细胞研究范文
时间：2023-12-04 17:29:03
细胞研究篇1
此前，为了研究未经批准的干细胞系，研究人员不得不建立独立的、私人融资性质的实验室，然后还要经过一系列繁琐的会计程序，以确保联邦拨款的每一分钱都不会用在干细胞研究中。但这样的情况不会再继续下去了。取消禁令“将给这一领域和其他领域的研究人员大开方便之门。”旧金山加利福尼亚大学的干细胞研究人员阿诺德 克里格斯汀作如上表示。
乔治・Q・戴利博士在波士顿儿童医院研究儿童血液病，他说，他利用私人资金进行研究，已获得15条人类干细胞株，如今他首次可以向美国国立卫生研究院(NIH)申请拨款来研究这些干细胞。
奥巴马总统支持胚胎干细胞研究的时机正与世界干细胞研究取得重大进展的背景不谋而合，日本生物学家山中伸弥在2007年发现，成体细胞能够重新编程回到胚胎状态，其容易程度令人惊讶。这项技术“有可能最终使得胚胎干细胞用于治疗和诊断的技术变得相形见绌。”干细胞用于治疗的前景虽然还很遥远，但如果能用病人自己的身体细胞进行治疗，可避免免疫排斥问题。
美国一些国会议员和其他一些倡导与疾病作斗争人士一直看好人类胚胎干细胞研究，认为它是快速治愈一些顽固性疾病的可靠途径。
但在私下里，许多研究人员的胚胎干细胞研究目标定得还是比较实际，他们主要的兴趣在于从一些特定疾病的患者那里获得胚胎干细胞系，通过跟踪观察这些细胞在试管内的生长情况了解疾病如何发展的基本知识。
尽管美国杰龙生物医药公司利用人体胚胎干细胞医治脊髓损伤病人的试验已在今年1月获得美国食品和药物管理局(FDA)批准，许多科学家还是认为，把干细胞衍生的组织移植到患者体内还有很长的路要走。胚胎干细胞有其自身缺陷，它们易产生肿瘤，从干细胞中分离出来的成体细胞有可能会受到患者自身免疫系统的排斥。此外，无论是什么样的疾病过程造成了病人组织细胞的死亡，也同样有可能杀死外来移植的细胞。所有这些问题也许都有可能得到解决，但至今为止还没有一个得到解决。
克林顿总统曾过允许NI H给研究员提供资金研究人体胚胎干细胞的设想，但一直没实行这项政策，直到2001年8月才开始有了这方面的研究，当时的美国总统布什寻求以一种不同的方式同避国会对干细胞研究的限制，规定研究人员可以使用在此之前获得的干细胞系进行研究。
奥巴马将克林顿当年提议的政策付诸实行，但美旧国会的限制依然存在。研究人员仍然禁止使用联邦资金来获得新的人类胚胎干细胞系。不过，他们将被允许对私人投资实验室里培养出来的新的干细胞系进行研究。
干细胞研究是再生医学研究的几个最佳途径之一，利用人体自身微妙的修复机制，让衰老的人体获得新生，而干细胞将是比药物和外科手术更为有效的方法。
细胞研究篇2
重庆三峡医药高等专科学校解剖教研室 重庆市 404120
【摘 要】神经系统的细胞主要由神经元和神经胶质细胞组成。传统认为星型胶质细胞没有动作电位，在神经系统内主要对神经元起到结构和功能上的支持作用，但随着研究的深入发现，Ast 在中枢神经系统的发育及病理生理过程中都起到重要作用。本文就星型胶质细胞生物学特性、体外培养、与脑缺血的关系方面做一简要概述。
关键词 星形胶质细胞； 脑缺血
神经系统的细胞主要由神经元和神经胶质细胞组成。胶质细胞在中枢神经系统中的数量约占90% ，星形胶质细胞(astrocyte，Ast) 在胶质细胞中体积最大，与少突胶质细胞合称为大胶质细胞。传统认为星型胶质细胞没有动作电位，在神经系统内主要对神经元起到结构和功能上的支持作用，是构成血脑屏障的重要结构。但随着研究的深入发现，Ast 在中枢神经系统的发育及病理生理过程中都起到重要作用，具有摄取、灭活和供给神经递质，抗氧化、营养、修复以及抑制神经元过度兴奋和帮助学习记忆等多种功能[1]。目前，越来越到的研究者在研究神经系统疾病时，把目光投向了星形胶质细胞。
1 星形胶质细胞生物学特性
人脑中神经元的总数为1010～1012 个，神经胶质细胞数量是神经元的10 ～ 50 倍。星形胶质细胞根据细胞内胶质丝的含量以及胞突的形状分为两种：纤维性星形胶质细胞，多分布在脑脊髓的皮质，突起细长，分支较少，胞质中含大量胶质丝；原浆性星形胶质细胞，多分布在灰质，细胞突起粗短，分支多。除此之外，在小脑、视网膜、脑垂体等还有一些特殊类型的星形胶质细胞。上世纪70 年代研究表明：Ast 拥有和神经元相同的神经递质受体，如乙酰胆碱受体、多巴胺受体、肾上腺素受体、5- 羟色胺受体及一些神经肽受体。
神经系统内的信号传递大多以电脉冲的方式，而Ast 不发生动作电位，所以长期被研究者忽视。但近年来，研究者发现胶质细胞之间有一些信号的传导，并且对神经元的功能产生影响。上世纪90 年代，研究者发现了钙波，这种新的细胞信息交流的方式指的是在胶质细胞之间，以及在神经元和胶质细胞之间，细胞内钙离子浓度升高会从一个细胞传播到另一个细胞。段树明[2] 认为，星型胶质细胞的钙波传播和突触功能的反馈调节都需要其释放ATP才得以完成。在受到刺激，星形胶质细胞会以胞吐的形式释放含有大量ATP 溶酶体，如果选择性地裂解星型胶质细胞溶酶体，发现ATP 释放和钙波传播都消失了。
2 星形胶质细胞的体外培养
星形胶质细胞在神经系统内含量较大，使体外培养高浓度的Ast 细胞培养物显得不是很难，也为研究Ast 生物学作用提供了方便。体外分离纯化CNS 的不同细胞，一般基于各种细胞之间的细胞粘附特性、营养需求、发育时程及生长方式等差异。从CNS 的灰质细胞纯化Ast 主要依据以下几方面特征：（1）Ast 的增殖速度远大于少突胶质细胞和其它神经细胞。（2）Ast与其它神经细胞分层生长，Ast 在底层，其它细胞生长在上层。（3）分层生长的细胞经一定力度摇动处理，可使在上层生长的细胞脱壁。目前，大多数研究者都是采用经典的方法进行培养[3]。将出生1-2 天的大鼠大脑的灰质组织制成混合细胞悬液，在培养瓶皿内连续培养，直至传代。使Ast充分增殖，神经元尽量死亡，从而使Ast与少突胶质细胞和其它细胞的比例增大，进行传代纯化，笔者在研究生时采用这种方法获得了纯度较高的细胞培养物。但是，这种方法比较耗时、麻烦。所以，有研究者采用了较为简便的方法也培养出了较纯的细胞培养物。
黄柏胜[4] 等使用改进的培养方法取得了比较好的效果，有以下特点：（1）原代培养时无须胰酶消化，减少胰酶对细胞的损伤；（2）筛网过滤，将细胞团分散成单个细胞；（3）传代培养时无需摇床震荡，缩短实验时间。笔者认为，经典的培养方法虽然耗时、麻烦，但是，培养的细胞比较稳定。
3 星形胶质细胞与脑缺血
脑缺血等脑损伤是临床的常见病，严重地威胁着人类的生命与健康。该类疾病发生后，最显著的病理改变是病灶区由于缺血缺氧引起大量的神经细胞死亡和凋亡，而神经细胞缺失是导致病人死亡和残疾的重要原因。
胶质细胞与神经元之间的细胞液构成神经元生存的直接微环境，其成分的改变对神经元产生直接而显著的影响。在脑缺血再灌注损伤时，Ast 形态和功能也会发生明显的改变 。应用外源性的神经营养因子或其他细胞因子可明显减轻神经元的损伤。经大脑皮质注入的胶质源性神经营养因子（GDNF）可保护大脑免于自由基、钙超载等缺血损伤，并且完全阻止缺血后NO 产生和再灌注损伤。神经营养因子具有促进神经功能恢复、改善神经电活动、诱导轴突再生等作用。
Ast 是体内产生神经营养因子的主要细胞。目前，神经胶质细胞条件培养液中发现了包括GDNF、脑源性神经营养因子、神经生长因子等多种神经营养因子 。所以，研究者认为Ast 对神经元可以起到一定的保护作用。研究表明，在脑缺血/ 再灌注损伤后，Ast 功能异常活跃，缺血周边区GDNF 表达显著增加，GDNF 可以阻止部分神经元凋亡 。
参考文献
[1]Chen Y，Swanson RA.Astrocytes andbrain injury[J].J Cereb Blood FlowMetab，2003，23（2）：137-149．
[2] 段树民. 胶质细胞的细胞间通讯[J].生命科学，2008，20（5）：680-683.
[3] 谢裕华等. 新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养[J]. 广州中医药大学学报，2009，26（3）：277-280.
细胞研究篇3
红细胞直接作为载体，用于运载小分子药物和蛋白质、核酸等大分子药物的研究已广泛展开。此外，制备保持完整功能的红细胞膜包封纳米粒作为药物载体的研究也取得了一定进展。本文综述了红细胞作为运载工具输送药物的研究情况，另外，着重介绍两种新型的红细胞膜载药系统---红细胞膜包裹纳米粒( RBC-NP) 和红细胞膜纳米海绵的最新研究进展。
1 红细胞作为药物载体的发展历程
早在 1953 年，已有科学家尝试用红细胞运载化学物质。随后有人成功将相对分子质量 10 ~250 kD 的右旋糖酐类载入红细胞。而直到 1973年，科学家们才开始采用红细胞做为药物载体，并于 1979 年首次以红细胞载体( carrier erythrocytes)来描述运载药物的红细胞[4].最先应用红细胞转运的是各种酶类，如乙醛脱氢酶[5]、谷氨酸脱氢酶[6]等。经过 30 多年发展，红细胞已应用于输送不同性质的药物，用于治疗肿瘤、心脑血管疾病、各类炎症等。
2 红细胞作为药物载体的特点
红细胞作为药物载体主要有以下优势： 降解不会产生有毒或有害物质，红细胞的粒径及形状相同，提供相对稳定的内环境，各种化学物质和酶都可包裹在红细胞膜内，防止内源物质降解运载的药物，可调整药物的药代动力学和药效学，保持血浆内药物浓度的稳定，延长药物的全身作用时间，减少药物的不良反应等[7].
2. 1 延长药物在体内的半衰期
正常红细胞的寿命为 120 d 左右，其体内循环时间远高于普通药物载体。将药物用红细胞负载后可显着延长其体内半衰期，提高药物疗效。将抗肿瘤药物长春新碱( MTX) 、甲氨蝶呤( VCR) 采用红细胞单一负载或复合负载后，可显着提高药物抗肿瘤活性，延长药物作用时间。其中 MTX + VCR 的双载红细胞对 K562 细胞 48 h的抑制率为( 68. 63 ± 2. 76) % ,显着高于 MTX 或VCR 单载红细胞( P < 0. 05)[8-10].连燕舒[11]以红细胞运载吗啡( M-RBC) 用于手术后镇痛，实验组术后无痛时间为( 15. 7 ± 5. 6) h,远高于对照组( 3. 2 ±2. 3) h,明显延长了吗啡的镇痛时效，且 M-RBC 半衰期为( 6. 48 ± 1. 56) h,与文献报道吗啡体内半衰期 2. 5 ~3 h 相比显着增加。核磁共振检查一般采用超顺磁氧化铁颗粒( SPIO) 和超小型超顺磁氧化铁颗粒 ( USPIO) 作为对比剂。Antonelli等[12]用红细胞运载 SPIO 作对比剂，注射后 24 h血液内铁离子浓度仍接近检测限，该对比剂血液中寿命可被延长至 12 d.
2. 2 良好的生物相容性和可降解性，减少不良反应。
天然红细胞为机体固有成分，可通过代谢完全降解为无毒产物，作为运载体在体内不会引起其他不良反应。聚氧乙烯蓖麻油( Cremophor) 常添加于紫杉醇注射液中作增溶剂，但易引起感染、过敏等不良反应。Harisa 等[13]尝试以红细胞作为药物载体运载紫衫醇，替代 Cremophor 的使用。载药的红细胞各种生理特性并无显着差异，可作为紫衫醇的药物靶向输送载体。
2. 3 增加药物在体内的稳定性，降低免疫原性。
红细胞可形成一个隔离空间以保护运载的物质，使药物不受内源性因素的影响而过早失活和降解，提高药物在体内的稳定性。此外，亦可减少外源性大分子( 如基因物质、蛋白等) 引起的免疫反应，是运载大分子药物的理想工具[14].
2. 4 增加药物的靶向性
红细胞因衰老或其他原因造成膜表面性质变化，经过脾和肝时可被网状内皮系统( RES) 的巨噬细胞识别、吞噬，因此红细胞可作为天然的 RES 靶向给药载体。已有研究将干扰素 α-2b 用红细胞担载后用于 RES 靶向给药[15].为增加红细胞被识别能力，Chiarantini 等[16]将反义肽核酸载入红细胞后，诱导红细胞表面的带三蛋白凝集并固定化，使之成为自体免疫球蛋白 G( IgG) 的识别、结合位点，从而被巨噬细胞内吞，最终抑制了巨噬细胞内一氧化氮合酶( iNOS) 和环氧化酶 2( COX-2) 的表达。
除 RES 靶向外，红细胞载体还可实现其他部位靶向。化疗药物在正常组织器官的分布积累是导致其不良反应的重要原因，磁化红细胞载体是解决这一问题的新手段。有报道将氧化铁纳米粒通过生物素-亲和素方法偶联到红细胞表面，或将四氧化三铁纳米粒载入红细胞内，制成红细胞磁化载体来运载多柔比星[17-18].磁化红细胞本身生理特性并无明显改变，但在外磁场的控制下可将药物准确输送到肿瘤部位。Cinti 等[19]将超顺磁纳米粒载入红细胞内，并以病毒血凝素糖蛋白对红细胞膜表面进行修饰，构建一种新型红细胞磁化载体。该磁化载体到达靶部位后能高效地与肿瘤细胞融合并释放药物，用其运载地西他滨，给药剂量仅为常规化疗剂量的 10%.
2. 5 延长药物释放时间，保持血药浓度稳定
红细胞膜是具有生物活性的半透膜，药物被载入红细胞后可实现缓慢持续释放，与传统给药方式相比，能明显减少血药浓度的波动。Alanazi 等[20]用红细胞负载伯氨喹用于疟疾的治疗，载药后的红细胞可实现 48 h 的药物持续释放，但膜上谷胱甘肽( GSH) 的含量显着降低，使载药后的红细胞更易被氧化。Bossa 等[21]将地塞米松的前药地塞米松-21-磷酸盐( DEX 21-P) 载入红细胞内，DEX 21-P先在酶的作用下去磷酸化生成地塞米松，再通过自由扩散作用释放到红细胞外，如此给药一次便可维持 3 ~4 周的治疗浓度。
2. 6 负载各类物质进行递送
红细胞载体适用范围广，无论是大分子药物还是小分子药物，大多可被红细胞运载，在适当的载药条件下可较大程度地保持红细胞的活性和功能。Harisa 等[22]用红细胞负载降血脂药物普伐他汀，探究不同包封条件对红细胞载药率及其生理特性的影响，结果显示在 0. 6% NaCl、普伐他汀质量浓度为 10 mg/mL 下孵育60 min 可得到最大载药率，且红细胞的生理特性基本无变化。Favretto 等[23]则研究了用 3 种方法将不同相对分子质量的酶载入红细胞的情况，结果显示，氯丙嗪浸泡法和脂质体融合法，相较于低渗透析法，可提高载药率减少不良反应。Shi 等[24]利用二硬脂酸磷脂酰乙酰胺将 IgG 连接于红细胞膜上，这种方法可显着提高整个红细胞载体的稳定性，且有利于药物的靶向运输。
3 红细胞载体的制备
3. 1 红细胞载体的来源
红细胞及红细胞膜的来源与提取相对简单，一般通过离心方法得到血液中的红细胞，采用低渗溶血的方式取得红细胞膜，也有化学合成仿生的红细胞膜[25].
3. 2 红细胞载体的载药方式
3. 2. 1 将药物连接在红细胞膜上 若药物( 酶或其他药物) 必须同红细胞膜外不能穿膜的底物直接作用才能产生治疗效果，则常用不同的连接方法将药物连接于红细胞膜上。其中亲和素-生物素方法是膜与药物( 特别是生物药物) 结合的最常用技术[30].哺乳动物红细胞膜生物素酰化可通过生物素 N-溴代琥珀酰亚胺酯( NHS-biotin) 引入氨基，也可生物氧化红细胞膜的醛基。Magnani 等[31]比较了这些方法，发现通过 NHS-biotin 生物素酰化的细胞活性最好，每 1 个红细胞膜连接约 1 000 个生物素，在体内 24 h 的活性不受影响。
3. 2. 2 将药物包载入红细胞内 目前，人们运用一系列技术将治疗成分包裹入红细胞内，常用的有低渗法、化学法、电穿孔、胞吞法和脂质融合法等[26-28].对于可自由扩散的小分子药物，常将其前药或其药物结合蛋白包载入红细胞内，通过前药的代谢或结合蛋白对小分子药物的亲和力实现药物的缓慢释放。大分子蛋白例如一些酶类( 其作用底物可穿过红细胞膜进入胞内的) 可直接包载入红细胞内，如此既可保持药物本身的稳定性，亦可实现缓慢催化作用[29].
4 基于红细胞载药系统的最新进展
红细胞载药的优势主要依靠红细胞膜的结构及功能实现，且红细胞膜提取分离较简单，因此许多研究者提取单纯红细胞膜来考察其药物输送作用。例如 Gupta 等[32]提取纯净红细胞膜经挤压制成直径为 100 ~200 nm 的纳米红细胞小体，运载法舒地尔治疗肺动脉高血压。红细胞膜包裹纳米粒( RBC-NP) 以及红细胞膜纳米海绵这两种新型红细胞膜载体的研究进展介绍如下。
4. 1 红细胞膜包裹纳米粒( RBC-NP)
RBC-NP 药物载体是将纳米粒内核和红细胞膜结合，既能弥补纳米粒体内清除速度快及红细胞载体释药缺乏可控性的缺点，又能发挥这两类药物载体的各自优势，是一种十分具有发展前景的新型药物载体。
4. 1. 1 RBC-NP 的制备、载药和释药方式 制备RBC-NP 一般采用低渗透析挤压法。制备基本原理如图 1 所示，在低渗环境下红细胞膜孔打开将内容物释出，得到的红细胞膜经纳米膜挤压形成纳米红细胞小体，再将纳米红细胞小体和纳米粒经反复挤压形成 RBC-NP( 直径约80 nm) .通过透射电镜( TEM) 观察以及蛋白酶消化等试验证明，合成的RBC-NP 能够稳定存在，且膜包裹的方向为红细胞膜的外侧朝外，膜内侧邻纳米粒内核。Luk 等[33]探究了纳米粒内核的表面电性、曲率半径等因素对红细胞膜包裹纳米粒的影响。结果显示，红细胞膜可包封粒径为 65 ~ 340 nm 纳米粒，负电性内核与负电性红细胞膜间的静电作用是能包裹并保持稳定的主要原因。
RBC-NP 主要是通过纳米粒内核载药，目前常使用 PLGA,载药方式分为物理包封和化学键接。有研究通过这两种方式将多柔比星载入 RBC-NP,得到的 RBC-NP 在 PBS 缓冲液中具有近似的高稳定性，且药效均高于单纯多柔比星给药，但化学键接载药的 RBC-NP 药物释放更加持久[34].
RBC-NP 的释药方式主要有被细胞吞噬后膜破裂释药和通过细胞膜扩散或特殊的转运体系释药[35].Gao 等[36]研 究 发 现，将 脂 质 体 中 装 载NH4HCO3,温度上升至 42 ℃时产生二氧化碳气泡破坏脂质体膜，可释放出药物。如此实现温度敏感性释药，且无有害化学成分残留。除了内部作用，也可通过外界触发释药。Delcea 等[37]发现，金纳米粒附于红细胞膜上，用激光照射后金纳米粒聚集处的膜性质改变，可形成孔道释放膜内的药物，这些成果为日后进一步发展 RBC-NP 释药技术提供了新思路。
4. 1. 2 RBC-NP 作为药物载体的特点及应用RBC-NP 与普通药物载体相比，可显着延长药物的体内循环时间。Hu 等[38]将 RBC-NP( PLGA 为内核) 、PEG 修饰的 PLGA 纳米粒( PEG-PLGA NP) 以及 PLGA 纳米粒( PLGA NP) 3 种药物载体进行荧光染色后，尾静脉注射入小鼠体内，按一定时间眼眶取血进行检测。结果显示，在 24 和 48 h 后，RBC-NP 在血液中的残留量分别为 29% 和 16% ,显着高于 PEG-PLGA NP 组( 11% 和 2%) 和 PLGANP 组( 2 min 后基本不存在) .
RBC-NP 可稳定持续释放药物，增加给药靶向性。Aryal 等[34]将多柔比星载入 RBC-NP 进行体外药物释放研究，发现 72 h 内药物释放率仅为20% ,约为对照组 ( PEG 修饰的 PLGA 纳米粒) 释放速率的二分之一。为使 RBC-NP 具有更好的功能性和靶向性，Fang 等[39]将两种配体即叶酸( 相对分子质量约 441) 和核仁素配体 AS1411( Mr约9 000) 以磷脂分子为连接剂对红细胞膜进行修饰。
结果显示叶酸修饰的 RBC-NP 在 KB 细胞中摄取量提高了 8 倍，AS1411 修饰的 RBC-NP 在 MCF-7细胞中摄取量提高了 2 倍。此外，采用这种脂质植入的修饰方式避免了普通化学修饰造成的膜蛋白变性、功能损害等问题。受到 RBC-NP 启发，Fang等[40]采用肿瘤细胞膜包裹纳米粒制成新型肿瘤靶向载体( CC-NP) ,通过细胞-细胞之间的相互作用，CC-NP 在肿瘤细胞的摄取量可达 PLGA 纳米粒的20 倍。
本课题组目前基于 RBC-NP 展开小干扰 RNA( siRNA) 的主动靶向输送研究。siRNA 类药物存在快速降解的风险[41],在前期筛选获得高效、低毒氨酯类聚乙烯亚胺衍生物( PEI-Et) 材料的工作基础上，将 PEI-Et 复合 siRNA,得到稳定的载体核心纳米粒( PEP)[42-43]; 将半乳糖修饰的红细胞膜包裹 PEP 作为新型输送系统( Gal-RBC-PEP NPs) ,实现 siRNA 的稳定包封。本课题组将考察该系统输送 siRNA 的长效、靶向、安全性，以此探索构建具有长效、主动靶向功能的新型红细胞膜类 siRNA输送载体。
4. 2 红细胞膜纳米海绵
RBC-NP 的红细胞膜可捕获体内毒素并使其被清除掉，从而对抗细菌感染，这种本身可吸收细菌毒素的特性 RBC-NP 被称作红细胞膜纳米海绵。
4. 2. 1 作为解毒剂 Hu 等[44]通过研究发现，PL-GA 为内核的纳米海绵，可特定吸收成孔毒素类( PFTs) ,显着降低其毒性。在注射纳米海绵的情况下再给予小鼠致死剂量的 α-毒素，小鼠存活率可达 80% ( 存活时间超过 360 h) .通过与 PEG-PLGA NP、PEG-Lipid NP、纳米红细胞小体的试验对比，证实 PLGA 纳米粒内核与红细胞膜对于吸收PFTs 缺一不可。PFTs 普遍具有细胞膜穿孔能力，纳米海绵的红细胞膜结构可作为该毒素作用底物吸引 PFTs 嵌入膜内，但在纳米粒的稳定作用下不发生溶血，且能在体内长时间循环继续吸收毒素，如此纳米海绵可将绝大部分毒素带离其靶细胞。当被巨噬细胞吞噬后，纳米海绵也可增强溶酶体对毒素蛋白的消化作用，最终可通过肝脏安全代谢。
研究者紧接着进行了链球菌及蜂毒肽等其他 PFTs解毒试验，结果均可显着减轻毒素对动物的伤害，说明红细胞膜纳米海绵的抗菌解毒作用具有普适性，可应用于各种 PFTs 的解毒治疗，克服了普通解毒治疗中不同的病毒必须采用不同解毒药物的缺点。
4. 2. 2 治疗免疫系统疾病 纳米海绵在治疗Ⅱ型超敏反应类疾病方面也有了新的研究进展。抗体诱导型贫血症的致病机制是患者体内产生了可与自体红细胞膜表面抗原结合的病理性抗体，正常的红细胞与之结合后被吞噬细胞吞噬而导致贫血。
4. 2. 3 作为抗毒疫苗 除了用纳米海绵直接进行解毒治疗外，也可将抗原蛋白嵌入纳米海绵的红细胞膜中制成抗毒素疫苗。Hu 等[45]将 PFTs 嵌入纳米海绵的膜上，PFTs 在纳米海绵的限制下不会对细胞产生毒性，且仍能保持原有结构形态，通过皮下注射后随淋巴循环可被有效运输到免疫系统。
被浆细胞吞噬后，能产生大量与毒素特异性结合的IgG.与通过加热或化学手段灭活的疫苗相比，这种疫苗产生的抗体数量更多，亲和力更强，且不会引发其他针对输药载体的免疫并发症。在体内循环过程中，对正常细胞亦没有危害。
Copp 等[46]的最新研究发现，纳米海绵膜上的相应抗原能够保持裸露并与该病理性抗体特异性结合，可作为诱饵大量中和病理性抗体，然后经吞噬细胞作用将其清除，最终使病理性抗体不能与正常红细胞结合，从而大大缓解自身免疫性溶血反应或药物诱导的贫血症。纳米海绵可吸收各型病理性抗体，这为解决免疫疾病治疗中药物不能普遍适用的问题[47]提供了思路。
5 展 望
红细胞载药体系具有极高的生物相容性和可降解性，在延长体内循环时间、提高靶向性和稳定性、提高药物效果等方面也具有其他传统药物载体不可比拟的优势 [48-49].相比于单纯的红细胞载药，复合型红细胞膜载药体系可实现更多的功能( 靶向性等)[39].目前，已有红细胞载体进入临床试验阶段[29].其中，地塞米松红细胞载体治疗溃疡性结肠炎已完成临床Ⅱ期试验; L-天门冬酰胺酶红细胞载体治疗急性淋巴细胞白血病复发正在进行临床Ⅲ期试验。
但对于大规模生产和使用，红细胞药物载体的来源和储存仍是阻碍其应用的主要问题。与其他药物载体相比，红细胞源于生物体，不同来源的载体本身就具有较大的差异性，且制备过程缺少统一控制标准。在红细胞的提取和载药过程中如何减少污染、降低对膜功能的损害，如何储存红细胞载体并保持其生物活性等，都是亟待解决的问题。对于新型 RBC-NP 的研究才刚起步，接下来应进一步探明红细胞膜与不同纳米粒内核的作用机制和原理，研究如何将较大粒径的纳米粒包裹入红细胞膜内且尽量减少对红细胞膜的损害。红细胞膜纳米海绵在抗菌解毒治疗上将有着极为广阔的发展前景，在其他临床应用方面也存在一定潜力，值得深入研究。最后，基于红细胞的载药体系还需通过各种科学优化，进一步提高药物的包封率、靶向性和控释性。随着相关研究不断深入，相信在不远的将来就会掀起一场临床药物载体的新变革。
参 考 文 献
[1] Alabi CA,Love KT,Sahay G,et al. Multiparametric approach forthe evaluation of lipid nanoparticles for siRNA delivery[J]. ProcNatl Acad Sci U S A,2013,110( 32) : 12881 - 12886.
[2] Bhateria M,Rachumallu R,Singh R,et al. Erythrocytes-basedsynthetic delivery systems: transition from conventional to novelengineering strategies[J]. Expert Opin Drug Deliv,2014,11( 8) :1219 - 1236.
[3] Yoo JW,Irvine DJ,Discher DE,et al. Bio-inspired,bioengineeredand biomimetic drug delivery carriers[J]. Nat Rev Drug Discov,2011,710( 7) : 521 - 535.
细胞研究篇4
1900年，Regand首次认识到发生过程中存在着生殖细胞的退化。对大鼠等啮齿目动物的研究表明，生精过程中实际产生的数量比理论预测减少25%～75%［1］。20世纪70年代，Kerr等提出细胞凋亡（apoptosis）的概念，包括程序化细胞死亡（programmedcelldeath,PCD）和非程序化细胞死亡（nonprogrammedcelldeath,NPCD），提示细胞凋亡在男性生殖中具有重要影响［2］。现已证实，生殖细胞退化是通过细胞凋亡实现的。在发生各个阶段，都存在自发性的生精细胞凋亡。但不同时期凋亡细胞数目有很大差异，原位检测表明，在发生过程中主要是精原细胞和精母细胞发生凋亡，而细胞凋亡很少发生。精原细胞特别是A精原细胞凋亡是导致数少的主要原因，其凋亡均发生在有丝分裂期间。精母细胞凋亡发生在减数分裂过程中的细线前期、偶线期，特别是粗线期。就是通过精原细胞不断增殖，同时过量的受到损伤的生精细胞不断凋亡，来控制细胞数目，维持发生的动态平衡。本文就生殖细胞凋亡的生理意义、机制和影响因素作一综述。
1生精细胞凋亡及其生理意义
生精过程是指精原细胞经过多次有丝分裂，最后发育成，其中存在精细复杂的调节机制。生精细胞凋亡主要发生在三个阶段：首先是在A型精原细胞的有丝分裂；其次是精母细胞的减数分裂；最后是发生的过程［3］。生精细胞的凋亡还与生精上皮处于生精周期阶段有关，不同发育阶段的生精细胞对相同刺激因素反应性不同，由此推测生精细胞凋亡有多种调节机制。现研究较多的是在激素和局部加热诱导下，生精细胞凋亡的调控机制，着也是目前较有希望的男性节育调节手段［4］。生精细胞凋亡具有重要生理意义，参与维持发生过程的动态平衡，维持支持细胞与生精细胞的最佳比例，清除基因异常生殖细胞，调节生精过程中数量和质量，是机体保持生殖遗传稳定的重要防御机制。在病理状态下，细胞凋亡则导致少精或无症发生［5，6］。
2生精细胞凋亡机制
2.1Bcl-2蛋白家族它包括促凋亡的蛋白（Bax、BAD、Bak、Bik、Bok、Diov、Hrk、BID和抑制凋亡的蛋白（Bcl-2、Bcl-xlr、Mcl-1、Bcl-w、Bfl-1/A1）。他们分别控制着细胞死亡通路的各个阶段。Furuchi和Rodriguez发现［7，8］，过分表达Bcl-2的转基因大鼠，会出现精原细胞增生，并且生精细胞凋亡的机会也减少。Bax缺失的大鼠会导致减数分裂前期生精细胞不正常积累，从而造成生精过程紊乱，以致没有生育能力。另外一些Bcl-w缺失的大鼠也没有生育能力［9］。这些资料都证实了Bcl-2蛋白家族的选择性表达对生精过程异常重要。
2.2肿瘤抑制蛋白P53P53蛋白和Bcl-2蛋白家族一样调控着细胞内的死亡信号途径。许多研究报告证明P53在生精细胞的凋亡中起着关键的作用，包括自发性的和损伤诱使的生精细胞的凋亡［10］。缺P53基因的大鼠虽然生长发育正常，也有生育能力，但是在射线作用或实验睾后表现出生精细胞凋亡的滞后，并且凋亡数目也减少［11，12］。尽管大多数的资料表明P53仅调节有丝分裂的生精细胞的活性来控制细胞凋亡，近来也有资料表明它也在生精细胞的减数分裂和减数分裂后期起着关键的作用，从而影响细胞凋亡。
2.3caspase-3蛋白酶caspase-3是一种活化胞浆的蛋白酶，它是一种死亡蛋白酶，凋亡细胞通过它的数目的增多从而启动凋亡的级联反应。Kumi-Diaka用5，7，45-三羟异黄铜（genistein）作用于TM4细胞株后［13］，同时发现了细胞的凋亡和坏死并且caspase-3的酶活性提高，因此表明在用genistein引起的内生精细胞和支持细胞的凋亡可能包括启动caspase-3蛋白激酶这一信号通路的作用。
2.4Fas/CD95系统Fas信号系统由相互作用的蛋白Fas（CD95/APO-1）和FasL（CD95L/APO-1L）组成。Fas是属于TNF受体家族的一种I型跨膜蛋白，它广泛存在于各种组织中。FasL是II型的膜蛋白，它以跨膜和可溶性的分泌形式（sFasL）存在［14，15］。sFasL可以在远距离范围内调控表达Fas蛋白的细胞凋亡。免疫组化的结果证明，支持细胞在它们的质膜上表达FasL，而生精细胞则选择表达Fas［16］。现在已有多种证据证明Fas信号系统启动生精细胞的凋亡：（1）在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸（阻断了FasL的翻译），明显看到生精细胞凋亡数目的减少；（2）Fas和FasL的mRNA的表达量随着动物年龄的不同而不同，在大鼠中是16～33天最多，而此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰；（3）加入模拟FasL功能的Fas的激动剂（一种抗Fas的抗体，Jo-2），生精细胞的数目大大减少。此外，在一些有害化合物引起的损伤中，Fas系统也与生精细胞的凋亡密切相关。Boekelheide［17］用MEHP诱使损伤的实验表明，随着生精细胞凋亡数目的增多，Fas和FasL的表达量也提高，并相应达到峰值。而且，Fas的活性部分RIP和FAP-1的表达也增多。因此，Fas/FasL是一个重要的旁分泌系统，它不仅影响生精细胞生理条件的凋亡，控制着生精过程的稳态，而且也在有毒物质诱使的损伤中极大地影响了生精细胞数目。
3生精细胞凋亡与激素
3.1睾酮（testosterone,T）又称生精激素，由间质细胞合成、分泌。大量研究表明，睾酮水平的降低是生精凋亡的重要原因。利用间质细胞毒性物质——乙基二甲基磺酸盐（EDS）处理大鼠，2天后中检测不到3β-羟类固醇脱氢酶，8天后凋亡指数增加，长时间EDS处理，粗线期精母细胞和细胞的凋亡明显增加［18］。睾酮是通过与支持细胞合成的雄激素受体（AR）特异结合发挥其生物学效应的。睾酮在精原细胞、精母细胞的发育及细胞的变态过程起作用，较高水平的睾酮对精原细胞的发育是必须的。睾酮有选择地在生精周期VII-VIII阶段起调节作用。抑制睾酮分泌、VII-VIII期的生精细胞首先发生凋亡［19］。另有研究结果显示，切除大鼠垂体后，体积明显缩小，发生停滞在初级精母细胞阶段，给予大剂量的外源睾酮可重新诱导发生。给予成年大鼠甲氧乙酸选择性破坏间质细胞，睾酮血清水平降低，生精细胞凋亡明显增加［20］。
3.2促卵泡激素正常发生过程需要促卵泡激素（folliclestimulatinghormone,FSH）存在。大量研究表明，FSH是灵长类发生启动的主要调节者之一，促卵泡激素被拮抗或其水平降低，都能使生殖细胞发生凋亡。FSH通过支持细胞上其唯一的受体FSHR发挥其作用。陈雪雁等［21］提取RNA进行斑点杂交发现FSHRmRNA的杂交信号全部位于支持细胞，于XIII-I期最强，VII-VIII期最弱，在II-VII期处于中等水平。可推测FSH主要作用于XII-I期，调节精原细胞的分裂和精母细胞的减数分裂过程，决定进入形成期的圆形细胞的数量。缺乏FSH导致粗线期精母细胞凋亡。Tesarik等［22］体外培养生殖细胞和支持细胞发现FSH和睾酮有作用的交叉点，睾酮可增强FSH对生殖细胞凋亡的调控作用，二者协同作用，共同维持正常的发生过程。
3.3促性腺激素释放激素丘脑下部分泌的促性腺激素释放激素（gonaditrophin-releasinghormone,GnRH）使垂体释放FSH和LH，FSH、LH分别刺激支持细胞和间质细胞做出应答，为发生创造微环境。用GnRH拮抗剂处理大鼠，生精周期特异阶段生殖细胞凋亡明显增加。Sinha-Hikin等［23］发现，给成年大鼠-GnRH拮抗剂后5天（VII-VIII阶段）和7天（VII-VIII和IX-XI阶段）生精细胞凋亡DN段明显增加，14天（I、II-IV、V-VI和VII-XIV阶段）达最高值。
3.4催乳素关于催乳素（prolactin，PRL）对生精细胞凋亡的研究相对较少，Yazawa等［24］对日本红腹蝾螈的研究发现，PRL水平提高只会导致生精周期中倒数第2期凋亡发生，推测可能是时间和细胞类型的特殊性引起的，也可能是PRL受体（PRLR）只在倒数第2期表达，或者PRLR全程都表达，只不过在倒数第2期细胞信号系统的组成跟其他期不同所致。他凋亡作用，这主要取决于FSH/PRL的比例。在分子水平上对PRL促进生精细胞凋亡的研究相当匮乏。用PRL类似物质（CHX）处理后，内caspase活性有高表达，并且可能由一种新的未经确定的caspase来介导［25］。PRL的许多功能表现为促进增生，但其促进凋亡的机制还有待进一步深入研究。
【参考文献】
1BillingAD.Apoptosisinthetestisgermcells:developmentalchangesingonadotropindependenceandlocalizationtoselectivetubulestages.Endocrinology,1995,136（2）:15-17.
2SaidTM,PaaschU,GlanderHJ，etal.Roleofcaspasesinmaleinfertility.HumReprodUpdate,2004,10（1）:39-51.
3KilincF,GuvelS,KayaselcukF,etal.p53expressionandapoptosisinvaricoceleintherattestis.JUrol,2004,172（6pt1）:2475-2478.
4JMorettiE,DiCairanoG,CapitaniS，etal.Ctyptorchidismandsemenquality:TEMandmolecularstudy.Andrology,2007,28（1）:194-199.
5TheasMS,RivalC,DietrichSJ,etal.Deathreceptorandmitochondrialpathwaysareinvolvedigermcellapoptosisinanexpcrimentalmodelofautoimmuneorchitis.HumReprod,2006,21（7）:734-1742.
6AssinderS,DavisR,FenwickM,etal.Adult-onlyexposureofmaleratstoadietofhighphytoestrogencontentincreasesapoptosisofmeioticandpost-meioticgermcells.Reproduction,2007,133（1）:11-19.
7FuruchiT,MasukoK,NishimuneY，etal.Development,1996,122:1703-1709.
细胞研究篇5
中图分类号：R739.86文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2016.03.022
恶性肿瘤的发病率呈逐年增长的态势，2015年我国估计有4 292 000的新增癌症病例（平均每天新增12 000例）和2 814 000的死亡病例（平均每天死亡7500例），其中口腔癌新增48 100例，死亡22 100例[1]。恶性肿瘤严重地威胁人类的健康和生存，成为全球致死的首要病因，而肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells，CSC）理论的提出给肿瘤的治疗指引了新的方向。舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，具有肿瘤恶性生物学特性，研究发现TSCC中也存在具有干细胞特性的肿瘤细胞。
1干细胞与肿瘤干细胞理论
干细胞是一类具有自我更新和无限增殖分化的多潜能细胞群体，即为起源细胞，常处于原始未分化状态。而肿瘤被认为是一个异常发育的器官，是机体细胞在内外不同致癌基因的长期协同作用下，在基因水平上失去了对其生长的正常调控而导致其基因水平的突变和功能调控异常，从而促使细胞的持续异常增殖。大量研究发现，肿瘤细胞具有干细胞相同或类似的特性：自我更新和无限增殖的潜能、相同的信号转导通路调节[2]（如Wnt、Notch和SHH途径）、相同的细胞表面标记物[3，4]（如CD34、CD133、SOX2等）。目前多数学者认为，肿瘤干细胞来源于正常干细胞累积的遗传突变，导致细胞异常过度增殖而形成肿瘤。
传统的肿瘤手术治疗结合放化疗后出现肿瘤复发现象，被认为是肿瘤中极少数肿瘤干细胞类细胞耐受甚至逃逸射线或药物的杀伤作用，最终导致肿瘤的复发和转移。Reya等[5]研究发现肿瘤细胞具有无限增殖潜能，并能形成新的不同表型特征组织，与干细胞生物学特性非常类似，由此提出了“肿瘤干细胞学说”。该理论认为肿瘤干细胞是肿瘤中数量极少，具有干细胞特性、高致瘤能力和侵袭迁移潜能的细胞亚群，具有新生肿瘤细胞能力，是肿瘤发生、增殖、侵袭、转移以及复发的根源[6]。除了与干细胞有相同特性，肿瘤干细胞的更新和增殖呈现出失控状态，它独特的表现在：失控的自我更新和异常分化潜能、自主侵袭和远处转移性、极高致瘤性、多药耐药性、相对特异性的表面标志和辐射抵抗特性[7，8]。
2肿瘤干细胞与舌鳞状细胞癌
研究者们经过多年的研究发现，在血液肿瘤、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中都存在肿瘤干细胞，它们的数量极少，并具有独特的生物学特性和较强的致瘤能力。急性髓系白血病（AML）肿瘤干细胞能特异性表达CD34+/CD38-标记物，只需要极少数量该类细胞就可在NOD/SCID裸鼠体内转移疾病，致瘤性极高[6]。AlHajj等[9]研究乳腺癌时，通过特异性标记物分离出CD44+CD24-/low Lineage-人乳腺癌干细胞，仅需100个就能在小鼠的乳腺中形成肿瘤。前列腺癌研究中发现具有特异性表面标志为α2β1hi/CD133+CD44-的肿瘤细胞才拥有自我更新和不断繁殖的能力，与前列腺癌的耐药性和复发性密切相关，这类具有干细胞特性的细胞仅需100个即能在小鼠的体内形成特异性的移植瘤[10]。此外，研究者们还发现在肝癌[7]、胰腺癌[8]、脑肿瘤[11]等多种肿瘤中找到了肿瘤干细胞存在的证据。
TSCC是最常见的口腔恶性肿瘤之一，发生率居口腔癌之首，患者5年生存率仅为32%～54%[12，13]。舌体拥有丰富的淋巴管和血液循环加之舌体运动频繁，使TSCC早期即可出现颈部淋巴结转移，且转移概率高。研究报道，在裸鼠爪垫上注射Tca8113细胞可建立TSCC淋巴道转移模型[14]，通过观察TSCC细胞在淋巴道转移的生物学特性，对临床的治疗、复发以及预后判断尤其重要。研究还发现肿瘤干细胞类细胞在TSCC的迁移和侵袭过程中起了重要的作用，TSCC的迁移和侵袭与含锰金属辅基的超氧化物歧化物（SOD2）有关，SOD2可成为一种直接的原癌靶基因促进TSCC细胞，包括肿瘤干细胞类细胞的迁移和侵袭[15]。此外，TSCC还具有抗凋亡和化疗耐药能力，严碌热[16]研究白细胞介素23（IL23）在TSCC肿瘤组织以及细胞系SCC9的表达情况，发现IL23可通过上调TSCC细胞的Wnt通路，从而增强其化疗药物耐药及抗凋亡能力。
3舌癌肿瘤干细胞的存在及相关基因表达
永生性细胞系对于研究原始肿瘤是一个很重要的工具。Owen等[17]从舌癌患者肿瘤组织中取原始肿瘤细胞进行培养并建立了舌癌细胞系UMSCC103，研究发现UMSCC103中具有CD44high/ALDH high表型的肿瘤干细胞在裸鼠体内能形成特异性肿瘤，与原始肿瘤具有相同的异质性。Yanamoto等[18]研究发现，TSCC能特异性的表达肿瘤干细胞标记物CD44v6和ABCG2，通过对89例TSCC病人的肿瘤组织检测发现CD44v6和ABCG2的阳性表达率分别为24.7%和13.5%。FACS技术可分选出舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株中高表达的ALDH（ALDHbr）干细胞样细胞，数量较少，约占总细胞数的1.3%，同时采用抑制消减杂交技术还可筛选舌鳞癌干细胞的相关差异表达基因，如LOC736141、CLDND1、ETFA等[19]。有数据表明，干细胞标记物ALDH1、CD44、OCT4和SOX2与舌鳞状细胞癌密切相关，且SOX2可作为舌癌的预后指标[20]。多数研究证实，与其他恶性肿瘤一样，TSCC中同样存在肿瘤干细胞，并且表达了多数肿瘤干细胞相关基因，目前仍无法寻找到舌癌特异性的表达基因，对于舌鳞癌根治治疗仍成为一大难题，急需寻找特异性舌鳞状细胞癌靶向基因，才能彻底治愈。
4肿瘤干细胞靶向治疗的研究
基因的突变、肿瘤微环境的时刻变化以及表观遗传特征改变均可导致肿瘤的异质性。多年来，研究者们都在研究如何才能彻底治愈肿瘤，彻底杀灭肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的靶向治疗是对肿瘤特异性的分子靶点进行选择性地抑制或杀灭作用，而不损伤正常细胞。因此，以CSC为靶标，运用生物工程手段寻找靶点成为肿瘤干细胞的靶向治疗的新趋势。
4.1靶向作用于肿瘤干细胞的微环境通过调节肿瘤干细胞微环境可以调控肿瘤干细胞的更新和增殖分化能力，改变干细胞对放化疗的敏感度。肿瘤微环境中包括各种内皮细胞、成纤维细胞以及各类免疫细胞，这些成熟细胞可通过与干细胞的直接接触或分泌细胞因子的方式来调节干细胞的自我更新和增殖分化能力[21]。研究证实肿瘤的内皮细胞在维持肿瘤干细胞生长方面起着关键作用，血管内皮细胞通过释放生长因子促进血管形成，维持肿瘤干细胞的生长和更新。Hovinga等[22]通过靶向作用于肿瘤相关的血管内皮细胞，抑制血管内皮细胞所介导的Notch信号通路，可引起肿瘤干细胞自我更新和增殖能力下降。
4.2靶向作用于肿瘤干细胞的表面标志肿瘤干细胞可以表达特异的细胞表面标志，通过阻断相应的表面标志可能成为肿瘤干细胞靶向治疗的潜在靶点。Prince等[23]证实了头颈部鳞癌肿瘤干细胞特异性表面标记物为CD44分子，具有CD44+表型的肿瘤干细胞样细胞具有自我更新和多向分化潜能和致瘤性。研究表明，针对具有CD44+表型的细胞进行靶向治疗鳞状细胞癌已取得了很好的临床疗效，而CD44v6的表达被认为与鳞状细胞癌转移有关，已转移的鳞状细胞癌通过对CD44v6的靶向治疗有明显疗效[24]。
4.3靶向作用于肿瘤干细胞的信号通路肿瘤干细胞受多条信号转导通路的调控，以维持肿瘤的恶，研究发现Notch、Wnt、Hedgehog信号通路与肿瘤干细胞调控相关[2]，因此针对肿瘤干细胞的这些信号转导通路的靶向治疗成为肿瘤治疗的一个方向。通过阻断参与肿瘤干细胞调控的相关信号通路，从而抑制肿瘤干细胞的增殖、转移等恶性生物学特性。Wnt信号通路参与调节细胞的增殖和分化功能，异常的信号通路可导致细胞质内过量游离的β蛋白聚集进入核内与转录因子结合，激活多种靶基因和各种酶等，从而诱导细胞的恶性生长[25]。survivin作为凋亡抑制蛋白的新成员，具有肿瘤特异性，与肿瘤的分化增殖和浸润迁移密切相关。研究胃癌干细胞时发现，Wnt/βcatenin信号转导通路参与其中调节，而survivin抑制剂YM155及其复合物通过抑制Wnt信号通路中的TCF/βcatenin，从而能抑制肿瘤的增殖[26]。Notch信号通路上的基因也可成为潜在的肿瘤治疗靶点，研究证实，激活Notch信号通路可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移，阻断该通道促进肿瘤干细胞对药物的敏感性，从而抑制肿瘤的增殖。研究发现，在前列腺癌中Notch1过表达，通过下调Notch1和Jagged1，从而抑制前列腺癌细胞生长、迁移和侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡[27]。
5结语
肿瘤干细胞理论受到越来越多的关注，靶向肿瘤干细胞治疗也成为研究者钻研的新方向。肿瘤干细胞与正常干细胞之间存在相似的信号转导通路调节[2]（如Wnt、Notch和SHH途径）以及相同的细胞表面标记物[3，4]（如CD34、CD133、SOX2等），导致针对肿瘤干细胞的靶向治疗同时也会抑制正常干细胞的更新分化。许多肿瘤都能表达肿瘤干细胞标记物，如CD133、CD44、CD90、ALCH1等，但却缺乏特异性的标记物，只有少数肿瘤具有相对特异的细胞表面标记物，使得针对肿瘤干细胞的表面标志的靶向治疗受到了一定的限制。然而，肿瘤干细胞的各种靶向药物和靶向给药途径在临床或试验中均取得了比较显著的成果[25]，如肿瘤干细胞耐药机制、凋亡、信号通路和表面标志的靶向给药系统，对一些表达特异性标记或通路的肿瘤干细胞起到明显的作用。因此，寻找不同肿瘤的特异性基因并结合肿瘤干细胞的靶向途径给肿瘤治疗提供了新的思路。
参考文献
[1]Chen W，Zheng R，Baade PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin， 2016，66（2）：115132.
[2]Wang R，Sun Q，Wang P，et al.Notch and Wnt/βcatenin signaling pathway play important roles in activating liver cancer stem cells[J].Oncotarget，2016，7（5）：57545768.
[3]Testa U.Leukemia stem cells[J].Ann Hematol，2011，90（3）：245271.
[4]梁洪享，钟f，罗勇，等.肿瘤干细胞标志物CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J].肿瘤防治研究，2013，40（12）：11381142.
[5]Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells[J].Nature，2001，414（6859）：105111.
[6]Chaffer CL，Weinberg RA.A perspective on cancer cell metastasis[J].Science，2011，331（6024）：15591564.
[7]Zhu L，Zhang W，Wang J，et al.Evidence of CD90+CXCR4+cells as circulating tumor stem cells in hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol，2015，36（7）：53535360.
[8]Yao J，Cai HH，Wei JS，et al.Side population in the pancreatic cancer cell lines SW1990 and CFPAC1 is enriched with cancer stemlike cells[J].Oncol Rep，2010，23（5）：13751382.
[9]AIHajj M，Wicha MS，BenitoHernandez A，et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（7）：39833988.
[10]Gu G，Yuan J，Wills M，et al.Prostate cancer cells with stem cell characteristics reconstitute the original human tumor in vivo[J].Cancer Res，2007，67（10）：48074815.
[11]Lathia JD，Mack SC，MulkearnsHubert EE，et al.Cancer stem cells in glioblastoma[J].Genes Dev，2015，29（12）：12031217.
[12]Lambert R，Sauvaget C，de Camargo Cancela M，et al.Epidemiology of cancer from the oral cavity and oropharynx[J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2011，23（8）：633641.
[13]Sankaranarayanan R，Ramadas K，Amarasinghe H，et al.Oral Cancer：Prevention，Early Detection，and Treatment[M]//In：Gelband H，Jha P，Sankaranarayanan R，Horton S，editors.Source Cancer：Disease Control Priorities，Third Edition（Volume 3）.Washington（DC）：The International Bank for Reconstruction and Development/The World Bank，2015，Chapter 5.
[14]姚金光，邝晓聪，温冠媚，等.舌鳞状细胞癌淋巴道转移裸鼠模型建立的实验研究[J].右江医学，2006，34（6）：581583.
[15]Liu Z，He Q，Ding X，et al.SOD2 is a Cmyc target gene that promotes the migration and invasion of tongue squamous cell carcinoma involving cancer stemlike cells[J].Int J Biochem Cell Biol，2015（60）：139146.
[16]严拢苏玉婷，周月鹏，等.白细胞介素23通过无翅基因相关整合位点/β连环蛋白通路增强舌鳞状细胞癌抗凋亡及耐药能力[J].华西口腔医学杂志，2015，33（3）：249254.
[17]Owen JH，Hauff SJ，Tang AL，et al.UMSCC103：a unique tongue cancer cell line that recapitulates the tumorigenic stem cell population of the primary tumor[J].Ann Otol Rhinol Laryngol，2014，123（9）：662672.
[18]Yanamoto S，Yamada S，Takahashi H，et al.Expression of the cancer stem cell markers CD44v6 and ABCG2 in tongue cancer：effect of neoadjuvant chemotherapy on local recurrence[J].Int J Oncol，2014，44（4）：11531162.
[19]邹波，季平，孙守娟，等.舌鳞癌Tca8113细胞株干细胞相关差异表达基因的筛选及分析[J].华西口腔医学杂志，2012，30（5）：458462.
[20]Huang CF，Xu XR，Wu TF，et al.Correlation of ALDH1，CD44， OCT4 and SOX2 in tongue squamous cell carcinoma and their association with disease progression and prognosis[J].J Oral Pathol Med，2014，43（7）：492498.
[21]Korkaya H，Liu S，Wicha MS.Breast cancer stem cells，cytokine networks，and the tumor microenvironment[J].J Clin Invest，2011，121（10）：38043809.
[22]Hovinga KE，Shimizu F，Wang R，et al.Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate[J].Stem Cells，2010，28（6）：10191029.
[23]Prince ME，Sivanandan R，Kaczorowski A，et al.Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（3）：973978.
[24]Richad V，Pillai MR.The stem cell code in oral epithelial tumorigenesis：‘the cancer stem cell shift hypothesis’[J].Biochim Biophys Acta，2010，1806（2）：14662.
[25]乔明曦，张晓君，巴爽，等.肿瘤干细胞靶向给药系统的研究进展[J].药学学报，2013，48（4）：477483.
[26]Cai C，Zhu X.The Wnt/βcatenin pathway regulates selfrenewal of cancer stemlike cells in human gastric cancer[J].Mol Med Rep，2012，5（5）：11911196.
细胞研究篇6
[关键词] 骨髓干细胞；移植；肝细胞癌；治疗
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0151-03
Research progress on the treatment of hepatocellular carcinoma by transplanting bone marrow stem cells
ZHOU Bin1 CHEN Zhihao1 GONG Xumeng2 GAO Yi2
1.The Second Clinical Medical College of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China； 2.Department of Hepatobiliary Second Surgery， Zhujiang Hospital of Southern Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510282， China
[Abstract] Hepatocellular carcinoma （HCC） refers to the primary liver cell malignant tumor， which is 91.5% of primary liver cancer. Recurrently there are many methods of treating HCC and bone marrow stem cells （BMSCs） transplantation is one of the hot spot on treating HCC. BMSCs can promote liver regeneration， slow down the process of cirrhosis and induce the apoptosis of HCC. At the same time， BMSCs can change the surrounding microenvironment of HCC by autocrine and paracrine， thus inhibiting HCC metastasis. Along with the advance of molecular biotechnology， BMSCs has become the ideal target cells of gene therapy due to the fact that BMSCs are esay to be isolated， expanded in vivo and genetically modified， which has become the ideal target cells of gene therapy. However， with the deepening of research， the tumorigenicity risk of BMSCs is also brought to the attention of researchers. This study does a review from BMSCs in liver cancer tissue and its transfer， the influence of BMSCs as the ideal target cells used in gene therapy and possible risk of progression of tumorigenicity by BMSCs.
[Key words] Bone marrow stem cells； Transplantation； Hepatocellular carcinoma； Therapy
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是指原发于肝细胞的恶性肿瘤，占原发性肝癌的91.5%。肝切除术是目前治疗HCC的主要手段。对于早期HCC，肝切除术后患者的预后往往较好。但由于早期发现HCC存在困难，该疾病在被诊断时往往已到了晚期。而对于晚期HCC，由于癌症组织巨大，肝切除术需要切除大量肝脏组织。但这会给患者的肝功能产生极大的影响并最终导致肝脏衰竭，而此时肝移植成为了最终的选择。但是供体来源的匮乏限制了目前肝移植的发展。近年来，随着组织工程的不断发展，越来越多的研究尝试运用干细胞移植技术治疗肝癌。其中骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）因具有多分化潜能并能分泌多种细胞因子，已经被广泛地用于肝脏疾病如肝衰竭及脂肪肝的研究中[1-2]。而在HCC治疗中，BMSCs移植也开始展现出较好的应用前景。本文将从BMSCs对肝癌组织及其转移的影响，BMSCs作为理想靶向细胞应用于基因治疗及BMSCs致瘤性的可能风险等方面的研究进展进行综述，从而为BMSCs移植应用于临床治疗HCC奠定坚实的理论基础，为HCC的治疗提供新的方案。
1 BMSCs对肝癌组织的影响
肝切除术是目前治疗HCC的重要手段，但由于术后大量肝脏组织被移除，患者往往出肝脏衰竭的表现。近年来新提出的BMSCs移植治疗肝癌患者已经成为研究的热点。据当前的研究表明，BMSCs可通过以下三种途径影响肝癌：①BMSCs可促进肝组织再生；②BMSCs减缓肝硬化进程；③BMSCs可诱导HCC凋亡。
1.1 BMSCs可促进肝组织再生
目前的研究已经证明BMSCs移植可以促进肝功能衰竭患者体内肝组织的再生。Kuo等[3]给口服四氯化碳构建肝癌模型的小鼠移植了BMSCs后发现小鼠的死亡率降低。同时研究表明肝组织内细胞角蛋白、肝细胞核因子4、细胞色素P450和谷氨酰胺合成酶等蛋白表达量都上升，提示小鼠内肝功能得到一定的改善。利用同样的模型，Banas等[4]发现BMSCs可以高度表达肝细胞刺激因子如白介素-8、粒细胞集落刺激因子、肝细胞生长因子等。有学者[5]将BMSCs与肝细胞混合培养，结果显示其肝组织内BMSCs可以分化为肝样细胞。综合以往的研究，BMSCs移植促进肝脏再生的机制可能为：①BMSCs有分化成肝样细胞的潜能；②BMSCs可以分泌多种成肝样细胞因子，从而促进干细胞增殖。
1.2 BMSCs可减缓肝硬化进程
在肝炎的流行病区，HCC患者大多经历肝炎到肝硬化最后发展为肝癌的过程。而当疾病发展到肝硬化时往往已经是不可逆的过程。最近有研究表明BMSCs可以抑制肝星状细胞的活化，促进其凋亡，减少细胞外基质分泌，从而达到延缓肝纤维化的进程[6]。Wang等[7]则从分子层面验证了BMSCs可以通过细胞间信号传导和分泌肝样生长因子，调控肝星状细胞的TLR4/NF-kB通路，从而抑制肝星状细胞的活性和增殖能力。但Peng等[2]在其临床试验中却发现BMSCs移植只能在短期内缓解肝衰竭的慢性乙肝患者症状，而无法真正地阻止其最终转化为HCC的进程以及降低HCC的死亡率。
1.3 BMSCs可诱导HCC凋亡
近年来有研究提出BMSCs移植可以通过诱导癌细胞凋亡从而用于治疗HCC。吴昌雄等[8]在其研究中发现：BMSCs不仅可以在肝脏中定植并分化为具有肝细胞功能的肝样细胞，同时其可诱发肝癌细胞的坏死。Li等[9]则从分子层面研究BMSCs移植对肝癌组织的影响，研究表明细胞凋亡相关基因Bax和caspas-3的表达量明显上升，且抗凋亡相关基因Bcl-2的表达量也下降。同时该研究也指出肿瘤转移相关因子OPN、BSP和α-V基因的表达量都下降。
2 BMSCs对肝癌转移的影响
晚期肝癌患者往往已经出现了肝外的转移，因此预防和治疗肝癌转移已经成为研究HCC的热点之一。Li等[10]在研究患HCC小鼠移植BMSCs的实验中发现：移植BMSCs实验组小鼠的肺转移发生率低于对照组。同时Li等[11]还发现BMSCs通过下调TGF-β1和MMP的表达。其中由于TGF-β1可以通过调节致瘤性mRNA的表达，促进HCC细胞的生长、转移和浸润能力，从而促进HCC的发生和发展[12]。因此TGF-β1表达量的下降将能够阻止HCC向肝外组织转移，从而提高HCC患者的治疗效果。Li等[9]也发现肿瘤转移相关因子OPN、BSP和α-V基因的表达量都下降，并且证明BMSCs对HCC转移的抑制作用大于BMSCs对HCC凋亡作用效果。综合以往研究，目前普遍认为BMSCs可以通过自分泌和旁分泌的方式改变HCC周围的微环境，从而抑制HCC向肝外组织的转移。
3 BMSCs作为靶向细胞治疗HCC
随着分子生物技术的不断进步，基因治疗已经成为治疗HCC的研究热点之一。而BMSCs由于易于分离、体内扩增及进行基因修饰，因此成为基因治疗的理想靶向细胞[13]。有研究运用基因转录的方法将组织特异性自杀基因：趋化因子CCL5和促血管生成素家族的Tie2基因分别导入BMSCs中，并将两种细胞分别移植到肝癌组织中，实验结果表明两种基因转载后的细胞都具有抑制肿瘤细胞增殖的能力，其中转载CCL5的BMSCs对HCC的抑制作用强于转载Tie2的BMSCs。Xie等[14]将干扰素-β（IFN-β）基因植入BMSCs中，并将修饰后的BMSCs移植至肝癌组织中，该研究发现BMSCs分泌大量IFN-β从而通过抑制AKT/FOXO3a通路从而抑制HCC的增殖能力。类似的研究也发现IFN-γ、IL-2等肿瘤源性的外切体植入BMSCs细胞中都能够一定程度上抑制HCC的活性和增殖能力[13-15]。Gao等[16]在其研究中将色素上皮源性生长因子转载到BMSCs中并移植到HCC小鼠模型中，实验结果表明转载后的BMSCs不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖，同时也能够缓解HCC的转移。
Knoop等[17]则将钠/碘转运体的基因导入BMSCs内并将细胞移植至HCC中，这一方法不仅可以通过123I-闪烁扫描术或124I-PET监测BMSCs在HCC中的活动情况。同时研究发现移植后肝组织内HCC含量下降，其可能的机制是BMSCs胞内聚集的131I放射出射线破坏了周围的HCC。此方法将为生物治疗联合放射治疗应用于靶向治疗HCC奠定了初步基础。
4 BMSCs的致瘤性分析
虽然目前运用BMSCs移植被广泛应用于治疗HCC的研究，但随着研究的深入发现BMSCs也具有一定潜在的致瘤性。目前已经有研究猜测BMSCs可能是恶性纤维母细胞瘤和尤因骨肿瘤细胞的共同远祖来源[18-19]。但Dawson等[20]在研究中发现只有髓系来源的BMSCs（CD45+CD11+bSca1-）具有促进肿瘤细胞增殖和分化而间充质来源的BMSCs（Sca1-Gr-1-F4/80-CD11b-CD31-CD45-）则无此特性。而Gong等[21]则研究发现，BMSCs可以通过分泌促血管生成素促进肝癌组织内微血管的生成，从而有利于HCC在局部获得更多养料来源并迅速增殖。
为了降低HCC患者BMSCs移植后出现BMSCs致瘤的发生率，有学者[22]提取了BMSCs中具有抗肿瘤活性的微囊泡（microvesicles，MV），并将其与HCC混合培养，观察MV在小鼠体内外对HCC的影响。实验结果表明MV在小鼠体内外都具有抑制肿瘤细胞增殖能力的作用。此方案将有可能解决BMSCs移植治疗HCC过程中遇到的BMSCs向恶性肿瘤细胞增殖分化的问题。
5 展望
虽然近年来人类对BMSCs移植治疗HCC的研究取得了很大的发展，但真正将BMSCs应用于临床治疗HCC仍然面临着以下几个问题[23-25]：①由于BMSCs具有一定的致瘤性，所以在BMSCs移植后对肝组织的监控是十分重要的；但目前仍然缺乏较为精确监控设备。②虽然BMSCs移植到人体肝脏组织能够分化为特定的肝组织，但分化后的组织是否能够正常发挥肝脏的功能仍然是需要进一步地研究。③虽然BMSCs可以作为基因靶向治疗的细胞，但转导的效率以及转载基因的表达产物对HCC的抑制效果仍然不高。④目前大部分研究只停留在体外实验或者动物模型，而真正用于临床治疗HCC仍需要进一步的人体体内试验验证。面对现在存在的这些问题，人类必须进一步地了解BMSCs在分子层面的生物特性并且寻找更为有效的转载基因。这不仅充分可以发挥BMSCs本身具有的向肝样细胞分化和抑制HCC增殖和转移的能力，同时也发挥转载基因表达产物对HCC抑制的作用，从而为BMSCs移植应用于临床治疗HCC奠定了坚实的理论基础。
[参考文献]
[1] Ezquer M， Ezquer F， Ricca M， et al. Intravenous administration of multipotent stromal cells prevents the onset of non-alcoholic steatohepatitis in obese mice with metabolic syndrome[J]. J Hepatol，2011，55（5）：1112-1120.
[2] Peng L， Xie DY， Lin BL， et al. Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liver failure patients caused by hepatitis B： short-term and long-term outcomes [J]. Hepatology，2011，54（3）：820-828.
[3] Kuo TK， Hung SP， Chuang CH， et al. Stem cell therapy for liver disease： parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Gastroenterology，2008，134（7）：2111-2121.
[4] Banas A， Teratani T， Yamamoto Y， et al. IFATS collection： in vivo therapeutic potential of human adipose tissue mesenchymal stem cells after transplantation into mice with liver injury[J]. Stem Cells，2008，26（10）：2705-2712.
[5] Qihao Z， Xigu C， Guanghui C， et al. Spheroid formation and differentiation into hepatocyte-like cells of rat mesenchymal stem cell induced by co-culture with liver cells [J]. DNA Cell Biol，2007，26（7）：497-503.
[6] Cesselli D， Beltrami AP， Poz A， et al. Role of tumor associated fibroblasts in human liver regeneration， cirrhosis， and cancer [J]. Int J Hepatol，2011，2011：120925.
[7] Wang PP， Xie DY， Liang XJ， et al. HGF and direct mesenchymal stem cells contact synergize to inhibit hepatic stellate cells activation through TLR4/NF-kB pathway [J]. PLoS One，2012，7（8）：e43408.
[8] 吴昌雄，郑进方，梁力建.骨髓基质细胞在小鼠肝脏内分化及癌变的潜能[J].世界华人消化杂志，2009，17（29）：2984-2989.
[9] Li T， Song B， Du X， et al. Effect of bone-marrow-derived mesenchymal stem cells on high-potential hepatocellular carcinoma in mouse models： an intervention study [J]. Eur J Med Res，2013，18：34.
[10] Li GC， Ye QH， Dong QZ， et al. Mesenchymal stem cells seldomly fuse with hepatocellular carcinoma cells and are mainly distributed in the tumor stroma in mouse models[J]. Oncol Rep，2013，29（2）：713-719.
[11] Li GC， Ye QH， Xue YH， et al. Human mesenchymal stem cells inhibit metastasis of a hepatocellular carcinoma model using the MHCC97-H cell line [J]. Cancer Sci，2010，101（12）：2546-2553.
[12] Sawada R， Ito T， Tsuchiya T. Changes in expression of genes related to cell proliferation in human mesenchymal stem cells during in vitro culture in comparison with cancer cells[J]. J Artif Organs，2006，9（3）：179-184.
[13] 马博，任军，姜晗，等.肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究[J].北京大学学报：医学版，2008，40（5）：494-499.
[14] Xie C， Xie DY， Lin BL， et al. Interferon-beta gene-modified human bone marrow mesenchymal stem cells attenuate hepatocellular carcinoma through inhibiting AKT/FOXO3a pathway[J]. Br J Cancer，2013，109（5）：1198-1205.
[15] Ma B， Jiang H， Jia J， et al. Murine bone marrow stromal cells pulsed with homologous tumor-derived exosomes inhibit proliferation of liver cancer cells [J]. Clin Transl Oncol，2012，14（10）：764-773.
[16] Gao Y， Yao A， Zhang W， et al. Human mesenchymal stem cells overexpressing pigment epithelium-derived factor inhibit hepatocellular carcinoma in nude mice[J]. Oncogene，2010，29（19）：2784-2794.
[17] Knoop K， Kolokythas M， Klutz K， et al. Image-guided， tumor stroma-targeted 131I therapy of hepatocellular cancer after systemic mesenchymal stem cell-mediated NIS gene delivery[J]. Mol Ther，2011，19（9）：1704-1713.
[18] Murata M， Matsuzaki K， Yoshida K， et al. Hepatitis B virus X protein shifts human hepatic transforming growth factor （TGF）-beta signaling from tumor suppression to oncogenesis in early chronic hepatitis B [J]. Hepatology，2009，49（4）：1203-1217.
[19] Tirode F， Laud-duval K， Prieur A， et al. Mesenchymal stem cell features of Ewing tumors [J]. Cancer Cell，2007，11（5）：421-429.
[20] Dawson MR， Chae SS， Jain RK， et al. Direct evidence for lineage-dependent effects of bone marrow stromal cells on tumor progression [J]. Am J Cancer Res，2011，1（2）：144-154.
[21] Gong P， Wang Y， Wang Y， et al. Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on hepatocellular carcinoma in microcirculation[J]. Tumour Biol，2013，34（4）：2161-2168.
[22] Bruno S， Collino F， Deregibus MC， et al. Microvesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells inhibit tumor growth [J]. Stem Cells Dev，2013，22（5）：758-771.
[23] Hang HL， Xia Q. Role of BMSCs in liver regeneration and metastasis after hepatectomy [J]. World J Gastroenterol，2014，20（1）：126-132.
[24] Bayo J， Marrodan M， Aquino JB， et al. The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells on hepatocellular carcinoma [J]. Liver Int，2014，34（1）：330-342.
[25] 赵晨成，马迅，张明，等.人骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养后的类髓核分化效应及其对髓核细胞表型的调节作用[J].中国现代医生，2012，50（6）：6-9.
细胞研究篇7
effect and antitumor mechanism of f90 on glioblastoma cells
liu fangjun1, gui songbai2, sun zelin1, et al.
1. beijing neurosurgical institute, beijing 100050, china; 2. department of neurosurgery, beijing tiantan hospital,
capital university of medical sciences, beijing 100050, china
abstract: objective to investigate the antitumor effects and antitumor mechanism of f90, a kind of inhibitor of epidermal growth factor receptor (egfr) on glioblastoma (gbm) cells. methods antitumor activity of f90 was detected by mtt assay. the antitumor mechanism was investigated by flow cytometry and western blot assay. results u251 and shg-44 cells were inhibited by f90 in a dose-dependent manner in vitro. the 50% inhibitory concentration (ic50) of them was 5.8±1.3 and 5.1±1.2 μmol/l, respectively. f90 inhibited phosphorylation of egfr and downstream signaling proteins of mitogen-activated protein kinase (mapk) pathway, up-regulated p53 protein and down- regulated bcl-2 protein, induced cell apoptosis confirmed by flow cytometry. conclusion f90 is effective for growth inhibition of some gbm cells in vitro and has a similar effect to iressa, therefore may be a novel potent agent for gbm.
key words: glioblastoma; receptor, epidermal growth factor; 在高度恶性的胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤 （gbm） 中经常能见到表皮生长因子受体 （egfr） 的过表达[1]。由英国阿斯利康研发的 iressa （gefitinib，zd1839） 是一种选择性的egfr酪氨酸激酶抑制剂，在体外对高表达egfr或转染egfr基因的gbm有抑制生长及抗侵袭作用[2]。f90是中国医学科学院药物研究所自主研制开发的一种iressa前药，在体外经脂酶孵育或体内经胃酸作用后可以转化为有活性的iressa，已经申请了中国专利与国际专利。本实验旨在观察f90对gbm细胞的抑制作用及其机制。
1 对象与方法
1.1 药品与试剂 f90由中国医学科学院药物研究所化学合成室提供，经脂酶孵育24 h后用于体外实验，对照药物iressa购自英国阿斯利康公司。两种药物均采用二甲基亚砜 （dmso） 配制，对照组加入相同剂量的dmso （浓度不超过0.1%）。一抗购自美国santa cruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国promega公司。
1.2 细胞株 人gbm细胞株shg-44、tj899和tj905由中国医学科学院药物研究所药理室惠赠，bt325和u251由北京市神经外科研究所细胞室提供。均采用含10%胎牛血清 （fbs）、100 u/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的dmem培养基，0.25% 胰酶-乙二胺四乙酸 （edta） 消化，在含5% co2的37 ℃培养箱中培养传代。
1.3 mtt法测定肿瘤细胞存活率 按 1 000个细胞/孔接种于96孔板，次日加含不同浓度药物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每组设3个平行孔，培养96 h后，每孔加用无血清培养基新鲜配制的5 g/l mtt 100 μl，继续培养4 h，然后每孔加200 μl dmso溶解甲?颗粒，振荡混匀后，mk3型酶标仪 （labsystems，dragon，finland） 测定光密度值 （od），参考波长450 nm，检测波长570 nm；抑制率 （%） = （给药组od值-对照组od值） /对照组od值 × 100%。半数抑制浓度 （ic50） 由线性方程计算，通过药物浓度对生长抑制率的回归曲线进行推算。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 不同浓度化合物 （iressa 5 μmol/l，f90 2.5、5 和10 μmol/l）作用u251细胞48 h后，收集贴壁细胞，用预冷pbs洗2次，按1 ∶ 1 ∶ 50 比例将annexin v-异硫氰荧光素 （fitc）、碘化丙啶 （pi） 和4-羟乙基哌氰乙磺酸 （hepes） 缓冲液配成annexin v-fitc/ pi染液。每100 μl 染液重悬1 × 105个细胞，室温下孵育15 min后加入1 ml hepes缓冲液混匀上机。以激发波长488 nm，发射波长 525、575 nm分别检测fitc 和pi 荧光。每样本收集10 000个细胞荧光信号。
1.5 western blot杂交分析蛋白表达 将不同浓度化合物 （iressa 5 μmol/l，f90 2.5，5 和10 μmol/l） 作用u251细胞48 h后，收集贴壁的细胞，从3 × 106个细胞中提取蛋白质，裂解液裂解细胞。采用bradford法计算蛋白质含量，然后用细胞裂解液将各样品调至相同浓度，取各组蛋白质样品120 μg，上样30 μl，经8%和10% 十二烷基硫酸钠 （sds）-page电泳后，用半干法转膜，加入稀释的一抗，常温孵育2 h或4 ℃过夜，洗膜3遍，加入相应的二抗，常温孵育2 h或4 ℃过夜，洗膜后，用增强化学发光法 （ecl plus，amersham pharmacia biotech，usa） 显影并采集图像。
1.6 统计分析 所有试验均重复3遍，结果用x ± s表示，western blot结果用image j软件测条带灰度值进行半定量分析，采用spss 12.0软件进行t检验，以p ＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 f90对gbm细胞的生长抑制作用 （表 1） mtt结果显示：f90对u251、shg-44细胞有显著的生长抑制作用，ic50值分别为 （5.8 ± 1.3） 和 （5.1 ± 1.2） μmol/l；且呈剂量依赖性，在剂量为12.5 μmol/l时能显著抑制肿瘤细胞的生长，当达到25 μmol/l时抑制率接近100%；对tj899和tj905细胞有一定的抑制作用；对bt325细胞则需高剂量才能呈现抑制作用。
2.2 f90诱导u251细胞凋亡 （图 1） 不同浓度的药物作用细胞48 h后，用流式细胞仪检测，annexin v-pi染色，将早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞区分。与对照组相比，随着药物剂量的增加，凋亡细胞的数目逐渐增加；与阳性药物iressa相比，f90与其效果相似，在浓度为5 μmol/l时即能显著诱导细胞凋亡。
2.3 western blot结果 （图 2，表 2） 由于iressa选择性作用于磷酸化的egfr，f90是iressa的前药，因此，我们主要检测u251细胞磷酸化的egfr及其丝裂原活化的蛋白激酶 （mapk） 通路下游蛋白的关键蛋白。f90对磷酸化egfr、细胞外信号调节激酶1 （erk1）、p38和c-jun氨基末端激酶 （jnk） 蛋白表达有下调作用，且随着剂量的加大，抑制作用更加明显。药物下调bcl-2蛋白的表达，上调p53蛋白的表达，且与剂量有一定的相关性。同剂量的f90与iressa效果相似。
3 讨 论
大约40%～50%的gbm高表达egfr[3]，这与gbm病人的预后不良，短时间内复发，对化疗、放疗抵抗等有关[4]。因此，阻断依赖egfr的信号传导通路即可阻止肿瘤的生长，而egfr阻断剂 （包括单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂） 作为肿瘤治疗的方法已成功应用于临床[5]。
本研究mtt结果表明：f90与iressa具有相似的作用，只是对某些gbm细胞的生长有较好的抑制作用，且呈一定的剂量依赖性，其原因及机制有待于进一步研究。
本研究选用了对两种药物均敏感的u251细胞来探讨其作用机制。细胞凋亡是抗肿瘤作用的重要机制之一，抗凋亡蛋白bcl-2和促凋亡蛋白p53在细胞凋亡的过程中起着关键的作用[6]。黄海燕等[7]曾报告过125i在体内及体外有诱导shg-44细胞凋亡的作用，主要机制可能与抑制bcl-2蛋白的表达、上调p53蛋白的表达有关。本研究western blot也显示了类似的结果，说明f90诱导细胞凋亡主要通过下调bcl-2蛋白、上调p53蛋白而发挥作用。
egfr重要的下游通路是mapk通路，而erk、jnk和p38是这条通路的下游信号蛋白[8]。mapk通路与胶质瘤生长及病人预后不良有着密切的关系，与正常组织相比，瘤组织中mapk的表达明显升高[9]。本研究结果显示：f90在体外作用于u251细胞48 h后，可以抑制磷酸化egfr的表达，同时下调下游磷酸化erk1、jnk和p38蛋白的表达，说明egfr-mapk信号传导通路受到了抑制。这种下调可能是f90体外抑制u251细胞生长的主要原因。因此，我们推断：f90抑制u251细胞生长的机制可能是通过直接阻止egfr的磷酸化，从而阻断了mapk下游通路的信号传导。
总之，本研究结果表明：f90有希望成为用于治疗高表达egfr的gbm病人的新药。
【参考文献】
[1] layfield l j, willmore c, tripp s, et al. epidermal growth factor receptor gene amplification and protein ex- pression in glioblastoma multiforme: prognostic significance and relationship to other prognostic factors [j]. appl immu- nohistochem mol morphol, 2006, 14(1): 91-96.
[2] raizer j j. her1/egfr tyrosine kinase inhibitors for the treatment of glioblastoma multiforme [j]. j neurooncol, 2005, 74(1): 77-86.
[3] shinojima n, tada k, shiraishi s, et al. prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multiforme [j]. cancer res, 2003, 63(20): 6962- 6970.
[4] quaranta m, divella r, daniele a, et al. epi- dermal growth factor receptor serum levels and prognostic value in malignant gliomas [j]. tumori, 2007, 93(3): 275- 280.
[5] halatsch m e, schmidt u, behnke-mursch j, et al. epidermal growth factor receptor inhibition for the treat- ment of glioblastoma multiforme and other malignant brain tumours [j]. cancer treat rev, 2006, 32(2): 74-89.
[6] wu s j, ng l t. mapk inhibitors and pifithrin-alpha block cinnamaldehyde-induced apoptosis in human plc/prf/5 cells [j]. food chem toxicol, 2007, 45(12): 2446-2453.
[7] 黄海燕, 洪新雨, 陈阳, 等. 125i 诱导大鼠脑内胶质瘤凋亡实验研究 [j]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2006, 11(4): 171- 174.
细胞研究篇8
【关键词】 肝，人工；肝/细胞学；肝细胞株；永生化程序
0引言
肝细胞是生物人工肝支持系统的核心原材料，生物人工肝对肝衰竭患者的肝支持作用依赖于所用肝细胞的生物学功能. 无论是动物肝细胞还是人肝细胞，在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间有限、传代困难等缺点. 采用永生化程序建立肝细胞株就成为解决生物人工肝细胞来源的重要途径，而永生化的人肝细胞株则可为生物人工肝提供取之不尽的细胞源. 现就这一方面的研究进展综述如下.
1肿瘤来源的肝细胞株
肿瘤来源的肝细胞株是指由肿瘤组织分离、克隆而来的具有某些正常肝细胞功能的细胞株. 其中HepG2细胞具有某些类似于正常肝细胞的代谢解毒功能，但细胞的分化功能和分化程度均较低. Khalil等［1］发现，将HepG2细胞包裹于海藻酸珠内，形成内聚性球形集落后可培养20+d，其合成与解毒功能均显著加强，细胞增殖明显，活力显著增强，白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原等成倍增加，细胞色素P450活性显著高于单层培养(4倍以上)，雄烯二酮代谢的5种酶活性明显上调. 形态观察见HepG2细胞在海藻酸盐珠内增殖成内聚性集落，保持正常的细胞形态与结构. 最近，他们利用HepG2细胞(包裹于海藻酸珠内)构成的生物人工肝治疗兔肝衰竭模型，显示能有效地改善其肝衰系统参数(如舒张压、血氧饱和度等)［2］.
考虑到生物人工肝所用细胞材料的转化代谢功能较生物合成尤为重要，特别是在治疗肝性脑病中，去除血氨的作用更为关键. Omasa等［3］将构建的谷氨酰胺合成酶(GS)基因质粒导入无氨清除能力的HepG2细胞，用含甲硫氨酸亚枫(MSX)的培养液选择性培养，获得新的MSX抗性GSHepG2. 该细胞株的氨清除能力可达原代肝细胞的四分之一，若提供适量锌离子可使其氨清除能力进一步提高近50%. 并且可在循环流式反应器长期培养，细胞数量由107增至109，去氨能力大大增强［4］. GSHepG2细胞型生物人工肝可明显延长肝衰竭动物的存活时间，并可用于长期反复治疗［5］. 另外，Yang等［6］将连接蛋白32(Cx32)基因转染到HepG2细胞内，使新的细胞株之间的缝隙连接加强，同时也使其白蛋白分泌和氨清除能力提高2倍以上. Naiki等［7］利用腺病毒将肝细胞核因子4(HNF4)基因导入无氨清除能力的细胞. 在新的细胞中，细胞色素P450、谷氨酰胺合成酶、α抗膜蛋白酶、载脂蛋白等基因的表达增加，特别是其氨清除能力提高明显.
C3A细胞是从肝母细胞瘤分离获得的类似但分化程度高于HepG2的肝细胞株，在空心纤维生物反应器中接种2gC3A细胞，可在1周内增殖到200 g，并具有良好的肝细胞特异功能. 但与猪肝细胞相比，C3A细胞株的P450IA1活性、氨清除以及氨基酸代谢等均较低. Filippi等［8］研究显示，利用UoE培养基预处理的C3A后，能显著提高其尿素、白蛋白、葡萄糖等的合成以及半乳糖的清除能力. C3A是目前唯一用于人工肝临床研究的肝肿瘤细胞株，且己有10年之久，取得了较好的效果［9］，但至今未能进一步扩大应用，可能仍主要与安全考虑有关. 除了上述细胞外，肿瘤来源肝细胞还有HuH6， JHH2等，也开始了用于生物人工肝的基础研究［10］，二者均能高分泌AFP，白蛋白，表达鸟氨酸氨甲酰基转移酯mRNA和乙醇脱氢酶mRNA.
2病毒转染的肝细胞株
病毒转染是建立细胞株的常用方法之一，但所建细胞株的肿瘤性质较为突出. OUMS29是一株人胎肝细胞转染PSV3neo质粒获得的含有SV40LargeT肿瘤抗原(SV40Tag)的肝细胞株，表达许多特殊肝脏功能的基因，可明显降低血氨水平，改善肝性脑病，能够为急性肝衰竭模型动物提供代谢支持作用，提高短期生存率［11］. OUMS29细胞株移植入裸鼠并未显示恶性特征，无转移瘤形成，相比之下HepG2细胞可在2 wk内引起裸鼠多发性肿瘤，说明OUMS29细胞的恶性程度较低. 新近，Kobayashi等［12］为了使OUMS29细胞更接近于临床应用的要求，成功地通过逆转录病毒介导基因释放的方式，将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)自杀基因(suicide gene)转入OUMS29细胞，形成一种新的OUMS29/TK细胞，该细胞株具有高分化的肝细胞功能，在无血清培养基中生长良好，具有肝实质细胞的特征. 此外，采用MTT法检测发现该细胞对GCV(ganciclovir)的敏感度是OUMS29细胞的100倍. 作者认为OUMS29/TK细胞严格调控，具有无限活性，有可能用于生物人工肝.
尽管SV40Tag转染的肝细胞株能提高外科型急性肝衰竭鼠的存活率，能防治门腔静脉分流模型鼠血氨升高所致的肝性脑病，可纠正Gunn鼠胆红素结合缺陷. 但SV40Tag长期存在于永生化的肝细胞可增加移植受体肿瘤转移生长的危险性. 为克服这一缺陷，Cai等［13］对SV40Tag转染细胞株的建立方法进行了改进，建立了新的病毒转染肝细胞株CB8. 建株方法的第一步是将含SV40Tag单纯麻疹病毒胸昔激酶和潮霉素抗性基因侧面连接LoxP位点的重组SSR69逆转录病毒导入鼠肝细胞；第二步再用含有基因编码Cre重组酶的重组腺病毒(AdCre)，在特殊位点重组而将SV40Tag切除. 在第一步完成后，肝细胞得以永生化. 当SV40Tag被Cre重组酶切除后，细胞停止生长，DNA合成下降90%，多种肝特殊性mRNA表达出现或增多，形态和细胞极性表现出更多的分化肝细胞特征，在免疫严重缺陷鼠体内形成的肿瘤停止生长. 这种通过切割有害基因的办法，为肝细胞株的应用提供了新的安全保障.
Hep Z细胞株也是从肝活检标本中分离、经转染获得的人肝细胞株，该细胞株具有细胞色素P450活性等肝细胞特异性代谢功能，能永久传代且增殖能力强. 最近，Werner等［14］采用旋转培养系统和生物反应器分别对Hep Z细胞进行了大孔明胶型CultiSpher G微载体大量高密度培养，研究结果显示永生化的Hep Z细胞具有原始的肝细胞代谢功能，可大量培养，适用于生物人工肝系统.
3可恢复性肝细胞株
近年来，国外学者设计了一种可恢复性永生化程序，为解决细胞材料问题提供了新的思路及手段. 其基本原理实际上就是前述Cai等建立CB8细胞株的思路，即是先将永生化基因SV40T导入原代细胞以获得永生化细胞株，使其获得体外增殖能力，然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因，使细胞株恢复到永生化前的状态. 如Kobayashi等［15］对原代成人肝细胞进行可逆性永生化程序，建立了一株可恢复性的永生化肝细胞NKNT3(reverted NKNT3)，引起同行的极大关注，有可能为生物人工肝支持提供用之不竭的肝细胞材料［16］. NKNT3细胞很大程度上与CB8相似，系将连接有LoxP重组靶基因的SV40T逆转入正常原代人肝细胞而建立的，NKNT3细胞具有肝实质细胞的形态学特征，可表达SV40T，可在体外进行永生化培养. 尽管NKNT3细胞株也保持了表达肝脏代谢的关键基因(谷酰胺合成酶、GST等)，但当切除了SV40T基因后，上述基因的表达水平戏剧性地增加，而且也只有当SV40T切除后该细胞株的白蛋白、人血凝血因子ⅩmRNA才能检测出来. NKNT3细胞对SCID小鼠无致瘤作用. 经能表达Cre重组酶的复制缺陷重组腺病毒转导，NKNT3不再表达SV40T，且分化程度更高，核浆比及胞浆颗粒类似肝细胞. 动物实验己经显示将NKNT3细胞植入90%肝切除大鼠的脾脏可显著改善其生化指标与临床表现，残余肝叶增大并示明显肝再生，脾脏“肝化”，存活率达60%(空白对照组模型大鼠全部死亡). 他们在NKNT3细胞的基础上，将p21基因导入细胞内使细胞在GO/G1阻滞，进一步改善了肝细胞表型，提高了白蛋白和细胞色素P450的表达［17］. 同时，他们用几乎相同的方法构建了可恢复性人内皮细胞株HNNT2［18］和肝星型细胞株TWNTs， TWNT1和NKNT3细胞共同培养时可以加强NKNT3细胞的细胞素色P4503A4和2C9的表达［19］. 可恢复性NKNT3细胞良好的肝细胞功能和无致瘤及致病毒感染之虑，再加上可复性的肝非实质细胞株共同培养，将在今后生物人工肝中有着良好应用前景.
参考文献
［1］ Khalil M， ShariatPanbi A， Tootle R， et al. Human hepatocytes cell lines proliferating as cohesive spheroid colonies in alginate markedly upregulate beth synthetic and detoxificatory liver function ［J］. J Hepatol， 2001，297:68-77.
［2］ Rahman TM， Selden C， Khalil M， et al. Alginateencapsulated human hepatoblastoma cells in an extracorporeal perfusion system improve some systemic parameters of liver failure in a xenogeneic model ［J］. Artif Organs，2004，28(5):476-482.
［3］ Omasa T， Yamanaka M， Tanimura N， et al. Expression and amplification of glutamine synthetase gene endows HepG2 cells with ammoniametabolizing activity for bioartificial liver support system ［J］. Enzyme Microbial Technol， 2004，35:519-524.
［4］ Enosawa S， Miyashita T， Suzuki S， et al. Longterm culture of glutamine synthetasetransfected HepG2 cells in circulatory flow bioreactor for development of a bioartificial liver ［J］. Cell Transplant，2000，9:711-715.
［5］ Enosawa S， Miyashita T， Fujita Y， et al. In vivo estimation of bioartificial liver with recombinant HepG2 cells using pigs with ischemic liver failure ［J］. Cell Transplant，2001，10:429-433.
［6］ Yang J， Ichikawa A， Tsuchiya T. A novel function of connexin 32: Marked 6 enhancement of liver function in a hepatoma cell line ［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2003，18:307(1):80-85.
［7］ Naiki T， Nagaki M， Shidoji Y， et al. Functional activity of human hepatoma cells transfected with adenovirusmediated hepatocyte nuclear factor (HNF)4 gene ［J］. Cell Transplant， 2004，13(4):393-403.
［8］ Filippi C， keatch SA， Rangar D， et al. Hayes PC， Plevris JN. Improvement of C3A cell metabolism for usage in bioartificial liver support systems ［J］. J Hepatol， 2004，41(4):599-605.
［9］ Demetriou AA， Brown RS Jr， Busuttil RW， et al. Prospective，randomized，multicenter， controlled trial of a bioartificial liver in treating acute liver failure ［J］. Ann Surg， 2004，239(5):660-667; discussion 667-670.
［10］ Kobayashi N， Miyazaki M， Fukaya K， et al. Establishment of a highly differentiated immortalized human hepatocyte cell line as a source of function in the bioartificial liver ［J］. Transplant Proc， 2000，32:237-241.
［11］ Kobayashi N， Miyazaki M， Fukaya K， et al. Transplantation of highly differentiated immortalized human hepatocytes to treat acute liver failure［J］. Transplant， 2000，69:202-207.
［12］ Kobayashi H， Noguchi H， Watanabe T， et al. A tightly regulated immortalized human fetal hepatocyte cell line to develop a bioartificial liver ［J］. Transplant Proc， 2001，33:1948-1949.
［13］ Cai J， Ito M， Westermam KA， et al. Construction of a nontumorigenic rat hepatocyte cell line for transplantation: Reversal of hepatocyte immortalization by sitespecific excision of the SV40T antigen ［J］. J Hepatol， 2000，33:701-708.
［14］ Werner A， Duvar S， Muthing J， et al. Cultivation of immortalized human hepatocyte cell line HepZ on macroporous CultiSpher G microcarriers ［J］. Biotechnol Bioeng， 2000，68:59-70.
［15］ Kobayashi N， Fujiwara T， Westerman KA， et al. Prevention of acute liver failure in rats with reversibly immortalized human hepatocytes ［J］. Science， 2000，287:1258-1262.
［16］ Guha C， Chowdhury NR， Chowdhury JR. Reversibly immortalized human hepatocytes: An eternal fountain of liver support［J］? Hepatology， 2000，32:440-441.
［17］ Kunieda T， Kobayashi N， Sakaguchi M， et al. Transduction of immortalized human hepatocytes with p21 to enhance differentiated phenotypes［J］. Cell Transplant， 2002，11:421-428.
［18］ Noguchi H， Kobayashi N， Westerman KA， et al. Controlled expansion of human endothelial cells bv Cre/loxPbased reversible immortalization［J］. Hum Gene Ther， 2002，13:321-334.
［19］ Watanabe T， Shibata N， Westerman KA， et al. Establishment of immortalized activated hepatic stellate cells to develop bioartificial livers ［J］. Transplant， 2003，75:1873-1880.