性成分柴胡皂甙、人参皂甙、甘草甜素、黄芩皂甙和小柴胡汤的水溶性全部成分;分别处理体外培养的肝癌细胞株、胆管癌细胞株、正常大鼠肝细胞和正常人外周淋巴细胞。结果发现,各药效成分单独使用对两种癌细胞株的凋亡诱导率很低,而小柴胡汤全成分作用最为明显,且有浓度依赖性,所有试验药对所培养的两种正常细胞都没有影响。该实验表明中药复方在诱导肿瘤细胞凋亡方面较中药提取成分更有效。

3.中药有效提取成分

紫杉醇是从天然植物红豆杉中提取的抗癌药,可诱导人急性早幼粒细胞白血病HL―60、人乳腺癌细胞系MCAS、人食管癌细胞Fac109细胞凋亡。榄香烯是从中药莪术中提取的效成分,具有广谱抗肿瘤活性,可诱导人白血病细胞和人肝癌腹水瘤细胞凋亡,明显影响肿瘤细胞的分裂周期,进而导致其快速凋亡。喜树碱是从中药喜树中提取的有效成分,可诱导白血病细胞、人胰腺癌细胞凋亡。中药蟾酥是从蟾蜍分泌物中经干燥后形成的固状物,除具有强心作用外,还对人白血病细胞系、大肠癌细胞系有诱导凋亡作用。蟾酥对人癌细胞具有特异性,对大鼠和小鼠的癌细胞几乎没有影响。此外,槲皮素、淫羊藿甙、叶秋碱、姜黄素、地榆鞣质、芹菜素、天花粉蛋白、汉防已碱、熊果酸等都对肿瘤细胞有诱导凋亡作用。

细胞凋亡范文第5篇

论文摘要:就近年来中药抑制细胞调亡的文献进行整理,从中药调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子4个方面进行系统综述。认为中药在抑制细胞凋亡方面有较好的作用。

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式,是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程,在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞,或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多,研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节,进而抑制细胞凋亡,维持机体内平衡,阻止组织病理过程的恶化。

1通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径,其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。

1.1通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡许多研究结果均表明,线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用,是最重要的途径之一,其通过Cyt-C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下,会使caspases激活,胞质Ca2+水平升高,产生ceramide,诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放,使能量产生中断,线粒体内膜跨膜电位(ψm)的下降,并导致外膜破裂,释放出Cyt-C等各种活性蛋白,Cyt-C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt-C在dA7P存在下,与凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)结合,诱导caspase-9前体的寡聚化,并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase-9,继而活化Caspase-3,启动Caspase的级联反应,引起细胞凋亡。

有研究以缺氧/缺糖再给氧为模型,观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度,抑制细胞凋亡,提高线粒体膜电位和活性,认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。

1.2通过调控死亡受体途径抑制凋亡凋亡还可以通过死亡受体通路介导,现知死亡受体途径主要包括Fas/FasL途径和TNFa/TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas/CD95、TRAlL-Rs等,当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后,将凋亡信号由胞外传人胞内,在连接分子的媒介下,激活Caspase,导致细胞凋亡。1.2.1通过调控Fas/FasL途径抑制凋亡中药可以通过调控Fas/FasL的表达,抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧/复氧时凋亡相关基因Fas/FasL蛋白表达影响研究发现,结果缺氧4.5h及10.5h后,心肌细胞Fas/FasL蛋白的阳性表达指数(positiveexpressionindex,PEI)参附注射液组明显低于缺氧组;参附注射液可通过下调Fas/FasL蛋白表达,参附注射液组还见到caspase-3活性下降,提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas/FasL-caspase-3途径实现的。

1.2.2通过调控TNFa/TNFR途径抑制凋亡研究还发现中药通过调控7NFa/TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现,枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达,降低老年大鼠T细胞的过度凋亡,从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。

2通过影响凋亡信号传导抑制凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下,激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K)/蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径,RAS-MAPK途径,NF-κB途径,N()途径等。2.1P13K/PKB途径P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,PKB是P13K的靶蛋白之一,P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子;其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现,认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、P13K水平,增加组织对胰岛素的敏感性,改善胰岛素信号转导有关。

2.2RAS-MAPK途径丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK,MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK,jNK/SAPK,P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCsMAPK)通路中ERK、JNK的活化情况,以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P-JNK)表达,肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低,正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平,两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一;阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。

2.3NF-κB途径在大多数细胞类型中,NF-κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中,可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF-κB能从复合物中释放并活化,活化的NF-κB迅速转位进入胞核,继而作用于靶基因,诱导基因表达,编码前炎性蛋白,如IFN,细胞因子,生长因子,细胞黏附因子,红细胞生成素与MHC-I类分子等,抑制NOS的生成,并诱导编码凋亡抑制蛋白C-IAPl,C-IAP2基因表达,诱导抗凋亡基因Bcl-2,Bcl-x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现,结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVECNF-κB向细胞核内转移,人参皂甙则能阻止LPS诱导的NF-κB核内转移;能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF-κBDNA结合活性;IJs能使HUVl3CPAl-1蛋白及mRNA表达显著增强,人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF-κB途径拮抗LPS致HUVECPAI-1的表达。

2.4NO途径NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡,但在一些特定环境中,NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现,认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡,此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中,NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl-2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构,起抗细胞凋亡作用,通过抑制粘着斑激酶的表达,调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现,NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中,生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放,机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。2.5其他胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用;细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂,钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂,也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶,导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血/再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和/或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。

目前发现在某些细胞中,cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶,使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化,从而影响这些蛋白的生物学功能,引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响;但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值;其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量,通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。

3通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡

Bcl-2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl-2和bcl-xL是Bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl-2家族中重要的促凋亡基因。另外,p53、c-myc、Fas、c-fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠,提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl-XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡,并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用,其机理是下调Fas基因的蛋白表达,上调Bcl-2基因的蛋白表达。c-los是一种转录调节因子,正常情况下在脑内水平极低。c-fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能,导致细胞凋亡。有实验表明。c-fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达,共同调控细胞凋亡,而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c-fos的表达,减少神经细胞的凋亡,从而具有保护神经的作用。

4通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine,CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平,增强SOD活性,降低OX2LDL及N()水平等,从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能,TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡,其中TNF-α与凋亡的关系更为密切,能与TNF受体结合,引起细胞内贮存Ca释放,引起细胞内游离Ca2+浓度升高,从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶,引起DN段断裂和细胞凋亡。此外,与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1,NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用,其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放,抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制,与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达,抑制线粒体释放细胞色素C,控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。

5结语

细胞凋亡范文第6篇

自从1972年病理学家Kerr首先对细胞凋亡进行描述以来,经过20余年的研究, 人们认识到细胞凋亡在组织的自动平衡中起着重要作用。细胞凋亡是通过正常的方 式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞,使机体细胞有丝分裂的速 度与凋亡的速度相平衡。任何情况的异常凋亡对机体都是有害的,都会产生不良后 果,肝脏也不例外。目前人们认识到异常凋亡在肝病的发生、发展起着重要作用: 一方面,肝细胞过度凋亡可以导致严重的肝脏损伤;另一方面,诱导凋亡机制的丧 失可以导致肝癌的发生。因此,对肝病患者需抑制肝细胞的凋亡,对肝癌患者需选 择性的诱导肝细胞的凋亡。 1细胞凋亡的定义和检测方法 1.1定义细胞凋亡是一个主动过程,是机体在生理或病理条件下受到刺激后 ,导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡(program medcelldeath,PCD)。细胞凋亡的特点:(1)细胞变小,核固缩,细胞膜完整 。(2)核碎裂,DNA断裂成180~200bp,而且有蛋白质和mRNA的合成。(3)膜包 绕的凋亡小体形成(在肝细胞称为Councilman小体)。(4)凋亡小体被邻近巨噬 细胞吞噬,这整个过程进展非常快,由数分钟到几个小时[1]。(5)一般周 围无炎症反应,但如果凋亡速度大于清除速度,则组织结构被破坏 而且伴随炎症反应[2]。与凋亡不同,坏死是一个被动过程,坏死细胞变大, 核溶解,膜通透性改变,线粒体结构变化,DNA随机断裂,其间没有蛋白质和mRNA 的合成,坏死周围有炎症反应。 1.2检查方法(1)对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微 镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。(2)对DNA降解片段的分析有琼脂 糖凝胶电泳检测DNA以及SouthernBlotting方法。(3)荧光标记膜蛋白V的检测 [3]。(4)流式细胞技术(FCM)可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分 析。(5)末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术(TUNEL) 。(6)免疫组化。 2凋亡机制 细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、 蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺 (ceˉramide)、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶(transglut aminase)激活[1,4]。 参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种,包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶(C ASPSE,cysteingylaspartasespecificproˉtease)家族成员和组织蛋白酶等 [5]。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切,至少有14种哺乳动物 caspase已获克隆,但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细 胞凋亡中发挥启动作用;caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用[6]。由于各c aspase可相互激活,所以caspase蛋白酶级联反应(caspaseproteasecascade) 是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关 键作用[6],能促进线粒体功能障碍的因素很多,包括各种有害刺激和信号传 递过程,其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合, 就导致复杂的多蛋白复合物(multiproteincomplex)形成,即将凋亡信号传递给 效应蛋白酶FLICE(Fas-associatedproˉteinlikeinterleukin-1βconvertin genzyme,Fas相关性蛋白样白细胞介素1β转化酶),FLICE与caspase-8相互反应 可激活caspase-8,caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。 线粒体功能障碍导致细胞色素C释放,细胞色素C与凋亡激活因子-2(apoptosisa ctivatingfactor-2,Apaf-2)相结合,使caspase-3激活[7]。caspase-3又 激活DNA断裂因子(DNAfragmentationfactor),导致静息状态的核酸内切酶激 活,最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂,是细胞凋亡生化途径的共同 途径。 在肝细胞凋亡发生机制中,以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得 最多。此外,转化生长因子β1(TGF-β1)及其受体(TGF-β1R)[8]、肿瘤 坏死因子(TNF)及其受体(TNFR)[9]在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作 用。细胞毒性T细胞(CTL)释放的穿孔素(perforin)和颗粒酶B也是介导肝细胞 凋亡的重要因素。 DNA断裂分两型。首先发生的DNA断裂片段较大,为300kbp或500kbp的倍数,此 型DNA断裂在细胞凋亡中发生频繁,但并非都有。继之DNA在核小体(nucleosome) 间断裂成许多100~200bp的小片断,或呈100~200bp的倍数出现,称为DNA断裂梯 状模式(ladderpattern)[10]。两型DNA断裂是由不同的核酸内切酶切割而 形成的。也有人认为这两型DNA断裂可能单纯代表一种动力学现象,即必须先有足 够大的DN段形成,方可发生小分子DNA断裂,用凝胶电泳技术、原位细胞化学技 术或原位组织化学技术检测DNA断裂,是确定细胞凋亡的常用 方法。 细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-celllymphoma/l eukemia-2protein,Bcl-2)家族的成员[11,12]。Bcl-2,通过抑制凋亡以 延长细胞存活时间,是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密 切的同源物是Bcl-x,有两个RNA拼接变种,长Bcl-X(Bcl-XL)是较大的拼接变种 ,短Bcl-X(Bcl-XS)是短拼接变种。此外还发现一些其它的Bcl-2同源物。Bcl-2 蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Bcl-XS、Mcl-1、Bfl-1、 Brag-1、Al;细胞凋亡促进因子有:Bax、Bak、Bag、Bid、Bad、Hrk、Bik。 细胞凋亡促进因子和细胞凋亡抑制因子的相对优势决定着细胞对致凋亡刺激的 反应性。Bcl-2及其同源物主要定位于细胞膜,包括内质网膜、核外膜和线粒体外 膜。当细胞接受凋亡刺激时,Bcl-2可能通过防止线粒体功能障碍或阻断线粒体细 胞色素C、Apaf-2释放而抑制细胞凋亡。Bcl-XL似乎在不表达Bcl-2的肝细胞承担这 一功能。Bcl-2家族成员的表达在肝脏病和胆管细胞癌的发生中可能起重要作用, 并参与调控肝再生反应。

3肝脏疾病中的凋亡现象 近年来研究表明肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展 过程中的重要作用得到了人们的重视,现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象 分述如下。

3.1病毒性肝炎Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生发展过程中起着重要作 用,在不同条件下,穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡 [13,14]。1998年Galle等[15]报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强,致 敏的细胞毒性T细胞(CTL)表达Fas配基(FasL),CTL经过免疫途径介导肝细胞凋 亡,参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强,则可能诱发暴发性肝 功能衰竭。这已经得到大家的公认。 3.2肝纤维化肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变,有研究表明各种类型的 肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞(HSC)的激活是肝纤维化发生的中心环节。 1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞(MFB)的转变与sFasL介导的凋亡增强相平 行,Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB,Bax则相反。这说明调 节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。故认为促进HSC的凋亡有可 能成为抗纤维化的措施之一。

3.3肝硬变凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存

在。1999年Frommel等[16]对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本,

发现对Bcl-2的表达逐渐增强,肝硬变患者中表达最强,提出了一种解释肝硬变患

者中肝癌高发生率的新机制。

3.4肝癌肝细胞癌形成过程中,不仅癌细胞异常增生,而且突变的细胞凋亡

减少,肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷[17],1998年Jodo等报道肝癌血清

中sFas水平升高,切除肿瘤后,sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、

化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡,从而降低肝癌的发病率,这从一个

侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年CrasL等报道在非基因毒性致癌

物nafenopin所致的原发性肝癌中,正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当na

fenopin的作用消失后,二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋

亡率都高于前者。因此,采取促进肝癌细胞凋亡的措施,将有可能成为未来治疗肝

癌的有效手段之一。

3.5酒精性肝病凋亡可发生在临床和实验性的酒精性肝病中,酒精诱导肝细

胞出现凋亡的机制有:(1)表达细胞色素P4502E1的HepG2细胞暴露于花生

四烯酸导致了脂质过氧化和凋亡增加;(2)肝铁水平的升高也促进了脂质过氧化和

肝细胞凋亡发生;(3)酒精性肝病中TNF及其受体的水平都升高,二者结合导致凋

亡增加;(4)肝细胞CD95L的水平升高与肝组织中的CD95结合诱导凋亡;(5)CTL细

胞也通过CD95与CD95L的结合促进凋亡的发生。

3.6自身免疫性肝病细胞凋亡对于清除潜在的自身反应性淋巴细胞以及免疫

应答后剩余的效应细胞或突变细胞具有重要意义。若该机制发生障碍,则可能导

致自身免疫性疾病的发生。自身免疫性肝病中具有代表性的是原发性胆汁性肝硬变

(PBC),它是一种免疫介导的肝内小胆管进行性损害为特征的自身免疫病。1997

年Harada等报道[18]PBC受损胆管上皮细胞高表达CD95L,CD95/CD95L途径的

凋亡导致了胆管上皮细胞的破坏。

总之,细胞凋亡在某些肝脏疾病的发生、发展、转归中可能起着重要的作用,

其具体机制有待进一步研究证实。

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细胞凋亡范文第7篇

1神经元凋亡的慢性炎症学说

近年的免疫组织化学研究表明,许多神经疾病尤其AD患者脑内有强烈的局灶性炎症反应,组织培养及分子生物学方法也证明脑细胞可产生许多炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β等)、补体蛋白及其他免疫分子。这些炎性蛋白质及小胶质细胞(microglia,Mi)活化同AD病变间的密切关系,使人们提出了神经元退化的炎症学说。近年来有关β-淀粉样蛋白(amyloidproteinβ,Aβ)激活免疫炎症过程而间接造成神经退行性病变的假说获得了不少新的证据。AD患者脑内的Aβ类不溶性大分子以及胞外的NFTs,极易被吞噬细胞发现,因而作为慢性刺激物质而逐渐积累,并刺激炎症反应不断加强,造成AD的慢性炎症状况。

AD的许多促发因素如遗传、年龄、环境因素等均可诱发初始病变(如AD的SP及NFT),这些病变即使引起某些神经元死亡,也是较为轻微的,因而病变进展缓慢;然而这些初始病变可激发炎症反应,后者发展至一定程度则导致更多神经元死亡,造成更多的病变,进而激发更严重的炎症反应,如此形成一个不断加强的自身毒性环路(autotoxicloop)。这个正反馈环路导致了临床所观察到的AD及其类似疾病在起始阶段进展较缓,到某个时期病情才急剧恶化。由此可见,慢性炎症可能是AD发病机制的必要因素。AD是一种由Aβ沉积,通过激活周围Mi产生细胞因子和神经系统免疫炎症应答,加速神经细胞死亡,而致记忆减退和认知障碍的疾病。而记忆与颞叶海马CA1区神经元活性有关,提示AD发病机制之一可能是Aβ等启动CA1区神经元细胞凋亡。

2神经元凋亡的诱导

细胞凋亡(PCD)是由细胞基因控制的一种主动死亡过程,特定基因由于种种原因编码自杀性蛋白而致DNA裂解。愈来愈多的证据表明,大多数动物细胞皆能自我致死,而且这种普遍性的自杀程序能由发自其他细胞的信号所激活或抑制。例如许多发育中的脊椎动物神经元的生存依赖于与其连接的靶细胞分泌的神经营养因子(NTF),若NTF缺乏可致神经元发生PCD。细胞的PCD也受外源性因素的影响,但诱导PCD的内源性与外源性因素都必须通过特定基因而发挥作用。

2.1淀粉样蛋白与神经毒越来越多的证据表明,Aβ是各种原因诱发AD的共同通路,是AD形成和发展的关键因素[5]。分子克隆研究证明,Aβ来自一分子量更大的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursorprotein,APP)。目前多数学者认为,Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件,超前于其他脑区损伤和临床症状数年[6]。在发生顺序上,Aβ的出现早于神经纤维缠结、轴索缺乏营养等病理变化以及临床症状。最为直接的证据是Aβ在一定条件下能表现出神经毒性。90年代初,Yankner等首先观察到较高浓度的Aβ能引起神经元退化和死亡,并证实引起毒性的必需结构是其25~35位的氨基酸序列(Aβ25~35)。最近发现,Aβ的神经毒性包括两个方面[7],一是增强或放大各种伤害性刺激如低糖、兴奋毒素、自由基等的细胞损伤效应,一是直接的细胞毒性。实验发现,多数细胞与Aβ接触后就能表现出细胞肿胀、染色质浓缩、核内DNA断裂等细胞凋亡典型的形态和生化特征[8],仅在少数细胞内或与兴奋毒素共存时才表现出神经元肿胀、膜溶解、乳酸脱氢酶释放等坏死(necrosis)的特征[9]。Aβ的神经毒性涉及到复杂的分子机制,主要包括促进自由基的形成、破坏细胞内的Ca2+稳态[7],降低K+通道的功能[10],增强致炎细胞因子(cytokine)引起的炎症反应[11]。由于多种因素相互影响给研究带来了相当大的难度。

2.2炎性细胞因子和神经毒

2.2.1白细胞介素6(IL-6):在中枢神经系统(CNS),IL-6主要由Mi和星形胶质细胞(astrocyte,As)产生,其受体也广泛存在于丘脑、海马、皮层等脑区的神经元膜上。IL-6的神经元毒性作用主要在转基因小鼠脑内得到证实。Campbell[12]报道,IL-6转基因小鼠具有严重的神经疾病症状,表现为瘦小、行为异常、震颤、共济失调和癫痫。神经病理特征为,海马与小脑出现明显的神经元退化,尤其是海马CA1区域树突萎缩,树突空泡化和树突数目减少,并且伴随着高表达的IL-6mRNA和高水平的IL-6。这些结果表明,脑内IL-6水平的升高是导致转基因小鼠神经元退化的主要原因。此外IL-6转基因小鼠研究还发现,隔一海马胆碱能通路的功能受到严重损害[13],由于隔一海马通路参与记忆印迹的形成,因此脑内高水平的IL-6有可能影响学习与记忆功能。

有关IL-6与Aβ或APP关系的研究已有报道[14]。在原代培养的大鼠皮层神经元实验中,IL-6200ng/mL与神经元接触6h之后,APPmRNA的表达增加了大约一倍。由于IL-6与APP或Aβ共存于AD的SP内,提示IL-6对APP的表达具有直接调控作用,可以促进APP产生,进而导致Aβ沉积,诱发AD。α2-M是已知最强的蛋白酶抑制剂,与IL-6共存于AD皮层与海马SP内。曾有报道[15],在培养的人神经元细胞株内,α2-M可抑制APP的正常分泌,导致Aβ形成增加。在人SH-SY5Y神经元细胞培养实验中,α2-M的基础合成很低,但用IL-6刺激后其合成被强烈诱导,α2-M水平大约增加了20倍[16]。这些结果提示,IL-6与α2-M在AD脑内的共存具有功能性联系,IL-6可能通过诱导α2-M合成,进而抑制APP的正常酶解,导致Aβ生成与沉积异常增加,从而诱发AD病理发生。

2.2.2肿瘤坏死因子-α(TNF-α):LPS可刺激Mi产生TNF-α,As也可能产生少量TNF-α。在人胚胎原代神经元培养中发现,TNF-α有增强N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体介导的神经毒性作用[17],且对人神经元细胞HN33.1有细胞毒作用。大鼠神经细胞培养中,TNF-α通过作用于As间接发挥了细胞毒性而引起神经元的损伤。直接将TNF-α注射到小鼠小脑,可引起普遍性损伤。TNF-α可引起牛及啮齿类动物的Mi通过PCD机制发挥细胞毒作用。但这一作用在人类尚没有被发现。

2.2.3转化生长因子-β(TGF-β):TGF-β是具有多功能作用的细胞因子,它可由多种细胞产生,在胚胎发生期的神经细胞发育过程及免疫炎症反应过程中,TGF-β都具有重要作用。大鼠新皮层神经细胞培养中,TGF-β可减少由细胞毒物、缺氧、缺血或谷氨酸引起的细胞损伤,而起到了神经保护作用[18]。使用人类胚胎皮层细胞培养,也发现了TGF-β可减轻由Aβ引起的神经细胞损伤。TGF-β对神经细胞的这些保护机制目前并不清楚。相反的结果也发现,TGF-β可能具有细胞损伤作用。由于其抑制了星形细胞谷氨酰胺合成酶的活性而增加了外源性谷氨酸造成的神经细胞损伤。也有报道TGF-β伴随Fos-Iacz的表达而参与细胞凋亡过程。

2.3一氧化氮(NO)与神经毒在人的中枢神经系统,As是产生NO的主要细胞,IL-1β是一个关键性因子,可直接刺激人As产生NO[19]。TNF-α及IFN-γ可加强IL-1β的作用。实验也证明这些白细胞介素处理过的As能产生足够量的NO,而造成神经细胞损伤[19]。Mi产生的NO具有细胞毒性作用,它可能参与神经损伤及神经退行性疾病的病理过程。NO合酶抑制剂或能抑制Mi活性的物质均可减轻Mi介导的神经元损伤。此外,能释放NO的硝普钠(sodiumnitroprusside,SNP)能直接杀伤培养中的人类胚胎皮层神经元。炎症条件下,脑内的胶质细胞可以表达诱生型一氧化氮合酶(inducibleNOS,iNOS),产生大量NO,导致神经元坏死或凋亡。一般情况下,持续与低水平的NO或过氧亚硝酸盐接触引起神经元凋亡,而短暂与高水平的NO或过氧亚硝酸盐接触则引起神经元坏死。

此外目前的研究结果也证实,前列腺素E2(PGE2)直接与海马神经元接触引起了神经元凋亡性死亡[20]。一些神经递质如多巴胺(DA),谷氨酸盐(glutamate,Glu)等可使某些神经元细胞凋亡。Glu是Mi激活后产生的一类神经毒物质,它是一种兴奋性氨基酸(EAA)。目前认为,神经细胞的缺血缺氧、退行性病变、变性、炎性损伤等都可能与EAA的神经毒性有关。Yamada和Hatanaka报道[21],在20d胎大鼠海马神经元培养中,Glu与神经元接触15min,可引起海马神经元显著退化。

3神经元凋亡的基因调控

PCD是受遗传基因调控的,在调控PCD的过程中常有新基因表达,合成新的蛋白。在调控的信号中有的是起正调节作用,也有的是起负调节作用。不同的细胞由不同的基因诱导PCD。这些基因有:ced-3/ced-4、nedd2、TRPM-2、Fas(Apo-1)、c-fos、c-jun、c-myc、野生型p53等。抑制PCD的基因有:ced-9、bcl-2、突变型p53等[22]。此外,IL-1β转化酶家族是一些新发现的细胞“死亡蛋白”,与ced3、nedd2具有高度同源性,在炎症因子诱导的神经元PCD中起重要作用。

IL-1β转化酶(IL-1beta-convertingenzyme,ICE)是存在于许多哺乳动物细胞内的一种蛋白酶,是近年来研究较多的“死亡蛋白”之一。人类ICE最初是在单核细胞中发现的一种半胱氨酸蛋白酶,可使非活性的前体IL-1β(相对分子质量为33000)在116位天冬氨酸和117位丙氨酸之间酶解为具有活性的相对分子质量为17000的IL-1β细胞因子。ICE与线虫细胞死亡基因ced-3有高度同源性[23]。Kumar等先克隆出鼠nedd-2基因,长3.7kb,其基因编码的蛋白可促进鼠细胞的凋亡,LinWang以nedd-2为模板通过PCR扩增制备探针从人胎脑cDNA文库筛选出人nedd-2基因,其编码的氨基酸序列和ICE/ced-3顺序同源。转染小鼠ICE基因或ced-3基因,使其过度表达均可引起小鼠纤维母细胞出现凋亡。另外,在发生凋亡的细胞中可见成熟的IL-1β分泌增多。这一结果提示,ICE/ced-3基因可能是决定细胞死亡基因之一[24]。目前认为ICE在由Fas、TNF及一些炎症因子等诱导的细胞凋亡中起重要作用。ICE是Fas、TNF及炎症因子介导的主要通路,其研究的重要性可想而知。AD患者神经细胞退行性改变有ICE参与。由于细胞死亡基因ced-3与nedd-2和ICE为同种物质,是引起细胞凋亡的重要酶,多种因素均可激活该基因,ICE产生可在细胞内产生一种细胞死亡蛋白,而ced-3、nedd-2和ICE为同种物质,是引起细胞凋亡的重要酶,多种因素均可激活该基因,ICE产生的IL-1β对神经细胞起直接或间接毒性作用,导致神经元凋亡。证明ICE表达促进神经细胞凋亡,而对ICE表达的调节,寻找一些抑制ICE活性的药物,对一些凋亡过多的疾病如AD及Parkinson病有重要的治疗潜力。

4抗炎药物抑制神经元凋亡的可能性

20世纪的神经科学已获飞速发展,但造成神经元死亡的原因尚未明了,以致许多全球性致死性神经疾病一直缺乏有效的防治手段。AD发病的炎症学说启发人们用抗炎药物减缓或阻止AD发病。它不同于近10多年惯用的两种治疗方法,即基于胆碱学说的各种AchE抑制剂如他克林(tacrine)、新斯的明等和以吡烷酮醋胺为代表的促智药(nootropicdrugs),被用来试图改善大脑皮层的代谢能力,进而减轻痴呆程度[25]。上述治疗方法并不能减缓皮层神经元的急剧损毁,因而无消除病变的根本原因。人们转而思索用抗炎疗法来抑制神经元死亡。这个设想已被临床试验所证实,有人在用非甾体类抗炎药物(NSAID)吲哚美辛(indomethacin,IM)治疗AD的一项有安慰剂对照的双盲试验中发现,接受100~150mg/kgIM治疗的患者,其认知功能的改善明显优于安慰剂对照组[26,27],然而尚需要更大规模的临床试验及进一步研究,以筛选出选择性调节免疫炎症反应和抑制神经元死亡的新药。

参考文献

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17ChaoCC,HuS.Tumornecrosisfactor-αpotentiatesqlutamateneurotoxicityinhumanfetalbraincellcultures.DevNeurosci,1994,16:172-179

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19ChaoCC,HuS,ShengWS.Cytokine-stimulatedastrocytesdemagehumanneuronsviaanitricoxidemechamism.Glia,1996,16:276-284

20Yamagata,K,AndreassonKI,KaufmannWE,etal.Expressionofamitogen-induciblecyclooxygenaseinbrainneurons:regulationbysynapticactivityandglucocorticoids.Neuron,1993,11:371-386

21YamadaM,HatanakaH.Interleukin-6protectsculturedrathippocampalneuronsagainstglutamate-inducedcelldeath.BrainRes,1994,643:173-180

22WhiteE.Death-defyingacts:ameetingreviewonapoptosis.Genes&Develop,1993,7:2277-2284

23KumarS,KinoshitaM,NodaM,etal.InductionofapoptosisbythemouseNedd2gene,whichencodesaproteinsimiliartotheproductofthecaenorhabditiseleganscelldeathgeneced-3andthemammalianIL-1β-convertingenzyme.GenesDev,1994,8:1613-1626

24MiuraM,ZhuH,RotelloR,etal.InductionofapoptosisinfibroblastsbyIL-1β-convertingenzyme,amammalianhomologoftheC,eleganscelldeathgeneced-3.Cell,1993,75:653-660

25EaggerSA,LevyR,SahakianBJ.TacrineinAlzheimer′sdisease.Lancet,1991,337:989-992

26RogersJ,HempelmanSr.ClinicaltrialofindomethacininAlzheimer′sdisease.Neurology,1993,43:1609-1611

细胞凋亡范文第8篇

1900年,Regand首次认识到发生过程中存在着生殖细胞的退化。对大鼠等啮齿目动物的研究表明,生精过程中实际产生的数量比理论预测减少25%~75%[1]。20世纪70年代,Kerr等提出细胞凋亡(apoptosis)的概念,包括程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)和非程序化细胞死亡(nonprogrammedcelldeath,NPCD),提示细胞凋亡在男性生殖中具有重要影响[2]。现已证实,生殖细胞退化是通过细胞凋亡实现的。在发生各个阶段,都存在自发性的生精细胞凋亡。但不同时期凋亡细胞数目有很大差异,原位检测表明,在发生过程中主要是精原细胞和精母细胞发生凋亡,而细胞凋亡很少发生。精原细胞特别是A精原细胞凋亡是导致数少的主要原因,其凋亡均发生在有丝分裂期间。精母细胞凋亡发生在减数分裂过程中的细线前期、偶线期,特别是粗线期。就是通过精原细胞不断增殖,同时过量的受到损伤的生精细胞不断凋亡,来控制细胞数目,维持发生的动态平衡。本文就生殖细胞凋亡的生理意义、机制和影响因素作一综述。

1生精细胞凋亡及其生理意义

生精过程是指精原细胞经过多次有丝分裂,最后发育成,其中存在精细复杂的调节机制。生精细胞凋亡主要发生在三个阶段:首先是在A型精原细胞的有丝分裂;其次是精母细胞的减数分裂;最后是发生的过程[3]。生精细胞的凋亡还与生精上皮处于生精周期阶段有关,不同发育阶段的生精细胞对相同刺激因素反应性不同,由此推测生精细胞凋亡有多种调节机制。现研究较多的是在激素和局部加热诱导下,生精细胞凋亡的调控机制,着也是目前较有希望的男性节育调节手段[4]。生精细胞凋亡具有重要生理意义,参与维持发生过程的动态平衡,维持支持细胞与生精细胞的最佳比例,清除基因异常生殖细胞,调节生精过程中数量和质量,是机体保持生殖遗传稳定的重要防御机制。在病理状态下,细胞凋亡则导致少精或无症发生[5,6]。

2生精细胞凋亡机制

2.1Bcl-2蛋白家族它包括促凋亡的蛋白(Bax、BAD、Bak、Bik、Bok、Diov、Hrk、BID和抑制凋亡的蛋白(Bcl-2、Bcl-xlr、Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1/A1)。他们分别控制着细胞死亡通路的各个阶段。Furuchi和Rodriguez发现[7,8],过分表达Bcl-2的转基因大鼠,会出现精原细胞增生,并且生精细胞凋亡的机会也减少。Bax缺失的大鼠会导致减数分裂前期生精细胞不正常积累,从而造成生精过程紊乱,以致没有生育能力。另外一些Bcl-w缺失的大鼠也没有生育能力[9]。这些资料都证实了Bcl-2蛋白家族的选择性表达对生精过程异常重要。

2.2肿瘤抑制蛋白P53P53蛋白和Bcl-2蛋白家族一样调控着细胞内的死亡信号途径。许多研究报告证明P53在生精细胞的凋亡中起着关键的作用,包括自发性的和损伤诱使的生精细胞的凋亡[10]。缺P53基因的大鼠虽然生长发育正常,也有生育能力,但是在射线作用或实验睾后表现出生精细胞凋亡的滞后,并且凋亡数目也减少[11,12]。尽管大多数的资料表明P53仅调节有丝分裂的生精细胞的活性来控制细胞凋亡,近来也有资料表明它也在生精细胞的减数分裂和减数分裂后期起着关键的作用,从而影响细胞凋亡。

2.3caspase-3蛋白酶caspase-3是一种活化胞浆的蛋白酶,它是一种死亡蛋白酶,凋亡细胞通过它的数目的增多从而启动凋亡的级联反应。Kumi-Diaka用5,7,45-三羟异黄铜(genistein)作用于TM4细胞株后[13],同时发现了细胞的凋亡和坏死并且caspase-3的酶活性提高,因此表明在用genistein引起的内生精细胞和支持细胞的凋亡可能包括启动caspase-3蛋白激酶这一信号通路的作用。

2.4Fas/CD95系统Fas信号系统由相互作用的蛋白Fas(CD95/APO-1)和FasL(CD95L/APO-1L)组成。Fas是属于TNF受体家族的一种I型跨膜蛋白,它广泛存在于各种组织中。FasL是II型的膜蛋白,它以跨膜和可溶性的分泌形式(sFasL)存在[14,15]。sFasL可以在远距离范围内调控表达Fas蛋白的细胞凋亡。免疫组化的结果证明,支持细胞在它们的质膜上表达FasL,而生精细胞则选择表达Fas[16]。现在已有多种证据证明Fas信号系统启动生精细胞的凋亡:(1)在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸(阻断了FasL的翻译),明显看到生精细胞凋亡数目的减少;(2)Fas和FasL的mRNA的表达量随着动物年龄的不同而不同,在大鼠中是16~33天最多,而此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰;(3)加入模拟FasL功能的Fas的激动剂(一种抗Fas的抗体,Jo-2),生精细胞的数目大大减少。此外,在一些有害化合物引起的损伤中,Fas系统也与生精细胞的凋亡密切相关。Boekelheide[17]用MEHP诱使损伤的实验表明,随着生精细胞凋亡数目的增多,Fas和FasL的表达量也提高,并相应达到峰值。而且,Fas的活性部分RIP和FAP-1的表达也增多。因此,Fas/FasL是一个重要的旁分泌系统,它不仅影响生精细胞生理条件的凋亡,控制着生精过程的稳态,而且也在有毒物质诱使的损伤中极大地影响了生精细胞数目。

3生精细胞凋亡与激素

3.1睾酮(testosterone,T)又称生精激素,由间质细胞合成、分泌。大量研究表明,睾酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。利用间质细胞毒性物质——乙基二甲基磺酸盐(EDS)处理大鼠,2天后中检测不到3β-羟类固醇脱氢酶,8天后凋亡指数增加,长时间EDS处理,粗线期精母细胞和细胞的凋亡明显增加[18]。睾酮是通过与支持细胞合成的雄激素受体(AR)特异结合发挥其生物学效应的。睾酮在精原细胞、精母细胞的发育及细胞的变态过程起作用,较高水平的睾酮对精原细胞的发育是必须的。睾酮有选择地在生精周期VII-VIII阶段起调节作用。抑制睾酮分泌、VII-VIII期的生精细胞首先发生凋亡[19]。另有研究结果显示,切除大鼠垂体后,体积明显缩小,发生停滞在初级精母细胞阶段,给予大剂量的外源睾酮可重新诱导发生。给予成年大鼠甲氧乙酸选择性破坏间质细胞,睾酮血清水平降低,生精细胞凋亡明显增加[20]。

3.2促卵泡激素正常发生过程需要促卵泡激素(folliclestimulatinghormone,FSH)存在。大量研究表明,FSH是灵长类发生启动的主要调节者之一,促卵泡激素被拮抗或其水平降低,都能使生殖细胞发生凋亡。FSH通过支持细胞上其唯一的受体FSHR发挥其作用。陈雪雁等[21]提取RNA进行斑点杂交发现FSHRmRNA的杂交信号全部位于支持细胞,于XIII-I期最强,VII-VIII期最弱,在II-VII期处于中等水平。可推测FSH主要作用于XII-I期,调节精原细胞的分裂和精母细胞的减数分裂过程,决定进入形成期的圆形细胞的数量。缺乏FSH导致粗线期精母细胞凋亡。Tesarik等[22]体外培养生殖细胞和支持细胞发现FSH和睾酮有作用的交叉点,睾酮可增强FSH对生殖细胞凋亡的调控作用,二者协同作用,共同维持正常的发生过程。

3.3促性腺激素释放激素丘脑下部分泌的促性腺激素释放激素(gonaditrophin-releasinghormone,GnRH)使垂体释放FSH和LH,FSH、LH分别刺激支持细胞和间质细胞做出应答,为发生创造微环境。用GnRH拮抗剂处理大鼠,生精周期特异阶段生殖细胞凋亡明显增加。Sinha-Hikin等[23]发现,给成年大鼠-GnRH拮抗剂后5天(VII-VIII阶段)和7天(VII-VIII和IX-XI阶段)生精细胞凋亡DN段明显增加,14天(I、II-IV、V-VI和VII-XIV阶段)达最高值。

3.4催乳素关于催乳素(prolactin,PRL)对生精细胞凋亡的研究相对较少,Yazawa等[24]对日本红腹蝾螈的研究发现,PRL水平提高只会导致生精周期中倒数第2期凋亡发生,推测可能是时间和细胞类型的特殊性引起的,也可能是PRL受体(PRLR)只在倒数第2期表达,或者PRLR全程都表达,只不过在倒数第2期细胞信号系统的组成跟其他期不同所致。他凋亡作用,这主要取决于FSH/PRL的比例。在分子水平上对PRL促进生精细胞凋亡的研究相当匮乏。用PRL类似物质(CHX)处理后,内caspase活性有高表达,并且可能由一种新的未经确定的caspase来介导[25]。PRL的许多功能表现为促进增生,但其促进凋亡的机制还有待进一步深入研究。

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7FuruchiT,MasukoK,NishimuneY,etal.Development,1996,122:1703-1709.

细胞凋亡范文第9篇

摘 要 生物体内各种组织细胞通过增殖与凋亡来维持数量的平衡。一旦这种平衡被打破就会导致一些疾病的产生,如癌症。细胞凋亡与癌症之间的关系为癌症的治疗提供了新思路。

抗癌药物的研究经历了一个漫长的发展过程,尽管已对许多抗肿瘤药物的细胞目标有了一定了解,但对于药物与肿瘤作用后如何导致细胞死亡的确切机制尚不清楚。近年来的研究发现细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式,从而使得细胞凋亡与癌症之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿瘤研究的新焦点。

1 细胞凋亡

细胞死亡一般有两种方式,即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死通常发生在一群接触的细胞中,是由各种非生理因素,如局部缺血等引起的难以控制的一种破坏现象。它通过干扰细胞能量代谢,引起细胞渗透压不平衡,细胞质肿胀,最终由溶酶体酶导致细胞结构的不可逆性破坏并诱发局部的炎症反应。细胞凋亡这一概念是1972年由Kerr和Wyllie等提出的。它是一种主动的、固有的程序化现象,故又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。

许多生理性、非生理性的因素都可以引起细胞凋亡,如射线、高温、毒素及各种抗癌药物等。而坏死实质上是由于细胞周

围环境产生严重的损伤性变化所诱发的,所以这两种过程在发生机制、形态学和生物化学等诸方面都不相同。

凋亡的细胞由于失去细胞间相互联系而与邻近细胞分离,随后细胞表面释放出信号分子被吞噬细胞识别,因此凋亡不损伤周围的细胞。凋亡一般伴有明显的形态学特征,以细胞核的变化为主,表现为核浓缩、细胞浆中细胞器密集、胞膜突出、体积缩小、DNA断裂及形成凋亡小体。

在生物体的每种细胞中,细胞数量的控制都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的,细胞增殖是受到高度调控的。但是直至最近人们才认识到细胞死亡的调控与细胞增殖的调控一样复杂,而且多细胞组织中不同细胞似乎都是通过活化一种内部编程的自杀程序而导致凋亡的[1]。尽管不同的细胞之间有共同的死亡机制,但各种细胞发生凋亡的诱导信号各不相同。各种不同细胞甚至同一细胞不同阶段对凋亡诱导的难易程度、速度也各不相同,如静止期的T细胞在X光照射后迅速凋亡,而活化后的T细胞则不同,与胸腺中蛋白质紧密结合的未成熟T细胞株对凋亡更为敏感[2]。

是什么导致了这些不同?越来越多的工作表明对凋亡的敏感性主要由Bcl-2、p53两种基因调控。p53基因位于17号染色体短臂上,长14~24 kb,编码一个由393个氨基酸组成的53 kD的蛋白质。p 53蛋白是细胞周期的“分子警察”,也是在DNA损伤后诱导凋亡的因子。p 53蛋白通过上调p 21蛋白来介导细胞周期停滞,p 21蛋白是各种细胞周期蛋白、CDK5(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)及细胞周期蛋白-CDK5复合物的抑制剂,细胞周期停滞可以为DNA修复赢得时间,另一方面,如果细胞内损伤已无法修复,则p 53蛋白促进细胞凋亡。Bcl-2基因发现于人类滤泡性淋巴瘤的14、18位染色体转换点,它可以阻断细胞的凋亡而不影响细胞增殖。它是Bcl-2家族中的一员,该家族中一些成员促进凋亡,如Bax基因;另一些则阻碍凋亡,如Bcl-2基因[3]。体内细胞凋亡与增殖的不平衡与许多疾病有关[4]。

2 肿瘤的产生

30万亿正常细胞是一个复杂和相互依赖的共同管理、相互调控对方的大环境。一个细胞只有当收到附近其它细胞的生长刺激信号时才会增殖,收到抑制信号时则停止生长。这种相互作用使每一种组织得以维持一定的大小和形状,以适应机体需要。

癌细胞则与之截然相反,它们对于正常控制增殖的信号不加理会,只遵循它们自己内在的增殖标准。它们甚至可以移动、入侵邻近组织。由于这种恶性肿瘤细胞组成的肿瘤会入侵越来越多的组织,所以当它们干扰了机体生存所需的器官和组织后就导致机体死亡。

癌细胞是如何产生的呢?许多原癌基因正常时的作用是把外界生长刺激信号传入细胞内。当一种原癌基因突变后影响一个重要的生长刺激信号时,就会使本该沉默的基因活化。有的原癌基因突变后会干扰细胞中的部分信号级联途径,如Ras蛋白,从而在没有受到外界生长刺激信号的情况下,体内基因也被激活。外界的抑制信号也由于信号级联途径受到干扰而无法传入胞内。此外,癌细胞的细胞周期也受到干扰。1/2肿瘤细胞中的p 53基因都缺失或丧失功能,使p 21蛋白失去了抑制细胞周期蛋白、CDK5以及两者复合物的能力,从而使细胞周期失去了限制。组织一般有两种控制增殖并避免癌症的方法:一个是当细胞内重要成分受损或控制系统失调时导致细胞凋亡;另一个系统是细胞增殖倍数的限制。

细胞是如何控制自身增殖倍数的呢?染色体末端的端粒充当了计数器,并在一定时期开始启动衰老和危机。当每次增殖后进入S期时端粒都会微微变短,当长度低于一定阈值它们就启动细胞进入衰老。若细胞仍未经历衰老,进一步的缩短将最终导致危机,即过分短的端粒会导致细胞中的染色体融合或断裂,给细胞造成致命性打击,从而限制细胞增殖能力。端粒酶在正常细胞中几乎不存在,而几乎所有的癌细胞都有该酶,该酶编码的端粒代替了每次细胞周期中被缩短的端粒片段,从而保持了端粒的长度以不受增殖限制。

癌细胞也有几种逃避凋亡的方式。大多数癌细胞p 53基因丢失或无功能,而有一些癌细胞中产生过多Bcl-2蛋白,这些都可以有效避免凋亡[5]。当癌细胞突破这最后两道防线时它们就获得了永生。这不仅使肿瘤可以无限制生长,而且给了原癌细胞或癌细胞以足够长的时间来进行突变以增加复制和扩散能力[2,6]。

3 细胞凋亡与癌症治疗

在最近的30~50年中,癌症治疗主要依赖于各种细胞毒放疗和化疗,这些措施对许多血液恶性肿瘤和一些实体瘤,特别是对生殖细胞和一些儿童的恶性肿瘤有一定的治疗作用。但恶性肿瘤对这些措施有一定抗性,使用大剂量化疗会使抗性反应有一定好转但不会有所突破,而且正常组织和细胞也受到这些细胞毒的杀伤。

长期以来,人们认为肿瘤治疗是选择性地以快速分裂的细胞为靶细胞,但在临床上这种解释并不令人满意。因为可治疗的癌症有时生长缓慢而有抗药性的癌症中也可能快速分裂。更多的事实表明,治疗可能是在肿瘤细胞中诱导凋亡,而各种细胞凋亡的阈值不同造成了对治疗的反应不同[7]。

放疗的基础理论是体外的剂量依赖性模型与临床反应相关,DNA修复在放疗敏感性中扮演重要角色。从而人们推论敏感细胞与抗性细胞相比可能是修复能力差些。但近来的发现与这个观点相矛盾,如p 53基因损伤的肿瘤细胞对放疗有抗性,但是DNA的修复能力却很差。这与预计的结果不符合,暗示放疗可能并不是通过破坏DNA而是直接杀死肿瘤细胞的。凋亡提供了一个令人信服的解释——肿瘤并非死于DNA损伤而是诱发了凋亡程序,DNA损伤在凋亡诱导中也许十分重要,但是不可能直接杀死细胞,因此凋亡可能是放疗诱导的肿瘤死亡的机制[4]。

在研究表臼亚乙苷(拓扑异构酶Ⅱ抑制剂)和其它化疗药物时发现表臼亚乙苷诱导核内DNA断裂,这意味着它可能是通过凋亡来导致细胞死亡。从那以后,诱导凋亡的化疗药物的范围不断扩大,支持凋亡在化疗活性中的作用的事实不断积累。现已知通过凋亡的化疗药物有表臼亚乙苷、5-氟尿嘧啶、顺铂、长春新碱等。

这些化疗药物在许多细胞株的组织培养物中都可诱发凋亡,包括正常的胸腺细胞、淋巴瘤细胞、卵巢癌上皮细胞、白血病细胞、腺瘤细胞等。凋亡的产生可以用形态学观察,琼脂糖凝胶电泳,流式细胞仪来检测DNA含量或用其它标准来判定。

已有研究表明化疗药物在体内同样诱导细胞凋亡。例如在体内用视黄酸处理后T淋巴细胞凋亡;体内对食道癌细胞放疗和化疗(5-氟尿嘧啶、顺铂,博来霉素)处理后诱导细胞凋亡。

化疗诱发细胞凋亡的机制与凋亡调节密切相关。例如,许多化疗药物(如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)都是通过活化ICE或相关蛋白酶而引发最终的凋亡执行阶段。Bcl-2基因的过度表达也可以对抗一些化疗药物(如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、地塞米松、喜树碱、放线菌素 D)引起的细胞凋亡。Bax基因的少量表达也与癌症对联合化疗不良的反应及癌扩散有关。其它的凋亡调节剂也显出与化疗诱导的细胞死亡相作用。如破坏p 53基因可以保护乳腺细胞免遭顺铂诱导的凋亡;Epstein-Barr病毒蛋白BHRF 1(与Bcl-2在结构和功能上都类似)可以使细胞不受表鬼臼毒素吡喃葡糖苷和顺铂诱导的凋亡;Safingol(一种蛋白激酶C抑制剂)可以增加丝裂霉素C杀伤肠癌细胞的能力。

由于凋亡的诱发及调节机制十分复杂,所以各种肿瘤药物诱发细胞凋亡的机制也不尽相同。博来霉素(BLD)引起细胞凋亡机制与进入胞浆中的BLD数目有关。当数千个BLD进入胞浆后,细胞周期停滞在G2/M期,同时伴有细胞肿胀,核多形性改变并逐渐死亡;而当数百万个BLD分子进入胞浆后,细胞很快凋亡并伴有特征性DNA降解[8]。紫杉醇对同步在G0/G1期和G1/G2期的细胞均可在20 h内诱发凋亡。它是通过使Bcl-2表达下降且磷酸化灭活并同时激活Bax基因而诱发凋亡的,p 53基因在其中并无影响。阿霉素是通过升高二脂酰甘油的水平导致PKC激活,PKC可通过拓扑异构酶Ⅱ的磷酸化而直接作用DNA,导致DNA损伤和细胞凋亡[9]。阿糖胞苷(Ara-c)通过下降c-myc,Bcl-2基因表达而导致细胞凋亡,小剂量的Arg-c是S期特异性药物,而中大剂量则不限于S期[10]。顺铂在低剂量时使细胞生长停滞于G2期而不凋亡,高剂理时则诱发凋亡[8]。VP-16主要是引起聚(ADP-核糖)多聚酶活性提高,而该酶可直接激活钙/镁性依赖核酸内切酶,并且不被蛋白合成抑制剂所抑制[11]。

4 细胞凋亡与抗药性

放疗与化疗对癌症都有显著疗效,主要的障碍是许多肿瘤细胞对各种治疗都有抗性,所以细胞的抗药性成为研究的焦点。对凋亡的抗性成是抗药性的主要机制之一,许多其它抗药性机制已在体外肿瘤细胞中得到证实,包括药物代谢水平升高、药物积累改变、药物靶目标扩增、修复受损目标、多药抗性与MDR编码的p-糖蛋白、多药抗性蛋白、p450活性增加、多种药物靶目标——拓扑异构酶Ⅱ突变等。对凋亡的抗性是抗药性中新发现的机制,可以解释相当一部分治疗失败的原因[12,13]。

实际上不存在绝对的对抗化疗和放疗诱发的凋亡,只是相对于正常组织细胞的难易程度而已。许多肿瘤细胞都比正常细胞的抗凋亡能力强,故几乎不存在可以选择性杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常宿主细胞的治疗方法[14,15]。

尽管我们对凋亡的产生及调控已有了初步的认识,但如何把它们应用于临床实践仍是一个大问题。但我们相信,随着基础研究的进一步深入,将为肿瘤治疗的成功或失败提供科学依据,并可为发掘新的抗癌药物拓宽研究领域。

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细胞凋亡范文第10篇

摘要:细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用;它并不是病理条件下自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。凋亡是个井然有序的过程,大量的分子和途径参与了细胞凋亡发生。本文旨在对近几年来对细胞凋亡的最新进展中的几个活跃领域作一回顾。

关键词:细胞凋亡;线粒体;细胞色素C;caspase;Bcl-2家族;NF-κB

文章编号:1006-3617(2007)01-0102-06

中图分类号:R114

文献标识码:A

细胞凋亡(Apoptosis),又称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD),是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是有一系列酶参与、由基因控制的一个主动的、高度有序的死亡过程。细胞凋亡概念提出至今还不到35年的时间,但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中作用重要,引起人们对其机制和组分的广泛深入的研究,成为目前生命科学界研究的热点之一。但其凋亡的确切机制仍不清楚,本文从多个方面概述了细胞凋亡的机制。

1 线粒体在细胞凋亡中的中央调控作用

长期以来,线粒体一直被公认为是细胞内的能量加工厂,其主要作用是为细胞的各种生命活动提供所需的能量。然而越来越多的研究发现,线粒体具有调控细胞凋亡的作用,如细胞凋亡过程中的一类调节因子B 细胞淋巴瘤/白血病基因 2(B cell cymphoma/leukemia-2,Bcl-2)/Bcl-2xl 蛋白位于线粒体的外膜[1]。非洲蟾属卵母细胞的体外凋亡过程也需要一种线粒体复合成分的参与[2]。在研究人类细胞如何调控半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶(caspases)的过程中,人们发现了线粒体释放蛋白――细胞色素C(cyt C)、Smac/DIABLO 蛋白以及凋亡诱导因子(AIF)等可以通过激活caspases 通路导致细胞凋亡,或直接作用于细胞核引起细胞凋亡,这些发现为人们研究线粒体在细胞凋亡中的作用提供了线索。

无论从原始的生物线虫到高级的哺乳动物乃至人类,还是从生物体外周器官到中枢神经系统,细胞凋亡都广泛存在。它作为生命的基本现象之一,可以发生在生理或病理条件下。最初人们仅从形态学表现的特征上加以认识,如胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。进一步的研究表明凋亡细胞形态学上的变化涉及一系列复杂的生化反应,是通过一系列酶参与的级联反应,涉及不同基因的表达及调控、信号传导系统的正负调控。凋亡过程中有许多关键事件集中在线粒体上,如电子传递链的变化、线粒体膜电位的异常去极化、超常的细胞氧化-还原反应。线粒体膜上具有调控凋亡的Bcl-2家族蛋白,该蛋白的结合状态将调节线粒体膜电位的变化,改变cyt C、Smac/DIABLO蛋白以及AIF等的释放。从而通过激活caspase通路导致细胞凋亡。或直接作用于细胞核引起细胞凋亡。由此可见,线粒体除了具有经典的生物学效应外,还具有调控细胞存亡的重要作用[3]。

在细胞凋亡中,线粒体起着中心调控作用,在某种意义上,线粒体可以决定细胞的生存或死亡[4,5]。线粒体具有氧化磷酸化、传递电子、贮存Ca2+、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用,它为细胞的各种生命活动提供基础能量。细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关,包括caspase 激活因子的释放,如cyt C、电子传递链的改变、线粒体膜电位的丧失(Ψmt)、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。不同信号的传导最终都集中到线粒体上来启动或抑制这些事件及其效应的产生[6]。研究发现,凋亡早期线粒体结构保持完整,而坏死细胞的线粒体则发生肿胀,因此将其作为凋亡与坏死的一个重要区别。线粒体的结构和功能的改变,能加速核凋亡特征的出现[21],并是限制细胞凋亡进程中关键的一步。

细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控,多种因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。就现有的材料而言,更多的研究证据提示,线粒体在细胞凋亡的过程中可能起了促进的作用。线粒体可能通过释放与凋亡相关的蛋白,如cyt C、Smac/ DIABLO蛋白以及凋亡诱导因子(AIF)等激活caspases,促进凋亡。且线粒体的此种促凋亡作用受Bcl-2 和caspases 的调节。但是人们对线粒体在凋亡中的作用机制还不清楚,如线粒体的释放蛋白如何作用于caspases,Bcl-2家族蛋白如何调控线粒体膜电位的变化,线粒体是否仅通过释放蛋白的方式来调控细胞凋亡等。目前对线粒体参与凋亡的认识均来源于离体细胞甚至亚细胞水平的研究,并无整体实验的证据。大多的研究证据仅来源于哺乳动物,在对节肢动物和线虫的研究中并未确定线粒体在凋亡中的作用。如前所述细胞的凋亡是一种高度保守的进化过程,因此开展不同类型动物的研究将有利于全面了解细胞凋亡过程。细胞凋亡的复杂性使人们很难判断哪一因素起了最为重要的作用。

细胞凋亡时,原先位于线粒体膜间隙的某些与凋亡有关的活性物质释放到胞质中,这些物质包括cyt C、Bcl-2及其家族成员、线粒体caspase等。cyt C是电子传递链复合物III的一个组分,由核基因组编码,定位于线粒体内膜的外侧[22]。研究表明,多种细胞应激包括 DNA 损伤、热休克和氧化应激等均可激活线粒体介导的凋亡通路致cyt C释放。caspase 是人体细胞的自杀基因。当细胞受凋亡信号刺激后,cyt C从线粒体释放到胞质中,经级联放大作用,形成caspase 9-caspase 3 活化复合物(凋亡体),最终引起细胞凋亡。Bcl-2是促进细胞存活、抑制凋亡的基因,是线粒体上的一种跨膜蛋白,它可通过阻止线粒体释放前凋亡因子cyt C来阻断凋亡。而另一些Bcl-2家族成员Bax、Bak和Bid可插入线粒体外膜形成通道,释放凋亡活性物质。因此,线粒体结构和功能的变化是细胞凋亡的枢纽环节[7]。

2 cyt C在凋亡中的作用

近年来人们对凋亡的认识已经从细胞核的改变决定凋亡发展为重视线粒体的作用,因为它构成了细胞存亡的控制中心。凋亡过程中线粒体呼吸链电子传递中断,自由基产生,能量供应受阻。在检测到经典的细胞凋亡特征以前,线粒体膜完整性就已经发生了重大变化。这些变化涉及到线粒体内膜和外膜的改变,包括内膜跨膜电位的丧失和(或)蛋白质通过外膜的释放。线粒体在细胞存亡机制中的作用所以越来越引起人们的重视,一方面是由于线粒体膜间隙的cyt C释放至胞质后触发caspase级联,导致细胞死亡;另一方面,线粒体外膜上的Bcl-2蛋白家族调控cyt C从线粒体的释放。因此cyt C是哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因素,对cyt C释放的研究是目前的研究热点[8]。

大量证据表明,在多种细胞死亡模型中cyt C从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步骤,LIU等[9]在试图纯化一种体外激活caspase所需的成分时提取出了包含cyt C的组分。在无细胞(cell-free)模型系统中,cyt C可激活caspase-3,从而触发细胞凋亡。此外,在无细胞模型系统和完整细胞中,Bcl-2或Bcl-xL的表达均可阻断cyt C从线粒体释放,从而抑制caspase-3活化和细胞凋亡。

在线粒体调控下的细胞凋亡与神经元的死亡过程有着密切的联系,包括cyt C的释放入胞质和凋亡级联反应的起始[10]。铝诱导的老年兔海马中的cyt C从线粒体释放入胞质是凋亡的关键性步骤[11]。cyt C从线粒体释放并参与Apaf-1引起铝介导的凋亡级联反应[12]。cyt C释放后作用的机制尚未完全清楚,近年来的研究集中于cyt C在介导对引发凋亡起关键作用的procaspase-9转变中的枢纽作用。释放的cyt C与Apaf-1的结合可导致下游的caspase的活化或解除一种内在的抑制机制。Apaf-1的氨基末端组成一个caspase募集区(caspase recruitment domain,CARD),它可能直接结合于caspase。有研究表明热休克蛋白HSP70、HSP90可通过与Apaf-1的CARD直接结合而抑制cyt C介导的Apaf-1-caspase-9寡聚体(apoptosome)的形成。

近来凋亡研究的一个重要进展是发现线粒体可向胞质释放一些凋亡相关因子,启动凋亡反应,其中最重要的是cyt C和AIF。大量研究表明,在凋亡初期cyt C可以从线粒体内膜释放,从而启动了线粒体的凋亡机制[13~16]。其释放的途径有两条:一条是线粒体通透转运孔(MTP)的开放;另一个是促凋亡基因Bax的诱导作用,引发了细胞的凋亡。但抗凋亡基因Bcl-2可以阻断cyt C的释放和caspase的激活。研究证实Bcl-2家族蛋白,诸如Bcl-2、Bcl-xL和Bax具有成孔性质[17],估计它们直接调节线粒体膜对cyt C的通透性。cyt C的释放是细胞死亡程序中关键的一步。一种类似ICE的caspase的激活是Fas和TNF-α受体信号途径的早期过程。该酶的抑制阻止了cyt C从线粒体中释放,也抑制了Fas介导的细胞凋亡[18]。但至今还未证实caspase与线粒体膜的主要成分直接反应。在很多细胞凋亡实验中,caspase抑制剂并不能导致cyt C的释放[19]。

3 caspase在细胞凋亡中的作用

哺乳动物细胞中,在凋亡过程中起关键作用的一些含有半胱氨酸-门冬氨酸特异蛋白酶,被称为caspase。caspase主要以酶原形式存在于健康细胞中,通过活化发生蛋白水解获得活性。caspase有许多种,它们可以逐级水解活化,共同促进凋亡进程。线粒体释放的cyt C能与Apaf-1及caspase-9 形成一个复合体,在dATP、ATP存在下活化caspase-3,6,7等下游caspase,但需要高浓度caspase-8,体外实验在无线粒体的提取物中caspase-8能活化其他caspase导致DNA的降解,但核膜仍然完整。在线粒体存在时caspase-8的作用可被依赖cyt C的caspase放大,加速凋亡的进行[20]。事实上,活化的caspase自身可以刺激线粒体释放cyt C,实验发现活化的部分caspase与分离出的线粒体作用,可改变线粒体膜的通透性,导致Ψmt的崩溃。线粒体自身也含有一定量的caspase,通过单抗鉴定,caspase-3前体有一种亚型,位于膜间隙,受凋亡信号刺激后会释放出来[21]。这样就有可能存在一个caspase和线粒体自身反馈的环,凋亡刺激导致线粒体cyt C、AIF、caspase的释放,caspase的活化又促进诱发这一过程,这对于凋亡的加速和凋亡信号在线粒体间的传递是十分有意义的[22]。

与caspase有关的凋亡通路至少有3种:线粒体/细胞色素C通路、死亡受体通路和内质网通路[23]。

3.1 线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路 各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放cyt C。在ATP/dATP存在的情况下,cyt C结合到Apaf-1的WD40重复区域,促使Apaf-1寡聚化,形成Apaf-1-cyt C多聚复合体。此复合体通过Apaf-1氨基端的CARD与caspase-9原域的CARD之间的蛋白-蛋白相互作用,以1∶1比例募集胞质中的caspase-9。caspase-9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化[24]。caspase-3和caspase-7也被募集到Apaf-1/caspase-9复合体中,活化的caspase-9激活caspase-3和caspase-7,从而启动了caspase级联反应。caspase-3是细胞凋亡的主要执行者,通过特异性地裂解一套底物而导致细胞凋亡。caspase-3和 caspase-7具有高度的同源性、相似的功能和相似的底物特异性,都能酶切多聚ADP核糖聚合酶(PARP)和乙酰基-DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素(Ac-DEVD-AMC),乙酰基-DEVD-乙醛(Ac-DEVD.CHO)是caspase-7和caspase-3的强有力的抑制剂。Bcl-2家族成员调节Apaf-1的活性。Bcl-xL能抑制Apaf-1/caspase-9的活化;Bik能拮抗Bcl-xL的功能。

3.2 死亡受体介导的凋亡通路 死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族,包括Fas(又称CD95或Apol)、TNFR1(又称p55或CD120a)、DR3、DR4和DR5,在胞内部分都含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白[25]。

3.3 内质网介导的凋亡通路 大量事实表明内质网在凋亡信号处理过程中发挥重要作用,导致下游caspase和其他蛋白酶的激活。虽然其确切机制还不清楚,但是内质网通路不同于线粒体或死亡受体介导的凋亡通路。内质网在维持细胞内钙离子内环境稳定,以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面发挥关键作用[20]。在几乎所有非肌肉细胞中,钙离子的储存、释放和摄取都受到内质网蛋白的调控。caspase-12位于内质网膜,是内质网应激(如内质网钙离子内环境紊乱以及过量内质网蛋白积累)诱导的凋亡所必需的。内质网应激诱导caspase-12表达,同时也导致胞质中的caspase-7转移到内质网表面。Caspase-7激活caspase-12,然后导致细胞死亡[21]。研究表明,钙离子在凋亡的调节过程中发挥重要作用。钙网织蛋白(Calreticulin)是内质网腔主要的结合钙离子的分子伴侣,调节细胞内钙离子的动态平衡[22]。Calreticulin 的过表达导致细胞对毒胡萝卜内酯(Thapsigargin)和十字孢碱(Staurosporine)诱导的细胞凋亡敏感性增加。此过程与线粒体cyt C释放增加有关。

虽然特定的凋亡刺激可激活3种凋亡通路中的一种,但是在某些情况下3种通路之间是相互联系的。如上所述,caspase-8通过切割Bid把死亡受体通路和线粒体/细胞色素C通路联系起来;通过Ca2+内质网和线粒体之间也存在着密切的联系。

但也有研究指出caspase在神经保护中也可以起到重要作用[26]。caspase-3是细胞凋亡信号中最关键因子之一,但并非caspase-3增加,细胞便不再自救并直接进入凋亡。其实细胞在活化caspase-3时,caspase-3一方面会导致细胞的凋亡,同时另一方面它也会活化HSP70,诱导神经细胞的保护,两者共同作用决定了细胞的真正命运。该研究表明细胞凋亡并非是单一通路,而且细胞并非接到死亡信号(如FADD等)时便立即无选择性地进入凋亡,往往细胞会激活相对立的两个过程,凋亡和抗凋亡,两种信号通路的强弱对比决定凋亡或生存最后的命运。如果细胞的抗凋亡作用占上风,表明这个细胞尚有生存价值,它未必走向凋亡。

4 Bcl-2家族在细胞凋亡过程中对线粒体功能的调控

Bcl-2家族与秀丽隐杆线虫(C. elegans)的CED-9蛋白同源,包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2,Bcl-xL,Bcl-w及Mcl-1)和促凋亡蛋白(如Bax,Bak及Bok)。除Bak之外,大部分Bcl-2家族蛋白通过羧基末端的疏水基插入到线粒体外膜上。Bcl-2蛋白家族调控cyt C释放的线索之一来自于对 Bcl-xL[27]三维结构的研究。Bcl-xL是由两个位于中心的疏水性螺旋(5和6)和包绕于外周的亲水性螺旋构成的。 Bcl-2家族的其他成员如Bcl-2、Bax和tBid(truncated form of Bid)与Bcl-xL均具有高度同源性序列。已证实Bcl-xL、Bcl-2、Bax和tBid能够在人工质体和双层质膜中形成功能性离子通道。这些通道都具有多种电导状态,对pH和电压敏感,对离子具有低选择性。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的通道的内在特性不同,前者形成的通道为阳离子选择性,而后者形成的通道为阴离子选择性,这可能与它们对cyt C释放的相反的调控作用有关。Bcl-2蛋白家族与凋亡密切相关。随着人们对其研究的不断深入,其家族成员亦日益增加,其中包括抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bfel、Al 等和促凋亡蛋白Bax、Bcl-xS、Bad、Bak、Bik等,它们分布在线粒体外膜、核膜和内质网膜上,在线粒体上Bcl-2成片分布于线粒体内外膜接触处。

Bcl-2对凋亡细胞的线粒体调控是多方面的,它能对抗神经酰胺诱导的Ψmt的丧失,并在完整和无核的细胞中均起作用。Bcl-2在线粒体外膜的过量表达抑制了叔丁基氢过氧化物(t-butylhy droperoxide,tbOOH)、prororophore和attractyloside诱导的MPT,却不能抑制其他因素,如500 μmol/L Ca2+或肼(diamide)诱导的MPT。因此,Bcl-2只能在较窄的范围内抑制MPT的发生[28]。Bcl-2抑制MPT的机制是阻止一些小分子如Ca2+从基质中释放以及AIF从内外膜间释放到胞质,而Bcl-2不能阻碍AIF的生成。此外,过量表达Bcl-2家族中能诱导凋亡发生的成员可能参与MPT的发生而阻碍线粒体释放AIF从而抑制凋亡的发生,可以说Bcl-2家族中能诱导凋亡发生的成员可能参与MPT的形成,而抑制凋亡的成员则阻碍MPT的形成。另外,Bcl-2还可以通过抑制cyt C的释放而阻止凋亡的发生。

文献报道抗凋亡蛋白Bcl-2在线粒体外膜上形成的阳离子选择性通道可允许质子从线粒体膜间隙逃逸至胞质,避免膜间隙过酸,从而抑制凋亡。膜间隙过酸促使细胞色素C自线粒体释放的机制尚不清楚[29]。KUDLA等[30]证实正常情况下以单体形式存在于胞质的Bax在受到凋亡刺激时构象发生变化,导致Bax寡聚体形成并整合到线粒体外膜上,随后即发生cyt C自线粒体释放。这种迄今为止仅发现发生于Bax的寡聚化可能是促凋亡蛋白大型通道(megachannels)形成的机制。此外,已发现Bax和tBid可降低磷脂双层的稳定性,而Bcl-xL则不能,提示促凋亡蛋白可能通过直接降低线粒体外膜稳定性促进cyt C释放[31,32]。

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡过程中的一类调节因子。已有大量的研究提示,此蛋白家族需定位于线粒体膜才能发挥调节凋亡的作用。主要表现为通过调节线粒体膜电位的变化,影响线粒体膜的通透性,进而改变线粒体蛋白的释放,调控细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括两类功能相反的蛋白质,一类是抑制细胞凋亡的蛋白,如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等;另一类是促进细胞凋亡的蛋白Bax、Bak、Bok等。Bcl-2相关蛋白包含不同数量Bcl-2保守区域(BH12BH4)。近年发现Bid、Bad、Bik等仅含有BH3同源区域的一类蛋白(BH32only protein),在促进细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。多种凋亡诱发因素,如死亡受体与死亡配体结合、细胞损伤因子等均可活化Bid 蛋白,活化的Bid 蛋白可通过两种途径促进细胞凋亡:①与Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制蛋白结合,减弱其抑制凋亡作用[33];②与Bax、Bak 等凋亡促进蛋白结合,使原来位于细胞质或松散定位于线粒体膜上的Bax、Bak 插入线粒体膜,诱导线粒体蛋白的释放,促进凋亡[34,35]。Bid 蛋白的这种促凋亡作用在神经元凋亡中也有发现。Bcl-2 家族蛋白调节线粒体蛋白释放的具体机制尚未明确。体外试验证明Bcl-2、Bcl-xL可在人工双层脂膜中形成通道[36],经X射线衍射和核磁共振(NMR)分析发现Bcl-2、Bcl-xl含两个反平行的疏水α2螺旋结构,与某些细菌的毒素蛋白成孔结构域相似。另有研究报道,Bcl-xL可以调节线粒体渗透性转换孔(PTP),维持线粒体的膜电位[37],从而抑制细胞凋亡的发生。以上研究表明,Bcl-2 家族中抑制凋亡的相关蛋白可能通过调节线粒体膜通道的通透性来稳定线粒体,阻止线粒体释放cyt C等凋亡相关蛋白,抑制凋亡发生。反之,促进凋亡的Bcl-2家族蛋白可能破坏线粒体膜的稳定性,促进凋亡发生。另有研究显示,当细胞发生凋亡时细胞质的pH值下降,胞质酸化与细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻共存。而细胞过度表达Bcl-2 则可降低胞质的酸化程度,抑制凋亡[38,39]。然而Bcl-2 对凋亡的此种抑制作用是否通过线粒体介导尚待进一步证实。

尽管Bcl-2对线粒体有直接的调控作用,但也有很多证据表明,其对内质网也有调控作用[40,41]。越来越多的证据显示了内质网在凋亡调控中的积极作用,内质网应激也可以导致细胞凋亡[42]。而且内质网可以单独激活不受线粒体调控的caspase-12因子[43],近来有报道内质网也可以诱导cyt C的释放和caspase-3的激活,但这种作用可以被Bcl-2所阻断[44]。Ghribi等在兔的脑池中注射铝制成的阿尔茨海默病模型的研究中发现,Bcl-2和Bax在内质网的表达也可以调节细胞的凋亡,并且其含量高于线粒体内的含量,Bcl-2/Bax的比值是决定cyt C释放和caspase的激活的关键[45],而且在小鼠的研究中也得到了相似的结论[46]。

5 NF-κB和神经元凋亡

细胞核因子κB又称κ基因结合核因子(nuclear factor k gene binding,NF-κB),是一广泛存在于细胞中的具有多向性调节作用的蛋白质分子,参与细胞激酶、趋化因子、生长因子、细胞黏附因子及早期反应的蛋白质分子基因的转录,其活性受到一个强抑制物IκB的抑制。近年来研究结果表明:NF-κB能介导广泛的生物学作用,参与多种疾病的发生发展过程。NF-κB在细胞凋亡中有一定的作用。

NF-κB是一种转录因子,有着广泛的生物学作用。1986年SEN等[47]最初发现NF-κB是一种与免疫球蛋白κ轻链基因增强子特定κB部位结合的蛋白质。NF-κB广泛存在于静止期细胞的细胞质中,其蛋白二聚体与特异性抑制蛋白-超级抑制物IκB形成三聚体,以非活化形式存在于细胞质。当细胞受到如病毒或细菌感染、紫外线照射和感染前期细胞因子等作用刺激后,IκB可发生磷酸化而失活,进而使NF-κB活化,进入细胞核内,随后NF-κB与胞核内某些基因的增强子的GGGRNNYYCC的基元结合,启动或调节早期反应基因的转录,参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡。

KIM等[48]首次发现在神经元中存在NF-κB,研究发现与大多数外周细胞不同,中枢神经系统尤其是大脑皮层和海马神经元内含有高结构型活性的NF-κB,推测这些NF-κB可能参与代谢非常活跃的神经元中抗氧化系统的调节。在神经元胞体、突触以及突触后致密层均已发现存在可诱导型的NF-κB活性[49],提示其作为信使将突触信号传递到核内。研究也证实在胶质细胞,如星形细胞、小胶质细胞及许旺细胞胞质中存在非活性的NF-κB[50]。中枢神经系统(CNS)内激活NF-κB的信号主要有以下两类:第一类信号在外周组织也存在,包括炎症细胞因子(TNFα,IL-1)、氧化应激、紫外线、细菌和病毒产物等[51];第二类为CNS特异的信号,包括去极化、神经递质(谷氨酸、阿片样物质)、神经生长因子以及几种不同的神经毒性刺激,如高浓度的谷氨酸、糖基化牛磺酸、β-淀粉样蛋白等[52]。

有关NF-κB是诱导细胞死亡还是促进细胞存活仍有争论。GRILLI等在培养的小脑颗粒体细胞和海马脑片中发现水杨酸可通过抑制谷氨酸对NF-κB的激活而阻止谷氨酸诱导的细胞死亡;MAIZO等[53]发现NF-κB的激活介导了谷氨酸引起的纹状体神经细胞的凋亡;GREEN等[5]发现自由基清除剂能通过抑制NF-κB的激活而减轻兴奋性毒素引起的纹状体神经细胞的凋亡。但越来越多的证据表明活化的NF-κB具有抗凋亡作用。用IκB反义核酸处理,即激活NF-κB能减轻β淀粉样蛋白对海马神经元的损伤作用;且证明具有神经保护作用的可溶性APP是通过激活NF-κB而起保护作用的;NF-κB的激活剂TNF-α和神经酰胺能保护培养的海马神经元免于兴奋性氨基酸和氧化应激的损伤,是通过引起κB反应基因Mn-SOD和钙结合蛋白的转录而起作用[6]。研究结果的不一致可能与以下因素有关:①在不同的细胞中,不同NF-κB亚单位表达量的不同,使得NF-κB二聚体的组成不同,从而影响NF-κB与其靶基因调控区DNA序列的结合,进而影响基因表达;②在不同细胞中与NF-κB同时激活的其他转录因子或同一类细胞中由于激活及代谢状态的不同均可影响NF-κB的最终效应,如已证明HMG样蛋白能决定NF-κB是起转录激活剂还是起转录阻遏物的作用;③外界刺激强度的不同也可影响NF-κB的效应。如在生理条件下,谷氨酸受体的激活引起胞内Ca2+浓度的短暂升高,导致少量转录因子的激活,而在病理情况下,突触间隙谷氨酸含量的增加和(或)异常刺激的谷氨酸受体,使得激活的转录因子的数量增加,进而使转录的NF-κB靶基因的数量或水平增加,最终改变细胞的反应.

大量研究表明,活化的NF-κB在细胞凋亡中具有抗凋亡和促凋亡的双重作用。NF-κB在神经细胞凋亡的网络中起着枢纽作用。NF-κB的不同作用可能与下列因素有关:在不同时间、部位以及其二聚体的组成不同,调控不同靶基因DNA序列而转录不同蛋白质进而影响凋亡的进程;与NF-κB同时激活的其他转录因子或由于激活及代谢状态不同而影响NF-κB的最终效应;外界刺激强度不同导致NF-κB的效应不同。目前存在的问题是NF-κB在何种情况下激活抗凋亡基因转录,在何种情况下调控促凋亡基因转录,与被调控的蛋白质翻译量(剂量-效应)之间的关系如何,抑制蛋白IκB的亚类是否和转录的蛋白种类有关,进而和凋亡进程关系是否相关;更进一步,IκB的各种类型与下游通路之间是否存在点对点关系及其与凋亡的关系如何等等[54]。

总之,细胞凋亡的调控是一种复杂的多水平的调控,多因素相互作用促进或抑制凋亡的发生。对细胞凋亡分子机制的探讨是当今一个热点,除了以上这些基因蛋白在细胞凋亡过程中起到非常重要的作用外,还有许多基因蛋白在凋亡中也起着很重要的作用,还有许多基因蛋白也许是人类还没有认识到的。细胞凋亡的复杂性是使人们很难判断那一因素起了最为重要的作用,相信通过新的研究和新的发现将为人们带来新的认识,不仅有利于人们更完整地了解细胞的凋亡机制,而且有利于人们找到有效的手段来调控细胞的凋亡过程,为人类的健康和有效生存服务。

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