细胞生物学特性范文
时间：2023-12-07 17:32:53
细胞生物学特性篇1
【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体
Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line
【Abstract】 AIM: To establish an immortalized human fetal hepatocyte line and to study its biological characteristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morphologic and functional detection. RESULTS: One of the hepatocyte clones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat was 31.2%. The immortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the transformed cell genome. CONCLUSION: The immortalized human fetal hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes， and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.
【Keywords】 immortalized; hepatocytes; cell line; characterization; SV40; liposomes
【摘要】 目的: 构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果： 经G418 700～300 mg/L筛选，40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论： 新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.
【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体
【中图号】 R512.6
0引言
原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命. 研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择［1-5］. 而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择. 从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.
1材料和方法
1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 14～28 wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；DMSO及秋水仙素为Sigma公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.
1.2方法
1.2.1重组质粒的构建及鉴定提取含SV40LargeT的pcD2质粒，限制性内切酶BamHⅠ单酶切，10 g/L琼脂糖电泳. 回收含目的DNA片段的凝胶，纯化后用T4 DNA连接酶与pcDNA3.1空载体进行连接. 制备感受态细胞并提取重组质粒. 用限制性内切酶BamHⅠ进行酶切，10 g/L琼脂糖电泳鉴定.
1.2.2胚胎肝细胞的分离培养及转染取引产死胎儿置无菌托盘中，常规消毒铺单后打开腹腔，显露游离门静脉后插管，用DHanks液（含0.01 g/L EDTA，37℃，pH 7.4，通以含950 mL/L O2及50 mL/L CO2的混和气体）以20 mL/min的速度灌入，随后于下腔静脉插管放出积血积液，并剪开胸腔，夹闭上腔静脉. 灌注5 min至肝脏变色后改为含0.05 g/L胶原酶的Hanks液（37℃，pH 7.4，通以含950 mL/L O2，50 mL/L CO2的混合气体）持续灌注5 min. 取下肝脏，置于含4℃ Hanks液的平皿中，剪开肝被膜，疏下肝细胞，以单层无菌纱布过滤，制成混合细胞悬液，以100目及200目筛网过滤，500 r/min清洗离心3次，每次2 min，弃上清，以4℃ Hanks液重悬，台盼蓝（Trypan Blue）染色判断细胞活率，肝细胞活率>90％时，计数制成肝细胞悬液，以终浓度1×105/mL接种于培养瓶内，选择低糖DMEM培养基，其中含15 mL/L胎牛血清、10 nmol/L胰岛素，培养48 h后采用脂质体转染法将重组质粒SV40T/pcDNA3.1转染至胎肝细胞. 用含700 mg/L G418的培养液筛选1 wk，将G418浓度改为300 mg/L，至出现阳性克隆，将其转移至新培养瓶进行扩大、传代培养.
1.2.3细胞形态的观察在倒置显微镜下观察新建肝细胞系的形态，并在电子显微镜下观察细胞的超微结构.
1.2.4细胞生长曲线的测定细胞消化后制成悬液，以103浓度接种于96孔板内，37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，每天取8孔加入MTT溶液20 μL/孔， 37℃继续孵育4 h，终止培养吸去上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上选择490 nm波长，测定光吸收值取平均值，连续测定12 d. 以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制细胞生长曲线.
1.2.5细胞克隆形成率肝细胞以1个细胞/孔的密度接种于96孔板，连续培养15 d，在倒置显微镜下观察含有50个以上细胞的细胞克隆数，按下列公式计算细胞克隆形成率：克隆形成率（%）＝（克隆数/接种细胞数）×100%.
1.2.6软琼脂试验肝细胞预先制成细胞悬液，在60 mm培养皿中预先铺上含12 g/L琼脂的培养基，将细胞以1×105/皿浓度与37℃预温的含6 g/L琼脂的培养基混匀后，接种于平皿内底层琼脂培养基上，连续培养20 d后观察克隆形成数.
1.2.7染色体检查取对数生长期的肝细胞加入终浓度为0.5 mg/L的秋水仙碱，继续作用4 h，收集分裂中期细胞，离心去上清，加入0.075 mol KCl低渗处理20 min，最后经甲醇冰乙酸固定，制片，Giemsa染色后，在油镜下观察染色体形态.
1.2.8免疫组织化学方法检测整合的SV40T基因及ALB在细胞中的表达新建胎肝细胞系常规爬片，PBS清洗，4℃丙酮固定，30 mL/L H2O2处理，血清封闭，分别滴加人血清白蛋白单克隆抗体及SV40T单克隆抗体，孵育60 min，然后滴加HRP标记的二抗，孵育60 min，苏木精复染. 脱水、透明、封片、镜检.
2结果
2.1重组质粒的鉴定重新构建的质粒SV40T/pcDNA3.1经BamHⅠ单酶切，酶切产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，获得大小约2600 bp及5600 bp的2条带，前者符合GenBank中SV40T片段大小（图1）.
图1重组质粒酶切鉴定（略）
2.2胚胎肝细胞的培养及转染原代胚胎肝细胞经分离纯化，细胞存活率达91%. 体外培养48 h后，可见80%贴壁，经脂质体转染SV40T/pcDNA3.1重组质粒，G418筛选40 d后出现一簇抗G418的阳性克隆. 将其转移至新培养瓶内继续培养.
2.3细胞形态观察胚胎肝细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征，传代一次约需5 d时间（图2A）. 透射电镜观察，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管重建（图2B）.
图2胚胎肝细胞形态结构（略）
2.4细胞生长曲线根据MTT数据绘制的生长曲线显示，细胞在培养第4日进入对数生长期，第7日进入平台期，第12日后开始出现凋亡（图3）.
图3胚胎肝细胞生长曲线（略）
2.5细胞克隆形成率及软琼脂集落形成试验细胞连续培养15 d，形成非常明显的克隆，克隆形成率为31.2%. 而在软琼脂培养基内，细胞连续生长20 d，未见有细胞克隆形成，说明该永生化肝细胞不能在软琼脂培养基内生长.
2.6染色体核型分析第16，28，45代肝细胞各计数30个分裂相，均为正常二倍体细胞，染色体为23对，核型结构与正常人肝细胞相同（图4）.
图4染色体核型分析（略）
2.7免疫组织化学检测结果以抗SV40T单克隆抗体作一抗，免疫组化检测可见肝细胞核内的棕色颗粒，证实SV40T基因已整合入胚胎肝细胞（图5A）. 另外该永生化胚胎肝细胞具备合成白蛋白的能力，免疫组化检测可见胞浆内有棕色颗粒着色（图5B）.
图5免疫组织化学染色（略）
3讨论
近年来在重型肝炎的治疗方面已得到共识，即生物人工肝及肝细胞移植可以作为原位肝移植的有效替代治疗手段治疗肝功能衰竭，而且取得了一定的临床治疗效果. 然而由于供肝短缺和原代肝细胞体外培养增殖困难，使得肝细胞材料的相关研究成为关注的热点. 人们曾尝试采用异种肝细胞或各种肝细胞系如C3A，HepG2来解决这一问题［6-9］，常用的猪肝细胞应用最为广泛，效果也可靠，但异种肝细胞可引起强烈的免疫排斥反应，而且由此带来的人畜共患疾病的感染无法避免［10］. 采用C3A， HepG2的生物人工肝在动物实验及部分临床试验中已取得肯定的结果，可是细胞系的来源为肿瘤细胞，研究显示它的细胞色素P450酶活性、氨清除和尿素合成功能均较差，加之用于处于免疫抑制状态的重型肝炎患者，潜在致瘤的风险始终令人担忧［11-12］.
我们利用真核表达载体pcDNA3.1，将猿猴病毒40大T抗原基因通过脂质体转染至体外培养的原代胚胎肝细胞，经G418筛选40 d后获得一阳性细胞克隆. 生长曲线观察结果表明，该细胞具有永生化细胞系典型的“S”特征，细胞生长的每一阶段特征明显. 光学显微镜下观察，细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较快；透射电镜观察发现，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管形成. 表明转染肝细胞在形态结构上与原代细胞无明显差异. 此外，我们构建的永生化胚胎肝细胞系的克隆形成能力较强，在软琼脂培养基中不能生长，而且核型组成与正常肝细胞相同，说明该细胞没有发生恶性转化. 经免疫组织化学检测，转染肝细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入胚胎肝细胞内，另外人血白蛋白在细胞胞浆中有明确表达，说明该细胞系具备分泌蛋白的能力，具有正常肝细胞的某些功能.
本研究结果表明，利用SV40T抗原，采用脂质体转染方法建立的这株永生化胚胎肝细胞系，具备了原代肝细胞的典型形态特征以及某些生物学功能，为肝细胞体外长期培养以及功能维持提供了可能，应该可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料，从而为生物人工肝及肝细胞移植临床的广泛应用奠定更加坚实的基础.
参考文献
［1］ Di Campli C， Gasbarrini G， Gasbarrini A. A medicine based on cell transplantation is there a future for treating liver diseases?［J］. Aliment Pharmacol Ther， 2003， 18:473-480.
［2］ Di Campli C， Nestola M， Piscaglia AC， et al. Cellbased therapy for liver diseases［J］. Eur Rev Med Pharmacol Sci， 2003， 7:41-44.
［3］ Leckel K， Blaheta RA， Markus BH. State of hepatocyte transplantation:A risk or a chance? ［J］. Zentralbl Chir， 2003， 128:283-290.
［4］ Strain AJ， Neuberger. A bioartificial liverstate of the art［J］. Science， 2002，295(8): 1005-1009.
［5］ Ichida T. Artificial liver support system for fulminant hepatic failure as bridgeuse to living donor liver transplantation［J］. Intern Med， 2003， 42(10): 920-921.
［6］ Kobayashi N， Okitsu T， Tanaka N. Cell choice for bioartificial livers［J］. Keio J Med， 2003， 52(3): 151-157.
［7］ Kerkhove MP， Hoekstra R， Chamuleau RA， et al. Clinical application of bioartificial liver support systems［J］. Ann Surg， 2004， 240(2): 216-230.
［8］ Xu Q， Sun X， Qiu Y， et al. The optimal hepatocyte density for a hollowfiber bioartificial liver［J］. Ann Clin Lab Sci， 2004， 34(1): 87-93.
［9］ Hodgson H. Liver cells: biology to therapeutics［J］. Clin Med， 2003， 3:161-165.
［10］ Tacke S， Bodusch K， Berg A， et al. Sensitive and specific detection methods for porcine endogenous retrovirus applicable to experimental and clinical xenotransplantation［J］. Xenotransplantation， 2001，8:125-135.
［11］ Wang L， Sun J， Li L， et al. Comparison of porcine hepatocytes with human hepatoma(C3A) cells for use in a bioartificial liver support system［J］. Cell Transplant， 1998，7:459-468.
细胞生物学特性篇2
【关键词】 骨髓基质细胞;细胞培养;表面抗原
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.03.005
In vitro culture ofmarrow stroma cell and its biological characteristics WANG Xiang-yi， LI Ji-shen， LIU Fu-quan， et al. Department of Neurosurgery， The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Baotou 014010， China
【Abstract】 Objective To explore in vitro culture method of human bone mesenchymal stem cells （BMSCs） of cerebral hemorrhage sequelae patients and its amplified biological characteristics. Methods Ilium myeloid tissues were taken from patients with 3-month cerebral hemorrhage sequelae， and they were in adherence standing culture after removing the lymphocyte， and multiple liquid purification. Morphology and growth characteristics were examined by inverted phase contrast microscope. Cell surface markers CD29， CD34， CD45， and CD105 in the third and sixth generation were tested by flow cytometer. Results After 48 h of phase contrast microscopy inoculate， there were several spindle-shaped cells. After 6～8 d， cells were in colony. After passage， cellular morphology tended to be conform and swirling. Flow cytometer showed that CD34 and CD45 were positive， while CD29 and CD105 were negative. Conclusion In vitro density gradient centrifugation and adherence standing method can provide a large number of homogeneous BMSCs.
【Key words】 Marrow stroma cell; Cell culture; Surface antigen
细胞移植开辟了一条治疗脑损伤后遗症的途径， 目前发现BMSCs植入后会改变损伤区的局部环境， 通过自分泌和旁分泌神经营养因子来保证自身的存活和促发内源修复[1]。骨髓基质细胞是成体干细胞，与其他的干细胞相比有显著的优越性，是细胞移植治疗中枢神经系统疾病的种子细胞之一。由于骨髓中细胞成分比较混杂， BMSCs在骨髓中含量极少， 仅占骨髓中有核细胞的 0.001%～0.01%， 实际应用中需对其进行体外分离纯化并大量扩增[2]。本实验对人BMSCs进行体外分离培养， 并对培养细胞的表面抗原进行测定， 为临床应用提供足量有活性的骨髓基质细胞。现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 主要试剂与设备 淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque （1.077 g/ml， 上海试剂二厂）， DMEM/F12培养基 （Gibco）， 胰蛋白酶（Gibco）， 胎牛血清（Hyclone）， 异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD105（Immunotech）， Caliber 流式细胞仪（BD公司）、倒置相差显微镜（Nikon）、CO2恒温培养箱（Heraeus）， 低速离心机（北京医用离心机厂）。
1. 2 方法
1. 2. 1 BMSCs获得和培养 骨髓来源：病例1， 54岁， 男， 高血压脑出血患者， 行髂骨嵴骨髓穿刺获得， 无菌抽取， 肝素抗凝的骨髓中加入等体积的无钙镁磷酸缓冲液， Ficoll分离， 取单个核细胞层， 用无钙镁磷酸缓冲液洗涤2次， DMEM/F12培养基洗涤1次， 以1×106/ml的细胞密度接种， 用含10% FBS DMEM/F12培养基在37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养， 第1次72 h后更换新鲜培养基， 去除未贴壁细胞并继续培养， 后每3～4天换液1次， 以去除未贴壁细胞。连续培养2周后， 当基质细胞贴壁约80%时， 按照1：2比例传代。通过传代， 对BMSCs进行纯化和扩增， 取第3、6代的细胞用于流式检测。体外培养的BMSCs采用倒置相差显微镜， 逐日观察细胞生长情况和形态特征。
1. 2. 2 BMSCs表面抗原检测 采用直接免疫荧光染色流式细胞术， 测定BMSCs表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105。
2 结果
2. 1 体外培养 BMSCs形态学观察 倒置相差显微镜下， 刚接种的骨髓悬液中含有大量悬浮细胞， 无细胞贴壁;48 h后， 发现少数细胞贴壁， 呈梭形。72 h后换液， 将未贴壁细胞弃去。贴壁细胞呈克隆性生长， 细胞增殖后形态多样， 呈异质性， 以长梭形细胞为主， 亦可见三角形、多角形及扁圆形细胞。6～8 d后细胞形成集落。传代后， 细胞形态趋于一致， 呈长梭形， 细胞排列紧密， 可成漩涡状。见图1。细胞传至第12代时， 胞浆内颗粒物增多， 细胞折光性变差， 提示细胞活力变弱， 增殖能力减弱。
2. 2 BMSCs细胞表面抗原检测结果 流式细胞仪分析 BMSCs表面抗原， 流式细胞仪检测显示CD34、CD45阴性为非造血细胞， 且表达率在3代时（2.52%、2.07%）%较6代时（0.32%、0.14%）高， 说明第6代几乎为纯基质细胞。而CD29、CD105阳性说明BMSCs较为幼稚， 且3代和6代数值无差异。
3 讨论
研究已明确BMSCs是成体干细胞的一种， 但细胞成分不单一， 有可能包含不同分化阶段的前体细胞的混合物[2， 3]。BMSCs也具有自我更新能力及多向分化潜能， 在体外经诱导可以分化为骨、软骨、脂肪组织、神经组织及肝组织等。由于骨髓来源丰富， 取材方便， 创伤小， 在组织再生和损伤修复中有很好的临床应用前景[1]。
BMSCs广泛存在于胎儿和成人的各种组织和脏器中， 骨髓组织中含量最为丰富， 为了获取种子细胞， 目前用于分离骨髓BMSCs的方法主要有：密度梯度离心法;流式细胞仪分选法;贴壁培养法;免疫磁珠分选法。作者用密度梯度分离联合贴壁培养法进行了BMSCs的分离和培养， 其操作简单， 经多次传代可获得足够量的细胞。流式细胞仪检测显示CD34、CD45均阴性， 传3代时表达率分别为2.52%和2.07%， 较6代时0.32%和0.14%高， 说明第6代几乎为纯基质细胞。
研究表明BMSCs的表面标志尚无特异性表面标志表达， 部分与间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志有关[4-6]。主要包括：①粘附分子， 如CD44等。②生长因子和细胞因子受体， 如IL受体3、4、6、7， 干扰素γ受体等。③整合素家族成员， 包括CD49a、CD49b、CD49c及CD29、CD104等。④如CD90、CD105等。实验选用的标记物也符合鉴定BMSCs通用标志物， 因此， 本实验培养细胞符合BMSCs的免疫表型。
BMSCs具有多向分化潜能， 在细胞移植和基因治疗方面有重要优势。本实验成功对BMSCs 进行分离、纯化及培养， 为深入研究 BMSCs 的组织再生和修复提供了实验基础。
参考文献
[1] Vaquero J， Zurita M. Functional recovery after severe CNS trauma： current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells. Prog Neurobiol， 2011， 93（3）：341-349.
[2] 闫冬梅，徐开林，杜冰，等.人骨髓基质细胞的培养及鉴定.临床血液学杂志， 2009， 22（3）：144-146.
[3] 胡学昱，罗卓荆，田爽，等.成人骨髓基质细胞体外诱导成神经细胞实验研究.中华神经外科疾病研究杂志， 2006， 5（2）： 139-142.
[4] 谢谦， 罗莉.成人正常骨髓基质细胞体外培养及生物学特性.口腔医学研究， 2004， 20（2）：153-155.
[5] 戚晓渊，孙泽林，刘方军.单克隆永生化人骨髓基质干细胞分化能力和VEGF分泌量的相关性. 中华医学杂志， 2011，91（17）： 1193-1196.
[6] Jung S， Panchalingam KM， Wuerth RD， et al. Large-scale production of human mesenchymal stem cells for clinical applications. Biotechnol Appl Biochem， 2012， 59（2）：106-120.
细胞生物学特性篇3
【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定
【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02
骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。
1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。
1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。
1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。
1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。
1.5 兔 BMSCs的鉴定
对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。
2 讨论
BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。
2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。
2.3 传代的注意事项
2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。
2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。
2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。
综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。
参考文献
［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243
［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308
［3］Pittenger MF,Mackay AM, Beck SC，et al.Mlutilineage potential ofhuman mesenchymal stem cells，Science 1999；284（5411）:143-147
细胞生物学特性篇4
原癌基因和抑癌基因所编码的蛋白存在于细胞的各个组成部分中，包括细胞核、细胞质、线粒体和细胞膜。通过对原癌和抑癌基因蛋白结构和功能的分析，发现许多原癌基因和抑癌基因位于信号通路中的不同部位，参与许多重要的细胞活动过程，如细胞生长和分化、DNA复制和损伤修复、基因转录和表达、细胞周期调控等，在细胞凋亡、衰老过程中起重要作用，也在肿瘤的发生发展和转移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近发现的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成员之一，具有抗细胞凋亡作用，并明显地在肿瘤组织中特异性表达。目前的研究表明， Livin基因在各系统的正常组织中很少表达，但在胚胎组织或发育组织、淋巴细胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多种组织中广泛表达。非小细胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）的肿瘤细胞系中也有Livin基因的表达，但其与肿瘤的发生、转移、耐药性等之间的确切关系尚不清楚。Livin基因特异性地表达于肿瘤组织，有可能成为NSCLC早期诊断的分子标志物，并为基因治疗提供新靶点［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表达及其抗细胞凋亡作用、信号传导途径与调节机制等分子生物学特性作一综述。
1 Livin基因及蛋白结构功能的多样性
IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，其共同的结构特征是N端含有一个或多个(最多为3个)串联的杆状病毒IAP重复序列结构域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一个环指结构域(RING finger domain，RING)。目前已发现人类IAP家族有8个成员，即NIAP，XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(MLIAP/KIAP)［2］。
Livin蛋白是IAP家族的一个新成员，一些实验室采用IAP同源序列(BIR或RING)寻找的方法，分别从人类基因组cDNA文库中克隆得到Livin核苷酸序列，从不同的组织中发现了Livin基因的表达。Kasof等［3］在发育组织和肿瘤组织中发现并命名了Livin基因。Lin等［4］从人胎肾cDNA文库中分离到该基因，故称其为KIAP（kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP）。Vucic等［5］发现Livin基因在G361 和 SKMel29两种黑色素瘤细胞源株中高表达，将其命名为MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等［6］发现了该基因存在2个剪接变异体（isoforms），分别命名为Livin α和Livin β。 同时，Lin等［4］用荧光原位杂交方法确定Livin基因位于人20号染色体20q13.3区域，全长4.6 kb，包含7个外显子。此外还发现存在长约2.2，2.8和4.0 kb的转录子，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，包含4个α螺旋和一个三股抗平行 β片层，与相应的氨基酸残基共同构成疏水核心。C端含有一个RING环指结构［4，6］，氨基酸残基C124，C127，H44及C151与锌原子结合，借以稳定整个重叠结构。
Livin蛋白有α和β两种变异体，分别由298和280个氨基酸组成，二者相差18个氨基酸，此区域由介于BIR和RING结构之间的第6外显子5′端54 bp的基因序列编码。Livin蛋白主要表达于胞质，但Kasof等［3］认为livin蛋白的细胞内分布与Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞质内呈丝状表达，同时也表达于胞核，并认为livin蛋白 C末端的RING结构对介导其在亚细胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3′端非翻译区多腺苷酸化与存在未剪接加工成熟的前体RNA有关，不同的剪辑有不同的变异体及亚型，这种结构基础有可能解释Livin基因蛋白存在多个结构功能。如BIR结构域内单个氨基酸的突变就能发挥其抗凋亡作用，作者的实验也发现在A549细胞中表达的Livin 蛋白缺少66个核苷酸的变异体，其确切的功能意义尚不清楚。但Livin基因蛋白结构的变化与其功能的多样性存在明显的相关性。
2 Livin基因在NSCLC中的表达
Livin基因仅在少数正常组织中表达，各家报道的研究结果存在较大差异，目前还不能确定Livin基因在人正常组织中的表达谱及其生理意义［2，7］。Tanabe等［7］采用 RTPCR法对15例正常肺组织和38例NSCLC组织作对比研究，发现Livin mRNA在NSCLC组织阳性率为73.6%，正常肺组织阳性率为6.7%，显示Livin基因在NSCLC中呈高表达，同时证明Livin基因与Survivin基因在NSCLC中的表达并不相关。CrnkovicMertens 等［1，8］同时采用NSCLC组织和NSCLC源 HeLa细胞株培养检测Livin基因及其两种异构体Livin α和Livin β的表达，结果显示Livin α和Livin β在NSCLC中呈高表达。采用RNAi技术分别使异构体基因沉默，发现Livin β和Livin α基因的功能意义不完全相同， Livin β在细胞凋亡中起关键作用。国内崔肃等［9］采用RTPCR法检测NSCLC组织中Livin α mRNA和Livin β mRNA的表达，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表达，结果显示45例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为71.1％，两种异构体基本同时表达，Livin β mRNA的表达量略高于Livin α mRNA。而在癌旁正常肺组织和肺良性瘤样病变组织呈低表达，阳性率分别为5.7％和6.7％。而且Livin mRNA表达阳性标本中均能检测到Livin蛋白表达。陈淼等［10］采用免疫组织化学(SABC)的方法检测Livin蛋白在40例NSCLC组织以及12例正常和肺良性疾病组织中的表达，结果显示22例腺癌和18例鳞癌组织中的Livin蛋白阳性率分别为45.5﹪和50.0﹪，而正常肺组织和肺良性疾病组织均未检出Livin蛋白表达。他们同时观察到不同分化程度NSCLC组织之间Livin蛋白的表达无显著性差异。有和无淋巴结转移的肺癌组织中Livin蛋白表达的阳性率分别为72.7﹪和11.1﹪，两组的显著性差异标志着不同的生物学特性。孙建国等［11］ 的研究结果显示，48例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为22.9%，其表达与NSCLC组织学类型相关，腺癌中Livin mRNA表达阳性率达45.5%，明显高于鳞癌和大细胞癌，而癌旁组织和肺良性疾病组织均未检出阳性结果，而且Livin 蛋白表达与mRNA表达相一致。研究还发现放、化疗后NSCLC组织中的Livin表达的阳性率为43.5%，显著高于未放、化疗组织，提示放、化疗可明显诱导Livin蛋白的表达，这可能与临床上NSCLC对化疗药物和放疗耐受有关。
目前，Livin基因在NSCLC组织中特异性地高表达的现象已引起许多学者的关注［12］，但Livin mRNA的表达与NSCLC患者的病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期等的相关关系尚未完全阐明，Livin基因作为NSCLC的分子标志物，成为诊断和治疗NSCLC新靶点的可能性已引起人们的极大兴趣。
3 Livin抗细胞凋亡作用及其调节机制
Kasof等［3，8］研究显示，Livin蛋白N端的羧基与Caspase3，7，9的直接结合，阻断了caspase发挥凋亡作用的途径，从而抑制了细胞凋亡的发生。将Livin基因转染HeLa细胞，受转染细胞内由FADD（Fasassociated protein with death domain），Bax，RIP，RIP3及DR6诱导的细胞凋亡可被有效阻断。Vucic等［13］将Livin基因转染乳腺癌MCF7细胞，证实转染细胞对Fas，TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1），DR4（death receptor 4）及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。许多化疗药物可导致肿瘤细胞DNA的损伤而诱导细胞凋亡，转染Livin基因的MCF7细胞可有效对抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）诱导的细胞凋亡。但是各家报道Livin α和Livin β蛋白的抗细胞凋亡作用存在一定差异。Yang等［14，15］观察在Jurkat T淋巴细胞株中，Livin基因可明显抑制由TNFα及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡，其抗细胞凋亡作用强于Bcl 2。Livin α对STS诱导的Jurkat细胞凋亡表现出一定的抑制作用，而Livin β则无此作用。CrnkovicMertens 等［8］ 采用RNA干扰技术分别使内源性Livin α和Livin β基因沉默，检测两者的抗凋亡作用，结果显示Livin β可显著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外线放射治疗（UV irradiation）等诱导的HeLa细胞凋亡，但Livin α则不明显。更多的研究则认为Livin α和Livin β基因均具有抗细胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途径有待进一步证实。
许多研究证实［12-16］，Livin蛋白介导细胞凋亡抑制存在不同的调节途径，通过与激活形式的Caspase 3和Caspase 7结合，抑制其活性。Livin蛋白还可与未加工的或断裂形式的Caspase 9结合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、细胞色素C及dATP诱导的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白与Caspase的结合抑制作用具有高度的特异性和亲和性，BIR结构域内单个氨基酸的突变即可导致Livin蛋白与Caspase的结合作用的减弱或消失，致使Livin蛋白抗细胞凋亡作用的明显降低甚至完全丧失，这也许可成为基因治疗的调节点。Sanna 等［12］的研究显示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但对JNK3无激活作用，而Livin蛋白对JNK1的激活作用远远强于JNK2，并且这是Livin蛋白对抗TNFα和ICE介导的细胞凋亡作用的重要途径之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白对JNK1的激活并不依赖于MKK4/MKK7信号途径，而是通过TAB1/TAK1途径实现。 TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身对于JNK1无激活作用，但可促进TAK1介导的JNK1激活作用。Livin蛋白可与TAB1结合，并进一步激活TAK1。此外，Vucic 等［13］证实SMAC（ second mitochondrial activator of caspases， SMAC）及活性肽片段可与Livin蛋白的BIR结构域特异性结合，抑制Livin蛋白与caspase的结合及其抗细胞凋亡作用。因此存在着由SMAC介导的对Livin蛋白抗细胞凋亡作用的负性调节机制。
4 Livin基因治疗NSCLC的临床应用前景
鉴于Livin基因具有明显的抗细胞凋亡作用以及在肿瘤组织中的特异性表达，人们注意到其与肿瘤发生发展的关系，并开始探讨Livin用于肿瘤基因治疗的可行性。应用基因转染技术可获得稳定表达Livin α和Livin β的NSCLC A549细胞克隆。孙建国等［17］用平板克隆形成实验研究A549细胞生长情况，用MTT法检测其对放、化疗的敏感性，用细胞周期分析法观察细胞凋亡情况。结果发现转染Livin α和Livin β基因后的细胞尤其是表达Livin α的A549细胞，克隆形成能力提高、倍增时间缩短，对多种化疗药物和放射线敏感性降低，10 Gy放射线照射下仅有0.2%细胞发生凋亡。可见 Livin基因参与NSCLC的发生发展，也可能是NSCLC细胞对放、化疗耐受的重要机制之一。
CrnkovicMertens等［18］利用基因转染和特异性小干扰RNA(siRNA)技术，在肺癌SPCA1细胞株中建立Livin异构体α和β特异的基因沉默体系，观察诱导SPCA1细胞凋亡效应中的不同作用，并用TUNEL法和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示内源性Livin α和Livin β基因沉默后，SPCA1细胞克隆形成能力较对照组显著下降，促使SPCA1细胞发生凋亡，表明Livin α和Livin β两种异构体均能作为诱导肺癌细胞凋亡的分子靶点，通过使Livin基因沉默的靶向诱导肺癌细胞凋亡可作为手术、化疗、放疗等传统治疗的辅助手段。
由于Livin基因仅在肿瘤组织表达而在正常组织极少表达，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和肿瘤组织中均检测到自身Livin蛋白抗体，其组织特异性显而易见。Hariu等［20］ 用Livin反义核苷酸片段刺激周围淋巴细胞，发现HLAA24与Livin 7肽具有特殊亲和力，Livin蛋白表达阳性的NSCLC患者可检测到特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），而Livin蛋白表达阴性NSCLC患者则测不到CTLs。结果提示Livin蛋白可成为NSCLC免疫治疗的靶点，将Livin 7肽作为免疫制剂具有良好的应用前景。
综上所述，Livin基因是肿瘤细胞凋亡途径中的一个信号调节点，其在NSCLC组织中的特异性表达为NSCLC的诊断提供了新的分子标记物，亦可成为NSCLC治疗的新靶点［21，22］。目前，人们已能在基因水平上干预因基因表达异常而导致的疾病，尤其是以mRNA为靶标的反义药物，可抑制和消除致病基因的表达，达到治疗的目点。因此，采用反义核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制剂（smallmolecule inhibitors）和免疫介入（immunemediated approaches）等基因治疗手段直接阻断Livin 蛋白与目的分子的结合，可以促使肿瘤细胞的凋亡，为NSCLC的治疗开辟新的途径［23，24］。同时，对NSCLC患者肿瘤组织和外周血免疫细胞的Livin蛋白（受体）及其mRNA表达的联合检测，有可能成为NSCLC早期诊断、转移风险和预后的分子标记物。
参考文献
［1］ CrnkovicMertens I， Muley T， Merster M， et al. The antiapoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of nonsmall cell lung cancer cells［J］. Lung Cancer， 2006，54(2):135-142
［2］ Salvesen GS， Duckett CS. IAP proteins: Blocking the road to death′s door［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2002，3(6): 401-410.
［3］ Kasof GM， Gomes BC. Livin， a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］. J Biol Chem， 2001， 276(5): 3238-3246.
［4］ Lin JH， Deng G， Huang Q， et al. KIAP， a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］. Biochem Biophys Res Commu， 2000，279(3): 820-831.
［5］ Vucic D， Stennicke HR， Pisabarro MT， et al. MLIAP， a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］. Curr Biol， 2000，10(21): 1359-1366.
［6］ Ashhab Y， Alian A， Polliack A， et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern［J］. FEBS Lett， 2001，495(12): 56-60.
［7］ Tanabe H， Yagihash A， Tsuji N， et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in nonsmallcell lung cancer［J］. Lung Cancer， 2004，46(3):299-304.
［8］ CrnkovicMertens I， Semzow J， HoppeSeyler F， et al. Isoformspecific seilencing of the Livin by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells［J］. J Mol Med， 2006，84(3):232-240.
［9］ 崔 肃，陈东义， 韩力波，等.凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］.中国肿瘤临床，2006，33（5）：249-252.
［10］ 陈 淼，陶晓南，张晓菊.凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义［J］.广东医学，2006，27（7）：1014-1015.
［11］ 孙建国，廖荣霞，陈正堂，等.一种新的凋亡抑制蛋白Livin在非小细胞肺癌组织中的表达［J］.重庆医学，2004，33(7):982-984.
［12］ Sanna MG， da Silva Correia J， Ducrey O， et al. IAP suppression of apoptosis involves distinct mechanisms: The TAK1/JNK1 signaling cascade and caspase inhibition［J］. Mol Cell Biol， 2002，22(6):1754-1766.
［13］ Vucic D， Deshayes K， Ackerly H， et al. SMAC negatively regulates the antiapoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(MLIAP)［J］. J Biol Chem， 2002，277(14): 12275-12279.
［14］ Yang F， Sarangarajan R， Le Poole IC， et al. The cytotoxicity and apoptosis induced by 4tertiary butylphenol in human melanocytes are independent of tyrosinase activity［J］.J Invest Dermatol， 2000，114(1): 157 -164.
［15］ Andersen MH， Reker S， Becker JC， et al. The melanoma inhibitor of apoptosis protein:a target for spontaneous cytotoxic T cell responses［J］. J Invest Dermatol， 2004，122(2):392-399.
［16］ Yan H，Brouha B， Liu T， et al. Proteolytic cleavage of Livin(MLIAP) in apoptotic melanoma cells potentially mediated by a noncanonical caspase［J］. J Dermatol Sci， 2006，43(3):189-200.
［17］ 孙建国，廖荣霞，陈正堂，等.Livin异构体基因转染对肺腺癌A549细胞生长及放化疗敏感性的影响［J］. 中华结核和呼吸杂志，2005，28（12）：836-840.
［18］ CrnkovicMertens I， HoppeSeyler F， Butz K. Induction of apoptosis in tumor cells by siRNAmediated silencing of the Livin/M LIAP/KIAP gene［J］. Oncogene， 2003，22(51): 8330-8336.
［19］ Yagihashi A， Asanuma K， Kobayashi D， et al. Detection of autoantibodies to livin and survivin in sera from lung cancer patients［J］. Lung Cancer， 2005，48(2):217-221.
［20］ Hariu H， Hirohashi Y， Torigoe T， et al. Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family，Livin/MLIAP in lung cancer［J］. Clin Cancer Res， 2005，11(3):1000-1009.
［21］ Schmollinger JC， Vonderheide RH， Hoar KM， et al. Melanoma inhibitor of apoptosis protein(MLIAP) is a target for immune mediated tumor destruction［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100(6): 3398-3403.
［22］ Hassan MA， Braam SR， Kruyt FA. Paclitaxel and vincristine potentiate adenoviral oncolysis that is associated with cycle and apoptosis modulation， whereas they differentlly affect the viral life cycle in nonsmallcell lung cancer cells［J］.Cancer Gene Ther， 2006，13(12):1105-1114.
［23］ Kumar A，Wakelee H. Secondthirdline treaments in nonsmall cell lung cancer［J］. Curr Treat Options Oncol， 2006，7(1):37-49.
细胞生物学特性篇5
关键词: 成纤维细胞;细胞培养
摘 要:目的 探讨来自正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织的成纤维细胞的生物学特性. 方法 对三种组织均采用组织块法进行细胞的原代培养，采用胰蛋白酶消化传代，分别利用绘制细胞生长曲线，3 H-胸腺嘧啶掺入及3 H-脯氨酸掺入等方法观察细胞的增殖，DNA合成代谢及胶原合成等情况，并比较它们之间的差异. 结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞增殖、DNA合成代谢及胶原合成量等方面均明显高于正常皮肤及增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞，后两者之间有一定区别但无统计学意义. 结论 不同组织来源的成纤维细胞其生物学行为亦有所区别，因此在进行实验研究时应有一定的针对性.
Keywords:fibroblasts;cell culture
Abstract:AIM To investigate the biological characteristics of fibroblasts derived from normal human dermal，hyper-trophic scar and keloid tissues.METHODS Fibroblasts pri-mary culture was carried out by the assay of planting tiny tis-sue masses into culture bottles.The fibroblasts，after being isolated from different tissues，were cultivated and the cell growth curves were drawn.Meanwhile，3 H-TdR and3 H-pro-line incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively.RESULTS Keloid fibroblasts had a much more active bio-logical characteristic than that of the other two kinds of fibroblasts.There was a slight difference between the normal dermal fibroblasts and hypertrophic scar ones.CONCLUSION Fibroblasts derived from different tissues have their own biological characteristics.This makes it necessary for us to do the research on different tissues with different fibrob-lasts.
0 引言
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩常见于烧伤或皮肤外伤愈后，是机体组织异常修复的结果.在临床上轻者可影响美观，重者可导致邻近器官的功能障碍甚至畸形，这些均直接影响患者的生活质量［1］ .研究证实，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成主要是由于组织在修复过程中成纤维细胞的活动异常增强，从而产生大量的Ⅰ型胶原、蛋白聚糖及纤维粘连蛋白等基质成分并使之沉积所致［2，3］ .对于这种疾病目前临床上尚缺乏有效的治疗手段，实验研究则由于缺乏理想的动物模型而受到很大的限制，因此我们通过该实验初步探讨不同组织来源的成纤维细胞的生物学区别.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，3 H-TdR及3 H-脯氨酸购自中科院原子能物理研究所，MTT购自华美生物工程公司.
1.2 方法 正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织均来自外科手术后所切除标本，所培养出的成纤维细胞分别命名为正常皮肤成纤维细胞（normal skin fi-broblast，NsFb）、增生性瘢痕成纤维细胞（hyper-trophic scar fibroblast，HTsFb）及瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblast，KFb）.标本剪去表皮及皮下组织，在小瓶中剪成碎组织块（0.5mm×0.5mm×0.5mm），接种于25mL培养瓶中，37.0℃，50mL L-1 CO2 孵箱中孵育4～6h后加入含100mL L-1 小牛血清的DMEM培养基，继续培养，2～3d换液1次，待细胞长出后即为原代成纤维细胞.当原代成纤维细胞达到80%～90%融合时，用2.5g L-1 胰蛋白酶消化收集细胞，用含10mL L-1 小牛血清的DMEM重悬细胞，按1 3传代，实验用第3～6代. 1.3 观测指标 ①细胞增殖.计数法:将三种细胞取相同代数并于其对数生长期时同时消化并制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106 L-1 ，将细胞按1mL/孔接种48孔培养板，每种细胞设1个复孔，共设12组.置孵箱培养24h后以2.5g L-1 胰蛋白酶消化第一组细胞并以胎盼蓝做活细胞染色，在镜下计数，此后每日于相同时间点连续测量12d，依所得数据绘制细胞数-时间的细胞生长曲线.四唑盐（MTT）比色法:同上法接种细胞并于24h后将第一组细胞每孔加入80μL MTT（20g L-1 ），继续孵育4h后弃去上清，再每孔加入0.5mL二甲基亚砜，振荡30min后选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定个孔的吸光度，此后每日于相同时间点连续测量12d并绘制吸光度值-时间的细胞生长曲线.②细胞DNA合成的测定.胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，为DNA合成所必需，因此用同位素3 H标记TdR即3 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入其合成代谢过程，通过检测细胞放射性强度可以反映出细胞DNA的代谢情况.接种细胞于48孔板，每种细胞设8个复孔，每孔细胞数为1×104 ，于接种后24h换液并每孔加入1μci3 H-TdR，继续培养12h后弃培养基，用37℃PBS缓冲液冲洗培养板10次，风干后每孔加入2mol L-1 NaOH200μL，室温放置30min，镜下观察细胞完全溶解后将各孔溶液分别收集于纤维滤纸上，于Beckman LS-6500型液闪计数仪上测定cpm值.③细胞胶原合成的测定.脯氨酸是成纤维细胞合成胶原所必需的氨基酸之一，因此3 H-脯氨酸作为胶原合成的前体能掺入其合成代谢过程.同上法接种细胞于48孔板，于接种后12h换液，继续孵育24h后进行3 H-脯氨酸掺入:配制β-氨基丙腈，L-维生素C，3 H-脯氨酸混合液，终浓度分别为100g L-1 ，50g L-1 ，10ci L-1 ，按每孔100μL进行掺入，孵育24h后收集并进行cpm值测定.统计学处理:数据以x ±s表示，应用Origin软件进行组间t检验.
2 结果
2.1 原代成纤维细胞的生长 结果表明，KFb游出组织块的速度明显快于NsFb及HTsFb（P
图1 －图3 略
2.2 细胞的增殖 细胞记数法与MTT比色法均显示，KFb的生长增殖明显较NsFb与HTsFb快，表现为进入对数生长期的时间短而持续时间长且没有明显的平台期;HTsFb的增殖较NsFb略慢，但基本趋势一致，无明显区别（Fig4）.
2.3 细胞的DNA代谢及胶原合成 结果表明，KFb的DNA合成量及胶原合成量均明显高于NsFb与HTsFb（P
3 讨论
烧伤及皮肤损伤是临床上较常见的病种，其损伤后的愈合过程是一系列修复细胞如表皮细胞、成纤维细胞及内皮细胞等与细胞外基质及多种细胞生长因子共同作用的结果，其中成纤维细胞的生物学活动构成了创面愈合与瘢痕形成的主要病理学基础，因此目 前国内外在研究增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的形成机制时主要将目光集中于成纤维细胞生物学行为及其相关因素的研究方面［4-6］ .
从皮肤组织中获取成纤维细胞的方法有消化法和组织块法两种，消化法又分为胰酶消化法及胶原酶消化法，由于消化法易受组织块的来源、大小、酶作用的时间和温度等多方面因素的影响［7］ ，因此在本实验中对三种组织我们均采用组织块法进行细胞的原代培养.人体成纤维细胞在体外培养情况下一般能存活一年左右，能继续培养50代，用于实验时国外学者多采用3～10代［8，9］ 处于对数生长期的细胞.
我们首先通过组织块培养法对正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的成纤维细胞进行了原代培养研究，发现它们在细胞游出及生长方面均存在着一定的差异，其中瘢痕疙瘩成纤维细胞表现最为活跃.其次在细胞的继代培养研究中，我们通过比较它们在生长增殖、DNA代谢及胶原合成等方面的区别，进一步证实瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学功能远较其他两种成纤维细胞活跃，这与临床上这三者的区别是一致的.来自增生性瘢痕的成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞之间虽有一定区别但差异不明显，这可能是临床上增生性瘢痕在晚期发生退化的原因之一.
综上所述，我们的研究在一定程度上揭示了不同组织来源的成纤维细胞在生物学特性上的差异，同时说明在进行相应研究时应有一定的针对性.
参考文献
［1］Chen B，Jia CY，Su YJ，Xu MD，Hu DH，Zhu XX.Better life quality:Large sheet thin and/or split-thickness skin autograft-ing in the treatment of extensive third degree burn victims ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:420-422.
［2］Murray JC，Pollack SV，Pinnell SR.Keloids:A review ［J］.J Am Acad Dermatol，1981;4（3）:461-468.
［3］Robert F，Diegelmann.Cell culture and biochemical aspects of normal and abnormal wound healing:An overview ［J］.J Urol，1997;157（2）:298-302.
［4］Colige AC，Lambert CA，Nusgens BV.Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro ［J］.Biochem J，1992;285（3）:215-221.
［5］Han JT，Liu SJ，Chen B.Effects of suramin on proliferation of keloid fibroblasts in vitro ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:451-452.
［6］Zhang LX，Guo SZ，Wang Z.Biological effects of supernatant from melanocytes culture on proliferation of hypertrophic scar fi-broblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），1999;20（2）:166-167.
［7］Dong ML，Chen B，Xu MD，Su YJ，Tang CW.PDGF-AB ef-fects on proliferation of hypertrophic scar fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:437-438.
［8］SiTu ZQ，Wu JZ.Xibao Peiyang（Cell culture）［M］.Xi’an:Shijie Tushu Chubanshe（World Books Publishing Company），1996:9-11.
细胞生物学特性篇6
[关键词] 骨髓; 间充质干细胞; 兔; 细胞培养
[中图分类号] R329.2+8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)05-29-03
Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro
LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1
1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China
[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.
[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture
骨髓基质中存在骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等多向分化潜能,是组织工程学技术的重要的种子细胞[1]。目前,国内外已分离培养出骨髓间充质干细胞(MSC),但尚无统一的分离培养方案。虽然有多种MSCs的分离方法,但密度梯度离心法和贴壁分离法是目前骨髓间充质干细胞最常用的分离培养方法。本实验应用密度梯度离心分离法与贴壁分离法对骨髓间充质干细胞进行分离培养,并比较分析这两种分离法对MSC生物学特性的影响,为选择对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单的MSCs分离方法提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F-12培养基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均为国产分析纯试剂。碘化丙啶、噻唑蓝和二甲基亚砜均为SIGMA产品,Percoll为Pharmacia公司产品。实验动物日本大耳白兔12只,体重2kg左右,雌雄随机,动物饲养条件为25℃,湿度60%~ 70%。
1.2 方法
1.2.1 骨髓细胞的制备 用3%戊巴比妥钠将兔全身麻醉,用脱毛剂脱去兔后下肢的毛发,用3%的碘酊和75%酒精彻底消毒兔后下肢后移入工作台,铺无菌巾,解剖出胫骨上、下端,用骨钻分别在胫骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7号针头刺入两侧骨端的骨孔内,用加有肝素的DMEM 培养基反复冲洗骨髓腔,收集骨髓细胞悬浮液备用。
1.2.2 离心分离法制备MSCs 将骨髓细胞悬浮液贴壁加入到预置等体积1.077g/L的Percoll淋巴细胞分离液的离心管中,2000r/min离心20min。吸取中间乳白色的界面层,与5倍体积的生理盐水混匀后1000r/min离心5min,除去残留的Percoll成分。用磷酸盐缓冲液洗涤1次,然后均采用F12-DMEM 培养液(含体积分数为0.1的进口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素)重悬细胞,按1×105的密度接种于25mL培养瓶中,37℃、0.05%的CO2饱和湿度下培养,3d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后2~3d换液1次。
1.2.3 贴壁分离法制备MSCs 将骨髓冲洗液放入平皿,再抽出平皿中液体对髓腔进行二、三次冲洗。用吸管反复吹打呈单细胞悬液,每个胫骨的骨髓单细胞悬液经接种入一个25mL培养瓶中,于37℃ 、体积分数为0.05的CO2孵箱饱和湿度培养,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每三四天换液1次。
1.3 细胞计数、细胞形态学观察
在倒置显微镜下,每天观察贴壁分离培养、密度梯度离心培养条件下的原代及传代细胞的生长情况和活体形态特征。MSCs活力测定取1～3代传代细胞,制成单细胞悬液,以0.4% 台盼蓝作为染色剂,用细胞计数板计数活细胞和死细胞,共3次,取3次平均值,计算细胞活力:活细胞率(%)=活细胞数/(总细胞数-着色细胞数)×100。骨髓间充质干细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中。分别于接种后第2,3,4,5,6,7天收集4个复孔细胞(注:原代培养细胞于接种后4d换液时开始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞蓝拒染法计数活细胞。根据计数结果绘制生长曲线。取MSCs按2×104个细胞/孔接种于24孔培养板内,从接种后第2天起,每日随机收集4个复孔细胞用计数,取均数描记生长曲线。
1.4 MSCs传代培养
原代细胞长满单层后,即可进行传代,首先弃去培养液,用CMF-PBS液洗细胞两次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)约1mL,消化约5min,倒置显微镜下证实细胞已完全分离(此时镜下可见细胞呈圆球形),加入4mL含血清培养基,反复轻轻吹打成单细胞悬液,离心并用无血清培养基洗涤1次后重新加入含血清培养基计数,按所需密度传代培养或冷藏。
1.5 MSCs细胞的HE、Gimas染色及细胞骨架制备
Gimas及HE染色采用文献报道方法,细胞骨架制备按参考文献[2]方法。
1.6 MSCs流式细胞仪观察制样
按文献[2]的方法制备观察样本,用流式细胞光度计(FCM)检测,采用激发波长为488nm的氩离子激光,DNA被PI着色成红色荧光,蛋白质被FITC着色成绿色荧光,打印出各组细胞周期所占百分比,计算增殖指数(proliferation index,PIX)衡量细胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。两组检测数据用均数±标准差(χ±s)表示,各项指标差异显著性用t 检验。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
2.1.1 密度梯度离心法 细胞培养24h后,均可见大圆形细胞与少量小圆形细胞悬浮于培养液中,4d首次换液后可见少量细胞呈短梭形、多角形细胞及三角形,培养到12~14d细胞增殖铺满至80%左右,15~16d细胞增殖逐渐汇合成单层细胞。传代后至第3代时细胞形态较均匀,呈长梭形集落状分布。
2.1.2 贴壁分离法 细胞培养24h后,均可见数目较多的小圆形细胞、血细胞悬浮于培养液中。4d时首次换液后可见到梭形、多角形细胞及三角形的贴壁细胞;第7~ 8天可见这些细胞呈集落样分布;至第10~12天细胞增殖铺满至80%左右,14~15d时增殖逐渐汇合成单层细胞。Gimas 染色可见细胞核为紫红色,圆形或椭圆形,镜下可见分裂相细胞,两种分离方法未见不同。(图1)
2.2 细胞活性检测
密度梯度离心法:活细胞率为96.2%,贴壁分离法:活细胞率为98.7%,组间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 细胞生长曲线
见图4,应用密度梯度离心法与贴壁分离法第1代细胞生长曲线测定结果是密度梯度离心法的MSCs生长期比贴壁分离法MSCs的生长曲线延迟1~2d。第2、3代细胞生长曲线测定结果,细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;第2天开始至第6天,细胞呈指数生长,细胞数迅速增长,7d进入平台期,此后细胞数目无显著改变,细胞增殖减慢(图2)。
2.4 培养MSCs细胞骨架观察
镜下可见细胞骨架主要结构形式为环形排列,贯以辐射状微管组成圆形蜘蛛网形,细胞间有角形的突起。随着细胞传代次数的增大,细胞骨架逐渐过渡到以梭形细胞骨架为主要形式(图3)。
2.5 培养MSCs的细胞周期
第3代MSCs培养72h后,经PI和FITC双染在流式细胞仪下观察分析可见细胞增殖活跃,细胞蛋白质含量较丰富。贴壁法MSC:G1期细胞为67.5%,G2期细胞为28.9%,S期细胞为3.6%,细胞增殖指数为(PIX)32.5%,离心法MSC:G1期细胞为68.2%,G2期细胞为28.1%,S期细胞为3.7%,细胞增殖指数为(PIX)31.8%,经统计学分析贴壁法和离心法MSC的PIX差别无意义(表1)。
3 讨论
骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞之一,在适当的条件下,可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞[3-7]。获得大量高纯度的MSCs是将MSCs用于研究或临床治疗的基础,目前用于分离MSCs的方法主要有贴壁分离法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。其中后两者由于所需仪器昂贵、对MSCs损伤较大加之骨髓间充质干细胞尚未发现其特有的表面标志,故较少应用[3]。目前常用方法仍为贴壁法和密度梯度离心法。
本实验采用贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,随着细胞传代,去除其它可贴壁的杂质细胞,传过三代后细胞形态趋向一致,获得较为纯化的梭形成纤维样细胞(MSCs)。应用密度梯度离心法在原代培养获得的细胞,仍需用贴壁法进一步纯化,并且其操作步骤复杂,离心过程中不可避免地造成细胞损失或损伤,同时发现其原代培养时细胞的活性和生长曲线都迟于贴壁法分离的MSCs,而且MSCs贴壁所需的时间较贴壁分离法长,这可能与离心过程中丢失了骨髓微环境中对骨髓间充质干细胞生长有利的细胞因子和促贴附物质有关。原代培养中可见离心法的MSCs纯度较贴壁法的MSCs大,但随着细胞的传代,两者之间的差别逐渐消失。本实验发现应用离心分离法与贴壁分离法经过传代都可获得活性好、形态均一的骨髓间充质干细胞,但在实验过程中要避免软组织的细胞污染冲洗出的骨髓细胞,对所用试剂尽量做到现用现配。同时应用离心分离法时应注意时间不能过长,离心力不能过大,尽量减少细胞的损伤。本研究揭示虽然密度梯度离心法理论上可在原代获得较纯化的细胞,但仍需用贴壁法进一步纯化,而且容易发生细胞污染和损伤等,因此其并不具有明显优势,相反贴壁分离法具有方法简单、细胞损伤小等优点。
总之,本实验应用的两种方法均可获得可靠的MSCs。对原代培养的MSCs,贴壁分离法具有对MSCs损伤小、易于贴壁生长和操作简单等优点,但其MSCs纯度较离心分离法稍低。经过多次传代后采用两种方法所获得的MSCs的生物学特性已无区别,均可获得具有良好的活性的MSCs。
[参考文献]
[1] Pittenger MF,MackayAM,Beck SC,et al. Multilineage potential ofhuman mesenchymal stem cell[J]. Science,1999,284(5411):143-147.
[2] 孙晋虎,石冰,王大章. A系小鼠胚腭突细胞培养及生物学特性的研究[J]. 华西口腔医学杂志,2002,20(6):441.
[3]邱丽燕,王金福. 骨髓间充质干细胞的研究进展[J]. 生物工程学报, 2003,19(2):136.
[4] Orlic D,Kajstura J,Chiment S,et al. Bone marrow cells regenerate in- fracted myocardium[J]. Nature,2001,410(6829):701.
[5] Wagner W,Wein F,Seckinger A,et al. Comparative characteristics of mesenehymal stem cells from human bone marrow,adipose tissue,and umbilical cord blood[J]. Exp Hematol,2005,33(11):1402-1416.
[6] Ringe J,Kaps C,Schmitt B,et al. Porcine mesenchymal stem cells induction of distinct mesenchymal cell lineages[J]. Cell Tissue Res,2002, 307(3):321.
[7] 傅文玉,路艳蒙,朴英杰. 人骨髓间充质干细胞培养及多能性研究[J]. 中华血液学杂志,2002,23(4):202.
细胞生物学特性篇7
因此，针对特点版本的教材（人教版新课标教材），对术语、概念的细节进行辨析，从而深化对特异性免疫过程的理解，是突破相关考点的关键。
一、免疫细胞来源的辨析
例1 科研人员为研究脾脏中某种淋巴细胞（简称M细胞）在免疫应答中的作用，进行了如下实验：
[组别＼&处理方式＼&检测结果＼&实验组＼&用肺癌细胞抗原处理M细胞后，分离出M细胞与胸腺淋巴细胞混合培养，在分离出胸腺淋巴细胞与肺癌细胞混合培养＼&部分淋巴细胞能杀伤肺癌细胞＼&对照组＼&未经处理的胸腺淋巴细胞与肺癌细胞混合培养＼&淋巴细胞均不能杀伤肺癌细胞＼&]
下列对该实验的相关分析，不正确的是（ ）
A.实验证明M细胞能够将肺癌细胞抗原呈递给胸腺淋巴细胞
B.经M细胞刺激后部分胸腺淋巴细胞增殖分化形成效应细胞
C.实验组培养液中含有能增强效应T细胞杀伤力的淋巴因子
D.实验组培养液中含有能特异性识别肺癌抗原的免疫球蛋白
解析 从实验操作分析，是否用抗原处理后的M细胞，与胸腺淋巴细胞混合培养，导致胸腺淋巴细胞能否杀死肺癌细胞，说明M细胞能呈递抗原，辅助活化胸腺淋巴细胞，故A项正确；从免疫细胞的形成条件分析，胸腺中成熟的淋巴细胞是T细胞，在抗原的刺激下，能够分泌淋巴因子、增殖分化成效应T细胞，故B项、C项正确；而能分泌免疫球蛋白――抗体的浆细胞，由B细胞增殖分化形成，B细胞是来自骨髓的淋巴细胞，不是胸腺淋巴细胞，故D项错误。
答案 D
点拨 免疫调节中涉及吞噬细胞、B细胞、T细胞、浆细胞、效应T细胞、记忆细胞等免疫细胞，这些免疫细胞的来源如下图：
①来源：免疫细胞的根本来源都是造血干细胞。在初次免疫中浆细胞、效应T细胞直接来自B细胞或T细胞；在二次免疫中浆细胞、效应T细胞不仅直接来自B细胞或T细胞，还可以来自记忆细胞。记忆细胞来自B细胞或T细胞。
②场所：吞噬细胞、B细胞在骨髓中发育，T细胞需要在胸腺中发育。
③条件：吞噬细胞、B细胞、T细胞的形成都不需要抗原的刺激；浆细胞、效应T细胞、记忆细胞的形成需要抗原的刺激。
④实质：形成各种免疫细胞的增殖分化过程中，细胞的遗传物质并未发生改变，只是发生了基因的选择性表达。
二、免疫细胞功能的辨析
例2 若H7N9禽流感病毒侵入人体，机体在免疫应答过程中不会发生的是（ ）
A.吞噬细胞摄取和处理病毒
B.T细胞合成并分泌淋巴因子
C.浆细胞进行分裂并分泌抗体
D.B细胞增殖分化形成记忆细胞
解析 H7N9病毒对人体来说属于一种特异性抗原，侵入人体后会激发人体的特异性免疫反应。在特异性免疫中，吞噬细胞能摄取、处理和呈递抗原，故A项正确；T细胞能分泌淋巴因子，故B项正确；B细胞能增殖分化形成浆细胞和记忆细胞，故D项正确；浆细胞能分泌抗体，但已高度分化，不具有分裂能力，故C项错误。
答案 C
点拨 在免疫调节中，免疫细胞具有不同的功能，概括如下表：
[免疫细胞＼&具体功能＼&识别抗原能力＼&分裂能力＼&分泌功能＼&吞噬细胞＼&识别、摄取、处理和呈递抗原；吞噬消化＼&非特异性识别＼&＼&溶菌酶＼&B细胞＼&识别、增殖分化＼&特异性识别＼&形成浆细胞和记忆细胞＼&＼&T细胞＼&识别、增殖分化；
产生淋巴因子＼&特异性识别＼&形成效应T细胞和记忆细胞＼&淋巴因子＼&浆细胞＼&产生抗体＼&不识别＼&＼&特异性
抗体＼&效应T细胞＼&识别、直接接触靶细胞＼&特异性识别＼&＼&＼&记忆细胞＼&识别、增殖分化＼&特异性识别＼&形成浆细胞或效应T细胞＼&＼&]
①在各种免疫细胞中，浆细胞是唯一不识别抗原的；吞噬细胞是识别抗原的细胞中，唯一不识别抗原特异性的；效应T细胞和记忆细胞只识别特定的抗原。
②B细胞和T细胞受到抗原刺激后，增殖分化都分别形成两种细胞。记忆细胞增殖分化形成浆细胞或效应T细胞，取决于记忆细胞本身的来源。
③B细胞、浆细胞只参与体液免疫；效应T细胞只参与细胞免疫；T细胞、记忆细胞参与体液免疫、细胞免疫；吞噬细胞参与非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫。
三、相关物质的辨析
例3 将小鼠B细胞注入家兔体内，产生免疫反应后，家兔血清能使小鼠T细胞凝集成细胞集团。而未经免疫的家兔血清不能使小鼠T细胞凝集成团。T细胞凝集现象的出现是因为（ ）
A.小鼠B细胞诱导家兔产生细胞免疫
B.小鼠T细胞诱导家兔产生体液免疫
C.小鼠B细胞和小鼠T细胞有相同抗原
D.小鼠T细胞和家兔T细胞有相同抗原
解析 注入家兔体内后，小鼠B细胞上的蛋白质等物质相当于抗原，刺激家兔产生免疫反应，在家兔的血清中可以找到相应的抗体。根据抗原和抗体之间的特异性结合特点分析，血清中抗体可以使小鼠T细胞凝集成团，说明小鼠的B细胞和小鼠T细胞具有相同的抗原。
答案 C
点拨 除了免疫细胞，许多物质也参与了免疫调节，最常见的是下列几类物质：
抗原：能够引起机体产生特异性免疫反应的物质，如病毒、细菌等病原体表面的蛋白质等物质，题目中常见的外毒素、内毒素、类毒素、凝集原属于抗原。
抗体：特异性免疫中的免疫活性物质，化学本质是蛋白质，由免疫细胞――浆细胞合成分泌，分布主要在血清、组织液、外分泌液。参与体液免疫，能与特定的抗原发生特异性结合。题目中常见的抗毒素、凝集素属于抗体。
淋巴因子：特异性免疫中的免疫活性物质，由免疫细胞――T细胞合成分泌，参与体液免疫和细胞免疫，促进淋巴细胞的增殖分化和功能。
溶菌酶：非特异性免疫中的免疫活性物质，化学本质是蛋白质，由多种非免疫细胞和免疫细胞合成分泌，分布广泛。参与非特异性免疫，泪液、消化液中的溶菌酶参与第一防线，体液中的溶菌酶参与第二防线。
抗生素：微生物产生的一类物质，能抑制或影响细菌、真菌等病原体的生命活动，作为药物使用，与机体自身的免疫功能无关，不属于免疫活性物质。
要点提示：
①抗原不一定是外来的，自身衰老、破坏、癌变的细胞也可以成为自身免疫反应中的抗原。
②抗原的结构特异性决定了抗体、效应T细胞和记忆细胞的特异性，使抗体、效应T细胞和记忆细胞只能识别特定的抗原。
③免疫活性物质不都具有特异性，不都由免疫细胞分泌。
四、体液免疫与细胞免疫的辨析
例4 下图所示实验能够说明（ ）
[LCM病毒][被LCM病毒感染的51Cr标记的同种小鼠细胞][分离淋巴细胞][测定上清液中51Cr释放量][4小时后][培养][4～5天后][加入][加入]
A.病毒抗原诱导B细胞分化的作用
B.浆细胞产生杭体的作用
C.病毒刺激淋巴细胞增殖的作用
D.效应T淋巴细胞的作用
解析 只有被LCM病毒感染的小鼠细胞发生破裂，才会释放细胞内的51Cr标记物，因此测定上清液中51Cr释放量，可以表明靶细胞的破裂，该过程是细胞免疫的结果，发挥作用的是免疫过的小鼠体内分离得到的效应T细胞，故D项正确、A项、B项错误；LCM病毒是作为抗原物质刺激小鼠，使其体内的T细胞发生增殖、分化，形成相应的效应T细胞和记忆细胞，强调的是分化出效应T细胞，故C项不准确。
答案 D
点拨 体液免疫和细胞免疫相互区别、同时彼此联系。正确区分两种方式，能迅速把握题目的考查对象。
[免疫
类型＼&体液免疫＼&细胞免疫＼&抗原
类型＼&细胞外的抗原＼&细胞内的抗原＼&作用
主体＼&抗体＼&效应T细胞＼&作用
对象＼&细胞外的特定抗原＼&特定靶细胞＼&作用
方式＼&抗体与抗原结合＼&效应T细胞直接接触靶细胞＼&作用
效果＼&抑制病原体的繁殖或黏附，形成沉淀、细胞集团，被吞噬、消化＼&靶细胞裂解死亡，病原体失去寄生基础，从而被吞噬、消化＼&参与
细胞＼&吞噬细胞、T细胞、B细胞、记忆细胞、浆细胞＼&吞噬细胞、T细胞、效应T细胞＼&参与
物质＼&淋巴因子、抗体＼&淋巴因子＼&]
要点提示：
①吞噬细胞、T细胞、淋巴因子参与了两种特异性免疫，判断时应从两种免疫的区别入手。
②两种特异性免疫相互配合共同发挥免疫效应，如：对付病毒感染，先体液免疫阻止病毒经血液循环而播散，再由细胞免疫消灭靶细胞。
1.无胸腺裸鼠是一种无毛变异小鼠，先天性无胸腺，常作为医学生物学研究中的实验动物。下列表述中错误的是（ ）
A.无胸腺裸鼠具有正常的体液免疫功能
B.无胸腺裸鼠应饲养在无菌环境中
C.无胸腺裸鼠对异体组织无排斥反应
D.人类癌细胞可在无胸腺裸鼠体内增殖
2.某人因过量注射美容制剂而出现头昏、站立不稳等症状。经医生诊断后，医生为其注射了肉毒杆菌抗毒素进行治疗，目的是（ ）
A.中和体内的肉毒杆菌外毒素
B.中和体内的肉毒杆菌凝集素
C.刺激机体产生特异性抗体发挥体液免疫作用
D.刺激机体释放出淋巴因子发挥细胞免疫作用
3.研究发现两种现象：①动物体内的B细胞受到抗原刺激后，在物质甲的作用下，可增殖、分化为效应B细胞；②给动物注射从某种细菌获得的物质乙后，此动物对这种细菌具有了免疫能力。则这两种物质中（ ）
A.甲是抗体，乙是抗原
B.甲是抗体，乙是淋巴因子
C.甲是淋巴因子，乙是抗原
D.甲是淋巴因子，乙是抗体
4.某种病菌感染人体并侵人细胞内后， 机体可以对该靶细胞产生免疫反应， 其中有（ ）
A.浆细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解， 从而使病菌抗原被抗体消灭
B.浆细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解， 从而使病菌抗原被淋巴因子消灭
C.效应T细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解，从而使病菌抗原被外毒素消灭
D.效应T细胞接触靶细胞， 导致靶细胞裂解，从而使病菌抗原被抗体消灭
细胞生物学特性篇8
关键词：植物；干细胞；培养；生长特性
中图分类号：R282.2／R282.71 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2012)01-0052-04
植物来源的天然产物作为先导化合物和药物的主要来源，曾在制药业的发展中发挥过非常重要的作用。近年其地位日渐衰落，主要是因天然植物生长缓慢、活性成分含量低，致使此类化合物的来源难以保障，难以适应现代制药业工业化大生产的需求。
鉴于天然化合物具有重要的药用潜力和经济价值，随着现代科学的发展，各领域的学者为解决其来源给出了自己的答案，较有成效的研究主要集中在以下几方面：(1)在微生物中表达天然产物的合成途径，采用转基因工程菌发酵方式生产某些活性成分，如紫杉醇等；(2)以容易获得的化工原料或天然前体为基础，半合成某些结构复杂的化合物，例如：青蒿素等；(3)植物组织培养，定向生产目标成分，如紫草素等。然而，由于很多天然产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径也非常多，例如紫杉醇(20步反应)、喜树碱(11步反应)、长春新碱(18步反应)等化合物的生物合成均涉及一系列繁杂的酶促反应，要化学合成需要多达数十步反应。这样的天然产物在很长一段时间内是难以依靠化学合成或者合成途径表达的方法实现原料供应的。而植物培养技术，以生源植物细胞或组织固有的生物合成途径为基础，利用内源的相关酶系统，结合诱导子和生物反应器技术，定向生产目标成分，经过多年研究，已经有成功工业化的案例(表1)。如日本Mitsui Petrochemical Industries采用人工培养紫草细胞方法获得紫草素，实现了该成分的工业化生产。所得的紫草素不仅用以生产抗炎药，制成唇膏，在本国高科技绿色产品的概念推动下，当年销售量达到200万支，获得了良好的市场效益。美国Phyton Biotech公司利用红豆杉细胞培养技术，结合大量的诱导子实验，创立了紫杉醇高产的方法，其专利中披露的最高产量达902 mg／L。该公司目前已经获得FDA批准，以此专利技术为施贵宝公司供应紫杉醇。
1.植物培养技术面临的挑战
尽管已有许多成功的案例，植物培养技术在适应工业化生产过程中，仍要面临着很多问题需要解决。(1)很多活性成分在生源植物中的分布，呈现组织特异性。某些特定的组织培养物(如：茎、根、芽、毛状根等)，可以表现出与生源植物类似的代谢产物谱，但脱分化细胞中的二次代谢产物丰度非常低，甚至根本没有。例如：喜树碱在脱分化细胞中含量非常低，或者根本检测不到，但在喜树的根培养物中，其含量则与原植物不相上下。与此类似的是，在黄花蒿的脱分化细胞中，也没能检测到其抗疟成分――青蒿素。虽然，培养特定组织容易获得较高产率，但是，该类培养物在常用的生物反应器中难以生长，甚至不能存活，需要开发定制特殊的反应器，难以适应现阶段工业化生产的需要。脱分化细胞在该方面具有明显的优势，能够很好的适应商业化生产的需要。因此，如何提高脱分化细胞中目标成分的含量及产量，已成为目前植物组织培养研究的热点。现阶段采用的方法有：细胞系优选、培养条件优化、诱导子的使用、前体饲喂、阶段培养、灌注培养、细胞固定化等。根据具体情况选择不同的方法，可以获得较理想的结果。(2)植物细胞长期培养时，由于细胞不均一、基因突变、环境因素影响等原因，其生理、生化以及遗传性状逐渐发生变化，成为其商业化的另一大障碍。含量低和易变性作为植物细胞培养商业化的两大阻碍。迄今的研究多集中在前者上，经过多年努力，已建立了一系列卓有成效的实验技术和解决方案。相对而言，控制可变性的研究尚处于较浅水平，鲜有确实可行的方法。近年，在长期培养的细胞系中，随着培养时间延长，代谢产物含量普遍降低，使研究者日益关注植物细胞培养中可变性的机制以及控制方法。由于植物的种间差异和多样性，使此问题异常复杂，传统的研究方法和角度难以对此问题做出全面解答。由韩国和英国学者开发的植物干细胞培养技术，利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，为解决上述问题提供了一个全新的方案。
2.植物干细胞培养基本方法
2010年11月，韩国Unhwa公司和英国爱丁堡大学的研究者将以红豆杉干细胞培养为主体的研究成果，以“Cultured cambial meristematic cells as a source of plantnatural products”为题在Nature的子刊Nature Biotechnology上发表。该刊同期还发表了对此成果进行报道评论的综述“Plant natural products from cultured multipotentcells”。以红豆杉体系为代表的植物干细胞培养技术，吸引了全世界的关注。
植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。
根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要有以下几种。
木本植物维管形成层分生(以红豆杉为例)：采取野生红豆杉的新生枝条，表面灭菌后切开；将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织轻轻地从木质部剥离；将获得的组织在分离培养基上培养30d后，新生的形成层细胞和其他脱分化细胞(愈伤组织)因组织现状的差异自然分离――形成层细胞为均一生长的平板状组织，愈伤组织则为不规则的聚集生长物；将获得形成层细胞转移到生长培养基上培养。目前报道该方法成功的案例仅限于红豆杉属。
草本植物储藏根的维管形成层(以人参为例)：取户外培育、平滑无伤口的人参，表面灭菌；将主根削成薄片，再切成长5～7 mm，宽5～7 mm，高2～5 mm，使每片都含有形成层；将制备好的外植体用蔗糖高渗透液处理，使分化的组织――皮层、韧皮部、木质部、髓部等失去活力，仅形成层能保留生命力；将渗透液处理过的的外植体转移到诱导培养基，培养3-7 d后，外植体的形成层变成淡黄色；再过7～14 d后，淡黄色部分有一圈细胞生长出；将外植体继代到生长培养基，培养10-20 d后，即可分离得形成层细胞，所得细胞继续在同样的培养基上培养。目前，仅有人参属确实报道成功建立了该类干细胞培养体系。
静止中心(以水稻为例)：将稻谷剥皮，表面灭菌，干燥至水分完全去除；将干种子种入培养基，25℃下培养5 d，使其发芽；种子发芽5-6 d后，收集含有静止中心的根组织，去掉根端的根冠，从切口开始截取1 mm长作为外植体；将外植体放入诱导培养基，30 d后观察到细胞被
诱导出：所得静止中心干细胞为白色，均一，且周围环绕着黏性物质(黏原蛋白)，而一般根组织得到的细胞不均一，黄色，无黏性物质，这些差异使干细胞可以和其它细胞自然分离；将分离得到的静止中心干细胞转移到生长培养基。目前，利用该方法可以获得水稻、玉米等植物的干细胞培养体系。
3.植物干细胞培养体系的特性研究
不同来源的植物干细胞培养体系，有着不同的生长特性(表2)，这些特性决定了其各自的用途。这些方法由韩国Unhwa公司开发，现已申请了一系列相关专利。
所有的研究中，考察红豆杉干细胞培养体系的生长特性最为深入和全面。在完成了培养体系的初步建立工作后，研究者首先考察了获得细胞的形态、遗传学特征和基因组学方面的考察，以验证培养的细胞确为维管形成层细胞。另一方面，对培养体系的生长特性进行了研究，主要考察了细胞生长速度、长期培养稳定性(时长22个月)以及对生物反应器的适应性，并与脱分化得到的愈伤组织进行对比。红豆杉干细胞培养体系不仅生长速度快，性状稳定，而且由于细胞具有游离生长、液泡分散的特性，培养体系对各种类型(气升式、搅拌桨式)、各种规格(3L、10L、20L、3吨)的生物反应器均具有良好的适应性，具备了商业化生产的基本条件。为开发培养体系的实用价值，研究者诱导了所得培养体系活性成分，使其中紫杉醇含量提高了数十倍，并进一步进行灌注培养，促使更多的紫杉醇分泌到培养基中[含量268 mg／kg(细胞鲜重)，分泌率74％]。此外，研究者还系列测试了红豆杉干细胞提取物的抗癌活性，在抑制HHC-95肺癌细胞、PC-3前列腺癌等瘤株的实验中，提取物均显示了可与紫杉醇媲美的抗癌效果(该实验所用的培养体系未经诱导，经检测基本不含紫杉醇)。以上工作，从各方面为该技术的商业化提供了有力的技术支持。
对于水稻等干细胞的研究，主要目的是建立植物细胞银行。建立细胞银行可使植物细胞采用类似动物细胞冻存一复苏的培养方法，彻底解决植物细胞培养过程中的变异问题。该策略虽简单可行，但是一般的植物细胞却难以在冻存后顺利复苏，其存活率非常低，且回复生长能力的延迟期漫长。因此，该方面的研究一直停滞不前。如表2所示，以上各种干细胞的一个共同特征就是可在冻存条件下保持良好的生命力，这使植物细胞银行的建立具备了良好的前提。此外，植物干细胞培养体系建立方法的多样性使该技术具有普遍推广的潜力，因而可以预见，植物细胞银行中能够容纳的植物种类将非常丰富。作者相信，随着植物细胞银行的建立，不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。
目前，人参干细胞的研究成果，主要用于保健品和化妆品的开发，除了相关专利和文章外，已有相关产品面世。相信在植物干细胞这个高科技和全天然概念推动下，该类产品将会很快地在高端市场占有一席之地。
4.植物干细胞培养体系的应用展望
植物干细胞培养的相关报道给植物培养研究带来了新的视角和方法，特别是为长期培养过程中细胞的稳定性和细胞长期保存等问题提供了很好的备选答案，但在目前有限的相关报道中，仍存在着一些不足和疑问。以报道最为充分的红豆杉系统为例，未经诱导的干细胞体系中，基本不含有紫杉醇，研究者需要经过诱导提高其含量。但是，诱导后的细胞是否仍保持着干细胞的特性，尚未进行过相关考察。再者，研究人员发现，经过22个月的培养，干细胞的生长速度和外观都保持着稳定，然而，没有文献表明长期培养细胞的显微形态、遗传学特征和基因组学等方面是否保持稳定。此外，课题的研究者采用自行诱导的愈伤组织作为对照体系，与干细胞进行生长率、稳定性、紫杉醇含量等多项指标对比，表现出干细胞的优越性。如前文所述，美国Phyton公司已经采用红豆杉愈伤组织成功地生产紫杉醇，并已获FDA批准作为施贵宝公司的紫杉醇供应商，其专利在细胞生长、代谢产物积累等方面均有系统研究，并取得了很好的效果。因此，Lee等所做的干细胞和脱分化细胞的性能对比，只能说明研究者所在实验室培养系统的优劣，尚不能真正说明干细胞培养与脱分化培养这两种技术的优势。