时间：2023-10-12 06:33:48
【摘要】
目的建立鲜壁虎的高效液相色谱指纹图谱，探讨不同壁虎间的相似程度。方法采用高效液相色谱法分析鲜壁虎提取液中相关物质的保留时间和吸收强度，对6种壁虎样品共有峰峰面积进行聚类。结果选定的色谱条件给出了较好的保留时间分布和吸收强度，建立起鲜壁虎的hplc指纹图谱，聚类分析给出了相应结果。结论该hplc指纹图谱可用于鉴定鲜壁虎，壁虎所含化学成分的多寡等因素与其品种相关。
【关键词】 鲜无蹼壁虎 指纹图谱 高效液相色谱法 聚类分析
abstract：objectiveto establish an hplc fingerprint of fresh gekko, and to discuss the similarity among gekkos. methodsthe retention time and absorption intensity of extracts of gekko were determined by hplc,peak area of six kinds of gekko samples’mutual peaks were applied to grade by hierarchical cluster analysis. resultsbetter distribution of retention time and absorption intensity were shown under the given chromatographic condition, the hplc fingerprint was established and the result of hierarchical cluster analysis was got. conclusionthe fresh gekko can be identified effectively and the chemical constituents of different gekko are related to the kinds.
key words：fresh gekko; fingerprint; hplc; hierarchical cluster analysis
壁虎（gekko）属隶爬行纲有磷目蜥蜴亚目。我国现知有壁虎属动物11种［1］。其性味咸、寒，有小毒，能够祛风、定惊、散结、解毒，治中风瘫痪、历节风痛、风痰惊痫、瘰疬、恶疮、破伤风、痈疮、胃嗝气等症。 现代 医学认为壁虎对肿瘤、结核等疾病有确切疗效［2～5］。近年来对壁虎抗肿瘤作用的基础研究也有所报道［6，7］。笔者应用“壁虎散” 治疗 肺癌等肿瘤疗效显著，且副作用很小，是潜在的可开发利用的抗肿瘤中药品种。由于壁虎种类较多，它们体内所含的有效药物成分的种类及含量的多寡均会有所不同。为保证研究中所用壁虎的种属纯正，建立壁虎的高效液相色谱指纹图谱，用于对壁虎的鉴定具有重要的意义。
1 仪器与材料
1.1 仪器与试剂黄金系列通用ⅰ型高效液相色谱仪（126型泵，166型紫外-可见光检测器，gold软件；美国bechman公司）；ds-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）。色谱纯乙腈（美国tedia公司），分析纯95%乙醇。
1.2 药材实验所用壁虎的物种及来源见表1。壁虎均于9月从产地购买，并经当地药检所鉴定。表1 6种壁虎的种类及来源（略）
2 方法和结果
2.1 色谱条件层析柱：购自大连江申分离 科学 技术公司（瑞士 spherigel c18填料）， 4.6 mm×250 mm，5 μm粒度。流动相：a，亚沸水；b，乙腈。梯度洗脱：0～5 min，100% a，流速0.7ml/min ；5～ 6 min流速由0.7 ml/min升至1 ml/min；6～16 min，0～10% b；16～21 min，10～40% b；21～31 min，40 ～ 60% b；31～46 min，60～100% b；46～60 min，100% b。进样量10 μl；检测波长205 nm；室温。
2.2 供试品的制备购买秋季捕捉的活壁虎，随机选取14～15只（约50 g），在容器内放置72 h，以消化、排空壁虎体内的食物，蒸馏水清洗晾干后准确称重，置入95％酒精致死，用捣碎机粉碎匀浆（转速：10 000/ min），50 ml 95％酒精分两次涮洗捣碎机，合并涮洗液以浸泡匀浆后的壁虎，不时摇动，浸泡24 h后抽滤；滤渣用50 ml 95％酒精再次浸泡提取，抽滤；合并两次的提取液，定容于100 ml；置-2℃冰箱内保存；使用时，取一定量的样品液经0.45 μm微孔滤膜过滤；当其温度转变为室温后，以10 μl进样分析。
潍坊干壁虎的处理：将捕捉到的潍坊活壁虎按常规方法制成干品；取15只干壁虎，用100ml 95％酒精浸泡1 d（软化），用捣碎机粉碎匀浆（转速：10000 r·min-1），用原酒精液继续浸泡2 d，提取，抽滤；滤液经0.45μm微孔滤膜过滤，以10μl进样分析。
2.3 方法学考察
2.3.1 检测波长的确定由于业界对壁虎所含的有效药物成分尚无系统的研究和分析，其有效药物成分组成和结构尚不得而知，为了使壁虎乙醇提取液中所含有的物质能在紫外光检测波长下被最大限度地检出，宜选择短波长进行检测。在选用205，210，215，220 nm进行色谱分析后，对比所得色谱图发现：除色谱吸收的强度随波长增大而依次降低外，吸收峰的数量多寡无明显改变，据此而确定205 nm为色谱参数，用于色谱检测。
2.3.2 流动相及柱温的确定实验表明使用空调控制室温，在22～26℃的温度条件下，色谱峰的保留时间没有明显的变化，经5次在该温度范围内的测试，结果显示色谱峰的保留时间、峰高、峰面积数据的rsd均小于1.2%，在室温条件下的测试结果是可靠的。经采用不同的流动相梯度洗脱，方法中所述的梯度是最佳方案，尤其是方法开始的最初5 min以0.7 ml/min的流速进行洗脱可使保留时间较短（3～8 min）的物质得到较好的分离，满足测试的需要。
2.3.3 稳定性考察取鲜无蹼壁虎的乙醇溶液测试品分别在0，6，12，24，36，48 h不同时间进行测试，考察色谱峰保留时间与吸收强度的一致性，如图1中所标示的各指纹峰的保留时间与吸收强度的rsd均小于1.1%。
2.3.4 仪器精密度实验在空调的设定温度为24℃时，取测试品连续五次进样，图1中各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的rsd均小于0.6%。
2.3.5 重复性实验取壁虎分4次制作供试品，分别进样。结果显示各指纹峰的保留时间、峰高及峰面积的rsd均小于1.6%。
2.4 色谱图中选作指纹峰的保留时间区间范围的确定
2.4.1 壁虎95％酒精提取液的后续处理采用潍坊壁虎作抗肿瘤药用效果研究，匀浆后的壁虎用95％酒精连续浸泡提取5次，抽滤后，合并5次提取的抽滤液，在30℃下减压蒸馏浓缩，除去其中的乙醇，获得带黄色固体沉淀以及脂肪物的水液；添加一倍体积的蒸馏水后，水液经正己烷和二氯甲烷分别各萃取4次，得黄色水溶液。水溶液在30℃下减压蒸馏浓缩，冻干，得棕色浸膏状物。浸膏状物用95％酒精溶解，作硅胶柱层析，得各层析后样品。
2.4.2 各水溶性样品的抗肿瘤效果用各样品以mtt法对hepg2和ct-26肿瘤细胞作体外抑瘤率实验。其中棕色浸膏状物浓度为5 mg/ml时，抑瘤率最高可达37%，硅胶柱层析得到的4#样品，浓度为1 mg/ml时，抑瘤率最高可达49%，棕色浸膏状物对小鼠作体内抑瘤实验，通过肿瘤实体称重对比，抑瘤率可达63%。体内、外抑瘤实验均表明壁虎含活性较高的抗肿瘤有效药物成分。
2.4.3 确定指纹峰的保留时间区间范围通过上述各水溶性样品进行相同色谱条件下的色谱分析，发现各色谱图中的吸收峰的保留时间均在20 min以内，考虑到抗肿瘤有效成分是水溶性的（谢爽、王学美的研究也有同样的结论［6，7］），故将保留时间在20 min以内作为选取指纹峰的时间界限。
2.5 聚类分析为进行各种壁虎所含抗肿瘤成分的比较，对各壁虎色谱数据进行了聚类分析。聚类分析使用各壁虎保留时间在20 min以内共有的12个吸收峰，以每个壁虎的12个吸收峰的总面积除各吸收峰的峰面积，得到如表2所示的各吸收峰的相对峰面积，以此进行聚类分析。聚类分析使用spss统计软件，采用离差平方和法（ward’s method）及欧氏距离（euclidean distance）。表2 各壁虎共有吸收峰的相对峰面积（略）
2.6 结果
测试所得各壁虎的hplc色谱图，其中潍坊壁虎的色谱图如图1所示。
实验发现潍坊壁虎干品的色谱图（图2）与鲜品的有很大的差异，故鲜品的指纹图谱不适用于干品。
以各鲜壁虎色谱图中保留时间作标记的各吸收峰为指纹峰。取其中吸收强度最大的（保留时间分别为5.234，5.263，5.273，5.246，5.259，5.250）吸收峰为 参考 峰，确定其它指纹峰的相对保留时间和相对峰高，以归一化法（rai=ai/σai）确定各指纹峰的相对峰面积。由色谱中各指纹峰的相对保留时间、相对峰高及相对峰面积（ra），即可构建起样品的hplc指纹图谱。各鲜壁虎色谱图中吸收峰的保留时间见表3。表3 各壁虎hplc指纹峰的保留时间（略）
聚类分析所得的树状关系图见图3。
3 讨论
壁虎和乙醇的选择:为尽可能全面地研究分析壁虎体内所含物质的抗肿瘤活性，需要尽可能多地将壁虎所含物质提取出来。选用乙醇是考虑到乙醇与水的互溶性，选择鲜壁虎是因为鲜壁虎自身含水。在第一遍用乙醇浸泡壁虎匀浆物时，壁虎体内所含的水溶性好的物质可借助于壁虎体液与乙醇的互溶而被提取出来，当抽滤分离后，滤渣中含水甚少，再次用乙醇浸泡滤渣时，可保证其中脂溶性良好的物质也被提取出来。若对壁虎干品进行同样的处理，则干壁虎所含有的水溶性物质就不可能被很好地提取出来。从干、鲜壁虎的色谱图中可以看到，在梯度洗脱的前半段时间，干壁虎的吸收峰数少、吸收强度低，而在后半段时间内，干、鲜壁虎的吸收峰数基本相等，但干壁虎的吸收强度要显著大于鲜壁虎的。
关于壁虎的hplc色谱图：鲜壁虎的乙醇提取液中所含物质种类繁多，在某一特定色谱条件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好的分离，尽管在样品洗脱的初始阶段（前20min）吸收峰的分离状况不甚理想，峰的重叠相对较为严重；但色谱数据的稳定性良好，可以满足作为指纹图谱的需要。
关于相似度分析：仅从各壁虎在20 min以内的吸收峰的保留时间就可发现，在各吸收峰的保留时间序列中，各种壁虎均有峰的缺失。按时间序列，吸收峰的总数有20个，但六种壁虎的共有峰只有12个；因此从图谱的直观上就可以区分出不同的壁虎。为不同壁虎的鉴定提供了依据。
聚类分析的结果表明6种壁虎中，g.sw和g.a最为相似，相似度可达98.61%，当聚为五类时，两者为一类，其他壁虎各自为一类；当聚为四类时，g.sw和g.a为一类，g.h和g.j为第二类，g.su 和g.t各自为一类；当聚为两类时，g.sw、g.a、g.t和g.su为一类，而g.h和g.j为另一类。尽管在目前这12个共有峰尚未归属为某个确定的化合物，但随着研究的深入，各吸收峰的化合物名称及分子结构将一一确定；聚类分析将提供壁虎间相互替代的思路。
尚需解决的问题：拟通过后续的进一步分离纯化，以获得抗肿瘤活性成分的纯品及其抗肿瘤效果，并解决指纹图谱中各吸收峰的归属问题。
本文所介绍的壁虎hplc指纹图谱可用于壁虎的鉴定，聚类分析的结果给出了不同壁虎间的相似程度。
【参考 文献 】
【关键词】高效液相色谱；液相检验；医药分析
液相色谱法是一种以液体为流动相的色谱法，高效液相色谱法是现在应用十分广泛的一种液相色谱法，这种方法是20世纪60年代兴起的，经过不断的完善和发展，现已被应用于各个领域。在医药分析领域，液相检验的应用已经普及，而高效液相色谱法作为液相检验中的一种重要手段，也得到了大力的推广与应用，目前实验室最常用的P230高效液相色谱仪。
1高效液相色谱法及其系统构造
高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是以经典液相色谱法为基础，通过引入气相色谱理论而迅速发展起来的。区别于经典液相色谱法柱效低、时间长的特点，高效液相色谱法采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器等技术，因此其检测有高压、高速、高效、高灵敏度、检验速度快、分辨率高等特点，更适宜于分离、分析热稳定性差、高沸点、有生理活性及相对分子量比较大的物质。
HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、溶剂贮存器、检测器、检测数据记录器等组成。其中输液泵、色谱柱和检测器最为关键。制备型HPLC仪有馏分收集装置。新型HPLC仪增加了微机控制，可进行自动化仪器控制和数据处理。
输液泵性能的好坏直接影响分析结果的可靠性，好的输液泵应具备输出压力高，流量稳定、耐腐蚀，密封性能好，液缸容积小等特点；HPLC进样方式可分为：隔膜进样、阀进样、停流进样、自动进样，进样装置需要：密封性能好，重复性好，死体积小，对色谱系统的压力、流量影响小；色谱柱担负分离作用，是色谱系统的心脏，在选择色谱柱时要注意选择柱效高、选择性好，分析速度快的色谱柱；检测器是把洗脱液中组分的量转变为电信号，其要求线性范围宽、灵敏度高、重复性好、噪音低和适用范围广。
2高效液相色谱的原理及其在液相检验中的应用
2.1高效液相色谱的原理及分类高效液相色谱的原理主要依靠分离机制，其分离方法有多种，相应的分离机制也不同。根据分离机制的不同主要有四种基本类型色谱法：吸附色谱、分配色谱、分子排阻色谱及离子交换色谱法，其他还有胶束色谱法、化学键合色谱法及亲和色谱法等类别。在液相检验中，分离是核心，而色谱是一种分离分析手段。无论是那种分离方法，其分离原理都是一个物理过程，与液相层析的原理相似：将要检测分析的化合物通过进样器放入液相色谱仪，流动相携带着其流过色谱柱，由于不同物质在固定相上的保留时间不同出现的峰高或者峰面积定量以及出峰时间的不同而达到分离，从而或检测药物中不同成分的含量、或分析药效，或测定药物残留物杂质成分的浓度。
2.2药物含量检验中高效液相色谱的应用药物含量检验中定量分析的准确与否，关键在于检测器所产生的信号是否与被测样品的量始终呈一定的函数关系。高效液相色谱仪可使输出信号与样品量最好呈线性关系，这样进行定药物含量测定时既准确又方便。
例如，示差检测法就是用高效液相色谱测定多糖类药物，用电化学检测器检测高效的阴离子交换柱分离出多糖类药物，这种方法优于传统检验法，可直接对低浓度糖作定量分析，不需衍生和样品处理，在节约时间和资金的同时避免了有毒衍生试剂的使用。在检验中不同类型的糖（如单糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等）适用于不同的离子交换柱。
2.3药效检验中高效液相色谱的应用药物的治疗效果取决于人体对药物的吸收，与药物成分及其代谢物在血液中的浓度有关。随着现代药物的选择性越来越高，所服用的剂量越来越低，这就需要提高药效。现阶段药效临床试验中采用人肝组织，首选高效液相色谱法检测药性药效，对混合物中微量组分进行结构分析，可搭配固定相和流动相以达到最佳分离效果。
例如，用内标法检测血液中药物浓度的总量限度。内标法是高效液相色谱的一种常用测定方法。首选提取血液，然后根据规定的方法配制不含药物的溶液，注入到高效液相色谱仪中，记录为色谱图I，然后再配制含有药物的溶液，以相同的条件注样，记录为色谱图II。然后将图I与图II进行比较，则可以通过杂质峰确认杂质峰的面积，从而达到检验的效果。
2.4药物残留中高效液相色谱的应用通常药物在使用一段时间后在体内产生残留物会影响认得某些生理功能，也就是人们所说的食药三分毒，如何分析药物残留物成分，减少其引起的不必要危害，高效液相色谱法起到了重要的作用。质谱仪是完成药物代谢物毒性鉴定的主要工具，是制药工业中毒理学试验的基础。
3结束语
今后的医药分析检验研究中，我们可以应用高效液相色谱法不受试样挥发性限制等优点，结合其它的先进技术，如色谱――光谱联用、柱切换技术、傅立叶变换红外线吸收光谱联用等，不断提高高效液相色谱在液相检验中的应用。
参考文献
[1]张庆合.高效液相色谱实用手册[M].化学工业出版社,2008年.
[2]陈立仁.高效液相色谱基础与实践[M].科学出版社,2001年.
[3]于世林.高效液相色谱方法及应用（第二版）[M],化学工业出版社，2005年.
[4]董玉中，陈萍.高效液相色谱法测定芩连口服液中黄芩苷的含量[J].安徽医药，2005.9(1):38～39.
【关键词】尼扎替丁；反相高效液相色谱法
Determination of Nizatidine in Nizatidine Injection by RP-HPLC
LUO Yi.Hunan provincial people’s hospital,Changsha,410005,China
【Abstract】 Objective To establish a method for determining nizatidine in nizatidine injection by RP-HPLC.Methods The separation was performed on Hypersil ODS C18column,using acetonitrile-0．1 mol/Lammonium acetate soluttion(15:85)as mobile phase,the detection wavelengh of nizatidine was at 242 nm; the flow rate was at 1．0 ml/min.Results The linear range of nizatidine was 2．5-20．0 μg/ml,the average recovery of nizatidine was 100．13%(RSD=1．29%).Conclusion This method is found to be accurate,reliable and have good reproducibilities.It can be used for the determination of nizatidine in nizatidine injection.
【Key words】Nizatidine; RP-HPLC
尼扎替丁(Nizatidine,NTD)为一种新型的组胺H2受体拮抗的抗溃疡药,竞争性地与组胺H2受体相结合，可逆性地抑制其功能，从而抑制胃酸分泌。其原料药和胶囊剂为美国药典收载品种,临床上已用于治疗腐蚀性和溃疡性食管炎及与胃食管返流疾病相关的消化不良,不良反应轻,为法莫替丁等的换代产品[1]。尼扎替丁注射液在1993年由美国礼来公司以商品名Axid在美国上市销售,国内目前主要有仿制胶囊剂、片剂等口服剂型。无注射剂型获批上市销售，但目前国家药审中心已有数家申报，我们建立了反相液相色谱法测定尼扎替丁注射液含量，以期能为今后尼扎替丁注射液的应用提供参考。
1 仪器与试药
SHIMADZU LC-10Atvp型输液泵；SPD-10Avp型紫外检测器；HW-2000色谱工作站；TG328A分析天平(上海天平仪器厂)；HC-3C型台式精密酸度计(苏州华诚电力设备有限公司)；尼扎替丁对照品(含量为99．8%)由天津美通药业有限公司提供,尼扎替丁注射液(规格为4 ml∶100 mg,自制)。乙腈为色谱纯；醋酸铵、三乙胺、醋酸为分析纯；水为重蒸水。
2 方法与结果
2．1 色谱条件 色谱柱： Hypersil ODS C18(250 mm×4．6 mm，5 μm)(大连依利特)；流动相：乙腈-0．1 mol/L的醋酸铵溶液(15∶85,每100 ml中加0．6 ml的三乙胺，用醋酸调节pH至8．5)；检测波长：242 nm；流速：1．0 ml/min。在此条件下，样品中尼扎替丁与其对照品峰的保留时间基本一致，且分离良好，无其他干扰，见图1。
C( μg/ml)为横坐标，主峰面积A为纵坐标作标准曲线，得回归方程：A=317．4C+13．5(r=0．9999)。尼扎替丁在2．5~20．0 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
2．2．2 精密度试验 取浓度为10 μg/ml的尼扎替丁对照品溶液，连续进样6次，每次20 ml，记录色谱图，峰面积RSD值为0．89%，精密度良好。
2．2．3 稳定性试验 将浓度为10 μg/ml的尼扎替丁对照品溶液室温下放置，分别于0、2、4、6、8 h取样，测定峰面积值，RSD值为2．56%，稳定性良好。
2．2．4 重复性试验 将同一批号尼扎替丁注射液样品用流动相稀释为浓度约为10 μg/ml的尼扎替丁溶液六份，分别进样，峰面积RSD值为1．18%。
2．2．5 回收率试验 精密称取六份尼扎替丁原料药，每份约40 mg，置100 ml量瓶中，分别用不含尼扎替丁的处方量空白辅料溶液溶解定容，将上述溶液适量用流动相稀释成浓度约为10．0 μg/ml的溶液，分别进样20 ml，记录色谱图；另精密称取尼扎替丁对照品适量，用流动相溶解稀释制成10．0 μg/ml的溶液，作为对照品溶液，同法测定。根据加入量及测得量，计算回收率。
2．2．6 成品含量测定 取五个批号尼扎替丁注射液，将其稀释成浓度约为10．0 μg/ml的溶液，作为供试品溶液进样；另精密称取尼扎替丁对照品适量，用流动相溶解稀释制成10．0 μg/ml的溶液，作为对照品溶液进样。测得五个批号样品中尼扎替丁标示百分含量分别为100．35%、100．48%、100．07%、99．83%、101．02%。
3 讨论
美国药典24版采用反相梯度洗脱法测定尼扎替丁含量，国内有学者[2]将其方法改进为等度洗脱测定，尼扎替丁与相关物质有良好分离。也有报道[3]采用紫外分光光度法测定尼扎替丁含量。本方法在参阅相关文献基础上建立的反相高效液相色谱法测定尼扎替丁注射液中尼扎替丁含量准确可靠，重现性好，可为尼扎替丁相关制剂的质量控制提供参考。
参 考 文 献
［1］ 南天平,郭广炎,淡伯荣,等.新型H2受体阻滞剂尼扎替丁.国外医药-合成药生化药制剂分册,1990,11(3):162.
［2］ 张蓉琴,李铜铃,程强，等.尼扎替丁的含量及有关物质测定方法的改进.华西药学杂志，2004，19(3)：217-218.
【关键词】 糖尿病肾病
Reversedphase high performance liquid chromatography assay for determining 4 kinds of markers of diabetic nephropathy in urine
【Abstract】 AIM: To establish a new reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method for assay 4 kinds of nonproteinnitrogen markers of human diabetic nephropathy (DN)， creatine (Cr)， creatinine (Cn)， urea (U) and uric acid (Ua) in DN patients urines. METHODS: The urine samples were assayed by RPHPLC on C18 column (200 mm×4.6 mm， id 5 μm) at the ambient temperature and a wave length of 200 nm， using a 10 mmol/L pH 6.86 phosphate buffer ［consisted 30%(V/V) methanol］ as mobile phase with the flow rate of 0.9 mL/min. RESULTS: Baseline separation of the urine could be easily achieved in 5 min after a simple sample preparation. The method also displayed a high reproducibility (RSD values of retention time and peak area were no more than 3%) and the calibration curves showed good linearities in the range of 5-300 μmol/L， 10-200 μmol/L， 1-30 μmol/L， 10-1500 μmol/L for Cr， Cn， U and Ua respectively. CONCLUSION: This method has great potential for routine assay of clinical urine samples and monitoring DN early.
【Keywords】 reversed high performance liquid chromatography; diabetic nephropathy; nonprotein nitrogen; urine
【摘要】 目的：建立糖尿病患者尿液中与肾病相关的非蛋白氮代谢产物(肌酸、肌酐、尿素和尿酸)的反相高效液相色谱分离分析方法. 方法：采用Agilent C18（200 mm×4.6 mm， 内径5 μm）色谱柱，流动相含30％(体积比)甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸缓冲溶液，流速0.9 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温. 结果：在5 min内可对患者尿液中上述4种物质同时进行测定，样品前处理简单，重现性较好(迁移时间和峰面积的RSD均≤3%)，线性范围较宽（肌酸：5~300 μmol/L， 肌酐：10~200 μmol/L， 尿素：1~30 mmol/L， 尿酸：10~1500 μmol/L）. 结论：此法完全适用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.
【关键词】 反相高效液相色谱；糖尿病肾病；非蛋白氮；尿样
0引言
糖尿病并发肾病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病患者致死的重要原因之一，已引起了人们的广泛关注. 非蛋白氮代谢产物如肌酸(creatine， Cr)、肌酐(creatinine， Cn)、尿素(urea， U)和尿酸(uric acid， Ua)即是与DN相关的几种物质. 已报道的有关这些物质的分离分析方法主要有比色法［1］、酶法［2］、液相色谱法［3-6］、毛细管电泳法［7-9］等. 其中比色法和酶法通常只能测定单一的物质，而且尿液中的一些内源性物质对测定有干扰；液相色谱法则多集中在对某一种或部分物质的测定上；毛细管电泳测定这些标志物重现性有待于提高. 我们运用反相高效液相色谱法，对DN患者尿液中与DN相关的Cr， Cn， U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物进行同时分离检测. 同时测定尿液中的4种物质目前还未见报道. 此法具有快速、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.
1材料和方法
1.1材料Agilent 1100液相色谱仪（美国Agilent公司）；Cr，Cn，Ua均购自Sigma公司（USA，Sigma）；甲醇为色谱纯试剂（天津第二化学试剂厂）；其余试剂均为分析纯，水为二次重蒸水.
1.2方法
1.2.1色谱条件色谱柱为Agilent C18柱（200 mm×4.6 mm，内径5 μm），流动相含体积比为30%的甲醇和10 mmol/L，pH 6.86的磷酸缓冲溶液，等度洗脱，流速0.9 mL/min，检测波长200 nm，柱温为室温，进样量为10 μL.
1.2.2标准溶液的配置和尿样的处理方法Cr， Cn和U标准溶液均使用二次重蒸水配置成一定的浓度. Ua溶液的配置方法如下：取30 mg磷酸钾，溶解在40 mL重蒸水中，加热至60℃，使其完全溶解，精确称取Ua 28 mg，溶解于热磷酸钾溶液中，冷却至室温，移入100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，贮存在棕色瓶中保存. 尿液样品的处理方法：取新鲜的尿液用水稀释1倍后待用. 所有溶液每周更换1次，使用前均过0.45 μm的水相膜后再用于色谱分析.
2结果
2.1色谱条件的优化固定其它色谱条件不变，分别改变缓冲液的pH值、流动相（pH 6.86）中甲醇比例、流动相中缓冲液浓度和流动相的流速，考察了其对4种物质分离的影响. 四种物质的分离随pH、甲醇比例、磷酸缓冲液浓度和流动相的流速的变化情况分别如图1，2所示.
A：流动相pH；B：甲醇比例.
图1流动相pH和甲醇比例对几种标志物保留时间的影响（略）
A：磷酸缓冲液浓度；B：流速. R12: U和Cr之间的分离度; R23: Cr和Ua之间的分离度; R34: Ua和Cn之间的分离度.
图2流动相中磷酸缓冲液浓度以及流速对分离的影响（略）
2.2方法重现性在选定的色谱条件下，连续5次测定了同一样品，对各物质的迁移时间、峰面积和峰高的重现性进行了考察，结果表明，各物质的迁移时间的变化很小（保留时间的RSD值见表1），方法的重现性较好.
转贴于
2.3定量标准曲线、回收率以及最低检测限配置一系列浓度的标准溶液，按上述色谱条件进行分析测定，将所测的峰面积对物质的浓度作回归分析，其线性相关系数均大于0.9992；以信噪比(S/N)为3来测定检测限；添加已知量标样，测定其含量，计算方法的回收率(表1).
表1方法的相关参数（略）
2.4样品分析在选定的色谱条件下，对标准溶液和实际DN尿样进行了分析，5 min内4种物质即可达到完全分离，分离结果如图3所示，实际DN尿样中的4种物质得到了很好的检出，尿样里的其他物质对分析无干扰. 采用此法对某糖尿病患者以及正常人尿样中的Cn， Cr， U，Ua分别进行测定，结果糖尿病患者尿样中Cn， Cr， U，Ua的含量分别为10.3， 0.68， 26.7，2.1 μmol/mL， 正常人尿样中的Cn， U，Ua的含量分别为7.7， 36.7，1.0 μmol/mL，而Cr未被检出.
图3标准溶液(A)和尿样(B)的色谱图（略）
3讨论
3.1pH对分离的影响其从图1A中可以看出，在pH 3.5~7.5范围内U和Cr的出峰时间和顺序几乎不随pH的变化而变化；而对于Cn和Ua来说，其出峰时间和顺序都随pH的变化而变化，当pH接近5.5时，两者的出峰时间近乎相同，得不到分离. 因此，在选择最佳pH时，主要考虑Cn和Ua之间的分离度（Rs）以及分析的效率（分析周期短），最终选择缓冲能力最强，分离度较佳（Rs＝4.1）的pH 6.86为优化的分离pH.
3.2流动相中甲醇比例的选择从图1B中可以看出，随着流动相中甲醇比例的增加，各标志物的出峰时间随之减少，分离周期大大缩短，但与此同时各标志物间的分离度也相应减少，当流动相中甲醇的比例大于40％时，各物质几乎同时被洗脱出来，难以达到分离. 最终选择流动相中甲醇含量为30％为较佳的比例（此时分析周期较短，各物质间分离度均大于2.0）.
3.3流动相中缓冲液浓度对分离的影响从图2A中可以看出，随着缓冲液浓度的增加，各标志物的峰面积随之减小. 而缓冲液浓度为5和10 mmol/L时峰面积比较接近，最终选择缓冲能力较强的10 mmol/L为最佳缓冲液浓度.
3.4流速的优化从图2B中可以看出，当流速从0.4 mL/min增加到0.9 mL/min时，各物质间的分离度是逐渐增加的，并且分析周期变短；而当流速从0.9 mL/min增加到1.0 mL/min后，虽然分析效率有所提高（分离周期从4.8 min减少到4.0 min），但各物质间的分离度却有所减小（此时的柱压也过高：93.1 bar）. 最终选择0.9 mL/min为最佳流速.
3.5测定结果的分析从某糖尿病患者以及正常人尿样测定的结果可以看出，Cn，Cr和Ua在糖尿病患者尿样中的含量高于正常人（患者尿样中Cr的含量远远高于正常人尿液中Cr的含量）；而患者尿样中U的含量反而有所降低. 这些都说明患者肾功能已经出现异常，非蛋白氮代谢产物不能很好的排出体外（对Cr的排泄率增加，而U排泄率降低），这也从一个侧面证实了患者的肾脏已经有了一定程度的损坏.
传统的分析方法的干扰因素较多，分离效率和灵敏度较差，而采用的此法可在5 min内同时测定糖尿病肾病尿样中的Cn， Cr， U和Ua这4种非蛋白氮代谢产物. 此方法具有快速、需样量小、灵敏度高和重现性好的特点，完全可运用于临床上患者尿液的日常分析和早期肾病的监测.
参考文献
［1］ 朱忠勇，陈之航. 临床医学检验［M］. 上海：科学技术出版社，1982: 300-313.
［2］ 叶应妩，李健斋，王玉琛. 临床实验诊断学［M］. 北京：人民卫生出版社，1991: 416-430.
［3］ Jen JF， Hsiao SL， Liu KH. Simultaneous determination of uric acid and creatinine in urine by an ecofriendly solventfree high performance liquid chromatographic method［J］. Talanta， 2002， 58(4): 711-717.
［4］ Shingfield KJ， Offer NW. Simultaneous determination of purine metabolites， creatinine and pseudouridine in ruminant urine by reversedphase highperformance liquid chromatography ［J］. J Chromatogr B， 1999， 723(12): 81-94.
［5］ Yukio Y， Sohei H， Tomoko T， et al. Lowcapacity cationexchange chromatography of ultravioletabsorbing urinary basic metabolites using a reversedphase column coated with hexadecylsulfonate［J］. J Chromatogr A， 2000， 886(12): 297-302.
［6］ Mo Y， Dobberpuhl D， Dash AK. A simple HPLC method with pulsed EC detection for the analysis of creatine［J］. J Pharm Biomed Anal， 2003， 32(1):125-132.
［7］ Kong Y， Zheng N， Zhang ZC， et al. High performance capillary zone electrophoretic assay for markers of diabetic nephropathy in patients plasma and urine［J］. J Chromatogr A， 2003， 987(12): 477-483.
［8］ Clark EA， Fanguy JC， Henry CS. Highthroughput multianalyte screening for renal disease using capillary electrophoresis［J］. J Pharm Biomed Anal， 2001， 25(56): 795-801.
［9］ Lee HL， Chen SC. Microchip capillary electrophoresis with electrochemical detector for precolumn enzymatic analysis of glucose， creatinine， uric acid and ascorbic acid in urine and serum［J］. Talanta， 2004， 64(3): 750-757.
【关键词】五种皮质激素；高效液相色谱；含量测定
【中图分类号】R927.1 【文献标识码】A 文章编号：1004-7484（2012）-04-0610-01
醋酸肤轻松、醋酸去炎松、醋酸氟氢可的松、丙酸倍氯美松及氯氟舒松五种皮质激素软膏为治疗皮肤病的常用药。国内一般采用紫外－可见分光光度法分别测定吸光度，因为有基质干扰，含量偏高，且操作复杂，测定结果重现性差。其他方法收载的醋酸肤轻松软膏含量测定方法均不够理想，本人经过试验，采用高效液相色谱法较好，做了回收率试验，确立样品的含量测定。
1.仪器、试剂及样品
岛津UV-2100型高效液相色谱仪，紫外检测器，检测波长：240nm，柱温：30℃；填料用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Diamonsil C185u200×4.6mm柱；甲醇、乙醚为色谱纯规格；醋酸肤轻松、醋酸去炎松、醋酸氟氢可的松、丙酸倍氯美松及氯氟舒松五种皮质激素对照品及内标物醋酸地塞米松、炔诺酮均符合规定，内标物甲基素及黄体酮为中国药品生物制品检定所提供的标准品；供试品均为市售品。
2.分析条件确定
2.1 取醋酸肤轻松、醋酸去炎松、醋酸氟氢可的松、丙酸倍氯美松及氯氟舒松五种皮质激素的甲醇溶液（浓度为50ug／ml），进样量为10ul，流速为1.0ml／min，以不同比例的甲醇－水为流动相，考察各自的保留时间，计算容量因子（K）。
通过实验结果，表明分离醋酸肤轻松、醋酸去炎松和醋酸氟氢可的松这三种皮质激素它们适宜的甲醇浓度为60～70%，而分离丙酸倍氯美松及氯氟舒松这两种皮质激素它们适宜的甲醇浓度为75%左右为好，这样它们的容量因子均能在2～8之间。
2.2 有文献报导在反相HPLC分离甾体激素时，在流动相中加少量乙醚作为有机改性剂，可提高化合物的分离灵敏度。实验证明在流动相中加少量乙醚能使醋酸肤轻松、醋酸去炎松及内标物的保留时间提前，峰形尖锐并提高了分离度。
2.3 峰面积与浓度的线性关。精密称取醋酸肤轻松、醋酸去炎松、醋酸氟氢可的松、丙酸倍氯美松及氯氟舒松这五种皮质激素的对照品与内标物适量，用甲醇制备对照品溶液、内标溶液与测定溶液，按选定的色谱条件进样10ul，从所得的色谱图，以被测皮质激素对内标物的峰面积比为纵坐标，以相应的浓度为横坐标作校正曲线图谱，均得到能过零点的直线，其数据经直线回归，线性关系及精度较好。
2.3.1 对照品溶液的制备。精密称取醋酸肤轻松、醋酸去炎松、醋酸氟氢可的松、丙酸倍氯美松及氯氟舒松对照品25mg，置200ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。
2.3.2 内标溶液的制备。精密称取内标物炔诺酮10mg、醋酸地塞米松30mg、甲基素12.5mg、黄体酮15mg各置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。
2.3.3 测定溶液。精密量取5种对照品溶液各1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别置10ml量瓶中，各分别加内标溶液1ml（醋酸肤轻松、醋酸去炎松加炔诺酮内标溶液，醋酸氟氢可的松加醋酸地塞米松内标溶液，丙酸倍氯美松加甲基素内标溶液，氯氟舒松加黄体酮内标溶液）加甲醇稀释至刻度。
3.回收率测定
称取按处方制得的空白基质5g，精密加对照品溶液10ml，搅匀，加甲醇适量，置80℃水浴中加热2分钟，使软膏熔融，精密加内标溶液5ml，放冷至室温后，用甲醇稀释使成50ml，摇匀，置冰浴中冷却2小时，取出后迅速滤过，量取续滤液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。按内标法以峰面积计算，色谱条件同上面所述。根据以上同体积对照品溶液在相同色谱条件下测得的校正因子计算回收率。5种对照品所得回收率分别为101.8%、100.4%、99.89%、101.0%、99.82%。
4.重复性试验
取市售各种软膏，精密称取约相当于皮质激系1.25mg，置50ml量瓶中，加甲醇约30ml，置80℃水浴中加热2分钟，操作及色谱条件同上。平行操作5份样品，RSD值为1.2%。
5.样品的含量测定
样品操作及测定方法同重复性试验，另按照提取法测定样品。其结果分别为：醋酸肤轻松：HPLC法：95.37%，提取法101.65%；醋酸去炎松：HPLC法：96.00%，提取法97.10%；醋酸氟氢可的松：HPLC法：99.68%，提取法100.60%；丙酸倍氯美松：HPLC法：98.02%，提取法100.50%；氯氟舒松：HPLC法：98.25%，提取法99.92%。
6.结果与讨论
本文采用高效液相色谱法测定醋酸肤轻松、醋酸去炎松、醋酸氟氢可的松、丙酸倍氯美松及氯氟舒松五种皮质激素软膏的含量，经反复试验，本法与提取法所得结果基本一致，且操作简单，所用试剂方便易得，应用HPLC法可有效分离这五种成分，所以认为此法较好。
参考文献
［1］ 《药物分析杂志》，1982.
［2］ 药学学报，1983.
关键词：氟康唑 HPLC 含量测定
氟康唑（Fluconazole）为新型的氟化三唑类广谱抗真菌药，对隐球菌、念珠菌和皮肤真菌具有良好的抗菌作用，其作用比酮康唑强10～20倍，是目前临床用于深、浅部真菌感染理想的药物。本文探讨了用高效液相色谱法测定氟康唑的含量。该法简便、准确，重现性好。
一、仪器与试剂
1.日本岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪HW-2000色谱工作站
2.试剂：磷酸二氢钾（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、甲醇（色谱纯）、纯化水、氟康唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100314-0101，含量100.0%）、氟康唑（民生药业集团绍光医药有限公司）
二、方法与结果
1.色谱条件
色谱柱为迪马公司生产的Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为pH7.0磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.8g，加水适量溶解，加0.1mol/L氢氧化钠溶液约291ml，调节pH至7.0，用水稀释至1000ml，混匀，即得）-甲醇（55：45）为流动相； 检测波长260nm；流速为1.0ml/min；超声脱气20min；柱温为室温；进样量20μl。
2.对照品溶液的制备
精密称取氟康唑对照品20.02mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.线性关系考察
精密称取氟康唑对照品适量，至50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，再分别精密量取适量，用水配制成100、150、200、250、300μg/ml的标准溶液，分别进样20μl。以色谱峰面积为纵坐标（Y），氟康唑含量为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程为Y=1421X+93，r=0.9998（n=5）。结果表明氟康唑在100-300μg/ml范围内呈现良好线性关系。
4.供试品溶液的制备
精密称取氟康唑20.01mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
5.精密度试验
精密吸取对照品溶液，连续进样5次，记录峰面积的平均值为284296，计算RSD为0.62%。
6.稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液20μl，分别在0、2、4、6、8小时进样测定，记录峰面积平均值为280176，计算RSD为0.65%。表明供试品溶液以流动相为溶剂在8小时内稳定。
7.重复性试验
取同一批样品，精密称取5份，按上述方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定氟康唑含量，结果平均含量为98.73%，其RSD=0.75%。
8.回收率试验
精密称取氟康唑对照品20.01mg，置100ml量瓶中，按供试品溶液的方法制备，按上述色谱条件测定，平均回收率为100.15%，RSD=0.98%。
9.样品的测定
取样品3批，分别照含量测定法下的规定进行测定，并与非水溶液电位滴定法进行对比，结果见表1。
三、讨论
原产品质量标准中是用非水溶液电位测定法测定含量，为严格控制产品质量，保证药品生产投料含量计算的准确性，建议用HPLC法测定。该方法简便可靠、精密度高、分离效果较好，对于控制氟康唑含量有一定意义。
参考文献
【摘要】 【目的】建立丹参药材中水溶性成分丹酚酸类和脂溶性成分丹参酮类的超高效液相(uplc)指纹图谱方法，为丹参的质量控制提供快速、科学的方法。【方法】以acquity c18 beh(2?1 mm×100 mm，1?7 μm)色谱柱，乙腈(a)?体积分数0?4%甲酸溶液(b)梯度洗脱，90%~50%a，0~10 min;75%a，15 min。检测波长280 nm，柱温30℃，流速0?5 ml/min。【结果】在15min内得到丹参药材水溶性和脂溶性成分的指纹图谱，峰容量85。并采用液质连用技术(hplc?dad?esi/msn) 鉴定了其中的20个特征峰。【结论】uplc指纹图谱方法具有灵敏、快速、简便、准确等特点，适合于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制。
【关键词】 丹参/化学;丹酚酸类/分析;丹参酮类/分析;指纹图谱;色谱法，超高效液相;液质连用
丹参是我国应用最广泛的中药品种之一，临床上有很好的疗效，以丹参作为原料药或君药的单一或复方制剂种类繁多。丹参药材指纹图谱的研究主要集中在分别研究丹参的水溶性成分和脂溶性成分指纹图谱[1-6]，这些方法基本均是将水溶性与脂溶性成分分开，分别建立指纹图谱。作为一种药材中的两大类成分，若能将两者结合起来，在同一张谱图上得到表征，直观地比较其化学成分的差异，将是一项十分有益的工作。目前也有一些报道采用高效液相色谱—二极管阵列检测器(hplc?dad)或高效液相色谱—质谱检测器(hplc?ms)连用的方法建立同时表征丹参药材中水溶性与脂溶性成分的指纹图谱，但是采用hplc 技术，尚难以兼顾和保证两类成分都具有良好的分离度，而且耗时较长。因此，本课题组尝试采用快速色谱技术——超高效液相色谱(uplc)建立丹参的指纹图谱，现报道如下。
1材料与试剂
1?1实验材料共收集了12个省、市(区)的丹参商品药材13份(表1)。药材经上海中医药大学中药研究所吴立宏博士鉴定为唇形科植物salvia miltiorrhiza bge.的干燥根茎。
1?2仪器与试药waters acquity uplctm超高效液相色谱仪，包括acquity binary solvent module 二元可选四溶剂高压梯度泵，含在线真空脱气机、acquity sampler module 低扩散自动进样器、acquity tuv detector高速紫外检测器及empower ii色谱管理软件(milford，boston，ma，usa)。milli?q system超纯水制备器(millipore，bedford，ma，usa)，kq?250db数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，bp211d型电子天平(satorius co.ltd.，德国)。甲醇、乙醇、甲酸均为分析纯(上海国药集团试剂有限公司)，乙腈为色谱纯(merck公司)，超纯水为milli?q处理水(millipore co.)。对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、二氢丹参酮i、丹参酮i、隐丹参酮和丹参酮iia均由上海中药标准化研究中心提供。
2方法与结果
2?1 色谱条件与质谱参数
2?1?1超高效液相色谱条件 acquity c18 beh(2?1 mm×100 mm，1?7 μm)色谱柱，乙腈(a)-体积分数0?4%甲酸溶液(b)梯度洗脱，90%~50%a，0～10 min;75%a，15 min。检测波长280 nm，柱温30℃，流速0?5 ml/min，进样量2 μl，运行时间15 min。表1不同产地丹参药材
2?1?2超高效液相色谱—质谱连用(lc?ms)条件 流动相为乙腈(a)—体积分数0?4%甲酸溶液(b)，洗脱程序与上述条件相同。柱后分流，分流比为1∶50，进样量10 μl，柱温30℃，电喷雾离子源(esi)，源电压-3?2 kv，负离子模式，雾化气(gas1)：2?33 pa，帘气(cur)：16 psi，去簇电势(dp)：-20v，聚焦电势(fp)：-80 v，去簇电势2(dp2)：-20 v。质谱扫描质量范围质荷比(m/z)100～800。
2?2样品溶液和标准品溶液的制备
2?2?1样品溶液的制备取丹参粉末0?5 g(过40目筛)，精密称定，精密加入体积分数10%甲醇20 ml，浸泡30 min后，超声提取30 min，放冷，3 000 r/min离心10 min，取上清液5 ml置25 ml量瓶中。残渣加甲醇20 ml，浸泡30 min后，超声提取60 min，放冷，3 000 r/min离心10 min，取上清液将上述25 ml量瓶补足至刻度，即得。
2?2?2标准品溶液的制备取对照品丹参素钠、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、二氢丹参酮i、丹参酮i、隐丹参酮、丹参酮iia适量，精密称定，置同一容量瓶中，用甲醇溶解，制成含上述对照品102、126、113、106、137、118、762、100、114、122、119 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
2?3方法学考察
2?3?1精密度实验取同一份供试品溶液，连续进样5次测定，以丹酚酸b为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积sr值，均小于3%。说明仪器精密度良好。
2?3?2稳定性实验取同一份供试品溶液，分别于1、3、5、7、9、12、24、48 h进样测定，以丹酚酸b峰为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积sr值，均小于3%，说明样品溶液在48 h内稳定。
2?3?3重复性实验同一样品粉末分别精密称取5份，按照上述样品制备方法制成供试品溶液，进样检测。以丹酚酸b峰为参照峰，分别计算色谱中20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的sr值，均小于3%。说明该方法的重复性良好。
2?4结果与分析
2?4?1丹参高效液相指纹图谱主要色谱峰的lc?ms鉴定以13个产地丹参药材的共有模式作为丹参药材的指纹图谱(图1)。在该指纹图谱中，20个色谱峰被选为特征峰。通过与对照品比较相对保留时间(tr)，紫外光谱(uv)和液相色谱—质谱联用(lc?ms)质谱数据(见表2)，结合对照品和文献[7-12]对照，确定了19个色谱峰的归属为1号峰丹参素，2号峰原儿茶醛，3号峰咖啡酸，4号峰丹酚酸d，5号峰丹酚酸g，6号峰丹酚酸e，7号峰丹酚酸c，9号峰迷迭香酸，10号峰紫草酸，11号峰丹酚酸b，12号峰丹酚酸a，13号峰异丹参酮iia，14号峰羟基丹参酮iia，15号峰丹参新醌a，16号峰丹参酮iib，17号峰二氢丹参酮i，18号峰隐丹参酮，19号峰丹参酮i，20号峰丹参酮iia。11号峰(丹酚酸b)既是该指纹图谱中的最强峰，又是有效成分。故以其为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间(tr)和相对峰面积(arp)，结果见表3。表2丹参药材中化学成分质谱数据及鉴定表313批不同产地药材中20个特征峰的相对峰面积值
2?4?2丹参药材uplc指纹图谱分析采用上述已建立的指纹图谱方法，对13批丹参药材进行指纹图谱分析，得不同产地丹参药材指纹图谱，结果见图2(彩图页第616页)。为了说明丹参药材之间的差异，引入总差异率ptd(%)的概念。差异率的定义是以每个特征指纹峰与相应的标准特征指纹峰的面积归一化值间的差与标准特征指纹峰面积归一化值的比值来表示两者间的差异程度，总差异率则是将每个特征指纹峰的差异率求和即得。计算公式：
ptd=σnias′-ai′as′×n
其中，ptd 为总差异率，as′为标准特征峰面积归一化值，ai′为待比较药材特征峰的面积归一化值，n为特征峰个数。以ptd代表样品图谱与标准图谱之间的相似度，当ptd>1时，表明待测样品与标准样品之间差异较大，说明待测样品有可能非欲鉴定品种。当ptd<1时，值越小说明待测样品与标准样品越相似。
在本实验中，选取13批丹参药材样品的特征峰面积归一化值的平均值作为标准特征峰面积归一化值(表4)，结果显示：(1)这些丹参药材的化学成分的分布具有相似性，每批药材被检测的色谱峰的数目几乎相等。(2)丹酚酸b的色谱峰占非常高的比例，最高达63?13%，最低有35?98%，说明该化合物是药材中主要成分之一。(3)水溶性成分中，丹参素的含量均较低，脂溶性成分以5个色谱峰为主(平均占总脂溶性成分的80%以上)。(4)就每一个化学成分来说，药材之间的相互差异比较大，13批药材统计处理，所有成分的sr均在20%以上。(5) 根据ptd值来看，13个产地或收集地的丹参药材ptd值均小于1，说明13个样品与标准样品之间的相似度均较高。表4不同产地13批丹参药材指纹图谱共有峰面积归一化值
3讨论
丹参中的两大类化学成分极性差异较大，文献报道显示采用hplc对这两类成分进行指纹图谱分析，通常耗费时间长而且色谱峰之间并不能达到理想的分离度，较难在一张图谱上直观地比较这两种成分之间的差异[1-6]。本课题在大量实验的基础上优选出合适的uplc色谱条件，建立丹参的指纹图谱，只需运行15min就可以将丹参的水溶性与脂溶性成分在同一张色谱图上表征，且色谱峰之间有较好的分离度，达到了高分离度兼顾快速的目的，适合于大量复杂样品的分析。
中药的指纹图谱研究中，hplc法是最常用的分析技术，但是对于一些复杂体系如中药的指纹图谱研究，hplc相对来说也是一种慢速技术，由于中药中所含化学组分多，化学差异较大，为保证目标组分的分离度，需要较长的运行时间，有时也可得到理想的色谱参数如分离度、对称因子和容量因子等。如何在得到理想的色谱参数的情况下，尽可能地缩短分析时间是科研人员比较关注的问题。uplc的色谱柱采用了1?7μm的小颗粒填料，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量，能显著提高分离的效率从而达到缩短分析时间的目的。
本实验中采用了uplc技术建立丹参药材的指纹图谱。结果显示，在15min中内即可获得丹参水溶性成分和脂溶性成分的指纹信息。丹参药材的uplc指纹图谱与hplc指纹图谱比较，色谱峰的个数、整体分布和峰形基本一致，但增加了最难分离物质对的分离度，增加了峰容量，减少了分析时间，说明uplc比hplc的分离能力强。
uplc与hplc具有相同的分离原理，因此uplc色谱条件在hplc条件的基础上稍加优化即可得到理想的色谱图结果。本实验根据上述uplc的色谱条件获得了丹参药材及其制剂的指纹图谱，且与hplc色谱指纹图谱一致的结果，因此，采用uplc 指纹图谱方法具有灵敏、快速、简便、准确等特点，适用于丹参药材及其制剂的指纹图谱研究和质量控制，值得推广和应用。
【参考文献】
[1]宋敏，杭太俊，张正行.丹参水溶性成分hplc指纹图谱指纹对照品对照法的研究[j].中草药，2005，36(3): 360.
[2]周欣，王道平，梁光义，等.丹参药材水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱研究[j].色谱，2005，23(3): 292.
[3]夏广萍，潘勤，程英莹，等.中江产丹参药材的指纹图谱研究[j].中草药，2004，35(9): 1009.
[4]黎琼红，张国刚，徐世义，等.丹参药材脂溶性成分的hplc指纹图谱[j].沈阳药科大学学报，2006，23(1): 22.
[5]金樟照，祝明，张文婷，等.不同产地丹参水溶性成分和脂溶性成分指纹图谱测定及相关性研究[j].中草药，2004，35(10): 801.
[6]张尊建，李茜，王伟，等.丹参及丹参注射液指纹图谱的hplc?ms研究[j].中草药，2002，33(12): 1074.
[7]zhao y，chen b，yao s z.simultaneous determination of abietane?type diterpenes，flavonolignans and phenolic compounds in compound preparations of silybum marianum and salvia miltiorrhiza by hplc?dad?esi?ms [j].j pharma biomed anal，2005，38(3): 564.
[8]li x c，yu c，cai y b，et al.simultaneous determination of six phenolic constituents of danshen in human serum using liquid chromatography/tandem mass spectrometry [j].j chromatogr b，2005，820 (1-2): 41.
[9]zhang j l，cui m，he y，et al.chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of danshen injection by hplc?uv and hplc?ms methods [j].j pharma biomed anal，2005，36(5):1029.
[10]jiang r w，lau k m，hon p m，et al.chemistry and biological activities of caffeic acid derivative from salvia miltiorrhiza[j].current medicinal chemistry，2005，12(1): 237.
[11]hu p，liang q l，luo g a，et al.multi?component hplc fingerprinting of radix salviae miltiorrhizae and its lc?ms?ms identification [j].chem pharm bull，2005，53(6): 677.
【关键词】 柴芩清肝汤;高效液相色谱;指纹图谱
柴芩清肝汤的原方是由柴胡、黄芩、白芍、甘草等制成的中药制剂，经多年的临床实践证明，其对慢性肝炎等疾病有较好的疗效。该方剂是集中医理论、现代研究和临床经验为一体的良好组合，具有疏肝解郁、消热解毒之功效。由于中药复方成分复杂，仅对某个成分进行定性、定量分析并不能有效控制其质量，中药指纹图谱作为目前公认的中药和天然药物质量控制的有效手段，其研究着眼于对象的宏观特征及内在规律，具有整体性和模糊性等基本特点，符合中药药效模式[1，2]。本实验运用HPLC法对柴芩清肝汤进行研究，确立其色谱条件，建立指纹图谱共有模式，从而从整体上控制柴芩清肝汤的质量。
1仪器与试药
Waters600-2487型高效液相色谱仪 Empower色谱工作站(美国.沃特斯公司);AG 135型电子天平(瑞士METTLER-TOLEDO公司);KQ-300VDE型双频数控超声泼清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。柴胡、黄芩等药材均购于哈尔滨市宝丰大药堂，经检验符合《中国药典》规定。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱为Diamonsil C18(5 μm， 250 mm×4.6 mm)，保护柱为Diamonsil C18;流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，见表1;流速1.0 ml/min; 柱温25℃;检测波长230 nm;进样量10 μl。
2.2对照品溶液的制备取黄芩苷、芍药苷和甘草苷各5 mg，精密称定，分别置5 ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解，定容，即得。
2.3供试品溶液的制备取柴胡、黄芩、白芍、甘草药材，制成柴芩清肝汤[3]。经冷冻干燥制成冻干粉。同法制备10批冻干粉。精密称取冻干粉0.5 g， 置25 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理30 min，放凉，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。同法制得10批冻干粉的供试品溶液。表1梯度洗脱程序
2.4参照峰的选择黄芩苷为本方有效成分之一，在HPLC图谱中峰面积较大，出峰时间适中且稳定，故选择黄芩苷为参照峰[4]。
2.5方法学考察
2.5.1精密度实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，连续进样5次，记录指纹图谱。以13号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.5%以下， 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。表明进样方法和仪器精密度良好。
2.5.2稳定性实验精密吸取同一供试品溶液10 μl，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样，记录指纹图谱。以13号峰黄芩苷为参照峰，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.6%以下， 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。表明样品溶液在24 h内稳定。
2.5.3重复性实验取同一批样品5份，按供试品制备方法进行制备，记录指纹图谱。结果，各共有色谱峰保留时间的RSD值均在0.6%以下， 各共有色谱峰相对峰面积间的RSD值均在5.0%以下。样品处理方法重复性良好。
2.6指纹图谱的建立将各供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定各样品的HPLC指纹图谱，见图1。经比较分析，确定19个色谱峰为柴芩清肝汤的共有峰，见图2。通过与药材指纹图谱的比较，对各峰进行了归属，其中1~5号峰来自白芍;6，7，10，13~20号峰来自黄芩;9号峰来自甘草。8号峰为白芍，黄芩，甘草共有;11号峰为白芍，甘草共有;12号峰为甘草，黄芩共有。通过与对照品比较，确定5号峰为芍药苷，9号峰为甘草苷，13号峰为黄芩苷。图1柴芩清肝汤10批样品的HPLC指纹图谱
2.7指纹图谱相似度分析指纹图谱相似度分析的目标在于通过对指纹图谱进行整体上的分析，来达到评价样品质量是否一致的目的[5]。本实验运用了国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A)进行色谱匹配，计算相似度，结果10批样品的相似度分别为：0.927，0.904，0.900，0.903，0.904，0.904，0.942，0.940，0.939 ，0.933，均在0.9以上。图2柴芩清肝汤共有模式HPLC指纹图谱
3讨论
实验比较了甲醇-不同浓度磷酸水体系、乙腈-不同浓度磷酸水体系，实验结果表明乙腈-0.1%磷酸水体系较好，基线漂移小，出峰数目多，峰分离情况比较理想。在此基础上，调整乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱的比例关系，最终确定了色谱洗脱条件。分别考察了210，230，254，280 nm波长进行指纹图谱的直观比较，结果230 nm波长检测所得的图谱基线比较稳，分离较好，峰数较多，故选择230 nm为测定波长。相似度评价是指纹图谱研究的一个重要组成部分，所建立的柴芩清肝汤HPLC指纹图谱中，共有19个共有特征(指纹)峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积较稳定，所建立的方法有较好的重复性，精密度和稳定性，为柴芩清肝汤的质量控制以及衡量其质量的优化提供了科学依据[6]。
方中柴胡具有解表和里、疏肝解郁、升举阳气等功效，其中皂苷类成分被认为是其主要的药效成分。但是柴胡皂苷类成分只在紫外末端(203~210 nm)有较弱的吸收[7～9]，因此，在中药复方这个复杂的化学背景下，难以实现对柴胡皂苷类成分的检测，有待于下一步利用蒸发光散射检测法进行分析。
参考文献
[1]谢培山.中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用[J].中国中药杂志， 2001， 26(10): 653.
[2]Gong F， Liang YZ， Xie PS， et al. Information theory applied to
chromatographic fingerprint of herbal medicine for quality control[J]. J Chromatogr A， 2003，1002(1-2): 25.
[3]闫广利，付克，吴君剑.柴芩清肝胶囊提取工艺研究[J].中医药信息，2008，25(2)：52.
[4]王欣之，文红梅，居玲玲，等.玉屏风散醇提部位HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2009，31(3)：335.
[5]鄢燕，汤宏敏，饶毅，等.血府逐瘀口服液的高效液相色谱指纹图谱研究[J].中草药，2009，40(4)：566.
[6]王桂红，吴杰，聂华，等.霉茶缓释片的高效液相色谱指纹图谱的研究[J].时珍国医国药，2009，20(6)：1441.
[7]余菁，梁卫青.高效液相法测定不同产地柴胡药材中柴胡皂苷a、d 的含量[J].浙江中医药大学学报，2007 ，31(3) ：374.
[8]肖蓉，王春英，张志雯，等.河北道地药材北柴胡HPLC-UC指纹图谱研究[J].中药材， 2006，29(2)：119.