细胞膜范文

细胞膜篇1

患者女16岁因“声音变粗、体毛增多1年多闭经、下腹胀痛6个月余”就诊以“盆腔包块性质待查”收入院。患者15岁月经初潮月经～天/15天～个月量中色暗红轻微痛经。1年前开始出现声音变粗如成年男性声音体毛增多长胡须。自认为发育阶段未予重视。半年前出现闭经同时自觉下腹部胀痛近日下腹部胀痛明显即来我院门诊就诊。B超检查提示:左侧附件区囊实性占位性病变。CT检查报告:下腹部囊实性占位性病变考虑:①肠系膜囊肿?②畸胎瘤?于5年月日收入院。患者无明显食欲减退、消瘦、乏力等症。入院后检查:T 66℃P 8次/分R 次/分BP 1/7mmHg。发育正常营养中等精神差对答切题声音粗哑。上唇汗毛及眉毛粗浓喉结明显。心肺无异常下腹部略膨隆左下腹可触及椭圆形包块质中等有压痛无移动性浊音肠鸣音正常下肢无浮肿神经反射正常。妇科检查:外阴发育正常浓密。肛诊:子宫大小触诊不清左侧附件区可触及儿头大小包块呈囊实性压痛明显活动差。入院后查血、尿、便常规、肝功、肾功、电解质、血糖均在正常范围。血SH 96mIU/ml5～1TSTO 19ng/dl1～76CA-15 5U/ml9～69E 8pg/ml8～17其余均在正常范围。心电图、胸部拍片无异常。初步诊断:盆腔包块性质待查①左侧卵巢肿瘤?②左卵巢畸胎瘤?。于5年月1日在腰麻+连续硬膜外麻醉下行剖腹探查术。术中见:盆腔内淡红色腹水约ml子宫呈幼稚型表面光滑无粘连质中左侧卵巢肿瘤约15cm×cm大小呈分叶状内为囊实性表面见约5cm大小破口破口处与前腹膜粘连右侧卵巢呈条梭状输卵管无异常即行左侧附件切除术切除组织快速冰冻切片回报:卵巢恶性肿瘤。手术方式改为左侧附件切除术+大网膜切除术+盆腔淋巴结清扫术+右侧卵巢活检术。术中分别抽取两侧卵巢静脉血测TSTO、CA-15、E左侧为TSTO 115ng/dlCA-15 1558u/mlE 91pg/ml右侧为TSTO 1756ng/dlE 17pg/ml。左侧明显升高。手术经过顺利术后剖视组织见:肿瘤表面光滑切面呈灰黄色烂鱼肉样部分区域有出血。病检回报:左卵巢颗粒细胞-卵泡膜细胞瘤右卵巢滤泡囊肿各组淋巴结反应性增生。术后第8、9天间断拆除伤口缝线愈合好。术后半月5年月5日复查血TSTO 6ng/dlE 188pg/ml血、尿常规肝、肾功凝血两项均在正常范围行双侧髂内动脉介入化疗。化疗方案:PEB方案即卡铂mg、足叶苷mg、博来霉素6mg。化疗顺利不良反应轻微住院7天好转出院。出院1周来院检查患者精神好、面色红润血TSTO 6ng/dlE 898pg/ml均正常。出院周复查血TSTO 6ng/dlE 1688pg/ml。术后个月复查血TSTO 57ng/dlE 1588pg/ml月经来潮量少。术后个月血TSTO 691ng/dlE 81pg/ml。月经不规律量少。此后由于家庭经济困难再未追踪随访。半年后病情复发在当地肿瘤医院再次行手术治疗。

讨 论

颗粒细胞瘤为卵巢性索间质肿瘤单纯颗粒细胞瘤为低度恶性肿瘤。占卵巢肿瘤%～6%占性索间质肿瘤8%左右任何年龄均可发病而以5～55岁为发病高峰年龄。由于肿瘤能分泌雌激素因此/病例伴有雌激素水平过高故有女性化作用。卵泡膜细胞瘤大部分发生于绝经后的妇女也分泌女性激素故而也具有女性化作用。两种细胞瘤常常合并存在均产生雌激素效应。据资料报道一些罕见的卵泡膜细胞瘤倾向发生于较年轻的女性而且机体产生雄激素。

本例15岁时才开始月经初潮出现明显男性化体征及闭经时仍未就诊直至下腹部胀痛时才来就诊。而且术前检查雌激素水平并不高相反雄激素水平却明显增高比较少见。

细胞膜篇2

大肠杆菌有细胞膜，除了病毒以外，所有的生物体都有细胞膜。大肠杆菌属于革兰阴性杆菌。革兰阴性菌与革兰阳性菌都是有细胞壁的，只是相应细胞壁的结构会稍微有所不同。二者都含有肽聚糖，但是革兰阳性菌的肽聚糖层数可以比较多，达到50层之多都是可能的。而革兰阴性菌的肽聚糖层数比较少，一般来说是1-2成左右。

（来源：文章屋网 http://www.wzu.com）

细胞膜篇3

关键词:人角膜上皮细胞 基质细胞 内皮细胞 体外培养

中图分类号:R772 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2012)05(c)-0231-01

组织工程人角膜体外重建基本方法是取一定量种子细胞,将其成功迁入到生物相容性良好的载体中,形成结构与人角膜相似的组织工程眼角膜。来源于病人本身的自体细胞是最理想的种子细胞,其最大的优越性在于植入人体后不会引起个体的免疫排斥反应。如果能将自体细胞在体外持续扩增培养,将会对组织工程人角膜体外重建做出巨大贡献。本文拟对人角膜三种细胞在体外扩增培养的研究进展、目前存在的问题以及解决途径进行综述。

1 人角膜细胞概述

人角膜细胞有三种:人角膜上皮细胞,人角膜基质细胞以及人角膜内皮细胞。形态结构各异的人角膜细胞在各自的区域行使着各自的生物学功能,共同维持角膜的透明度,厚度以及正常的生理功能。

人角膜上皮细胞根据其形状不同分为鳞状细胞,翼状细胞以及柱状细胞。其中鳞状细胞位于表层,靠紧密连接和黏着带形成一半渗透性膜。中间为翼状细胞,细胞与细胞间靠桥粒结构连接。底层为单层的柱状细胞,三种细胞中只有柱状细胞尚有分裂能力,且它还可以分泌产生基底膜,柱状细胞靠半桥粒结构固定于基底膜上。

人角膜基质细胞分布于角膜基质纤维板层之间,其形态非常扁平,从中央细胞体向各方延伸出许多长的分支,逐渐变细。这些分支的末端与邻近的细胞相接触,形成层间连接。它具有典型的蛋白质分泌细胞的细胞器,如核糖体,内质网及高尔基体等。正常情况下人角膜基质细胞处于静止、半脱水的状态,但在人角膜发育和修复时,人角膜基质细胞分泌和合成胶原纤维的能力增强。

人角膜内皮细胞排列成单层,构成人角膜内皮层。角膜内皮细胞呈规则的六角形,表面有很多微绒毛,细胞与细胞间的连接为桥粒和缝隙连接。细胞膜透明,透射电镜下可见胞浆中分布内质网,高尔基体以及较多的线粒体。人角膜内皮细胞没有增殖能力,随着年龄的增加,疾病或者眼内手术的影响,人角膜内皮的数量会慢慢减少,细胞的形状以及大小都会发生变化。

2 人角膜细胞培养概况

中山大学王智崇等人尝试建立利用连续传代培养的方法建立人角膜上皮细胞系[1]。该实验将无菌的眼球转入超净工作台后,用虹膜恢复器钝性分离角膜缘板层组织。随后剪成1mm3大小组织块,将组织块上皮面朝下贴在培养瓶中,干贴30min后补加少量完全培养液,静置培养。这些学者成功建立了2株角膜上皮细胞系。光镜下该细胞系细胞成典型的角膜上皮细胞形态,经免疫荧光检测发现该细胞系细胞表达角膜上皮细胞的特异的蛋白CK3。

谢立信等人尝试过人角膜基质细胞的原代培养[2],在无菌条件下获得人角膜基质片,将其切成4块,放进24孔培养板中。添加少量培养液,持续培养直到观察到组织块周围有角膜基质细胞贴壁生长之后再转移组织块至另一个孔内。原来的孔内补加培养液,使细胞分裂增殖形成原代纯基质细胞单层。光镜下观察角膜基质细胞密度越高,排列越整齐,呈典型梭形,染色后可见每个细胞有一个椭圆形的核。

以往角膜内皮细胞的培养方法是先剥离后弹力层及内皮细胞层组织[3],此种方法由于用力时力度不易掌握,而且反复刮除还容易使后弹力层破裂从而导致角膜基质细胞的污染,现在已不再采用。还有一种方法是酶消化法[4],将角膜内皮凹面朝上,加入消化酶并使消化酶仅作用于角膜内皮的部分从而收集原代内皮细胞,但在常因为由于操作的繁杂而难以达到预定结果并造成细胞本身的损害,同时角膜组织暴露时间过长而增加了污染的机会。目前采用的角膜内皮细胞原代培养方法大致上有三种,消化培养法,组织贴片培养法以及揭膜培养法。

3 人角膜细胞体外培养存在的问题以及解决途径

虽然来源于病人本身的自体细胞是最理想的种子细胞,有很大的优越性。但是自体来源的细胞具有局限性,来源有限、取材部位会受损伤、患病状态下或老年患者的细胞不宜用于移植。而将自体细胞在体外扩增到一定的数目,甚至建立成标准的细胞系,是致力于组织工程人角膜体外重建研究中学者们需要攻克的难关。

目前对种子细胞体外培养的研究应着重于以下几个方面,首先在不把癌基因或致使细胞永生化的一些其他基因片段导入细胞基因组的情况下,设计科学的培养方法使得人角膜细胞能在体外能连续传代培养,获得非转染的无致瘤性的细胞;同时致力于研究人角膜细胞在体外培养的情况下如何保持细胞的增殖能力,合成细胞外基质的能力以及能正常表达一些功能性蛋白行使正常的生物学功能等;除此之外还要致力于找出人角膜细胞在体外培养的情况下逐渐老化的本质原因,优化培养条件,提高培养技术,使在体外培养的人角膜细胞能大量增殖,最终建立形态学结构和生物学功能均正常的人角膜细胞系。

参考文献

[1] Diebold.Y,Calonge.M,Characterization of a Spontaneously Immortalized Cell Line (IOBA-NHC) from Normal Human Conjunctiva.Invest Ophthalmol Vis Sci,44:4263～4274.

[2] 谢立信,董晓光.人角膜细胞的原代培养实验研究[J].潍坊医学院学报,1990,12(1):10～13.

[3] tocker FW,Georging R.A tissue culture technique for growing corneal epithelial stromal,and endothelial tissues separately.Am J Ophthalmol,1958,46(5):294～298.

细胞膜篇4

【关键词】 干细胞； 子宫内膜异位症； 病因

子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是妇科最常见的良性疾病之一，发病率高达10%～15%，但现有治疗效果都不令人满意。EM的病因尚不明确，目前的学说均不能完全解释临床上多种类型EM的发病。因此，进一步探究EM的病因对于指导并寻找新的诊疗方法，有着十分重要的意义。随着干细胞研究的不断深入，越来越多的证据证明EM可能与各种来源的干细胞相关，EM是一种干细胞相关疾病的观点被越来越多的研究者所关注。

1 现有病因学的多种假说

对于EM的发病原因，研究已较为深入，目前存在多种学说，最广为接受的Sampson学说(即传统的子宫内膜种植学说)认为EM是内膜随经血逆流进入腹腔、种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜表面，继续生长、蔓延而形成的，随着月经周期反复出血而形成内膜异位囊肿。Hirata等［1］使用GFP小鼠示踪异位内膜支持了这一理论，但男性患者在长期使用雌激素治疗后，也可以发生EM，这种现象是不能用子宫内膜种植来解释的。体腔上皮化生学说认为由于胚胎发育过程中，苗勒氏管、卵巢表面的生殖上皮、盆腔腹膜都是由胚胎具有高度化生潜能的体腔上皮细胞分化而来，异位的内膜组织也是由体腔上皮化生而来的，也有病理学研究为该学说提供了证据［2］。然而这些学说均不能完全解释临床上所有类型EM的发病。

越来越多的研究开始关注免疫因素、遗传因素和内分泌因素在子宫内膜异位症发病中的作用。

由于发现EM患者常伴有某些免疫功能异常，EM发病的免疫因素越来越受到重视。免疫学说认为，免疫反应异常是导致内膜损害的起始点，并且能够维持这种损害的持续存在，即EM被认为是一种自身免疫综合征。在EM患者的血清、宫颈分泌物、阴道分泌物中发现抗子宫内膜和卵巢的IgG，IgA型自身抗体，而多种自身抗体与不孕症相关。细胞免疫反应的减弱是异位内膜细胞得以种植的重要条件，其中EM患者巨噬细胞活性增高、T淋巴细胞活性减低。巨噬细胞活性增高，其生长因子分泌增加，其中包括血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGFβ）、巨噬细胞衍生生长因子（MDGF）、表皮生长因子（EGF）等，而这些生长因子在体外可刺激内膜基质细胞的增殖。EM患者体内多种因子水平升高，如肿瘤坏死因子α（TNFα），白介素1（IL1），IL2，IL6，IL8，单核细胞趋化蛋白1（MCP1），γ干扰素（INFγ），以及活化正常T细胞表达和分泌的调节物（RANTES）等，且都与疾病的进展有关。但是，对于免疫因素是EM发生的原因还是结果，目前存在较大争议，前者尚缺乏确凿的证据［3］。研究表明EM有遗传倾向，在英国，EM患者的一级亲属EM发病率为一般人群的6倍；1997年报道单卵双胎姐妹EM发病一致性为88%。由此提出了EM是多基因遗传病，一名妇女基因中拥有阈值数量以上的致病基因就会发病。另外，部分EM患者有特异染色体的改变，包括单体X，4q+，5q+，和7，8，10三倍染色单体，以及基因片段如1p，22p，5p，6q，7p丢失等，都提示EM与遗传有关。

EM是雌激素依赖性疾病，EM病灶自己也产生雌激素。雌激素是一种很强的有丝分裂原，体内明显能促进正常子宫内膜和EM病灶的生长，而雌激素并不能促进体外培养的异位内膜细胞增殖，但可使体外培养的子宫内膜间质细胞VEGF合成增加，也能激发旁分泌细胞因子，刺激基质金属蛋白酶（MMPs）基因的表达，后者能促进子宫内膜碎片侵入腹膜下层，并在异位生长。EM妇女与正常妇女体内雌二醇（E2）水平无显著差异，而前者的月经血中E2浓度明显升高，说明病灶局部雌激素产生亢进。由此，有雌激素阈值理论认为：在很低的E2水平（5～15 pg/ml）时，很多雌激素反应性组织处于静止或萎缩状态（如内膜）；当某些组织中E2达到20～60 pg/ml时可引起明显的组织反应；例如EM病变组织需要E2水平>20～40 pg/ml才开始生长，显然EM病灶局部远远超过这个水平（正常月经妇女E2为50～300 pg/ml，绝经后与男性约为5～15 pg/ml）。

郎景和［4］根据EM患者的在位子宫内膜与非EM患者的在位子宫内膜存在基因表达等多方面差异，提出了EM的“在位内膜决定论”，即不同个体（患者与非患者）经血逆流或经血中的内膜碎片能否在“异地”黏附、侵袭、生长，在位内膜是关键，在位内膜的差异是根本差异，是发生内异症的决定因素。这一理论是近期EM病因学研究的一项重要发现，对常见的腹膜型内异症发生作出了合理的解释，对Sampson学说做出了重要的补充和发展。但是，在位子宫内膜到底通过什么途径“决定”或影响了EM的发生与发展，目前还缺乏较为深入的研究。

2 子宫内膜异位症病因的干细胞学说

2.1 子宫内存在干细胞的相关研究

临床研究支持子宫内膜干细胞的存在：正常女性的月经血中干细胞的含量相当于等量骨髓干细胞含量的30倍。在子宫内膜电切术治疗后的妇女中观察到内膜再生，也有报道患者怀孕。 临床证据表明成人干细胞在内膜中存在，通常在妊娠结束时，尤其是经常伴有慢性炎症和损伤的情况下有骨化的倾向，尽管钙化组织与胎儿源性无关［5］，而这两种情况被认为可以促进间充质干细胞重建组织［6］。子宫内膜的研究中曾经找到平滑肌组织，骨细胞和软骨细胞。月经血中还可提取出体外能诱导分化成心肌细胞的干细胞［7］。

因此很多经典的干细胞标记用来检测人类子宫内膜，检验子宫全切术后标本发现基底层腺体有表达造血干细胞标记如CD34，ckit/CD117和Bcl2，CD34在基底层间质部分特异性表达［8］。流式细胞仪检测新鲜培养的蜕膜间质细胞，发现有一部分表达Stro1和CD34。

子宫内膜的再生是由位于内膜基底层干细胞介导的假设已经存在了很长时间［9］。在人工周期的短尾猿动物模型中发现了在增生期和分泌期基底层和功能层的内膜腺体增殖指数的显著差异［10］。细胞功能学研究也支持了子宫干细胞的存在［11，12］。

干细胞分裂的总数可以由单个腺体中编码错误的积累间接反映。内源性的DNA序列在细胞分裂过程中某特定基因CpG位点甲基化时出现多态性，这些随机的复制错误随着时间的增加而积累，因此反映了内膜干细胞的分裂活性。CSX基因是人类子宫内膜的一个沉默基因，检测它的甲基化位点为确认甲基化模式的改变并不影响功能，而是由随机的与老化相关的过程引起的。至绝经期为止，人类内膜腺体的甲基化程度不断增加，绝经后维持相对稳定。数据的数学模型也说明一个腺体含有一定未知数量的长期生存的干细胞，而不是一个不死亡的不断进行非对称性分裂的干细胞。这样看来对称性和非对称性细胞分裂随机发生来维持子宫内膜腺体干细胞池中干细胞数量的恒定 ［13］。

有研究表明子宫内膜腺体呈单克隆性［14，15］。在正常内膜中存在少数PTEN空腺体。这些PTEN突变的腺体克隆在月经周期中持续存在于基底膜区，并在下一个周期中在功能层中找到各自相应的腺体。更有研究表明，子宫内膜异位症的异位病灶处也有单克隆、多中心起源的性质。

2.2 子宫内干细胞的来源

子宫内干细胞可能来源于胚胎时期干细胞的残留。来自于胚胎发育时期中肾管的干细胞仍存在于子宫内膜中，在月经周期中增殖。女性胚胎的生殖道来源于中胚层，中胚层在原肠胚形成后很快形成。随着这种胚胎组织增殖，有人认为一些细胞经历了间充质细胞到上皮细胞的转化以提供体腔上皮，并晚些形成了副中肾管或者苗勒氏管［16］。这些组成了表皮和潜在的尿生殖嵴间质。在胎儿期，在未分化的子宫表面上皮内收入潜在的间质中时腺体开始发展，间质分化成为平滑肌组织形成肌层［17］。推断一小部分的胎儿来源的上皮和间充质干细胞残留于成人的子宫内膜中并在其周期性的组织重建中发挥作用。

子宫内膜中存在CD34阳性的细胞，而CD34是骨髓来源干细胞的主要标记之一，因此推测骨髓来源的干细胞也是子宫内膜中干细胞的来源。有研究报道了骨髓来源的细胞可以迁移到在位和异位内膜组织，并且有小部分分化为间质细胞和腺上皮细胞［18］。少数接受单HLA抗原错配的异体骨髓移植的妇女中，受体内膜腺体和间质细胞中含0.2%～52%的供体来源细胞［19］，骨髓移植受者的内膜嵌合的程度与其他器官相似［20］，在局部的腺体和间质中找到了供者来源的细胞，说明细胞在局部的增殖。这项观察加之在每名患者中供者来源的上皮和间质细胞的百分比相似，可能存在一个单一的子宫内膜干细胞，形成了腺体和间质。尽管大多数腺体为供者或者受者表型，在一些腺体中发现了嵌合体，说明不都是单克隆性的，与未经骨髓移植的妇女中单克隆性相矛盾。多克隆腺体包含一部分的供体细胞，可能因为骨髓来源的细胞与子宫内膜细胞发生了细胞融合，但是在使用DNAcomplexing染色检查组织后排除了这个可能性。

这些观察都依赖于标记物的表达，但是他们提出了很多问题，需要更多的实验来解决，如是否骨髓干细胞转化成为有功能的子宫内膜细胞？骨髓包含至少3种不同的干细胞，造血干细胞、间充质干细胞和内胚层祖细胞，这些干细胞都参与循环，哪一种骨髓干细胞参与了子宫内膜的再生还需要明确。骨髓来源的细胞是否在生理条件下每个月经周期定植于子宫内膜，还是仅发生在骨髓移植后还不清楚。是否局部组织损伤合并月经就足以诱导骨髓来源的干细胞进入子宫内膜并定植还不确定。骨髓来源的干细胞是否参与了子宫内膜基底层、功能层或者两者都参与了也不清楚。解决这些问题的实验是不可能在人类进行的，要依靠使用转基因标记鼠的动物实验来完成。

2.3 子宫内膜异位症病因的干细胞学说的提出

人体内所有组织细胞都是由干细胞分化而来，而干细胞具有可塑性和横向分化潜能［21］。目前，干细胞理论已日趋成熟，干细胞分化研究取得了丰硕的成果［22］。研究表明，骨髓干细胞具有可塑性和横向分化潜能［23］。体内、体外研究都表明，多种来源的骨髓造血干细胞可以转分化为肝实质细胞、胆管上皮细胞、神经元细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肾组织上皮、角膜上皮细胞等，而骨髓间充质干细胞可转分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等，而且在组织损伤后骨髓干细胞能“定向”到达损伤部位，参与修复过程［24-27］。

干细胞具有多向分化潜能和可塑性，人体内所有的组织细胞都是由干细胞分化而来。因此推测子宫内膜细胞以及子宫内膜异位症病灶细胞也可能是由相应的干细胞分化而来。大量研究证明子宫内含有干细胞。EM病灶细胞呈单克隆、多中心起源，提示病灶是由不同的干细胞分化而来的。EM患者腹腔液中的干细胞因子（stem cell factor， SCF）水平明显高于正常妇女。最近，Gargett［28］根据以往的研究结果推测子宫内膜异位症、子宫腺肌病的发病可能与子宫内膜中的干细胞相关。

因此，我们推断子宫内膜异位症发病机理与干细胞有关：逆流的经血和雌激素治疗等因素为种植的内膜碎片中的未分化干细胞、胚胎期遗留下来干细胞、甚至种植部位组织中的多分化潜能的未分化干细胞等提供了适宜分化的局部微环境。逆流经血发生于大多数育龄妇女中，子宫内膜中已证实存在干细胞，所以大部分妇女都会发生EM，只是由于个人遗传背景、免疫状况、生活及营养等条件的不同，病变的程度不一，导致仅在10%～15%的妇女中发病且临床表现多种多样。这一子宫内膜异位症发病的干细胞理论为子宫内膜异位症的病因学研究带来了新的方向，在寻找新的诊疗方法方面前景良好，有着十分重要的意义。

参考文献

［1］ Hirata T， Osuga Y， Yoshino O， et al.Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein［J］.Hum Reprod， 2005，20(8): 2092-2096.

［2］ Zheng W， Li N， Wang J， et al.Initial endometriosis showing direct morphologic evidence of metaplasia in the pathogenesis of ovarian endometriosis［J］.Int J Gynecol Pathol，2005，24(2): 164-172.

［3］ 程明军，徐丛剑.子宫内膜异位症的发病机制理论及学说［J］.中国实用妇科与产科杂志， 2007，23(7): 561-562.

［4］ 郎景和.子宫内膜异位症研究的新里程［J］.中华妇产科杂志， 2005，40(1): 3-4.

［5］ Biervliet FP， Maguiness SD， Rohinson K， et al.A successful cycle of IVFET after treatment of endometrial ossification; case report and review［J］.J Obstet Gynaecol， 2004(24): 472-473.

［6］ Van Gorp T， Amant F， Neven P， et al.Endometriosis and the development of malignant tumours of the pelvis.A review of literature［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol， 2004(18): 349-371.

［7］ Short B， Brouard N， OcchiodoroScott T， et al.Mesenchymal stem cells［J］.Arch Med Res， 2003(34): 565-571.

［8］ Cho NH， Park YK， Kim TY， et al.Lifetime expression of stem cell markers in the uterine endometrium［J］.Fertil Steril， 2004(83): 403-407.

［9］ Garry R， Crewe J.A new look at menstruation: the role of bone marrow derived stem cells in menstrual regeneration［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2005，123(1):S4.

［10］ Brenner RM， Slayden OD， Rodgers WH， et al.Immunocytochemical assessment of mitotic activity with an antibody to phosphorylated histone H3 in the macaque and human endometrium［J］.Hum Reprod， 2003(18): 1185-1193.

［11］ Schwab KE， Chan RW， Gargett CE.Putative stem cell activity of human endometrial epithelial and stromal cells during the menstrual cycle［J］.Fertil Steril，2005(84): 1124-1130.

［12］ Snyder EY， Loring JF.A role for stem cell biology in the physiological and pathological aspects of aging［J］.J Am Geriatr Soc，2005，53(9): S287-S291.

［13］ Kim JY， Tavare S， Shibata D.Counting human somatic cell replications: methylation mirrors endometrial stem cell pisions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(49): 17739-17744.

［14］ Nabeshima H， Murakami T， Yoshinaga K， et al.Analysis of the clonality of ectopic glands in peritoneal endometriosis using laser microdissection［J］.Fertil Steril， 2003，80(5): 1144-1150.

［15］ Tanaka M， Kyo S， Kanaya T， et al.Evidence of the monoclonal composition of human endometrial epithelial glands and mosaic pattern of clonal distribution in luminal epithelium［J］.Am J Pathol， 2003，163(1): 295-301.

［16］ Kobayashi A， Behringer RR.Developmental genetics of the female reproductive tract in mammals［J］.Nat Rev Genet，2003，4(12): 969-980.

［17］ Spencer TE， Hayashi K， Hu J， et al.Comparative developmental biology of the mammalian uterus［J］.Curr Top Dev Biol， 2005，68(1): 85-122.

［18］ Du H， Taylor HS.Contribution of bone marrowderived stem cells to endometrium and endometriosis［J］.Stem Cells， 2007，25(8): 2082-2086.

［19］ Taylor HS.Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant recipients［J］.JAMA，2004，292(1): 81-85.

［20］ Korbling M， Estrov Z.Adult stem cells for tissue repairA new therapeutic concept? ［J］.N Engl J Med， 2003，349(6): 570-582.

［21］ Lakshmipathy U， Verfaillie C.Stem cell plasticity［J］.Blood Rev， 2005，19(1): 29-38.

［22］ Quesenberry PJ，Dooner G，Colvin G， et al.Stem cell biology and the plasticity polemic［J］.Exp Hematol， 2005， 33(4): 389-394.

［23］ Grove JE，Bruscia E，Krause DS.Plasticity of bone marrowderived stem cells［J］.Stem Cells， 2004，22(4): 487-500.

［24］ Orlic D.The strength of plasticity: stem cells for cardiac repair［J］.Int J Cardiol， 2004(6)， 95(1): 16-19.

［25］ Endo T.Plasticity of skeletal muscle differentiation generating stem celllike phenotype: possible application to cell therapy for muscular diseases［J］.Rinsho Shinkeigaku，2004， 44(11): 998-1000.

［26］ Tohill M，Terenghi G.Stemcell plasticity and therapy for injuries of the peripheral nervous system［J］.Biotechnol Appl Biochem， 2004，40(1): 17-24.

［27］ Lin QX，Liu SJ.Progress of research on stem cell plasticity［J］.Sheng Li Ke Xue Jin Zhan，2004， 35(3): 243-246.

细胞膜篇5

[关键词] 干细胞 视网膜细胞 分化

视网膜是人体接受外来信息的重要部位。外伤、退行性病变及肿瘤等导致的视网膜损伤常引起严重的视力障碍甚至失明。目前随着干细胞生物学的深入研究，应用不同来源的干细胞及其前体细胞参与视网膜组织修复和细胞再生成为研究的热点。

1 眼源性干细胞分化修复视网膜损伤

1.1 来源于睫状边缘生长区和睫状体的干细胞

睫状体边缘生长区（ciliary marginal growth zone，CMZ）位于视网膜的边缘。视网膜大部分由CMZ产生的视网膜神经元组成，哺乳动物视网膜生成一旦完成，就不再继续生成。此外也没有发现类似CMZ。最近，Abdouh等[ 1 ]在成年鼠眼内注入生长因子，发现睫状体上皮细胞能重新获得胚胎期特征, 并能表达神经前体标记物nestin及视网膜祖细胞的同源转录因子Pax6和Chx10。这一结果提示成年哺乳动物的睫状体可能是潜在的视网膜前体细胞来源，只是正常情况下这些具有干细胞特性的细胞处于静止状态，睫状体内微环境不允许细胞的迁移和神经发生。

1.2 Müller细胞

Müller细胞为一种特殊的神经胶质细胞，在视网膜的发育和功能活动中起重要作用。最近Peter和Patrick等[ 2, 3 ]分别应用出生后的鸡及鱼为对象，研究视网膜神经毒性物质NMDA损伤后视网膜内神经元的再生情况。结果显示：Müller细胞在视网膜受到急性损伤后可重新进入细胞循环，且增殖的Müller细胞具有向损伤区扩展的特性。说明在未损伤视网膜内同样可能发生神经再生。Müller细胞可以为视网膜再生提供来源。许多研究还发现在视网膜急性损伤后，许多Müller细胞不仅经历增殖反应，还失去其Müller细胞的形态，并开始短暂表达原仅表达于胚胎前体细胞中的转录因子， 如Pax6、Chx10、甚至Six3[ 3-5] 。这说明增殖的Müller细胞可分化表达视网膜祖细胞。

1.3 虹膜色素上皮细胞（iris pigment epithelium,IPE）

由于IPE细胞与视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）的胚胎来源相似容易得到。且体外培养的IPE细胞又具有RPE细胞的某些功能，如吞噬感光细胞的外节膜盘，维持视网膜的代谢等。 所以可以将IPE细胞移植于视网膜下代替RPE细胞。动物实验显示将自体IPE细胞移植于视网膜下1～3个月，IPE 细胞形成单层或多层排列，移植区感光细胞保持良好；6个月时IPE细胞与RPE细胞形成连接，RPE细胞顶端色素颗粒增多，感光细胞外节变长，IPE 细胞与感光细胞外节接触，视网膜增厚，荧光素造影时没有发现渗漏[6]。近年来，许多临床工作者将IPE进行自体移植治疗视网膜变性疾病都取得了良好的临床效果[ 7]

2 非眼源性干细胞与视网膜修复再生

2.1 脑源性神经干细胞

Dong等[ 8]从人胚胎大脑皮层分离获得神经干细胞，在体外用转化生长因子β3处理后再移植到鼠玻璃体腔内。结果发现这些细胞移行并与宿主视网膜整合，分化成视网膜细胞且有视蛋白阳性表达。这不仅表明人类神经干细胞能移行整合到宿主视网膜，而且更为重要的是这些细胞经过处理后能够分化成视网膜细胞，特别是类感光细胞。 Nishida等将海马来源的干细胞注入到机械刮伤视网膜的成年鼠玻璃体腔内，结果发现移植的海马干细胞整合到宿主视网膜内，免疫组化显示多数细胞能表达nestin，并表现出对微管相关蛋白2ab、MAP5及胶质纤维酸性蛋白的免疫活性，证明了移植干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。

2.2 胚胎干细胞( human embryonic stem, hES)

胚胎干细胞具有发育全能性，理论上可以分化出任何细胞类型。Haruta等将鼠胚胎干细胞在体外诱导分化为色素上皮细胞，并移植到4周龄的遗传性视网膜病变RCS鼠的视网膜下间隙。结果发现这些细胞具有正常视网膜色素上皮细胞的形态和生理特性。Meyer等将胚胎干细胞源的神经祖细胞注射到成年的遗传性视网膜退变小鼠玻璃体腔，16周后发现移植细胞与宿主视网膜整合，具有与视网膜神经元类似的形态结构和分布特征，并表达特异性蛋白。Meyer等还发现宿主视网膜神经元，特别是感光细胞的存活明显增加。最近，有学者将人胚胎干细胞进行体外培养，发现在合适的培养条件下大部分hES能够定向成为视网膜前体细胞，并主要分化为视网膜神经元(神经节细胞和无长突细胞) 。而将这种hES来源的前体细胞与视网膜变性小鼠的视网膜共培养，结果发现这些细胞整合到了变性视网膜上，并能表达感光细胞特异性标记物。

上述不同来源的干细胞虽然可以诱导分化产生特化的细胞并表达各种组织的特异性蛋白抗原，但是目前未能真正实现细胞功能。如移植的干细胞是否能够帮助修复受损的视网膜？受损的视网膜如果被修复是否伴随着视功能的恢复？这些问题目前还没有答案。尤其是胚胎干细胞的“成瘤性”问题和干细胞体内移植后如何获取免疫防御功能等一直是干细胞领域亟待正视与解决的关键问题。

2.3 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）

MSC是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。研究发现MSC 有跨胚层分化能力，体外可经诱导分化为神经元及神经胶质细胞。MSC 能在小鼠视网膜内存活并能与原视网膜结构发生融合，因而有可能成为视网膜移植治疗中具有发育潜能的高纯度视细胞供体，在治疗视网膜变性疾病及视神经病变中有广泛的应用前景。

2.3.1 MSC 体外诱导实验

许多学者运用不同的方法进行了MSC 体外诱导的实验研究，证实MSC 经诱导后可向神经元方向分化。常用的神经细胞诱导介质主要有和二甲基亚砜，神经营养因子及全反维甲酸（ATRA），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及双丁酰环化腺苷酸（dbcAMP）等。

Woodbury等在MSC如何向神经元分化方面取得巨大成果。他们首次确定骨髓间充质干细胞能在体外分化为神经元。此实验中将成年鼠的MSC在培养基中传代20代次，显示了非凡的增殖能力。将其先后用不同的诱导介质来诱导产生神经元表型。分化的细胞群致密表达神经元特异性烯醇化酶（NSE），正在分化的细胞表达神经元前体干细胞特有的nestin，且几乎80%的细胞表达NSE和神经纤维丝蛋白（neurofilament, NF-M）。他们接着又对人类骨髓间充质干细胞的分化潜能进行了研究。证明了人类的间充质干细胞也具有向神经元分化的能力。最近Chiou等将人MSCs与RPE细胞共培养成功诱导分化出视蛋白表达阳性的感光细胞，其机制与RPE细胞释放的色素上皮因子诱导分化有关。

2.3.2 MSC 体内移植实验

国内外学者做了大量工作研究自体骨髓干细胞移植治疗RP的实验。2002年Tomita等报道，用PKH-67标记了富含干细胞的骨髓细胞，注射到用钩针损伤的成年大鼠视网膜下，2周后观察到在损伤部位来源于骨髓的干细胞形成了新的视网膜细胞，外源的干细胞主要存在于损伤部位周围的外核层，并且表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP），钙结合蛋白（calbindin），视紫质和波形蛋白（vimentin），这一结果提供了骨髓来源的干细胞分化为视网膜神经细胞和修补受损视网膜的可能性。

Otani A等从小鼠骨髓中分离得到Lin谱系阴性的造血干细胞（Lin-HSC），移植入两种视网膜退形性变小鼠模型rd1和rd10眼中，使原本发生退形性变的视网膜血管网的数量和长度有了一定增长。与对照组比较，视网膜外核层及内核层的厚度增加，且有核细胞数量增加，同时可以观测到视网膜电图（ERG）记录的明显改善。他们同时进行了视网膜微点阵分析，显示多种抗凋亡基因（如热休克蛋白和转录因子）出现显著上调。

最近还有学者[18]将GFP转基因鼠骨髓源性干细胞移植入经碘酸钠定向诱导RPE受损鼠眼内，结果发现部分细胞能迁移整合到宿主受损RPE层内并拥有了RPE细胞表型，表现RPE细胞形态，表达色素颗粒，并且没有发现细胞融合。由此表明MSC可以成为视网膜组织再生的来源。

MSC 在眼科的应用研究刚刚起步。主要研究重点集中于寻找治疗视网膜色素变性可行的治疗方法上。其作为一种成体干细胞，除具有干细胞的共性外，还具有如下优势：取材方便且对机体无害；由间充质干细胞诱导来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；间充质干细胞在理论上可以向任何组织分化。

尽管近年来对MSC的研究取得了很大进展，但仍然存在以下问题尚待解决：(1)成体干细胞含量极微，每10万个骨髓有核细胞中约含有1个MSC，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞的数量逐渐减少；(2)目前尚未能建立鉴定MSC的统一标准，至今还未能筛选到MSC特异性的标记分子；(3)MSC具有多系分化潜能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在体外的分化是否会引起MSC遗传特性的改变还有待进一步证实；(4)是何种信号诱导了骨髓MSC向多系分化，其诱导分化的分子机制尚不明了。

综上所述，虽然理论上干细胞研究为眼科学者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑战性的屏障问题获得解决，人类疾病的治疗才能迈入“干细胞”时代。

参考文献

[1] Abdouh M, Bernier G. In vivo reactivation of a quiescent cell popu2 lation located in the ocular ciliary body ofmammals. Exp Eye Res, 2006, 83( 1 ) : 153 - 164.

[2] Peter H, Malgorzata O, Alexandra S, et al. Persistent and injury induced neurogenesis in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research, 2004, 23 (2) : 183－194.

[3] Patrick Y, David AC. Responses of Muller glia to retinal injury inzebrafish. Vision Research, 2005, 45 ( 8 ) : 991－1002.

[4] Fischer AJ, Schmidt M, Omar G, et al. BMP4 and CNTF are neuroprotectivce and suppress damage-induced proliferation of Mullerglia in the retina. Mol. CellNeurosci, 2004, 27 (4) : 531－542.

[5] Fischer AJ, Omar G. Transitin, a nestinrelated intermediate filament, is expressed by neural progenitors and can be induced inMuller glia in the chicken retina. J Comp Neurol, 2005, 484( 1 ): 1 - 14

[6] Crafoord S ,Geng L ,Seregard S ,et al . Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmol Scand ,2002 , 80( 4 ): 387 394

[7] Aisenbrey S, Lafaut BA, Szurman P, et al. Iris Pigment Epithelial Translocation in the Treatment of Exudative Macular Degeneration: A 3-Year Follow-up . Arch Ophthalmol, 2006, 124（ 8 ）: 183 - 188.

细胞膜篇6

[关键词] 胚胎干细胞；绿色荧光蛋白；分化；角膜上皮细胞；诱导

[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（b）-0013-03

角膜上皮位于眼角膜表面，是维持眼表正常生理功能的重要条件。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。人的角膜自我更新由位于角膜缘区域的角膜缘干细胞来维持，结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮再生的主要来源，当角膜受到化学及热烧伤，以及患有Stevens-Johnson syndrome等疾病时，角膜缘上皮细胞将会缺失，导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险[1]。因此，重建完整的角膜上皮就显得异常重要。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）是从早期胚胎内细胞团分离获得的，具有体外增殖和全能性两大特点。近年来随着ES细胞研究的不断深入，其逐渐应用于细胞、组织的修复和移植[2]。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因是一种新型的报告基因，用GFP作为标志物来标记ES细胞，可用来追踪ES细胞在体内的分化[3]。本研究利用质粒pEGFP-N1脂质体复合体转染鼠ES细胞，并在体外诱导鼠ES细胞向角膜上皮细胞分化，为治疗角膜损伤及重建角膜上皮提供细胞组织来源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼠ES细胞由北京大学深圳研究生院分子生物学实验室提供。DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、B-巯基乙醇、非必需氨基酸，购自Sigma公司；丝裂霉素C，购自Kogyo公司；脂质体Lipofectamine 2000、G418，均购自Invitrogen公司；白血病抑制因子（1eukemia inhibitory factor，LIF）、L-谷氨酰胺，购自Sigma公司；质粒pEGFP-N1，购自Clontech公司；明胶、TaqDNA 聚合酶，购自博大泰克公司；CK14、CK12、CD44引物，委托宝生物工程公司合成；免疫组化二抗试剂盒、DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 ES细胞的培养 ES细胞复苏后，经丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层培养，加入预先铺有明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养，每日更换ES细胞培养液为高糖DMEM（内含0.1 mol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、150 mL/L胎牛血清、1 000 U/mL LIF、15 g/L非必需氨基酸）。2～3 d传代1次。

1.2.2 转染及诱导ES细胞 将真核细胞表达载体pEGFP-N1转染ES细胞作为实验组，空载质粒转染ES细胞作为对照组。在转染前2 h改为无血清的DMEM培养液；含载体pEGFP-N1质粒的无血清DMEM 培养液与含脂质体Lipofectamine 2000的无血清DMEM培养液混合，加入ES细胞培养皿中，置37℃的CO2培养箱中培养，换液，培养基为不含LIF的ES细胞培养基。G418筛选GFP阳性细胞克隆，接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养层上，继续扩增培养，获得稳定的转染细胞系。ES细胞诱导前去除饲养层细胞，接种于涂抹明胶（Ⅳ型胶原）的培养皿中，加入无LIF的ES细胞培养液，隔日换液，传3～4代，诱导ES细胞分化成角膜上皮细胞。

1.2.3 形态学和免疫组织化学鉴定 显微镜下观察ES细胞形态，诱导培养7 d后，细胞基本融合，将培养分化的ES细胞用PBS洗涤3次后，冷4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封闭30 min，滴加K14、K12及CD44单抗，4℃过夜，0.02% Triton-PBS洗涤，加人生物素标记的二抗，室温下孵育40 min，PBS洗涤数次后，加入链亲和素一过氧化物酶溶液，放置于室温下10 min，0.02% Triton-PBS洗涤，最后DAB显色，显微镜下观察。

1.2.4 RT-PCR检测 Trizol R试剂盒提取ES细胞总RNA，具体过程参照Trizol Reagent说明书。引物序列分别为：CD44 正义链5'-atcaacctgcctatgcaacc-3'，反义链5'-cttggacgggaactgacact-3'（248 bp）； K12正义链5'-cgagagtggtatgaaaca-3'， 反义链5'-tgggctctcatttcattg-3'（218 bp）； K14正义链5'-ggtcgatttgatggatttgg-3'，反义链5'-gttcagtgttggcctcttcc-3'（192 bp）；内参照β-actin 正义链5'-gatgacgatatcgctgcgctg-3'， 反义链5'-gtccgaccagaggcatacagg-3'（512 bp）。每个周期参数如下：94℃ 30 s， 60℃ 35 s， 72℃ 60 s，共30个循环周期。采用小鼠角膜上皮细胞做阳性对照，每组PCR反应均设一个阴性对照。取RT-PCR产物20 μL行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察结果，凝胶成像系统拍照。

2 结果

2.1 ES细胞的形态

在饲养层上培养的ES细胞生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。GFP阳性ES细胞在荧光显微镜下可观察到细胞内有微弱的绿色荧光（图1～2）。

2.2 诱导分化的角膜上皮细胞形态

GFP阳性ES细胞经Ⅳ型胶原诱导培养1周，可见在细胞集落中爬出上皮样细胞， 贴壁生长，增殖迅速，逐渐呈集落式生长，生长胞体多为扁平，呈多角型或不规则形态生长，表现出典型的上皮细胞形态，在荧光显微镜下可观察到细胞内有很强的绿色荧光（图3～4）。

2.3 K12、K14及CD44表达情况

RT-PCR检测发现：诱导分化的ES细胞中有K12及CD44表达，而K14则无表达，证实转染后ES细胞向角膜上皮细胞方向分化（图5）；免疫组化结果显示：角膜上皮样细胞K14的表达很少，而K12及CD44的免疫细胞化学染色阳性（图6）。

3 讨论

严重的角膜损伤一直是眼科治疗的难题。一些严重的化学或热烧伤，以及Stevens-Johnson syndrome等疾病，常导致角膜上皮的大量缺失。传统的移植方法虽有一定疗效，但由于供体缺乏、移植免疫及伦理等问题，在临床上的应用发展受到很大限制[4]。重建角膜的关键是获得足够的角膜上皮材料。本研究探索采用诱导有多向分化潜能的ES细胞向角膜上皮细胞分化，为角膜上皮移植提供无限的供体来源。

ES细胞是一种具有全能性、可无限增殖和多向分化潜能的未分化细胞，具有两个重要特性：①自我更新潜能。干细胞在未分化状态下可不断增殖，从而可自我更新。②多向分化潜能。在体内外ES细胞均有分化成许多特定细胞类型的能力。它能迁移到不同部位分化成相应的细胞类型，恢复受损细胞的功能，成为一种新型细胞替代治疗和基因治疗的途径。经丝裂霉素C处理的含LIF的MEF作为饲养层，能够抑制ES细胞的分化和促进其增殖，并使其保持未分化状态以及多向分化潜能[5]。本研究将Ⅳ型胶原作为诱导剂，加入不含LIF的培养板中，诱导体外培养的ES细胞向角膜上皮细胞分化。

GFP是一种由238个氨基酸组成的蛋白，作为荧光标记分子，在研究细胞的分化、细胞移植中具有重要作用[6]。本研究用脂质体方法将含有GFP的质粒转染至小鼠ES细胞中，选择G418筛选并纯化后的GFP阳性ES细胞。将这些能够持续表达GFP的ES细胞在诱导条件下分化成角膜上皮样细胞，并稳定表达GFP，证明GFP基因已完全整合到ES细胞基因组中，这对ES细胞在体内的分化、迁移及整合具有重要意义。

本研究对诱导分化后的ES细胞进行了形态学观察，发现分化后的细胞符合具有典型上皮细胞的形态学特征。细胞呈集落式生长，排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。对于眼表上皮而言，区分角膜上皮细胞与结膜上皮细胞是非常重要的，因为它们在功能上有很大区别，影响角膜上皮组织的移植。细胞角蛋白（cytokeratin）是细胞骨架成分中间丝的重要组成部分，是一类在上皮细胞中表达丰富的蛋白质，也是某些上皮细胞重要的标志物，其中，K14主要在结膜上皮表达而不在角膜上皮表达，K12则是在角膜上皮细胞表达的角蛋白，是特异性角膜上皮细胞标志物。而CD44也存在于角膜上皮细胞中，功能与组织修复有关，它可以促进角膜上皮的愈合。本实验诱导分化的上皮细胞CD44和K12表达阳性，而表达K14阴性，说明诱导分化的细胞是角膜上皮细胞，而非结膜上皮细胞。提示ES细胞能在体外定向诱导分化为角膜上皮样细胞。本研究应用RT-PCR技术检测ES细胞及分化的角膜上皮样细胞中均有K12及CD44的表达，而结膜上皮标志物K14则无表达，证实转染GFP后的ES细胞向角膜上皮细胞方向分化。

总之，通过以上实验本研究成功建立了转染GFP基因的ES细胞系，并利用Ⅳ型胶原体外诱导ES细胞定向分化为角膜上皮样细胞，为临床治疗角膜损伤提供新的材料来源。

[参考文献]

[1] Kinoshita S，Adachi W，Sotozono C，et al. Characteristics of the human ocular surface epithelium [J]. Prog Retin Eye Res，2001，20（5）： 639-673.

[2] Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1981，78（12）：7634-7638.

[3] 唐仕波，邱观婷，黄冰，等.胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究[J].中华医学杂志，2000，80（12）：936-938.

[4] Boheler KR，Czyz J，Tweedie D，et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes [J]. Circ Res，2002，91（3）：189-201.

[5] Michelini M，Franceschini V， Sihui CS， et al. Primate embryonic stem cells create their own niche while differentiating in three- dimensional culture systems [J]. Cell Prolif，2006，39（3）：217-229.

[6] Chen BP，Fu S，Qin L，et al. Effects of basic fihroblast growth factor（bFGF）on early stages of tendon healing：a rat patellar tendon model [J]. Acta Orthop Scand，2000，71（5）：513-518.

细胞膜篇7

自20世纪50年代起学者们就对胎膜早破发生的病因进行了多方面的研究，尽管有许多因素与胎膜早破相关，但是至今有关胎膜早破确切的病理机制仍不清楚[1]。

近几年研究人员从分子生物学水平、社会心理生物学模式、神经内分泌免疫网络学说、基因调控及基因环境相互作用学说等方面进行了病因学的研究，使我们较深入地认识了该病。有研究表明，细胞凋亡可能与胎膜早破存在一定的关系，本文就这一问题综述如下。

胎 膜

人类胎膜由绒毛膜层、羊膜层及细胞外基质（ECM） 组成。ECM对细胞的黏附、迁移、增殖、分化及基因表达的调控具有重要作用。胎膜的抗张机械力依赖于ECM的胶原类型。羊膜和绒毛膜分别通过一层基膜（BM）与ECM相连。整个孕期ECM承受着持续的张力并保持动态平衡来适应宫腔容量和压力的增长。Pressman研究证实[2]，随孕周增加胎膜的弹性强度相应增加，尤其是在妊娠20周时更显著，39周时开始明显下降。羊膜中的胶原成分在妊娠32周后开始减少。pPROM的胎膜所含的胶原成分更少，抗张力也更低。最新的研究表明，胎膜破裂的最终机制是胶原合成、分泌及溶解的代谢失衡所引起的[3]。

胎膜早破

在整个妊娠过程中，覆盖子宫颈内口的胎膜组织是趋向于变薄和弱化的，目的是有利于产程的开始[4]。如果这个过程加速或程度加重，将导致胎膜组织结构改变，使胎膜组织不能承受宫腔内的压力的增加而发生胎膜破裂。研究表明，发生胎膜早破的患者与未发生者相比胎膜组织明显变薄，而绒毛膜的基底膜、滋养叶细胞、胶原纤维和纤维母细胞发育不良和老化现象多见，羊膜结缔组织中的肌成纤维细胞的体密度和数密度明显降低[5，6]。另外一些研究结果显示，凋亡细胞在胎盘及胎膜组织也可见[7，8]。

细胞凋亡

所谓的细胞凋亡（APO）是指细胞的程序性死亡，因细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下引起细胞的主动性死亡。凋亡产生过程中的遗传调控机制极其复杂，目的是维持机体的稳态，如果发生细胞凋亡调控异常就可能产生各种疾病。

近年来研究表明，在自身免疫性疾病、病毒性感染、胚胎发育，成熟器官稳定性的保持以及许多疾病，如肿瘤的发生、各种退行性疾病的发生和发展都与细胞凋亡有密切关系[9]。细胞凋亡还与机体正常生理活动的维持以及组织器官的发育有关，在正常妊娠中凋亡在维持胚胎发育中起重要作用，凋亡的过多或过少都将导致机体病理状态。

在胎膜结构重建以及胎膜细胞生长、发育、分化和再生过程中细胞凋亡调节可能存在重要作用。细胞外基质是维持胎膜结构的重要部分，对胎膜起着骨架支撑作用，胎膜细胞发生凋亡使细胞外基质产生减少后，胎膜强度和韧度减弱，导致胎膜破裂[10]。Tsatas等在人和动物中的研究显示[11]，正常足月分娩和胎膜早破产程发动中，包括胶原、层黏连蛋白和氨基葡聚糖等在内的细胞外基质总量急剧减少，这一表现在胎膜早破者中更明显，而在足月剖宫产者无明显改变。因此认为，胎膜早破中细胞凋亡的增加导致了胎膜降解的增加，从而导致了胎膜的破裂。

Bcl-2与Bax

目前细胞凋亡在分子生物学研究中被认为是细胞对内外刺激产生的一种反应[12]，基因在细胞凋亡的调控中占大部分。细胞凋亡主要调节途径有两条[13，14]：①线粒体通路，包括Bcl-2等抑制凋亡蛋白和促Bax等凋亡蛋白这两类作用相反的调控蛋白，这两种蛋白的表达水平决定了细胞凋亡与否。Bcl-2定位于内质网、线粒体膜及核膜上，通过抑制MPT开放和维持线粒体Δφm，通过阻止线粒体内AIF和细胞色素C的释放而抑制细胞凋亡[15]。②死亡受体通路，指肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族（如Fas，TNFR），存在于的细胞表面，可与携带凋亡信号的专一性配体结合诱导细胞凋亡。

Bcl-2是细胞程序性死亡的抑制基因，它抑制细胞凋亡，阻止程序化细胞死亡，延长细胞生存周期，在细胞凋亡的分子调节中起着重要的作用[16]。Bcl-2定位于18号染色体，由3个外显子组成，长度230bp，编码的蛋白质由239个氨基酸组成，分子量25kD的膜蛋白，抑制p53、C-myc诱发的细胞调亡。

Bax属于凋亡调控基因之一，由Oltrai等研究者首先发现，并对其结构和功能进行了描述，Bax与Bcl-2有40%同源性，但是二者的作用完全相反，Bax是促进细胞凋亡的调控因子[17]。Bax基因定位于19号染色体q13.3～q13.4，全长4.5kb，由6个外显子组成。其mRNA通过不同剪切可编码21kd、24kd、4.5kd 3种蛋白。

研究表明，哺乳动物Bcl-2蛋白家族成员不少于15个，有3个功能不同的亚家族[18]。有研究认为，Bcl-2基因家族成员自身或彼此间可形成二聚体/多聚体[19]。Bax可形成同源二聚体（Bax/Bax），能激活Caspase原的活化，引起细胞凋亡，也可与Bcl-2形成异源二聚体Bax-Bcl-2抑制Caspase原的活化，从而抑制细胞凋亡。Bax、Bcl-2形成了一个调控系统：①Bax形成同源二聚体时，便诱导凋亡；②当Bcl-2蛋白表达量逐渐升高，Bax二聚体会逐步分离，起到“中和”Bax-Bax诱导凋亡的作用，也就是说凋亡的调节与细胞内Bcl-2与Bax的比例有关，当细胞内的Bax增高，当Bax过多不能被结合时则会引起细胞凋亡，当细胞内Bcl-2增高，可通过结合Bax抑制细胞凋亡。Bcl-2家族蛋白的主要作用位点在线粒体膜上[20]，因此保证了线粒体在细胞凋亡过程中的“主开关”作用地位。

细胞色素C

细胞色素C在正常情况下不能通过外膜。细胞凋亡过程中，细胞色素C通过线粒体外膜释放，在ATP/dATP的参与下，在胞质中与Apaf-1（apoptotic protease activating factors）结合形成寡聚体（apoptosome）[21～23]，并激活下游的caspases。caspases是与秀丽隐杆线虫（C.elegans）同源的执行哺乳动物细胞凋亡的一组蛋白酶家族，大量研究表明，在多种死亡模型中线粒体释放细胞色素C到胞质是引发凋亡的重要步骤[24]。

Korsmeyer等证实[25]，Bax在受到凋亡刺激时构象发生变化，使Bax寡聚体形成并整合到线粒体外膜上，引起线粒体释放细胞色素C，表明促凋亡蛋白可能通过直接降低线粒体外膜稳定性而促进细胞色素C的释放[26]。

总之，导致胎膜早破的因素很多，是多因素的相互作用产生的结果。基因调控下胎膜细胞凋亡增加有可能是胎膜早破的发病机理之一，有待今后进一步研究证实。所以研究PROM确切的发病机制仍是我们指导防治的关键。

参考文献

1 戴钟英.胎膜早破的病因和发病机制[J].实用妇产科杂志，2001，21（1）：3.

2 Pressman E K，Cavanaugh J L，Woods J R.Physical properties of chorioamniont hroughout gestation[J].Am J Obstet Ggnecol，2002，187（5）：672-675.

3 Menon R，Fortunato SJ.The role of matrix degrading enzymes and apop tosis in rupture of membranes[J].J Soc Gynecol Investig，2004，11（7）：4371-4272.

4 RUNIC R，et al.Apoptosis and Fas expression in human fetal membrance[J].J Clin Endocrinol Metab，1998，83（3）：660.

5 赖仁胜，周溶，李祥周，等.胎膜早破的生物生理学机制探讨[J].中华妇产科杂志，1990，28（9）：520.

6 肖小敏，王自能.肌成纤维细胞与胎膜早破[J].中华妇产科杂志，1992，27（2）：108.

7 Kokawa K，et al.Apoptosis in human chorionic villi and decidue during normal embryonic development and spontaneous abortion in the first trimester[J].Placenta，1998，19（2）：21.

8 李小毛，沈慧敏，侯红瑛，等.关于临产前后胎盘与胎膜中细胞凋亡的研究[J].中华围产医学杂志，2003，3（2）：71.

9 方强.Caspase抑制剂研究进展[J].国外医学：生理、病理科学与临床分册，2001，21（6）：459.

10 陈丽丽，任雁林，等.胎膜早破凋亡机理的探讨[J].中国妇幼保健，2006，21（20）：2851-2854.

11 Tsatas D，Baker MS，Rice，et al.Differential expression of proteases in human gestational tissues before，during and after spontaneous onset labor at term[J].J Report Fertil，1999，116（1）：432-449.

12 安桂军.胎儿宫内发育迟缓病因与防治[J].河北医药，2003，25（4）：25.

13 Green DR.Apoptotic pathways： paper wraps stone blunts scissors[J].Cell，2000，102（1）：1241.

14 Green DR，Reed JC.Mitochondria and apoptosis[J].Science，1998，281（5381）：13092-13121.

15 曾益新.肿瘤学[M].北京：人民卫生出版社，1999：148-156.

16 银铎，刘彤.卵巢上皮性肿瘤组织中Caspase-3，Bcl-2的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系[J].中国现代医学杂志，2004，14（8）：55-58.

17 Oltrai Zn，Melliman CL，Korsmeyer SJ，et al.bcl-2 heterodimerizes in vivo with a consered homdog，bax，that accelerates programmed cell death[J].Cell，1993，74（4）：609-619.

18 Hsu S Y，Hsueh A J W.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis：an ovarian paradigm[J].Physiol Rev，2000，80（2）：593-614.

19 Basanez C，Nechushtan A，Drozhinin O，et al.Bax，but not Bcl-xl decrease the lifetime of planar phospholipid bilayer membranes at subnaomdar concent rations1，Procnatlacad Sci USA，1999，96（10）：549.

20 Fan TJ，Xia L，Han YR.Mitochondrion and apoptosis.Acta Biochim Biophys Sin[J]，2001，33（1）：7-12.

21 Zou H，Li Y，Liu X，et al.An Apaf-1.cytochrome C multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9[J]. Biol Chem，1999，274（17）：11549-11556.

22 Hu Y，Benedict MA，Ding L，et al.Role of cytochrome C and dATP/ ATP hydrolysis in Apaf-1-mediated caspase-9 activation and apoptosis[J].Embo J，1999，18（13）：3586-3595.

23 Saleh A，Srinivasula SM，Acharya S，et al.Cytochrome C and dATP-mediated oligomerization of Apaf-1 is a prerequisite for procaspase-9 activation[J]. Biol Chem，1999，274（25）：17941-17945.

24 常青，王晓良.细胞色素C、线粒体与凋亡[J].中国药理学通报，2003，19（3）：241-244.

25 Maurer M，Tsai M，Metz M，et al.A role for Bax in the regulation of apoptosis in mouse mast cells[J]. Invest Dermatol，2000，114（6）：1205-

1206.

细胞膜篇8

【摘要】

目的: 检测孕妇外周血及蜕膜中T淋巴细胞亚群和NK细胞表型， 探讨它们与母胎界面免疫耐受的关系。方法: 收集20例早孕同一患者的蜕膜组织及外周血， 密度梯度离心法分离出淋巴细胞， 流式细胞术（FCM）检测两组中NK细胞、 T细胞含量及其表面分子CD16、 NKG2A、 NKG2D表达水平。结果: 蜕膜自然杀伤（dNK）细胞占蜕膜淋巴细胞(57.15±4.0)%， 外周血自然杀伤（pNK）细胞占外周血淋巴细胞(11.46±1.58)%; dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞， 二者分别(10.3±3.9)%与(95.6±2.6)%(P

【关键词】 蜕膜 NK细胞 T细胞

在人类妊娠过程中， 胎儿是同种异基因产物， 携带父系的异源MHCI类分子， 却能抵御母体免疫细胞的攻击， 这与经典的移植免疫理论相矛盾[1]。虽然已经提出几个主要因素去解释正常妊娠的免疫生物学和妊娠相关的合并症， 但还是很局限。近年来研究发现， 子宫蜕膜组织中含有的免疫细胞包括大颗粒淋巴细胞， NK细胞， 蜕膜巨噬细胞， T淋巴细胞以及少许B淋巴细胞， 其中NK细胞含量最丰富， 占全部蜕膜免疫细胞的70%～80%[2]， 其比率随着妊娠的发展而改变。随着胚胎的植入， 蜕膜自然杀伤细胞（decidual natural killer cells， dNK）的数量明显上升， 它们聚集在胎盘部位的蜕膜处与侵入的滋养层细胞密切接触并分泌多种细胞因子调节母胎界面间的免疫平衡。dNK细胞通过影响滋养层细胞的侵袭和分化来控制胎盘的形成。基于dNK细胞的功能和在胚胎植入早期的大量增殖并广泛分布于滋养层细胞侵入的底蜕膜， 人们推测dNK细胞在维持母胎界面免疫平衡中起了重要作用。最近报道认为NK的活性是由淋巴因子调节的， 而激活的T细胞可以释放淋巴因子调节NK的细胞毒活性。本实验中通过比较母胎界面处dNK， T与外周血NK， T表型及含量的变化， 进一步揭示母胎界面免疫耐受的调节机制。

1 材料和方法

1.1 材料 在我院计划生育门诊2006-05/2007-0120例要求人工流产、 孕6～8周的正常妊娠妇女， 平均年龄（25.2±5.2）岁， 既往月经规则， 无病理妊娠史， 此次妊娠期间无阴道异常出血， B超检查提示胚胎发育正常， 有胚囊、 胚芽及心血管搏动。人淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海华精生物有限公司; 不同荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体（mAb）(CD3FITC、 CD3CY、 CD4FITC、 CD8PE、 CD56CY、 CD56PE、 CD16FITC)购自BD Pharmigen公司; 澡红蛋白标记的鼠抗人mAb(NKG2APE、 NKG2DPE)购自R&D公司; FACS检测仪为BD FACECalibur公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 经患者同意， 人工流产术之前接上无菌负压吸引瓶， 取患者蜕膜组织， 置于盛有冰预冷的1×PBS离心管中。迅速运回实验室， 在超净台内将新鲜蜕膜组织用 PBS 洗2、 3次， 除去血凝块， 小心去除蜕膜组织中绒毛组织。

1.2.2 蜕膜和外周血单个核细胞的分离 将洗净的蜕膜组织用眼科小剪刀剪切成1 mm左右的组织块， 置于120目铜网中， 4℃ PBS冲洗， 用1次性注射器橡皮头研磨， 将滤液再通过100目铜网， 离心浓缩后溶于RPMI1640培养液， 以1∶1体积比平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上， 2000 r/min离心25 min， 缓慢增速， 无制动停转， 取出中间层淋巴细胞层， PBS洗涤2次， 20 g/L台酚蓝排除法测活细胞>90%， 调细胞密度为1×109/L。

1.2.3 外周血单个核细胞的分离 外周血加入等体积的PBS 稀释， 然后以1∶1比例沿管壁缓慢加在淋巴细胞分离液液面上， 2000 r/min离心20 min， 吸取淋巴细胞层。用PBS洗涤2次， 调整细胞密度1×109/L， 20 g/L台酚蓝排除法测活细胞>90%。

1.2.4 FCM检测细胞表面分子 取单个核细胞悬液100 μL(约1×106细胞)分装至1.5 mL EP管中， 每管分别加入10 μL小鼠血清， 以阻断Fc受体(空白对照管除外)， 4℃避光放置30 min加入相应抗体各2 μL， 标记CD3、 CD56、 CD16、 NKG2A、 NKG2D、 CD4、 CD8避光放置30 min， 1×PBS洗涤2次后， 加入200 μL PBS(PBS+1 g/L叠氮钠)重悬细胞， 上机检测， 用WinMDI29软件程序分析数据。

1.2.5 统计学处理 SPSS13.0统计分析软件分析数据， 结果以x±s表示， 数据进行t检验。

2 结果

2.1 正常早孕dNK细胞与pNK细胞含量的比较 与外周血相比， 蜕膜中的dNK细胞占蜕膜淋巴细胞的(57.15±4.0)%， pNK细胞占外周血淋巴细胞(11.46±1.58)% (P

2.2 正常早孕dNK细胞与pNK细胞表型含量的比较 dNK细胞与pNK细胞表型差异明显， dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞， 二者分别为（10.3±3.9)%与(95.6±2.6)%(P

表1 外周血及蜕膜NK细胞的含量及表型变化的比较（略）

aP

2.3 正常早孕蜕膜T淋巴与外周血中T淋巴细胞亚型含量的比较 蜕膜中的CD4+T淋巴细胞的表达低于外周血中CD4+T淋巴细胞， 两者分别为（13.70±1.0）%与(15.85±2.4)%(P

表2 外周血及蜕膜T淋巴细胞含量的比较（略）

aP

3 讨论

关于妊娠免疫的研究表明， 子宫NK的表型和T细胞的平衡状态与不明原因习惯性流产、 胚胎停止发育及妊高征等妊娠期并发症有关[3]， 需要研究早期妊娠母一胎界面免疫状态， 以及这种状态和系统免疫的关系， 以便为先兆流产及自然流产的发病机制的研究奠定基础。本研究中通过同时检测早期妊娠子宫蜕膜和外周血中T细胞亚群、 NK细胞表型的含量， 了解正常早期妊娠母胎界面和母体外周血中NK， T细胞的免疫状态及其相互关系。

dNK细胞是妊娠子宫中数量最多的免疫细胞， 它分布于母体与胚胎接触的蜕膜， 直接识别胎儿抗原， 推测dNK细胞在母胎界面免疫耐受中发挥重要作用。CD16是NK细胞细胞毒效应的标志， CD16+细胞可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应启动NK细胞的杀伤功能， 早孕期其含量增加， 可能是母体对胎儿产生免疫排斥的结果， 当其反应过强时则可能导致流产， NK细胞杀伤活性增强可能是一些病理妊娠的发病机制之一[4]。本研究显示蜕膜NK主要以CD56+CD16-(约90%)为主， 而外周血中则以CD56+CD16+ (约95%)为主。同外周血NK细胞相比， 蜕膜NK细胞有不同的功能行为， 因为CD16的低表达， 蜕膜NK细胞显示出对表达MHCI类分子的滋养层细胞杀伤能力的下降， 提示蜕膜NK中低表达CD16有利于妊娠过程中滋养细胞的维持。与本课题研究组前期实验结果相比， 随着妊娠月份的增加， 蜕膜NK细胞逐渐减少， 而外周血中NK细胞的变化并不明显。最近文献报道在鼠的模型中证实蜕膜NK细胞是从外周血募集到蜕膜而不是由子宫黏膜自我更新的， 说明蜕膜中的NK细胞表型不同于外周血中， 有利于胚胎的发育， 这与本实验结果一致。胎儿免于母体NK细胞攻击， 由于dNK细胞高表达NKG2受体， 此类受体家族绝大多数胞外区都有一个C型凝集素样结构域， 因此也称为C型凝集素受体家族[5] 。NKG2A能特异性结合非经典的HLAⅠ类分子HLAE， 传递抑制信号抑制NK细胞的杀伤活性。妊娠期dNK细胞NKG2A的表达水平为(88.7±5.4)%， 明显高于pNK细胞(24.9±7.8)%， 由于滋养细胞表面高表达HLAE[6]， 推测dNK细胞表面的NKG2A与滋养细胞表达的HLAE特异性结合， 传递抑制性信号抑制dNK的活化， 阻止其对滋养层细胞杀伤。NKG2D对NK细胞有较强的活化作用， 与配体结合激活NK细胞的杀伤活性[7]， 由于滋养层组织中并未发现其相应配体MICA/MICB的表达[8]， 因此， 推测dNK细胞高表达的NKG2D不能传递活化信号， 从而不能对滋养层细胞进行杀伤。

T细胞是执行特异性细胞免疫应答的关键细胞， 可反映机体基本细胞免疫状态， 人类成熟T细胞按表型差异分CD4+T细胞和CD8+T细胞， 二者相互协调、 相互制约， 从而调控着机体的免疫状态。CD4+T细胞可分泌多种细胞因子， 促进B细胞、 T细胞和其他免疫细胞的增殖与分化， 协调免疫细胞间的相互作用， 而CD8+T细胞又称细胞毒T细胞， 可特异性杀伤靶细胞， 可抑制B细胞产生抗体免疫应答， 在机体免疫调节中起主导作用[9]。本试验结果表明妊娠期外周血中CD4+T、 CD8+T细胞比例高于蜕膜局部CD4+T、 CD8+T细胞比例， 蜕膜局部CD4+/ CD8+比值低于外周血中CD4+/ CD8+比值， 其比值的降低， 使机体防护性免疫反应增强， 这表明妊娠期母胎界面局部的细胞免疫功能处于一定的耐受状态， 有利于胎儿免受母体免疫系统的攻击。在正常情况下， CD8+细胞数增加， CD4+/CD8+比例下降， 母胎间免疫关系的平衡表现为免疫排斥的减弱和保护性反应的增强， 从细胞免疫状态方面看， 表现为CD8+细胞数功能增强， CD4+/CD8+比例下降， 这有利于母胎间免疫平衡的维持。

总之， 妊娠是一个极其复杂的生理过程， 胎儿在母体内不被排斥与很多因素有关， 从免疫学角度推测母胎界面处NK细胞和T细胞表型及含量的变化是胎儿在母体内不被排斥的重要原因之一， 但具体什么因素导致全身系统与局部系统存在此差别， 有待进一步研究。

参考文献

[1] Billingham RE， Brent L， Medawar PB. Activity acquired tolerance of foreign cells[J]. Nature， 1953， 172(4379): 603-606.

[2] MoffettKing A. Natural killer cells and pregnancy[J]. Nat Rev Immunol， 2002， 2(9): 656-663.

[3] 信朝霞， 单保恩， 李润青. 妊娠高血压综合征患者蜕膜组织微环境免疫功能变化的分析[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22（5）: 678-680.

[4] Keskin DB， Allan DS， Rybalov B， et al. TGFβ promotes conversion of CD16+ peripheral blood NK cells into CD16 NK cells with similarities to decidual NK cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104(9): 3378-3383.

[5] King A， Allan DS， Bowen M， et al. HLAE is expressed on trophoblast and interacts with CD94/NKG2 receptors on decidual NK cells[J]. Eur J Immunol， 2000， 30(6): 1623-1631.

[6] Avril T， Jarousseau AC， Watier H， et al. Trophoblast cell line resistance to NK lysis mainly involves an HLA class Iindependent mechanism[J]. Immunol， 1999， 162(10): 5902-5909.

[7] Kusumi M， Yamashita T， Fujii T， et al. Expression patterns of lectinlike natural killer receptors， inhibitory CD94/NKG2A， and activating CD94/NKG2C on decidual CD56bright natural killer cells differ from those on peripheral CD56dim natural killer cells[J]. Reprod Immunol， 2006， 70(1-2): 33-42.

[8] Groh V， Wu J， Yee C， et al. Tumourderived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and Tcell activation[J]. Nature， 2002， 419(6908): 734-738.