细胞自噬范文

细胞自噬篇1

细胞自噬(Autophagy)是通过细胞质中的酸性溶酶体对异常细胞器、蛋白质以及病原体的吞噬、降解，从而形成一种胞内环境分解代谢的平衡机制。细胞自噬对机体的保护与防御尤为重要，特别在免疫系统中发挥重要的生物学作用，是链接先天性免疫与适应性免疫的重要组成部分。当抗原表达时，细胞自噬还可通过先天免疫与适应性免疫的交叉途径而潜在的获得抗原，并在胸腺中调节CD4+T细胞的克隆，除此以外，树突细胞交叉激活CD8+T细胞，促进淋巴细胞尤其是T细胞的存活，骨髓B细胞发育以及细胞因子的产生。细胞自噬是细胞饥饿或低氧等不良条件下的应激反应，是众多应激反应中第一个被描述的，可以说自噬形成了最古老的免疫防御。在真核细胞早期演化的活动中细胞自噬可能是保护细胞质免受外来生物侵入的重要途径，这种原始免疫功能进化的残余物可以观察到自噬能有效地去除线粒体。应对复杂的环境与脊椎动物的自身免疫系统疾病，自噬发挥了很多方面的作用，是一个真正的监管机制和免疫系统效应器。

1细胞自噬的有效机制

哺乳动物细胞中多个自噬途径(微小细胞自噬和分子伴侣介导的自噬)存在退化模式，只有巨自噬(以下简称为“自噬”)有明确的免疫作用。自噬溶酶体不像蛋白酶，降解泛素标记的短链蛋白，自噬可以去除大的蛋白质聚合物和整个细胞器，传递到溶酶体。细胞自噬相关蛋白(Autophagy-relatedgeneproduct，Atg)控制吞噬并把目标吞噬到双层囊泡中，称为自噬体，之后与溶酶体融合，从而形成一个单膜的自溶酶体。而这里的腔内容物消化再生返回给细胞质重新利用。自噬起始时，活化的UNC-51-样激酶(ULK)(在酵母中称为Atg1)与Ⅲ型的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)hVPS34、Beclin1和Atg14一起，在内质网形成隔离膜。hVPS34产生磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)招募PI3P-结合效应因子WIPI-1和WIPI-2，有利于进一步形成隔离膜［1］。微管相关的轻链3(LC3)，产生两个蛋白共轭系统和自噬体原型标志，随后新生的自噬体被拉长。共轭结合物Atg-5-Atg-12结合Atg16L1形成E3样酶，有助于LC3与共轭脑磷脂(PE)形成LC3-PE(也简称为LC3-Ⅱ)。Atg5-Atg12-Atg16L1复合物也有利于定位第二共轭体系的隔离膜。LC3首先被Atg7激活，然后通过Atg3到内质网加工。之后LC3-Ⅱ可以插入隔离膜并促进其伸长成一个封闭双膜的自噬体。最后，自噬体融合晚期内体或溶酶体细胞器，以形成终端消化室。

2先天免疫中的细胞自噬

在先天免疫中，自噬有助于模式识别受体下游的效应反应，继而促进吞噬作用和细胞因子的产生。

2.1自噬与模式识别受体模式识别受体(Patternrecognitionreceptor，PRR)是一组先天受体，其通过对外源微生物特定基序来确定检测入侵的病原体。这些基序被统称为病原体相关分子模式(Pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP)，并且当他们结合同源PRR的同时也刺激了无数的效应反应。Toll样受体(TLRs)是一组与PRRs紧密相连的自噬途径。在脂多糖(LPS)刺激后TLR4能够诱导小鼠巨噬细胞的自噬。LPS刺激TLR4的结果表明，细胞自噬可以增加结核分枝杆菌细胞间隙［7］。自噬不仅充当TLR下游信号，而且在TLRs识别PAMPS中也发挥作用。Lee等的研究表明，自噬能够在浆细胞样树突状细胞(pDCs)中为TLR7提供病毒配体，且能诱导感染水泡性口炎病毒和仙台病毒后的机体产生Ⅰ型干扰素。NOD样受体(NLRs)是一组先天受体，负责感应胞内细菌，代表第二类PRRS并且链接自噬。自噬也可以充当RIG样受体(RLRS)介导病毒检测的下游通路。Tormo等［9］人的结果表明，用dsRNA模拟聚肌苷胞苷酸，通过RLRMDA-5治疗，能够在黑色素细胞中诱导自噬，导致自噬依赖性细胞死亡。多个研究表明自噬负调控RLRS，自噬在通过PRRS感染的途径下，呈现出复杂的调节作用，在某些情况下，通过RLRS对病毒识别的处理，可有效调节和清除细胞内的细菌，但其功能上却以被动形式存在。

2.2自噬和细菌处理虽然自噬经典定义为无针对性大批量降解途径，自噬的形式却演变为具有选择性，如线粒体(线粒体自噬)，过氧化物酶(过氧化物自噬)和胞内细菌(异体吞噬)持续在细胞质中躲过了内吞途径。自噬是由称为P62(又称为SQSTM1)的中央接头器蛋白质介导，识别细菌的聚泛素，并且通过其LC3相互作用区(LIR)链接到LC3阳性吞噬泡，摄取胞内细菌。通过这种方式，自噬体靶向定位胞内病原体李斯特菌。在这种细胞中，P62识别被多聚泛素标记的李斯特菌，反过来又结合LC3，在细菌表层形成多聚泛素-P62-LC3从而允许自噬体吞噬。自噬能促进B细胞融合，促进卡介苗空泡与溶酶体的融合，从而杀灭分枝杆菌。结核分枝杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌的吞噬体的相关研究证明，自噬是破坏胞内细菌的替代方法［12-15］。大多数细菌特异性自噬包括胞内细菌的捕获，同时也可以消除胞内细菌。Yuan等的研究表明，假单胞菌属能诱导肺泡巨噬细胞株MH-S自噬。中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是由外染色质构成的，通过中性粒细胞的释放，促进细胞死亡的过程，区别于细胞凋亡和坏死。Itakura等［17］对NET形成自噬的重要性进行了验证，表明自噬可诱发或抑制NET形成且是调节NET功能的重要因素。

2.3自噬和细胞因子自噬只有在细胞因子和免疫相关的细胞表面受体的调控下才能发挥作用，且在各种促炎性细胞因子的生物合成和分泌中也发挥积极作用。IFN-γ是一类强效的Th1类自噬诱导剂，而Th2细胞IL-4和IL-13对其具有抑制作用。LPS刺激ATG16L1缺陷型巨噬细胞，IL-1β和IL-18的分泌都增加［4］。多种细胞因子在自噬缺乏时分泌增加，Atg5fl/flLysM-Cre重组小鼠感染结核分枝杆菌较野生小鼠，IL-1α、IL-12、IL-17和CXCL1分泌量增加［18］，TNF-α和IL-6的分泌亦受自噬的调控。用3-MA抑制自噬或敲除beclin1基因和ATG7，从而促进巨噬细胞与DC分泌的IL-1α、IL-1β和IL-23，这反过来又增强了γδT细胞的IL-17、IFN-γ和IL-22。

3获得性免疫的自噬

3.1自噬与抗原呈递抗原提呈是指有效地参与并提供抗原到主要组织相容性复合体(MHC)分子的途径，往往需要细胞因子和细胞器之间复杂的相互作用。自噬在传统的MHCⅠ类途径中，通过高尔基体装载到MHCⅠ类分子的细胞表面并在表达之前进行抗原加工(TAP)，蛋白酶体加工相关的转运蛋白转成肽运到内质网(ER)。自噬涉及MHCⅠ类呈递的另一种途径，存在于树突细胞和巨噬细胞，称为交叉呈递。交叉呈递，MHCⅠ类分子通常会通过MHCⅡ类途径形成通路提供细胞外源抗原，从而诱导的CD4+T细胞免疫应答。通过这个机制CD8+T细胞可以对外源性抗原和吞噬成分进行免疫应答［21］。CD4+T细胞识别MHCⅡ类分子表达于专职抗原呈递细胞(APC)和上皮细胞上的抗原。与通过蛋白酶体产生的内源性MHCⅠ类肽不同，外源抗原在胞质溶胶中的溶酶体内被溶酶体蛋白酶降解并在内质网中转运到MHCⅡ类隔室(MHCs)，装配载成MHCⅡ分子。溶酶体系统在MCHⅡ类分子中有突出作用，并联系着自噬的抗原递呈。自噬体输送物质到溶酶体，是胞内MHCⅡ类抗原的重要来源。最近研究报道DCs中从MHCs发出，形成自噬体样结构。这些结构同时参与抗原处理以及自噬体标志物LC3和Atg16L1的分子机制。自噬的一种特殊形式细胞APCs，对特定抗原进行呈递时，自噬又进一步增加递送抗原的MHC分子的复杂性。

3.2T细胞中的自噬自噬可以通过影响细胞表位的呈现，从而影响随后的T细胞应答的性质与强度，因此认为自噬作用是T细胞活化的重要调节器。虽然较小细胞的胞浆有限，但T细胞也进行自噬和自噬基因的表达。在小鼠和人的CD4+和CD8+T细胞进行低水平自噬，并且可以随着TCR刺激［24，26］和HIV感染而在体外诱导。小鼠胸腺的皮质胸腺上皮细胞(cTECs)上已经观察到高水平的自噬，并表明自噬在T细胞的发育和选择上有作用。基质中Thymi(胸腺嘧啶)缺失Atg5表现出特异性CD4+T细胞的多器官炎症，表明自噬在T细胞中具有选择性与中枢耐受性，但观察到CD8+T细胞的选择性没有任何变化。一些遗传模型系统已经被用来研究体内自噬在T细胞中的特定角色，例如在Atg5－/－胎儿肝脏嵌合体，Atg7flox/floxLck-Cre和Vps34flox/floxCD4－Cre自噬缺陷小鼠中，T细胞在胸腺内正常发育，但外周血中的T细胞失去自噬的效果更明显。在T细胞特异性缺失的Atg5－/－，ATG7－/－，ATG3－/－和VPS34－/－小鼠脾脏和淋巴结中T细胞数减少，与此同时观察到Atg5－/－，ATG7－/－和VPS34－/－细胞凋亡水平的增加，激活后T细胞也不能有效地增殖。这些缺陷的出现来源于自噬缺陷的T细胞调节细胞器质量的控制。最近发现自噬能够调节T细胞的能量代谢，T细胞活化中溶酶体抑制剂阻断自噬，抑制ATP的增加。胸腺早期发展的iNKT(阶段0)，小鼠的特异性缺失VPS34的T细胞表现出阻断作用［31］。同样的研究也报道了自噬在FOXP3+Treg细胞稳态和功能上起至关重要的作用，表明自噬的影响力在T细胞生物学中延伸到多个方向。

3.3B细胞的自噬Miller等［32］采用Atg5－/－Rag－/－小鼠和特异性Atg5vB细胞缺失小鼠进行实验，结果发现自噬缺陷B祖细胞无法在骨髓B祖细胞和前B细胞之间过渡，表明自噬是B细胞发育的必要条件。与T细胞相同，当自噬受到周围环境的影响，B细胞也随之受到严重影响。而缺失Atg5的B细胞小鼠表现为B-1a中的B细胞动态平衡。体外LPS刺激缺陷型Atg5的B细胞能有效地分化成浆细胞(PCs)，表现出正常的增殖、细胞肿大和CD138的表达。

4结语

现在我们知道，自体吞噬与免疫系统有很重要的联系，并且免疫系统的许多方面依赖于自噬的调控和一些效应功能的介导。先天免疫系统最为明显，并且自噬在固有免疫和适应性免疫中抗原加工和呈递途径上起支点作用。但对于MHCⅠ类的自噬不是很清楚。在适应性免疫中，自噬是淋巴细胞体内平衡必不可少的。相比其他免疫细胞，自噬可应对ROS的水平增加;或者在免疫细胞中，自噬相关的细胞器具有相对宽泛的动态平衡。在淋巴细胞感染反应中，我们队B细胞的自噬进行了描述，而对于T细胞的自噬仍然缺乏了解。在B细胞中，我们在淋巴细胞感染反应中开始描述自噬的作用，而对于T细胞的自噬仍然缺乏了解。T细胞会以何种自噬途径降解方式来应对抗原?T细胞利用自噬蛋白的新作用仍然未被发现。通过操纵自噬以便有效地调节先天免疫系统的能力，表明在适应性免疫设定中针对自噬可能会在疫苗接种和老化领域上产生巨大的作用。

细胞自噬篇2

很少有人会拿死亡来开玩笑。然而，美国电影《巨蟒与圣杯》却这么做了。影片中，一名殡葬工人赶着已装满尸体的马车，走过一个瘟疫肆虐的中世纪村庄，一路大声吆喝：“家里有死人的，快把尸体带出来！”闻声，一个农人扛着一个老人，向殡葬工招手示意。可是，这显然不是一具尸体，老人还在挣扎，不愿意上马车。殡葬工起初拒绝将这位老人带走，但农人执意要把老人放到马车上：“虽然他还没死，但他很快就会死掉！要是再把他留在家里，我们也要玩完！”老人有气无力地辩解：“我明天就会好起来的。”但农人已很不耐烦，于是狠狠地敲了一下老人的头部，然后把他扔上了马车。

这无疑属于谋杀。但对于科学家来说，这一场景似乎并不陌生：农人的做法与生物体（包括人类和动物）辨别并处理自身的濒死细胞太相似了。

在今天看来，农人的确是过于冷酷无情。但在影片所反映的古老年代，他的做法却可能是非常明智的，因为如果不把那位已病入膏肓的老人及时抬走，瘟疫就会在家中进一步蔓延。由于当时的医疗水平很低，就难免造成更大的灾难。对生物体来说，把身上那些濒死的细胞及时处理掉，同样是十分重要的。如果健康的细胞不能及时把濒死的细胞吞没掉，后者就可能会分解，从而引起周围的组织发炎，或者引发组织对死亡细胞所释放出的物质进行免疫性攻击。事实上，最近有多项研究结果表明，如果不及时把已死亡的细胞去除，就会引发炎症、狼疮和糖尿病等自体免疫性疾病。

活着还是死去是个问题

在生物体的生长发育阶段以及成年后，随时都有大量已死亡的细胞需要被清理掉。在一种被称为“凋亡”的过程中，许多已受损害或不再被需要的细胞都会自杀。比如，人类胚胎开始时在手指和脚趾之间是有蹼状物的，就像鸭蹼一样，但在婴儿出生之前，组成“人蹼”的细胞全都会自杀，“人蹼”也随之消失。据估计，在幼鼠的胸腺中，每天都有大约1000万个细胞凋亡。其实，在任何动物的一生中，一旦体内的“卫士”――免疫细胞在成功抵挡危险微生物的进攻之后，免疫细胞都会像日本武士一样“切腹自尽”。

毫无疑问，即使处于健康状态，生物体内也存在着大量濒死的细胞。许多科学家感兴趣的是，细胞是如何自杀的？它们为什么要主动寻死？原来，生物体依靠一种被称为“巨噬细胞”的免疫细胞来吞食凋亡细胞，从而解除凋亡细胞所带来的危险。在紧要关头，其他细胞也能完成这一任务。关键问题是：这些“殡葬工人”――免疫细胞是如何决定到底应该吞食这个细胞还是把它留下来不管。换句话说，免疫细胞是如何识别濒死细胞和健康细胞的呢？

在过去十来年里，科学家已辨认出了多种巨噬细胞的表面分子，它们能够识别自杀细胞。他们还在濒死细胞的表面发现一种分子，它会请求巨噬细胞吞食濒死的细胞。2002年年底，科学家又发现了数种更为奇妙的巨噬细胞，它们会主动寻找那些濒死细胞，并将其清除掉。不仅如此，科学家还发现，健康细胞会发出大意为“我还没死”的“呼叫”，以此来提防那些东嗅嗅、西闻闻，四处寻找濒死细胞的巨噬细胞“错杀无辜”。科学家说，健康细胞的“呼叫”是一种“分子意义上的呼叫”，也就是说，细胞表面的某些分子能表明细胞的活性，并且这种信息能被巨噬细胞所识别。

凋亡时发信号但求一死

在研究如何清除凋亡细胞时，科学家们有一个假设，那就是巨噬细胞能够识别位于自杀细胞表面的某种或某些物质。这些物质可被看作是一种信号，对巨噬细胞而言，这种信号的意思为“吃掉我吧”。大约在十年前，科学家首次发现一种被认为是发出“吃掉我吧”信号的特殊分子，它就是人体免疫细胞在凋亡过程中表面出现的磷脂丝氨酸分子，正是由于这种分子的“邀请”，巨噬细胞才来吞食正在自杀的免疫细胞。这不由得让人想到，可能每一种能被巨噬细胞识别的凋亡细胞，其表面都存在那种能发出“吃掉我吧”信号的磷脂丝氨酸分子。

磷脂丝氨酸是存在于动物细胞膜里的一种类脂化合物。不过，它通常不会出现在细胞膜表面。在健康细胞中，磷脂丝氨酸存在于细胞膜内部。而在经历凋亡过程的细胞中，有一种酶会将磷脂丝氨酸迅速推至细胞膜表面。于是，凋亡细胞就会发出“吃掉我吧”的信号。

几年前，进一步的研究发现，巨噬细胞表面有一种蛋白质能与磷脂丝氨酸分子结合。该蛋白质被称为“磷脂丝氨酸受体”，正是它引发了巨噬细胞吞食凋亡细胞的“食欲”。另外，还有研究发现，如果把该受体的基因引入通常不与凋亡细胞发生作用的细胞内，经过基因改造后的细胞同样能识别并吞食濒死细胞。

处理“尸体”前先搔痒痒

科学家还发现，在处理细胞“尸体”方面，还有其他一些受体在发挥作用。比如，巨噬细胞表面有一种被称为“清道夫受体”的蛋白质，它们能让巨噬细胞与一些不同的类脂化合物结合。不过，生物学家对此类受体在清理细胞“尸体”过程中所发挥的具体作用还不太清楚。令人难解的一点是，某些“清道夫受体”既可与磷脂丝氨酸结合，又能与其他一些分子结合，所以很难判断到底是谁发出了“吃掉我吧”的信号。另外，科学家只知道巨噬细胞表面有一些受体不与磷脂丝氨酸及其他已知分子结合，却不清楚它们究竟是在同什么分子结合。因此，科学家提出了一种叫做“拴与搔”的理论，认为这些受体的作用首先是帮助巨噬细胞紧贴（就好比是拴住）濒死细胞。接着，磷脂丝氨酸与受体结合。最后，巨噬细胞才会将濒死细胞吞没。打比方来说，受体先为濒死细胞搔了一下痒痒，然后巨噬细胞才将其吃掉。

关注细胞死亡创造生机

尽管对生物体清理其内部濒死细胞的细节还了解得不够清楚，但此方面研究的医学意义却正在变得越来越清晰。在英国，甚至已出现了一家以此为主业的生物技术公司，专门研发针对病情来加速或延缓凋亡细胞清除过程的新疗法。

适当及时地处理掉濒死细胞，对控制炎症具有十分重要的意义。首先，如果巨噬细胞能在濒死细胞死亡、爆裂之前就将其吞掉，就能彻底阻止炎症的发生；其次，巨噬细胞在吞食细胞“尸体”时会分泌一些化学物质，这些物质能抑制其他参与制造炎症的免疫细胞的生长。

举例来说，胞囊纤维化是一种令人非常痛苦的疾病，患者的肺部会因慢性炎症而充满黏液。现在看来，该病的起因也许正是没有把那些已死亡的细胞很好地清理掉。在患者排出的痰中，凋亡细胞数量非常大。患者肺部有大量能破坏蛋白质的酶，所以巨噬细胞就可能看不见那些凋亡细胞，因为巨噬细胞的蛋白质受体一旦被破坏，就无法辨识由凋亡细胞表面的磷脂丝氨酸发出的“吃掉我吧”的信号。

细胞自噬篇3

[关键词] 心肌细胞；心肌肥大；番茄红素；血管紧张素Ⅱ；自噬相关基因

[中图分类号] R542.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）11（c）-0011-04

The effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ

WANG Haining LI Jilin YAO Huaiqi YANG Baojun XU Tan

The First Affiliated Hospital of Shantou University， Guangdong Province， Shantou 515041， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ）. Methods Cardiac hypertrophy was induced by AngⅡ incultured neonatal rat cardiomyocytes. Morphology and expression of hypertrophy marker atrial natriuretic peptide （ANP） were detected by optical microscope and Real time PCR. Protein level of Atg6 （Beclin1） and autophagic marker， LC3 were tested by western blotting. Results Lycopene down regulated cell surface area [（355.82±40.45） vs （517.19±52.31）， F = 56.518， P < 0.05] and RNA expression of ANP [（12.16±1.41） vs （17.83±2.07）， F = 157.048， P < 0.05] in cardiac hypertrophy induced by AngⅡ. Lycopene increased expression of autophagy related gene Beclin1 [（0.685±0.058）， F = 202.873， P < 0.05] and LC3 protein [（0.608±0.045）， F = 177.114， P < 0.05]. Blocking autophagy by 3-MA could significantly reduce the impact of lycopene on myocardial hypertrophy induced by AngⅡ（P < 0.01）. Conclusion Lycopene may inhibit myocardial hypertrophy by activating autophagy.

[Key words] Cardiomyocyte； Cardiac hypertrophy； Lycopene； Angiotensin Ⅱ； Autophagy related gene

番茄红素（lycopene，Lyc）是一种广泛存在于红色水果和蔬菜中的天然生物色素，属于类胡萝卜素一族，因最早发现于番茄中而得名[1]。目前国内外大量的研究证明Lyc不仅有极强的抗氧化能力[2]，还具有抑制炎症因子表达、抗癌、预防衰老等多种生物学效应[3-4]。虽然，近年来有少量关于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制动脉粥样硬化等文献报道[5-6]，但到目前为止，未见有关于其在心肌肥大方面的作用和机制的研究。因此，探索其内在的作用机制对于寻找预防和控制高血压等心脏肥大疾病的临床有效治疗具有重要的意义。

心肌肥大的本质是细胞合成代谢与分解代谢的失衡，机体主宰分解代谢的途径主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是广泛存在于真核细胞中一个保守的生物学现象，它是通过包裹待降解物形成自噬体，然后与溶酶体结合进行多种酶的消化及降解，参与机体受损细胞器和蛋白质的清除，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新、维持内环境稳定的重要方式[7]。微管相关蛋白1轻链3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特异性蛋白，分为胞质型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，笔者已经证实在心肌肥大中自噬受到抑制，阻断自噬会促进心肌肥大的发展，而Lyc是否对心肌肥大产生作用，其作用是否与自噬相关尚未明确；本研究旨在AngⅡ诱导的心肌肥大中明确Lyc的作用，探讨Lyc和自噬的关系。

1 材料

1.1 动物

SD乳鼠，清洁级，1～2日龄，汕头大学医学院实验动物中心提供（SCXK粤2012-0017）。

1.2 主要试剂

DMEM-F12培养基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型胶原酶（B1067）（Gibco）；5-溴脱氧尿嘧啶核苷BrdU（B5002），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和3-甲基腺嘌呤3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相关蛋白1轻链3 LC3 Ⅰ/Ⅱ抗体（3868s），Bclin1抗体（3738s）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印迹发光液（WBKLS0100）（Millipore），四氢呋喃（THF）（tetrahydrofuran）和2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海宝曼生物科技有限公司）；无核酶水（9012），逆转录酶（DR100A），RNA酶抑制剂+脱氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。

2 方法

2.1 原代心肌细胞分离和培养

消毒乳鼠，开胸取心脏，用D-Hank's溶液去血污，分离心室。置入离心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶37℃消化10 min，弃上清，放入0.05%Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化2 h。用上述胰酶重复消化1～2次，每次约6 min。将细胞悬液集中放入含10%胎牛血清培养基，均匀接种到培养皿，放置于5% CO2的培养箱60 min以分离成纤维细胞。以1×106/mL密度接种于6孔板，加入100 U/mL链霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纤维细胞生长，最后放入50 mL/L CO2培养箱内培养。接种24 h后80%的细胞生长成片并有规律搏动时，换无血清DMEM处理24 h后分组干预。在予以Lyc处理前，先将Lyc溶解于含有0.025%丁基羟基甲苯（BHT）的四氢呋喃。其在培养基中的浓度控制在0.05%（V/V），不会影响细胞活性。

2.2 细胞实验分组

首先在AngⅡ（1 μmol/L）诱导的心肌肥大中，观察Lyc（5 μmol/L）对细胞的作用，将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc组（5 μmol/L）和Lyc组（5 μmol/L）；于48 h检测心肌肥大的标志物ANP的mRNA表达水平。为观察心肌肥大时Lyc（5 μmol/L）对自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的影响，将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc组（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）组+3-MA（5 μmol/L）组；于48 h以Western blot法测定Beclin1和LC3蛋白的水平。

2.3 细胞镜检

用AngⅡ和（或）Lyc干预48 h的心肌细胞以4% PFA固定，显微镜400倍拍照，每组取50个同样大小视野，利用图像分析软件Image pro plus 6.0计算细胞面积[9]。

2.4 Western blot检测蛋白的表达

冰上裂解细胞30 min，收取蛋白。取总蛋白进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白以80 V，100 min转至PVDF膜上；用50 g/L的BSA封闭1 h，加LC3B抗体（1∶1000）、GADPH抗体（1∶10 000）4℃孵育过夜；次日用TBST洗膜，与辣根过氧化物酶标记的抗体（1∶10 000）室温孵育1 h；用ECL显影、曝光。采用图像分析软件检测蛋白条带的灰度值，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ条带的比值代表LC3蛋白的表达水平，其余以GAPDH作为参照[9]。

2.5 实时定量PCR

常规Trizol裂解法提取mRNA并逆转录成cDNA。参照文献[9]做标准曲线和定量PCR体系。在Roche PCR分析仪器里扩增目的基因，反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30循环，72℃ 6 min。反应结束后，使用PCR仪配套软件进行分析。重复3次，数据进行统计学分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

2.6 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，各组之间的差异用One-way ANOVA比较均值的单因素分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用

本研究从心肌细胞形态、细胞面积及心肌肥大标志物水平这三个方面，明确Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用。将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和Lyc（5 μmol/L）组；结果显示，与对照组比较，AngⅡ刺激48 h后细胞面积增大（P < 0.01），心肌肥大标志物ANP的mRNA水平上调（P < 0.01）；Lyc结合AngⅡ干预，细胞大小和面积明显减小（P < 0.05），ANP的mRNA比值显著下降（P < 0.05）；而用Lyc本身对心肌细胞大小和形态无明显作用（P > 0.05），ANP的mRNA比值无显著影响（P > 0.05）（图1、表1）。提示Lyc可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

与对照组比较，**P < 0.01；与AngⅡ组比较，*P < 0.05

图1 Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用

表1 四组大鼠心肌细胞面积和ANPmRNA测定结果比较

（x±s，n = 5）

注：与对照组比较，**P < 0.01；与AngⅡ组比较，#P < 0.05

3.2 在心肌肥大中Lyc对自噬的作用

为明确在心肌肥大中Lyc对自噬的作用，将细胞分为四组：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc组（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）组+3-MA（5 μmol/L）组；于48 h以Western blot法测定Beclin1和LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反应自噬活性。结果显示：与对照组比较，AngⅡ干预48 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平下降（P < 0.05），加入Lyc干预后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平有所增加（P < 0.05），而使用3-MA后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平迅速下降（P < 0.01）；3-MA（5 μM）对细胞本身无影响（图2、3，表2）。

与对照组比较，*P < 0.05；与AngⅡ组比较，#P < 0.05；与AngⅡ+Lyc组比较，**P < 0.01

图2 在心肌肥大中Lyc对LC3蛋白的影响

与对照组比较，*P < 0.05；与AngⅡ组比较，#P < 0.05；与AngⅡ+Lyc组比较，**P < 0.01

图3 在心肌肥大中Lyc对Beclin1蛋白的影响

4 讨论

从20世纪末人们发现服用Lyc能明显降低前列腺癌的发病率至今，已有大量的流行病学调查、临床研究和动物实验证明Lyc具有极强的抗氧化能力，可以预防各种慢性疾病[8-10]。特别是在心血管疾病中，Lyc不仅可以降低血脂，降低收缩压，减少心血管疾病的风险，还能缓解缺血/再灌注损伤[11-12]。但对于其是否有抑制心肌肥大的作用及相关机制，目前国内尚未有报道。本实验首次在心肌肥大的模型上探讨Lyc的作用和与自噬之间的关系。本实验观察到，AngⅡ干预心肌细胞后细胞面积明显增大、心肌肥大标志物心房利钠多肽（ANP）明显上升，说明AngⅡ诱导的细胞肥大模型成功；然后加入Lyc干预发现，Lyc减少了AngⅡ诱导心肌细胞面积的增大，降低了ANP的升高，在一点程度上对心肌肥大起到了抑制作用。实验进一步发现，AngⅡ诱导的细胞肥大中伴有自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白表达的下降，而Lyc的干预却促进了自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的表达。利用自噬阻断剂3MA降低了Lyc对心肌细胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通过激活自噬来抑制AngⅡ诱导的心肌肥大。

自噬在心脏中的作用存在着争议。早在20世纪80年代，人们就发现心肌细胞蛋白质合成增加和细胞肥大的同时，伴随着自噬水平的降低[13]。21世纪初Nakai等[14]在横主动脉缩窄诱导的早期心肌肥大模型中发现，自噬水平明显低于假手术组，提示心肌肥大代偿期，自噬活性显著下降；此外亦有文献报道自噬的激活剂雷帕霉素可以阻断由主动脉缩窄[15]、甲状腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆转已经存在的心肌肥大[17]。最近的研究发现，FoxO3可通过上调自噬水平，使心肌肥大的心脏体积缩小[18]。目前关于Lyc对自噬的作用在心脏病中的研究是空白。笔者前期实验表明自噬对于AngⅡ诱导的心肌肥大发展可能起抑制作用[9]。本实验在细胞水平上明确了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻断自噬会明显降低Lyc对细胞肥大的影响，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一个重要环节，而Lyc是如何调控自噬，其具体分子机制仍需进一步的研究和探索。

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细胞自噬篇4

[关键词] 人参皂苷Rb1； 阿霉素； 自噬； H9c2细胞

Protective effect of ginsenoside Rb1 on doxorubicin

induced myocardial autophagy

LI Longfei， MA Zengchun*， WANG Yuguang， TANG Xianglin， TAN Hongling， XIAO Chengrong， GAO Yue*

（Institute of Radiation Medicine Science， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

[Abstract] Ginsenoside Rb1（Rb1）， which is one of the main ingredients derived from Panax ginseng， has been found to have extensive pharmacological activities including antioxidant， antiinflammatory， anticancer properties. In this study， the effect of Rb1 on doxorubicininduced myocardial autophagy was studied with H9c2 as the study object. CCK8 method， transmission electron microscope observation， fluorescence staining observation and Western blot were used to detect changes in H9c2 cell proliferation and autophagy after treatment. According to the results， doxorubicin could cause cell viability decrease， significant increase in the LC3Ⅱ/LC3I ratio and downregulation of the expression of p62. Pretreatment with ginsenoside Rb1 inhibited cell viability decrease and increase in doxorubicininduced autophagic structure and LC3Ⅱ/LC3I ratio， and downregulation of the expression of p62. In conclusion， doxorubicin could induce H9c2 cell death and induce autophagy， and ginsenoside Rb1 showed a protective effect on DOXinduced cardiotoxicity， which may be correlated with suppression of DOXinduced autophagy.

[Key words] ginsenoside Rb1； doxorubicin； autophagy； H9c2 cell

自噬是细胞受到刺激后产生双层膜囊泡包裹胞内物质运送到溶酶体降解的过程，是真核生物所特有的进化保守过程，其主要功能是清除和降解细胞内受损的细胞结构和衰老的细胞器以及外来物，保持细胞稳态[1]。近年研究发现，自噬不但参与心血管系统稳态的调控，而且在心肌肥大、心肌纤维化、心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭等多种病理过程中发挥重要作用[25]。人参为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根茎，是我国传统名贵中药材，在我国药用历史悠久，对多种疾病具有防治效果。人参皂苷Rb1是人参的主要有效成分之一[6]。现代药理研究证明，人参皂苷Rb1可明显改善缺血性心脏病、各型心律失常、急性或慢性心力衰竭等心脏疾病[7]。阿霉素属于周期非特异性抗肿瘤药。文献报道，其具有心脏毒性并且会导致心肌细胞自噬性死亡[810]。因此，本研究拟用阿霉素建立心肌细胞自噬损伤模型，探讨人参皂苷Rb1对阿霉素诱导心肌自噬的影响。

1 材料

1.1 药品与试剂 人参皂苷Rb1购于上海一飞生物科技有限公司（批号E049517，纯度98%）；阿霉素（doxorubicine，DOX）、3MA购自美国Selleck Chemicals公司；DMEM高糖培养基、青霉素链霉素双抗溶液购于GE医疗公司；胎牛血清（FBS）购自天津康源生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、PremoTM Autophagy Tandem Sensor RFPGFPLC3B Kit购于美国赛默飞世尔科技公司；CCK8试剂盒购于日本同仁化学研究所；AntiSQSTM1/p62抗体购自英国Abcam公司；LC3B抗体购自美国CST公司；实验用水为超纯水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 VICTOR X型多标记酶标仪（美国Perkin Elmer公司）；SM 510 META激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）；日立透射扫描电子显微镜H7650（日本日立集团）；Microfuge 22R型离心机（美国Beckman公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；Millipore SimplicityTM185超纯水机（德国Merck集团）；VIBS223S电子天平（德国Sartorious公司）。

1.3 细胞系 本研究采用大鼠胚胎心肌细胞系H9c2（21）作为实验对象，此细胞系购自北京协和细胞资源中心（Cell Resource Center，IBMS，CAMS/PUMC）。

2 方法

2.1 细胞培养 H9c2细胞培养于含10%FBS的DMEM高糖培养液中（含青霉素钠100 units・mL-1，链霉素100 mg・L-1），放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养。2 d更换1次培养液，待细胞生长至约80%时用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期细胞进行实验。

2.2 细胞活力检测 取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔1×104个细胞，置于培养箱中培养。实验设置调零孔（只加培养基不加细胞）、细胞对照孔和实验孔，每组设置3个复孔。待细胞培养24 h后弃去上清培养液，加入用含2%FBS的DMEM培养基配成的各浓度受试药物，在培养箱中培养适当时间后，每孔加入CCK8试剂10 μL，培养箱内孵育约1～2 h，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。细胞存活率=（A给药组CA调零孔）/（A对照组CA调零孔）×100%。

2.3 电镜观察自噬体 细胞给药处理后采用刮刀法收集细胞，经过前固定、漂洗、后固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、切片等步骤制成超薄切片进行透射电镜观察。

2.4 RFPGFPLC3B融合蛋白示踪自噬形成 按照PremoTM Autophagy Tandem Sensor RFPGFPLC3B Kit说明书，每1万细胞中加入2 μL转染试剂，孵育16 h，将RFPGFPLC3B融合蛋白转染至H9c2细胞。转染成功后进行给药处理，采用激光共聚焦显微镜进行观察。

2.5 Western blot 法检测自噬相关蛋白 取对数生长期细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，每瓶约5×104个细胞。进行给药处理后，收集各培养瓶细胞，离心，PBS漂洗，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白。经BCA法测定蛋白浓度及变性后，进行SDSPAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉或BSA封闭，分别加入LC3B，p62和GAPDH抗体，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗室温孵育90 min，TBST洗膜3次后用化学发光法显影，采用Image J软件进行条带分析。

2.6 稻莘治 数据用±s表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析；统计分析软件使用GraphPad Prism 5.0，以P

3 结果

3.1 人参皂苷Rb1减轻阿霉素引起的细胞损伤 阿霉素0，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol・L-1处理24 h后，采用CCK8法检测H9c2细胞活力的变化。结果显示，阿霉素在1～20 μmol・L-1对H9c2细胞活力具有显著的抑制作用，且呈明显的量效关系（图1）。不同浓度的人参皂苷Rb1预处理6 h后加入5 μmol・L-1DOX共孵育24 h，采用CCK8法检测细胞活力。结果显示，人参皂苷Rb1可以逆转阿霉素导致的H9c2细胞活力下降，表明人参皂苷Rb1可以抑制阿霉素诱导的H9c2细胞死亡（图2）。

3.2 阿霉素诱导H9c2细胞自噬活化模型的建立 为了选择合适的浓度以及时间进行阿霉素自噬模型的建立，分别采用0，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol・L-1 DOX处理细胞12 h和1 μmol・L-1DOX处理细胞0，3，6，12，24，48 h后提取细胞蛋白，采用Western blot法检测自噬相关蛋白的变化。结果显示，阿霉素可剂量依赖性（0～10 μmol・L-1）以及时间依赖性（0～48 h）地导致LC3BⅡ/ LC3BⅠ升高并使p62蛋白含量降低，表明阿霉素可导致H9c2细胞自噬活化。根据数据分析结果，选择1 μmol・L-1DOX处理细胞12 h进行造模（图3）。

3.3 人参皂苷Rb1抑制阿霉素诱导的H9c2自噬活化 50 μmol・L-1人参皂苷Rb1预处理6 h加入1 μmol・L-1DOX共孵育12 h后，收集细胞，制备超薄切片，采用透射电镜观察自噬体。与对照组相比，DOX组可以明显观察到自噬结构，人参皂苷Rb1预处理组自噬结构则不明显（图4）。

将RFPGFPLC3B融合蛋白转染至H9c2细胞后，50 μmol・L-1人参皂苷Rb1和5 mmol・L-13MA分别预处理6 h加入1 μmol・L-1DOX共孵育12 h后，进行荧光观察。与对照组相比，DOX组merge后红色荧光明显增强，提示RFPGFPLC3B融合蛋白多定位于溶酶体或自噬溶酶体内，即自噬流活化（图5）。人参皂苷Rb1预处理与自噬抑制剂3MA预处理组merge后红色荧光减弱，提示其抑制DOX诱导的自噬活化（图5）。

50 μmol・L-1人参皂苷Rb1和5 mmol・L-13MA分别预处理6 h加入1 μmol・L-1DOX共孵育12 h后，采用Western blot法检测自噬相关蛋白的变化。结果显示，人参皂苷Rb1预处理与自噬抑制剂3MA预处理组LC3BⅡ/LC3BⅠ明显低于DOX组，同时p62蛋白表达亦有部分升高，但无统计学差异。提示人参皂苷Rb1可以抑制DOX诱导的自噬活化（图6）。

4 讨论

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细胞自噬篇5

[关键词] 大黄酸；自噬；mTOR信号通路；肾小管上皮细胞；雷帕霉素

自噬（autophagy）是真核细胞内一种溶酶体依赖性蛋白降解过程，主要分为巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导性自噬（chaperon-mediated autophagy，CMA），其中，巨自噬（简称为自噬）在细胞内最为普遍[1]。研究表明[2-3]，自噬在饥饿、缺氧、缺血/再灌注和感染等条件下可被激活，并且，在维持细胞内环境稳定、调控能量代谢等方面发挥着重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可以调控细胞周期及其增殖和凋亡过程，同时，作为自噬的主要调节剂，它能够抑制细胞自噬[4]。然而，对于肾小管上皮细胞而言，在生理和病理条件下，自噬对其作用究竟是怎样的？是否可以被临床上常用的“保肾”中药或雷帕霉素所影响？目前还不是很明确[5]。

据报道[6]，自噬与凋亡之间有着密切的联系。借助腺嘌呤诱导的肾间质纤维化模型鼠，笔者发现，大黄附子汤（由大黄、附子、细辛组成）可以通过调控JNK/Bcl-2信号通路而改善模型鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾间质纤维化[7]。作为大黄附子汤君药之一的大黄，其主要成分――大黄酸（rhein）在体内外可以调节肾小管上皮细胞转分化，改善肾纤维化[8-9]，那么，大黄酸是否在体外可以影响肾小管上皮细胞自噬，并通过mTOR信号通路而发挥调节作用呢？笔者采用Hank′s 平衡盐溶液（Hank′s balanced salt solution，HBSS）诱导大鼠肾小管上皮（NRK-52E）细胞饥饿状态而激活其自噬，与雷帕霉素相对照，试图阐明大黄酸通过mTOR信号通路干预NRK-52E细胞自噬的作用和分子机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 大黄酸（用0.1 mol・L-1NaOH配置成1 g・L-1溶液）、雷帕霉素（用二甲基亚砜配置成100 μmol・L-1溶液）购自美国Sigma-Aldrich公司；Dulbecco′s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培养基、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、青霉素链霉素溶液、Hank′s 平衡盐溶液（HBSS）购自美国HyClone公司；溴酚蓝（bromophenol blue，BPB）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）和BSA（bovine serum albumin）购自BioSharp公司；磷酸酶抑制剂（phosphatase inhibitor cocktail）和Chemi-Lumi One L发光液购自日本Nacalai公司；蛋白酶抑制剂、显影定影试剂盒购自碧云天公司；蛋白相对分子质量Marker购自美国Thermo Scientific公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自Millipore公司；兔抗大鼠哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）I/II抗体、兔抗大鼠mTOR抗体、兔抗大鼠磷酸化mTOR（phosphorylated-mTOR Ser2448，p-mTOR S2448）抗体、兔抗大鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；X光胶片购自Kodak公司。

1.2 仪器 细胞培养箱（日本SANYO公司）；奥林巴斯CK40型倒置显微镜；Western blot设备（美国BioRad公司）。

1.3 细胞培养和干预措施 大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）由日本山梨大学分子信号教研室Kitamura教授惠赠。NRK-52E细胞从液氮中取出后，常规复苏，接种于细胞培养基（95%DMEM/F12+5%FBS，含1%青霉素链霉素溶液），置于细胞培养箱中进行培养（37 ℃、饱和湿度、5%CO2）；将细胞以2×105个/孔的密度铺板至12孔板中，按各个实验的不同时间点将培养基换成HBSS 1 mL，再分别添加大黄酸（5 mg・L-1）和雷帕霉素（100 nmol・L-1）进行干预。

1.4 细胞中LC3 I/II抗体、mTOR抗体、p-mTOR S2448蛋白表达 采用Western blot检测上述蛋白的表达水平。在细胞刺激后的规定时间内，将12孔板中的液体倒掉，用PBS洗2遍，每个孔加入细胞裂解液100 μL进行裂解；再加入BPB和DTT各1 μL，于100 ℃沸水中煮4 min使蛋白变性；根据目的蛋白的相对分子质量配制7.5%或15%分离胶和10%浓缩胶；将等量（20 μL）的各种蛋白分别加样，在电泳槽中加满电泳缓冲液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE-SDS）；电泳完毕后，取下凝胶，将凝胶上的蛋白电转移至PVDF膜上，根据目的蛋白的位置留取所需PVDF膜；用含3%BSA的聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯（tris buffered saline tween，TBST）缓冲液封闭1 h；分别向PVDF膜中加入相应的一抗（兔抗大鼠LC3 I/II抗体、兔抗大鼠mTOR抗体、兔抗大鼠p-mTOR S2448抗体，均为1∶1 000稀释；兔抗大鼠β-actin抗体，1∶2 000稀释），密封，4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，共3次，每次5 min；加荧光标记的二抗（羊抗兔IgG抗体，1∶2 000稀释），孵育1.5 h；再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜，共3次，每次5 min；取出PVDF膜，将Chemi-Lumi One L发光液均匀滴撒在PVDF膜上，在暗室压X光胶片、曝光和定影；用Quantity one 4.1.1软件（Bio-Rad）进行光密度分析，结果分别与β-actin或mTOR光密度对照，其比值表示蛋白相对表达量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料采用±s表示，组间比较采用非参数Mann-Whitney U检验，P

2 结果

2.1 HBSS诱导NRK-52E细胞自噬 LC3 I/II是自噬的标志性蛋白，LC3 I向LC3 II转化的程度或者LC3 II/LC3 I比值高低能反映自噬的程度[3]。结果显示，在不同时间点（0，0.5，1，2，6 h），随着HBSS（1 mL）干预NRK-52E细胞时间的延长，LC3 I向LC3 II转化的程度逐渐增加；在1 h时，LC3 II蛋白表达水平最高（图1）；与各自前一个时间点相比，1 h和2 h的LC3 II蛋白表达水平明显变化，其差异有统计学意义（P

2.2 HBSS抑制mTOR信号通路活性 mTOR激活会抑制内质网膜脱落而形成的自噬体膜，也就是抑制了自噬[4] 。为探讨HBSS是否会通过调控mTOR信号通路而干预自噬，笔者对mTOR信号通路中关键蛋白mTOR和p-mTOR S2448进行了检测。结果显示，在不同时间点（0，0.5，1，2，6 h），随着HBSS（1 mL）干预NRK-52E细胞时间的延长，p-mTOR

与各自前一个时间点相比1）P

图1 HBSS诱导NRK-52E细胞LC3 I，LC3 II蛋白表达特征与表达量的比较

Fig.1 Comparison of characteristic and quantity of the protein expressions of LC3 I and LC3 II induced by HBSS in NRK-52E cells

S2448蛋白表达水平逐渐降低（图2）；在6 h时，p-mTOR S2448蛋白表达水平最低；与各自前一个时间点相比，在0.5和6 h 时，其蛋白表达水平的差异有统计学意义（P

图2 HBSS抑制NRK-52E细胞p-mTOR S2448蛋白表达特征与表达量的比较

Fig.2 Comparison of characteristic and quantity of the protein expression of p-mTOR S2448 inhibited by HBSS in NRK-52E cells

2.3 大黄酸抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬 为探讨大黄酸是否能影响HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬，笔者将大黄酸（5 mg・L-1）与HBSS（1 mL）联合干预NRK-52E细胞，在1 h时，检测LC3 I，LC3 II的蛋白表达水平。结果显示，大黄酸与HBSS联合干预可以明显降低LC3 II蛋白表达水平，与HBSS干预组相比，其差异有统计学意义（P

与空白组相比1）P

图3 大黄酸抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 I，LC3 II蛋白表达特征与表达量的比较

Fig.3 Comparison of characteristic and quantity the protein expressions of LC3 I and LC3 II exposed to HBSS inhibited by rhein in NRK-52E cells

2.4 大黄酸激活HBSS抑制的mTOR通路活性 为探讨大黄酸是否能通过调控mTOR信号通路而影响细胞自噬，笔者将大黄酸（5 mg・L-1）与HBSS（1 mL）联合干预NRK-52E细胞，在6 h时，检测了p-mTOR S2448和mTOR的蛋白表达水平。结果显示，大黄酸与HBSS联合干预可以明显促进p-mTOR S2448蛋白表达水平的恢复，与HBSS干预组相比，其差异有统计学意义（P

2.5 大黄酸干预NRK-52E细胞自噬的分子靶点可能是mTOR 为探讨大黄酸是否确实是作用于mTOR而影响细胞自噬，笔者将大黄酸（5 mg・L-1）、HBSS（1 mL）与mTOR公认的抑制剂[10]――雷帕霉素（100 nmol・L-1）联合干预NRK-52E细胞，在1 h时，检测LC3 I，LC3 II的蛋白表达水平。结果显示，雷帕霉素、大黄酸与HBSS联合干预可以

图4 大黄酸促进HBSS抑制的NRK-52E细胞p-mTOR S2448蛋白表达特征与表达量的比较

Fig.4 Comparison of characteristic and quantity of the protein expression of p-mTOR S2448 inhibited by HBSS enhanced by rhein in NRK-52E cells

恢复LC3 II蛋白表达水平，与大黄酸与HBSS联合干预组相比，其差异有统计学意义（P

3 讨论

临床实践表明，大黄是延缓慢性肾衰竭患者肾功能减退、减轻肾纤维化的重要药物[11]；对伴有慢性肾脏病的啮齿类动物，大黄可以改善其体重、血清肌酐、蛋白尿和血压等[12]。此外，大黄的主要成分――大黄酸[13]可以明显改善单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠肾组织中转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纤维连接蛋白（fibronectin）的表达，减轻肾纤维化[9]；大黄酸还能明显改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞肥大和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积[14]，抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[8]。因此，大黄和大黄酸都是治疗肾脏疾病的有效药物。

一般情况下，当细胞处于“饥饿”时，自噬活性将被上调，通过溶酶体内水解酶的降解作用，为缺

与空白组相比1）P

图5 雷帕霉素逆转大黄酸抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 I，LC3 II蛋白表达特征与表达量的比较

Fig.5 Comparison of characteristic and quantity of the protein expressions of LC3 I and LC3 II inhibited by rhein exposed to HBSS reversely-regulated by rapamycin in NRK-52E cells

血、缺氧后的细胞提供能量而维持其功能和存活；但是，过多或过少的自噬反而会损伤细胞，甚至可导致细胞死亡[15]。Chien等报道[16]，在肾脏缺血/再灌注大鼠模型中，自噬的增加伴随着凋亡的增加，增强抗凋亡基因Bcl-xL的表达，能够抑制肾小管上皮细胞的自噬和凋亡；Nakagawa等报道[17]，在急性肾损伤大鼠模型中，everolimus（mTOR的抑制剂）会增加自噬和加重肾小管损伤；Suzuki等报道[18]，自噬的抑制剂可以抑制H2O2诱导的肾小管上皮细胞死亡。这些结果都说明，在特定的条件下，自噬会加重肾小管上皮细胞损伤，抑制自噬就可能改善其损伤。

LC3是核心自噬蛋白，细胞溶质形式的LC3（LC3 I）通过结合脂化的磷脂酰乙醇胺，连接到LC3的羧基末端，转化为LC3 II，其转换的多少，也就是LC3 II蛋白表达水平的高低能反应自噬发生的程度[19]。笔者的研究结果表明，HBSS作为细胞饥饿的诱导剂，随着作用时间的延长，能促进LC3 I向LC3 II转化，增强LC3 II蛋白表达水平，诱导NRK-52E细胞自噬发生，而大黄酸可以降低LC3 II蛋白表达水平，抑制HBSS诱导的细胞自噬。

研究表明，在生理和应激条件下，mTOR信号通路是调控细胞自噬的关键信号途径[20]，mTOR信号通路活性增强可以促使核糖体与内质网黏附，抑制内质网膜脱落而形成自噬体膜，因此，调控mTOR信号通路就可以影响细胞自噬的发生[4]。笔者发现，随着HBSS作用时间的延长，HBSS可以明显降低NRK-52E细胞p-mTOR蛋白表达水平，mTOR信号通路的活性受到抑制，而大黄酸能恢复受抑制的mTOR信号通路活性；此外，笔者还发现，雷帕霉素，作为高度特异的mTOR抑制剂[21-24]，可以抵消大黄酸对细胞自噬的抑制作用。据此，笔者认为，大黄酸可能是通过调控mTOR信号通路活性而抑制HBSS诱导的细胞自噬；大黄酸干预NRK-52E细胞自噬的分子靶点可能是mTOR。尽管如此，笔者还没有直接的证据说明大黄酸在体外对肾小管上皮细胞自噬的保护作用。

综上所述，HBSS抑制mTOR信号通路活性而诱导肾小管上皮细胞发生自噬；大黄酸调控mTOR信号通路活性而抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白的表达，这可能就是其干预细胞自噬的作用和分子机制。

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Molecular mechanism of rhein on inhibiting autophagic protein

expression in renal tubular epithelial cells via regulating mTOR

signaling pathway activation

TU Yue1， SUN Wei1，2*， GU Liu-bao3， WAN Yi-gang1，4， HU Hao1， LIU Hong1

（1. Research Institute of Kidney Disease， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China；

2. Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine， The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，

Nanjing 210029， China；

3. Department of Molecular Signaling， University of Yamanashi， Yamanashi 409-3898， Japan；

4. Department of Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital， The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，

Nanjing 210008， China）

[Abstract] Objective： To explore the effects and molecular mechanisms of rhein on reducing starvation-induced autophagic protein expression in renal tubular epithelial（NRK-52E）cells. Method： Hank′s balanced salt solution（HBSS）was used to induce NRK-52E cells to be in the state of starvation. After the intervention of HBSS for 0，0.5，1，2 and 6 hours，firstly，the protein expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3（LC3 I/II），which is a key protein in autophagy，was detected. Secondly，the protein expressions of mammalian target of rapamycin（mTOR）and phosphorylated-mTOR Ser2448（p-mTOR S2448）were examined. And then，after the co-treatment of rhein（5 mg・L-1）and HBSS（1 mL）without or with mTOR inhibitor，rapamycin（100 nmol・L-1），the protein expressions of LC3 I/II，mTOR and p-mTOR S2448 were tested，respectively. Result： HBSS could induce the up-regulation of LC3 II and the down-regulation of p-mTOR S2448 at protein expression level in NRK-52E cells. The co-treatment of rhein and HBSS could reversely regulate the protein expressions of LC3 II and p-mTOR S2448 in NRK-52E cells significantly. The co-treatment of rapamycin，rhein and HBSS could recover the level of LC3 II protein expression in HBSS-intervened NRK-52E cells. Conclusion： HBSS induces autophagy in renal tubular epithelial cells by inhibiting mTOR signaling pathway activation. Rhein reduces the autophagic protein expression in renal tubular epithelial cells through regulating mTOR signaling pathway activation，which is the possible effects and molecular mechanisms.

[Key words] rhein； autophagy； mTOR signaling pathway； renal tubular epithelial cells； rapamycin

细胞自噬篇6

关键词：自嗟；自嗟活性；肺瘤耐药

中图分类号：Q255；R730.6 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0062-06

ProgressesonAutophagyandDrugResistanceofTumor

JIANGYan1，ZHANGJie2*，ZHANGJin-yang1

（1.FacultyofLifeScienceandTechnology，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650500，Yunnan，China.，2.DepartmentofGynecology，TheFirstPeople'sHospitalofYunnanProvinceandtheAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650032，Yunnan，China）

Abstract：Autophagy，whichisanessentialphysiologicalprocessineukaryocyte，recyclesnutrientbydegra-datingimpairedorunnecessarymacromoleculesandorganelles.Itisveryimportantformaintaininghome?ostasisandviabilityofcells.Autophagyexistswidelyinphysiologicalandpathologicalprocesses.Thereisacloserelationshipbetweenautophagyanddrugresistanceoftumorcells.Progressesonautophagyresearchrelatedtohumantumordrugresistancearereviewed.

Keywords：autophagy；autophagyactivity；tumordrugresistance

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：062-067）

肿瘤是威胁人类健康和生存最严重的疾病之―目前，手术治疗、放射治疗与药物治疗被认为是人类对抗肿瘤的二条有效途径，其中化学药物治疗在肿瘤的治疗中起着不可替代的作用。然而，肿瘤耐药（tumordrugresistance）的产生是临床治疗各种肿瘤面临的一个主要障碍，成为肿瘤治疗的瓶颈：而在肿瘤患者中用药物诱导凋亡是主要的治疗手段[1]。除凋亡外，发现另一种细胞生命现象――自噬（autophagy），是维持细胞生存的一种重要机制[2]。研究发现，自噬在肿瘤细胞中发挥着重要作用在代谢压力条件和抗肿瘤治疗如放疗、化疗和一些有针对性的治疗下自噬能维持肿瘤细胞的生存[3]。反之，自噬能通过溶酶体降解自身细胞成分，而无节制的自噬使细胞成分逐渐被消耗随之导致细胞死亡[4]。自噬可单独作用或与凋亡共同作用影响肿瘤对药物的敏感性，故本文就自噬与肿瘤耐药的研究进展作一综述。

1细胞自噬概述

自噬是在放疗、化疗、饥饿、生长因子匮乏、缺氧或病毒性感染时通过降解和循环利用细胞质基质、长寿或聚集蛋白、过量或损伤细胞器的一种进化保守代谢过程[5-9]。

自噬根据底物进入溶酶体内的途径不同分为3种类型：微自噬（microautophagy）、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侣介导的自嗟（chaper?one-mediatedautophagy，CMA）[10]。巨自唾即通常所指的自噬，由细胞内双层膜结构延伸、非选择性地包裹待降解物形成自噬体，进而与溶酶体融合降解内容物；微自噬不形成自噬体，由溶酶体膜直接包裹并消化待降解物；CMA降解蛋白的过程有选择性而无膜结构形成而是具有特殊基序的胞质蛋白被分子伴侣识别后，与溶酶体膜上的特殊受体溶酶体相关膜蛋白（lysosomal associated membrane protein.LAMP）2a型相结合，从而进入溶酶体被降解。CMA降解途径在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。自噬会有针对性地降解某些细胞质蛋白、脂类或细胞器（如核糖体、核小体和线粒体），可以进一步被划分为噬脂性、核小体自噬、核酸自噬和线粒体自噬[12]。

而自噬整个过程主要是受基因调控。在酵母S.cerevisiae中所发现的一系列调控基因（Apg、Aut、Cvt）被统一命名为“autophagyrelatedgene”（Atg），其产物即“自噬相关蛋白”（见表1）。自噬是一个复杂的调控过程，涉及了许多上游调控信号途径。主要有依赖mTOR（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）和非依赖mTOR的信号途径[13]。mTOR是一个丝/苏氨酸蛋白激酶，作为ATP、激素等的感受器，能感受营养和能量的变化，对细胞生长具有重要调节作用。mTOR由两种不同的复合体即mTORCl和mT0RC2组成，并接受多种上游信号如ClassIPI3K、IGF-1/2、MAPK等，可抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子。其中，无论是在正常细胞还是肿瘤细胞，mTORCl都是主要的自噬调节器[14]。而非依赖mTOR的途径包括ClassⅢPI3K、RAS-MAPK、P53、PTEN、内质网应激等。除此之外，Criollo等[15]还发现IKK能诱导自噬。另外，酪氨酸激酶受体、酪蛋白激酶、MAP激酶、HMGB1、PKA、PERK和IRE1、Ca2+等对自噬的调节也起重要作用。

自噬是细胞对于环境变化的有效反应，对细胞新陈代谢起着重要的作用，具有以下作用：1）自噬是对外源性刺激（包括营养缺乏、低氧、氧化应激、感染等）的适应性反应，其降解产物氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等可供作再循环的物质能量；2）自噬参与稳定细胞质内环境的管理机制，可调控长寿命蛋白、过氧化物体、线粒体和内质网的更新；3）自噬参与一定的组织特异性的融合；4）自噬既可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器和大分子物质，保护受损的细胞，同时它还作为一种细胞死亡程序，诱导细胞主动性死亡（II型凋亡）[20]。

2自噬与肿瘤耐药

肿瘤耐药是一个多基因、多因素、多水平共同参与的复杂问题，被广泛的分为三类：药代动力学抗性、肿瘤细胞自身抗性和肿瘤微环境相关的因素[21]。目前，90%的实体肿瘤由于血管系统不能提供肿块生长所需的氧气而产生缺氧区域[22]。在多种形式的抗肿瘤治疗中，因肿瘤缺氧而导致抗药性。此外，肿瘤缺氧还会导致肿瘤转移潜能和耐药性增强，预后较差。缺氧激活缺氧可诱导因子（hypoxia-induciblefactors，HIFs），帮助细胞和组织处理缺氧等压力。它主要目的不仅是能增加肿瘤细胞的存活而且能介导肿瘤耐药[23]。代谢改变、多耐药蛋白的过表达、抑制凋亡、诱导自噬和抑制DNA损伤应答（DNA-damageresponse，DDR）都是细胞通过HIFs对化疗效果妥协而重新触发的结果[22]。Vousden等[24]研究发现自噬可以帮助肿瘤细胞生存，回应限制增长的条件，比如营养耗尽、缺氧、缺乏生长因子和存在的细胞毒性药物。

化疗和放疗是防止肿瘤复发，延长肿瘤术后患者生命最重要的手段，通过化疗和放疗可以杀死大部分的肿瘤细胞，但有一部分肿瘤细胞可通过自噬方式从逆境中生存下来。在放疗和化疗过程中，肿瘤细胞自噬水平有明显提高，自噬在一定程度上削弱了抗肿瘤治疗的效果。目前多种抗肿瘤治疗都可诱导肿瘤细胞发生自噬。三氧化二砷、替莫唑胺和雷帕霉素在治疗恶性胶质瘤过程中可使肿瘤细胞自噬活性上调[25]；对结肠癌、乳腺癌及前列腺癌细胞给予小剂量放疗后，发现细胞内出现自噬泡堆积现象[26]。同时，发现自噬与肿瘤耐药的形成有关，Samaddar等[27]发现在雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌细胞中用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）诱导自噬有利于抗雌激素耐药的形成。他莫西芬作用于乳腺癌细胞MCF7导致C2-神经酰胺产生、Bedinl蛋白增加并诱导自噬。故抑制自噬可能是治疗肿瘤耐药的有效方法。

自噬是肿瘤细胞在外界环境压力（营养缺乏、乏氧）或内环境变化（内质网应激，蛋白、DNA、线粒体损伤）条件下的生存机制，自噬通过“自我消化”一部分内容物或清除受损细胞器，从而达到缓解代谢压力及促进细胞存活的目的。然而当外界环境压力或内环境变化超出细胞的应对能力而持续存在时，自噬水平无限制上调，最终导致自噬性细胞死亡。这可能是通过促进凋亡实现的，也可能是大量细胞成分被降解的结果。诱导肿瘤自噬性细胞死亡成为一种新的治疗策略，如通过诱导内皮细胞自噬性死亡以抑制肿瘤血管的形成，具有潜在的临床应用价值。

虽然自噬能增强肿瘤治疗，但如何适当使用自噬有相当大的分歧。Garoia-Escudero等[28]研究指出在不同的抗肿瘤药物作用下，自噬可作为肿瘤细胞杀伤机制。在治疗过程中诱导自噬往往能抑制肿瘤细胞的杀伤力[29]。有证据表明，自噬可杀死肿瘤细胞，也能保护肿瘤细胞。这对于怎样治疗肿瘤患者是一个待解决的问题，是应该设法抑制还是促进自噬。

2.1促进自噬与肿瘤耐药

目前，细胞死亡有3种主要方式：凋亡、自噬、坏死其中，有超过50%的肿瘤缺乏凋亡机制。在细胞凋亡无效时诱导过度自噬即II型程序性死亡也可能是主要的细胞死亡机制[31]。自噬性细胞死亡被认为是由一些化疗药物在哺乳动物细胞中诱导所致。Krysko等[32]研究表明，由于细胞自噬性死亡不如细胞凋亡明显，也能诱发清除信号，促进死细胞的去除。过度或持续自噬均有可能诱导肿瘤细胞死亡，这是一个潜在的肿瘤治疗策略。自噬受mTOR途径控制和抑制niTOR能激活自噬。雷帕霉素（rapamycin）是一种天然mTORCl抑制剂，与其类似物莫司（CCI-779）、依维莫司（RAD-001）和雷帕霉素衍生物（AP-23573）―样，选择性地作用于靶标mTORCl剌激自噬。mTORCl抑制剂依维莫司（RAD001）也被证实通过诱导自噬能杀死急性淋巴细胞白血病[33]。RAD001诱导自噬会出现beclin＼的表达、LC-3酯化和出现溶酶体或自噬体等现象。

有研究证明，在不同肿瘤细胞中促进自噬，可以增强肿瘤耐药细胞的死亡。自噬在顺铂诱导细胞死亡或顺铂耐药中起着重要作用。Kim等[34]发现在凋亡有效的细胞中自噬增加了细胞毒性的扩散，也能克服肿瘤细胞的多耐药，也有研究发现诱导自噬有利于治疗肿瘤。例如，白藜芦醇可诱导自噬并导致卵巢癌的生长停滞[35]，研究发现他莫西芬（tamoxifen）作用于乳腺癌细胞MCF7导致C2-神经酰胺产生、Beclinl蛋白增加并诱导自噬，以及他莫西芬等雌激素受体拮抗剂可诱导MCF7乳腺癌细胞发生自噬通过负调控蛋白激酶B/AKT[36]导致细胞死亡。姜黄素是一种治疗肿瘤的潜在化疗药物，能诱导自噬，形成高水平细胞质囊泡和酸性自睡泡（acidicvesicularorganelles，AVOs）且导致LC3-II的增加，能够抑制口腔癌细胞的增殖和生存进而引起自噬性细胞死亡[37]。因此，诱导并促进自噬可以预防肿瘤的发生、发展，同时还可以导致肿瘤细胞死亡。

2.2抑制自噬与肿瘤耐药

自噬在肿瘤形成的不同阶段作用不同。最初，自噬能预防肿瘤的形成，可一旦形成了肿瘤，肿瘤细胞会利用自噬保护自己[38、39]。在真核细胞能量缺乏时，诱导自噬能补充能量代谢并维持活力。如自噬缺陷型小鼠在出生1天时，由于缺乏能量导致死亡而发现自噬是一种生存机制[40]。在此期间，当胎盘补充能量停止，自噬需要维持血清氨基酸水平直到出生。因此，细胞能量缺乏能诱导额外的活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）累积和自噬提供保护的应激[41-43]。在肿瘤中许多不同应激常在ROS水平升高后发生保护性自噬。在一定的细胞应激如化疗条件下，细胞会分泌损伤相关分子模式（danger-associated molecularpatterns，DAMPs），它是一种旁分泌信号分子，能产生保护性应答。细胞保护性自噬被发现在神经胶质瘤CD133+干细胞放疗时能产生ATG5和HMGB1诱导自噬保护细胞。据报道，白血病细胞在化疗后分泌HMGB1能诱导细胞保护性自噬[41]。HMGB1被释放由肿瘤细胞在化疗诱导的细胞毒性并通过PI3KC3-MEK-ERK途径激活自噬增强肿瘤耐药[45]。通过KNA干扰（RNAi）或药理学抑制（如3-MA和U0126）PI3KC3-MEK-ERK途径可以逆转白血病对化疗的耐药[56]。

除此之外，肿瘤细胞修复受损的DNA，防止细胞凋亡和坏死，从而产生耐药性，也可能依赖于细胞自噬的介导。通过小分子RNA干扰DNA修复相关的RAD51的表达，可增强吉西他滨（geindtabine）即2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷对人非小细胞肺癌细胞的敏感性；同样，利用ERK1/2的抑制剂U0126或PI3KCⅢ的抑制剂LY-294002也可下调吉西他滨诱导的RAD51的表达，增强细胞对药物的敏感性[46]。可见，细胞自噬可能是肿瘤细胞针对抗癌药物产生耐药性的一个普遍机制或诱因。通过细胞自噬抑制剂，可克服自噬产生的耐药性，增强细胞对抗癌药物的敏感性，期望达到彻底消灭肿瘤细胞的目的。大量实验证明，无论是通过基因敲除、沉默还是用药理学抑制剂处理，抑制细胞自噬，可以极大地增强细胞对抗癌药物和放疗的敏感性，使细胞发生凋亡和坏死。不同的自噬抑制剂抑制细胞自噬通过不同机制：例如，通过细胞自噬抑制剂或RNA干扰自噬相关基因的表达而抑制自噬，可以增强慢性骨髓细胞性白血病对抗肿瘤药物苯磺酸伊马替尼（I-inatinibmesylate）的敏感性[47]。目如常用自噬抑制剂如：3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、LY-294002和曼青霉素（wortmannin）抑制PI3K的活性[48、49]；氯喹（cliloroquine，CQ）、羟氯喹（hydroxy-chloroquine.HCQ）和莫能菌素（monensin）通过改变溶酶体的pH值，抑制自噬小体和溶酶体的融合，以及自唾体的降解；BafilomycinA1抑制vacuolar-ATPase的活性；小分子干扰RNA（siRNA）抑制Atg表达。这些抑制剂可使自噬停滞于某一阶段，阻止自噬过程的完成。

在基因疗法、放化学疗法或营养缺乏的环境，由于自噬细胞的保护机制，有少数细胞能忍受急剧恶劣和紧张的条件。一旦生长条件有利，细胞会恢复并导致肿瘤复发。自噬通过允许残留或转移肿瘤耐受细胞毒性适应力，使抗癌药物对肿瘤细胞产生耐药性。因此，抑制自噬可能是根除肿瘤的一个有效方法。

3联合治疗

细胞自噬水平升高是细胞应对外界压力的重要方式。在多种肿瘤放化疗的过程中，可以观察到肿瘤细胞的自噬水平明显升高。发现自噬可能是肿瘤细胞放化疗耐受的一种机制抑制肿瘤细胞的自噬，可能会增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。有大量研究显示，自噬抑制剂可以增强恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、结直肠癌及前列腺癌等多种肿瘤对放化疗的敏感性[50]。Meschini等[51]发现老刺木胺联合阿霉素不仅能克服耐药骨髓瘤细胞阻力通过竞争性抑制P-glycoprotein（P-gp）/ABCB1，一个通过MDRI基因编码的170kD蛋白，而且导致耐药细胞自噬性死亡。因此，自噬抑制剂与常规放化疗的联合使用可成为改善肿瘤细胞对治疗药物效果的有效途径。

4小结与展望

自噬在肿瘤治疗过程中发挥着双刃剑的作用，一方面，自噬可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而主动诱导II型程序性死亡；另一方面，自噬也可协助肿瘤细胞抵抗化疗药物诱导凋亡作用。肿瘤抑制剂通过降解缺陷的细胞器和其他的细胞成分而激活自噬的功能：然而，这一途径也可以被利用在肿瘤细胞饥饿、缺氧、化疗期间的应激而诱导生成营养和能量。因此，诱导自噬已成为一个耐药性的机制，通过的自我消化促进肿瘤细胞生存。大量临床前研究已经证明，抑制自噬增强广泛的抗肿瘤药物的活性

在临床研究中，抑制自噬作为一种肿瘤治疗的策略，需要更进一步临床前评估使其达到最优的条件。抑制自噬作为肿瘤治疗面临如下问题：1）认识自噬在肿瘤中的双重作用――细胞保护或依靠在早晚期肿瘤的发生和肿瘤类型杀死细胞；2）识别在肿瘤中自噬的功能状态，一些肿瘤具有自噬缺陷路径，其他的有保存自噬的能力；3）药剂的开发――在用于促进或抑制自噬方面很重要。自噬促进剂和自噬抑制剂各自的适用时机尚未确定，还有待进一步研究和证实。如何诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡及抑制自噬并联合放化疗药物是治疗肿瘤的新思路，很可能会为肿瘤的治疗带来新的希望。

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细胞自噬篇7

1945年2月9日出生于日本福冈。1974年从东京大学获得博士学位。1974年至1977年，他在美国洛克菲勒大学做博后，随后返回日本，任职于东京大学。2009年起，为东京工业大学教授。

北京时间10月3日下午5点30分，2016年诺贝尔生理学或医学奖揭晓，日本科学家大隅良典（Yoshinori Ohsumi）获奖。获奖理由是“发现了细胞自噬机制”。

今年的诺贝尔奖获得者发现并阐明了细胞自噬的机制―这是细胞成分降解和循环利用的一个基本过程。

自噬（autophagy）一词来源于希腊语前缀auto-，意为“自我”，以及另一个希腊语单词phagein，即“吞噬”。因此，autophagy便引申为“自噬”。这个定义出现在上个世纪60年代，当时，科研人员首次观察到细胞能破坏自身成分，用膜将这些成分包裹，形成袋状囊泡并转移给溶酶体（lysosome）进行降解回收。此前人们对细胞自噬过程几乎毫无了解，因而相关研究一直是困难重重，直到上个世纪90年代初，大隅良典在一系列实验中，巧妙地利用面包酵母（baker，s yeast）找到了细胞自噬所需的基因。通过继续研究，大隅良典阐明了酵母自身内自噬的基本原理，并证明类似的复杂机制也存在于人体细胞内。

大隅良典的发现为我们了解细胞如何循环利用自身成分树立了新典范。他的发现也为我们了解并意识到细胞自噬在饥饿适应、感染反应等许多生理过程中的至关重要性开辟了新道路。自噬基因的突变会导致疾病的产生，自噬过程在包括癌症和神经性疾病在内的多种体内环境中充当不可或缺的角色。

降解―存在于所有活体细胞中的重要功能

上世纪50年代，科学家观察到一种特别的细胞微结构（这种微结构的学名又叫做“细胞器”），这种细胞器含有能够消化蛋白质、碳水化合物和脂肪的酶。后来研究人员将这种细胞器称为溶酶体，它相当于降解细胞成分的工作站。比利时科学家Christian de Duve就因为发现这种溶酶体而获得1974年诺贝尔生理学或医学奖。到了60年代，科学家们在溶酶体中有时可以找到大量的细胞组成物质甚至是完整的细胞器。因此，科学家们认为细胞内存在着一种过程―将细胞内的“大型货物”送到溶酶体那儿。进一步的生化和显微分析也显示，一种新的囊泡会将细胞成分打包送到溶酶体处进行降解。发现溶酶体的Christian de Duve使用了“自噬”这个合成词描述这一过程。这种囊泡则被称为“自噬体”（autophagosome）。

我们的细胞有着各种特别的细胞器。溶酶体就是这样的一种细胞器，它含有各种可以消化细胞成分的酶。细胞内还存在一种被称为“自噬体”的新型囊泡。当自噬体形成时，它会包裹住某些细胞成分，如那些被破坏的蛋白质和细胞器。最终，自噬体与溶酶体相融合，这些细胞成分便会降解为更小成分。这一过程为细胞的更新提供了养分和构建基础。

在上世纪70到80年代，科研人员将注意力放在了对另一种降解蛋白质的物质即“蛋白酶体”的研究上。在这个研究领域里，就有Aaron Ciechanover， Avram Hershko和Irwin Rose三位科学家因为发现泛素调节蛋白的降解而获得2004年诺贝尔化学奖。蛋白酶体能够有效地先后降解多个蛋白质，不过这种机制并没有解释细胞是如何处理更大的蛋白质复合物和破旧的细胞器的。那么自噬过程能够给出解释吗？如果可以，那其机制又是什么呢？

一个突破性实验

大隅良典曾活跃于多个研究领域，在1988年开始建立自己的实验室时，他将研究重点放在液泡中蛋白质的降解方面。酵母细胞相对比较容易研究，所以经常被用于人类细胞研究模型。对于研究在复杂细胞通路中具有重要作用的基因来说，它们尤其有用。但是大隅良典面临着一个主要的挑战：酵母细胞很小，内部结构在显微镜下很难区分，所以他就难以确定酵母细胞中是否存在着自噬作用。怎么办呢？他就想着，在自噬过程激活时，如果能打断液泡中的降解过程，那么自噬体就应当在液泡中聚集，并能在显微镜下可见。于是他培养了缺乏液泡降解酶的酵母细胞，并通过饥饿化细胞刺激自噬作用。结果是惊人的！几个小时内，液泡内就充满了未被降解的小囊泡。这些小囊泡就是自噬体，大隅良典的实验证明了自噬存在于酵母细胞中。更重要的是，他现在能够鉴别参与这一工程的关键基因了。这是一项重大的突破，大隅良典于1992年发表了这项结果。

自噬基因被发现

大隅良典开始利用改造过的酵母菌株，其中的吞噬体因饥饿而聚集。如果自噬重要基因失活，这种聚集不应该发生。大隅良典将酵母细胞暴露在一种化学物质下，随机在许多基因中诱发突变后，开始诱导自噬。他的策略成功了！在发现酵母自噬一年内，他就鉴别出了第一个对于自噬至关重要的基因。在后来的一系列精巧的研究中，他发现由这些基因编码的蛋白具有功能性。这些结果显示，自噬由一组蛋白和蛋白复合体调控，各自调节自噬体形成的不同阶段。

细胞自噬―细胞中的关键机制

在发现了酵母中的细胞自噬机制后，仍有关键的问题待解。其他机体中是否存在着响应机制来调控这一过程？很快，科学家弄清了人类的细胞中也存在着完全一样的机制。如今，用于研究人体细胞自噬重要性的工具已经诞生。

感谢大隅良典和其他跟进研究的人，我们现在知道自噬调控着重要的生理功能，以便细胞组件得以降解和循环。自噬能够快速提供能量燃料，及为细胞组件更新提供材料，从而对细胞响应饥饿或其他应激至关重要。在感染后，自噬能够清除入侵的胞内细菌和病毒。自噬对于胚胎发育和细胞分化也发挥作用。细胞还利用自噬清除受损蛋白和细胞器，这是一种质量控制机制，对于抵消衰老带来的副作用至关重要。

中断的自噬作用已被认为与帕金森症、Ⅱ型糖尿病及其他老年易患病相关。自噬基因的变异能导致基因疾病。干扰自噬作用被认为与癌症相关。目前相关研究正在紧密展开，以期开发相关药物能在多种疾病中标靶自噬作用。

虽然自噬作用已被发现了50多年，但直到上世纪90年代大隅良典颠覆性的研究之后，它的重要性才得到确认。因为这一贡献，大隅良典被授予今年的诺贝尔生理学或医学奖。

细胞自噬篇8

【摘要】

目的: 分析连翘(FS )对小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬和体外NO释放的影响。方法: 无菌收集小鼠腹腔巨噬细胞和羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)标记大肠杆菌DH5α， 短期培养3 h后流式细胞术(FCM)分析FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响。用LPS体外刺激活化腹腔巨噬细胞， Griess Reagent试剂盒检测并分析FS对巨噬细胞体外释放NO的影响。结果: FCM分析显示， 终浓度为40、 80、 160 mg/L的FS对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬具有明显的促进作用(P

【关键词】 连翘提取物 腹腔巨噬细胞 吞噬 NO释放

［Abstract］ AIM: To investigate the effect of forsythia suspensa (FS) extract on phagocytosis of peritoneal macrophages and NO production in vitro. METHODS: The peritoneal macrophagess were isolated from BALB/c mice. After stained with CFDASE， the DH5α were cocultured with peritoneal macrophagess for 3 h. The effect of FS extract on cytophagocytesis in vitro was analyzed by flow cytometry. The peritoneal macrophages were stimulated and activated by LPS in vitro. The effect of FS extract on NO production of the peritoneal macrophages in vitro was measured by NO assay kit. RESULTS: FCM analysis showed that FS extract significantly promoted the phagocytosis of peritoneal macrophages at the final concentration of 40， 80， 160 mg/L， respectively (P

［Keywords］forsythia suspensa extract;peritoneal macrophages;phagocytosis; NO production

连翘(forsythia suspensa， FS)又名旱莲子、 大翘子、 落翘等， 为木犀科植物连翘的果实。它作为传统中药广泛应用于对炎症、

发热和溃疡等方面的治疗［1］。同时， FS的主要活性成分连翘苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解热抗炎等方面［2］也起着重要的作用。本研究我们通过检测FS对小鼠腹腔内巨噬细胞体外吞噬和NO释放的影响， 进一步研究其免疫学效应。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级BALB/c近交系小鼠(雄性， 8～10周龄， 体质量20～22 g)购自广东省实验动物中心。FS购自四川广汗市维康植化有限公司。L谷氨酰胺、 β巯基乙醇、 刀豆蛋白A(concanavalin A， ConA)购自Sigma公司。羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFDASE)购自美国Molecular Probes 公司。RPMI1640、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)为美国GibcoBRL公司产品。Griess Reagent试剂盒为美国Promega公司产品。流式细胞仪(FACSCalibur)为美国Becton Dickinson公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备和细胞培养 断颈处死小鼠， 用750 mL/L乙醇消毒， 腹腔注射RPMI1640完全培养液约5 mL。用棉球轻揉腹壁1～2 min后， 收集腹腔液， 1500 r/min离心10 min， 弃上清， 用RPMI1640完全培养液(含100 mL/L的FBS)调整细胞密度为2×109/L。根据需要接种于24孔(1mL/孔) 或96孔(0.2mL/孔)细胞培养板中， 37℃、 50mL/L CO2培养箱培养3 h 。轻轻吸弃培养液后， 再用RPMI1640完全培养液洗去未贴壁细胞， 继续培养［3］。

1.2.2 对大肠杆菌DH5α的染色标记 采用CFDASE染色标记大肠杆菌DH5α。CFDASE用二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的储存液， -20℃ 保存。临用前， 取适量用PBS稀释成1 mmol/L的工作液， 备用。新鲜大肠杆菌DH5α离心弃去LB培养基(4 000 g， 6 min)， 冷PBS洗涤1次， 调整细菌密度为1×1010/L， 加入CFDASE工作液(终浓度为8 μmol/L)， 充分混匀后在37℃摇床振荡(220 r/min， 15 min)。RPMI1640培养基静置10 min终止染色后离心， 经RPMI1640洗涤2次(4000 g， 6 min)后， 重悬。流式细胞术(FCM)检测DH5α的CFDASE染色标记率为90%。

1.2.3 巨噬细胞体外吞噬 将CFDASE标记好的大肠杆菌DH5α(1×107/孔)与小鼠腹腔巨噬细胞(细胞密度为2×109/L)一同接种到24孔板内。实验分组及处理: 设2组空白对照(RPMI1640完全培养液组和PBS组)和不同终质量浓度FS组: (RPMI1640+FS 40)、 (RPMI1640+FS 80)、 (RPMI1640+FS 160)、 (PBS+FS 40)、 (PBS+FS 80)、 (PBS+FS 160)接种于24孔培养板。每组各设6个重复孔。37℃、 50 mL/L CO2培养箱中温育3 h后， 用细胞刮轻轻刮下贴壁的巨噬细胞， 各组分别经由70 μm滤器过滤， 立即以FCM检测。

1.2.4 巨噬细胞体外NO释放 实验分组及处理， 设阴性对照组(单独RPMI1640完全培养液组)、 阳性对照组(单独LPS组)、 不同终质量浓度的单纯FS组和(FS+LPS)组， 每组设6个复孔， 接种于96孔培养板。给药组细胞与药物FS共孵育4 h后， 再加入LPS(终浓度为10 mg/L)刺激继续培养24 h。收集相应培养上清-20℃保存。采用Griess Reagent试剂盒(Promega)以检测小鼠巨噬细胞培养上清中的NO稳定氧化代谢产物亚硝酸盐(NO-2)水平， 间接反映NO的释放量。50 mL小鼠巨噬细胞培养上清加入96孔平底酶标板中， 按试剂盒操作说明加入试剂， 室温避光孵育10 min， 检测A540值。

1.2.5 FCM检测及分析 所有样品经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中， 划出巨噬细胞细胞区R1。CFDASE为荧光1(FL1)。M1表示腹腔巨噬细胞吞噬经CFDASE标记后DH5α百分率。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件获取， 每管样品检测10000个细胞， 获得的数据用CellQuest软件分析。统计学分析用统计软件包SPSS10.0进行处理， 数据以x±s表示， 多组间比较采用方差分析， 两两间比较用LSDt检验。

2 结果

2.1 FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响 表1结果显示， 仅对照组RPMI1640完全培养液和PBS组之间比较， 发现RPMI1640 悬浮的巨噬细胞吞噬率比对照组PBS表现较高。对照组RPMI1640 完全培养液和(RPMI1640+FS)组比较， 各浓度FS组均可促进巨噬细胞吞噬率的增加， 具有统计学意义。对照组PBS和(PBS+FS)组比较， 相同浓度FS组也可促进巨噬细胞吞噬率的增加， 具有统计学意义。不同浓度FS间比较有一定的浓度梯度依赖性。巨噬细胞体外吞噬的一次代表性实验结果(图1)。

表1 FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬影响（略）

Tab 1 Influence of FS on the phagocytosis of peritoneal macrophage in vitro

aP

图1 腹腔巨噬细胞体外吞噬DH5α（略）

Fig 1 Phagocytosis of peritoneal macrophage on DH5α in vitro

2.2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响 表2结果显示， 单纯RPMI1640完全培养液组为阴性对照组。不同终质量浓度的单纯FS组均可抑制巨噬细胞体外NO释放， 且随着药物浓度的升高其抑制NO释放的程度越高， 具有统计学意义。LPS组为阳性对照组， 它的NO释放结果为(0.36±0.01) μmol/L。在(LPS+FS)组中， FS也可抑制LPS诱导刺激巨噬细胞体外NO释放， 不同浓度间也随着药物浓度的升高其抑制NO释放的程度越高， 具有统计学意义。与单纯FS组作用趋势呈一致性。巨噬细胞体外吞噬的统计学实验结果见图2。

图2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放影响（略）

Fig 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

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表2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放影响（略）

Tab 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

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3 讨论

腹腔中的巨噬细胞主要是通过引起和调节局部细胞介导的免疫反应来调节和维持腹腔环境的稳定， 是一种十分重要的免疫辅助细胞。它在细胞膜上表达MHCI/II类分子和多种黏附分子以及IgG Fc受体(FcγR)、 C3b受体(CRI)和多种细胞因子受体。在与多种病原微生物识别与结合过程中， 可以高表达IA抗原和分泌较高水平L10， 通过受体与病原体等抗原异物结合经吞噬或吞饮作用， 主动吞噬、 杀伤和消化病原微生物等抗原性物质。

本实验我们采用新的方法， 用CFDASE标记DH5α在体外被小鼠腹腔巨噬细胞吞噬， 间接证实了FS可促进小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬。不同浓度的FS对其吞噬影响呈一定的梯度表现， 与对照相比均有统计学意义。我们推测FS可能通过与腹腔巨噬细胞表面的受体间的特异性结合而促进了巨噬细胞的吞噬功能; 或者也可能对作为抗原的大肠杆菌DH5α的受体Fc段存在一定的调理作用， 从而协同促进了腹腔巨噬细胞识别、 结合并吞噬的过程。

腹腔巨噬细胞的NO释放是由LPS协同INFγ、 TNFα等细胞因子作用刺激诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)所达成的［4］。我们已知NO作为体内重要的生物活性物质， 可以兼具细胞间、 细胞内信使以及神经递质作用的信号分子。它是由血管及机体许多其他组织类型的细胞合成， 以自分泌或旁分泌作用参与正常生理过程和某些疾病的发生发展， 如血管扩张、 血管通透性、 血小板黏附和聚集、 神经信号转导、 宿主防御反应等等。此外， 在免疫学上NO也具有重要的意义。它作为机体非特异性免疫系统的组成部分之一， 起着免疫效应分子和免疫调节剂的作用， 可以杀伤细菌、 病毒和肿瘤细胞。但是， NO过量可对宿主细胞产生细胞毒性作用， 损害宿主细胞活性和导致基因突变， 如NO过量可诱发肿瘤， 有研究发现肿瘤的发生和发展与血液NO的浓度可呈正相关［5］。此外， 临床上NO过量还常表现在的休克和哮喘等［6］。

已知LPS诱导激活巨噬细胞一般是沿2条道路进行启动信号转导途径: 一是LPS与靶细胞膜相应受体作用并启动胞内信号转导途径; 二是LPS作用细胞后， 核内基因表达的变化及其上游信号分子的确定［6］。研究表明LPS的刺激可激活或增强通路MAPK家族(ERK1/2， JNK1/2以及p38MAPK)的磷酸化， 同时还可促进巨噬细胞分泌释放PGE2使之与其细胞表面G蛋白偶联的受体结合激活腺苷酸环化酶， 导致cAMP 释放增加及PKA的活化［7］。本试验结果表明FS对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞体外NO释放有抑制作用。低浓度FS(40 mg/L)即可抑制腹腔巨噬细胞NO的体外释放， 且各浓度梯度FS与对照组比较均有统计学意义。由此我们推测FS抑制小鼠腹腔巨噬细胞体外释放NO的原因在于FS可能参与和影响了LPS诱导的某些通路的表达。文献表明FS可以抑制cAMP磷酸二酯酶的活性并在一定程度上能够降低胞内cAMP的含量［8］; 它还可以抑制p38MAPK的活化、 阻断NFκB途径作用以及抑制iNOS蛋白和mRNA的表达［9］， 这些均为FS抑制腹腔巨噬细胞体外释放NO提供了理论依据。

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