维生素D减缓牙周炎症反应的实验研究

[摘要]目的：初步探讨维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞炎症反应的抑制作用，为牙周病的防治提供一定的依据。方法：采用酶联免疫吸附实验、实时荧光定量核酸扩增检测系统检测维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞分泌炎症因子白介素1β、肿瘤坏死因子α水平的影响。结果：维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞分泌炎症因子白介素1β、肿瘤坏死因子α有显著的抑制作用，最低有效浓度为6.25μg/ml，且随着维生素D浓度的增加，抑制作用越明显。结论：维生素D是一种潜在的防治牙周炎症反应的药物。

[关键词]维生素D；1，25-二羟维生素D3；牙周炎；白介素1β；肿瘤坏死因子α

[中图分类号]R781.4+2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）23-0035-04

Abstract： Objective To investigate the inhibitory effect of vitamin D on Porphyromonas gingivalis induced inflammation of human periodontal ligament cells，provide evidence for the prevention of periodontitis. Methods The enzyme linked immunosorbent assay and real-time quantitative PCR detecting system were used to observe the effects of vitamin D on the secretion of interleukin 1β and tumor necrosis factor α induced by Porphyromonas gingivalis. Results Vitamin D could inhibit the production of interleukin 1β and tumor necrosis factor α significantly.The minimum inhibitory concentration was 6.25μg/ml.With the increase of concentration of vitamin D，the inhibitory effect was enhanced. Conclusion Vitamin D may be a potential medicine of periodontitis.

Key words：vitamin D；1，25-dihydroxy vitamin D3；periodontitis；interleukin 1β；tumor necrosis factor α

牙周炎是以炎症因子渗出、牙周支持组织破环为主要病理表现的慢性、广泛性炎症反应，是成人失牙的首要原因。已被医学界定论为继癌症、心脑血管疾病之后，威胁人类身体健康的第三大杀手，也是口腔健康的“头号杀手”。流行病学研究结果显示牙周炎是加重心血管疾病、Ⅱ型糖尿病等多种系统性疾病进程，影响预后的重要诱因[1]。发病机制与免疫、炎症反应密切相关。现已证实革兰氏阴性厌氧菌――牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎发生、发展的主要病原菌，约占牙周炎患者95%以上的病变活动区域[2]。牙龈卟啉单胞菌能利用多种毒力因子如半胱氨酸蛋白酶（常指牙龈素）、菌毛和脂多糖侵袭牙周组织和宿主免疫系统。维生素D是保持骨骼健康，调节机体免疫、炎症反应的重要元素，不仅与钙吸收、破骨细胞活性密切相关，还参与调节基因表达、蛋白合成和免疫/炎症反应[3]。本实验的目的就是研究维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的人牙周膜细胞炎症反应的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

维生素D代谢物1，25-二羟维生素D3[1，25（OH）2D3]购自Sigma公司，牙龈卟啉单胞菌购自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室。1，25-二羟维生素D3溶液的配置：将晶体用95%的乙醇配置成10mg/ml的母液，置于-20℃冰箱中储存备用。使用时用细胞培养液稀释成各种浓度梯度（100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625μg/ml）的工作液。

1.2 实验方法

1.2.1 实验菌液的准备、细菌复苏及培养：将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277菌株复苏并接种于含有20μM氯高铁血红素和0.0001%维生素K的Todd-Hewitt肉汤（THB-HK）中，在37℃厌氧环境下（CO2 10%、N2 90%）培养48h，经形态学鉴定后传代培养24h，备用。

1.2.2 人牙周膜成纤维细胞的培养：采取酶消化原代培养法。刮取临床因正畸或阻生拔除牙齿的根中1/3的健康牙周膜，立即投入含三抗的D-Hanks内。清洗刮取的牙周膜，去除血污及不需要组织。加入0.1%胶原酶37℃消化30min，加入含10%FBS的DMEM终止消化，二层无菌纱布滤除组织块，1 000ppr 5min离心去上清，加入含10%FBS的DMEM进行培养。4～8代用于实验。

1.2.3 维生素D对人牙周膜成纤维细胞活性的影响：消化离心收集人牙周膜细胞，台盼蓝计数调整细胞密度为106/ml接种于96孔板中，培养2h待细胞贴壁后添加不同浓度的维生素D和厌氧培养了24h的牙龈卟啉单胞菌的菌液，继续孵育72h。接着每孔添加10μl MTT溶液置于细胞培养箱中培养4h，再每孔添加100μl溶解溶液孵育过夜。最后使用分光光度仪进行读数。

1.2.4 牙龈卟啉单胞菌诱导人牙周膜成纤维细胞发生炎症反应：消化离心收集人牙周膜细胞，台盼蓝计数调整细胞密度为106/ml接种于24孔板中，培养过夜。次日，在孔板中添加200μl不同浓度的维生素D置于培养箱中继续培养2h。将厌氧培养了24h的牙龈卟啉单胞菌的菌液转移至塑料离心管，10 000ppr，10min，4℃离心，弃上清液后用含1%FBS的DMEM清洗2次。测 OD660，并根据孔板内牙周膜细胞密度计算感染倍数（multiplicity of infection， MOI）为100时，所需细菌混悬液体积（OD660=1表明细菌密度为2.5×109/ml）。将感染倍数为100的菌液添加到孔板中，继续培养24h后收集培养液置于-20℃冰箱中保存备用。使用Trizol裂解细胞，酚/氯仿法提取细胞总RNA置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.5 ELISA检测IL-1β、TNF-α蛋白的表达：按ELISA试剂盒产品说明书步骤操作：使用标准品绘制标准曲线，取反应板加样、并按说明依次加入一抗、酶标抗体及底物工作液，最后加入反应终止液，于酶标仪以波长450nm读取各孔光密度值。通过标准曲线和ELISAcalc软件计算各样本含量。

1.2.6 qPCR检测IL-1β、TNF-αmRNA的表达：提取的总RNA经浓度测定、纯度鉴定后，逆转录为cDNA，按照反应体系依次添加SYBR Green染料、引物、dNTP、cDNA、Taq酶及去离子水，配制PCR反应溶液。置于Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：95℃3min预变性，然后按照95℃30s变性，58℃1min退火，72℃1min，共40做个循环，最后72℃7min延伸。

2 结果

2.1 维生素D对人牙周膜成纤维细胞活性的影响

如图1所示：与空白对照组相比，牙龈卟啉单胞菌组牙周膜成纤维细胞的增殖被显著抑制，当维生素D浓度为3.125和6.25μg/ml时，牙龈卟啉单胞菌引起的细胞毒性作用非常显著。可见，牙龈卟啉单胞菌显著抑制人牙周膜成纤维细胞的增殖，当维生素D浓度≥12.5μg/ml能减弱牙龈卟啉单胞菌引起的细胞毒性。单纯的维生素D不影响人牙周膜成纤维细胞的活性。

2.2 维生素D对牙龈卟啉单胞菌诱导的IL-1β、TNF-α表达水平的影响

ELISA及qPCR检测结果均显示牙龈卟啉单胞菌显著增加人牙周膜成纤维细胞分泌IL-1β和TNF-α，当维生素D浓度≥6.25μg/ml时，能显著抑制牙龈卟啉单胞菌诱导的炎症介质的分泌（如图2、3）。

3 讨论

维生素D是由暴露于紫外线的皮肤合成或从日常饮食中直接获取的开环甾类化合物。具有钙化醇（维生素D2）和胆钙化醇（维生素D3）两种形式。这两种形式的维生素均在肝脏代谢为25-羟基维生素D并在肾脏被1-羟化酶转化为其活性形式1，25-二羟维生素D。因此本实验选取维生素D的活性形式作为研究试剂。

牙周炎伴随的牙槽骨破坏主要起源于病原菌诱导的过强炎症反应。IL-1β和TNF-α是破骨细胞活化的主要因子。马宁等人在大耳白兔牙周组织注射IL-1β、TNF-α，能成功建立典型而稳定，近似临床牙周炎表现的实验动物模型[4]。尹丽媛等采用RT-PCR技术检测成人牙周炎患者牙龈组织中IL-1β、TNF-αmRNA表达水平的结果显示：其在病变牙龈的表达强度显著高于正常牙龈，因此推测IL-1β、TNF-α表达与牙周炎发病机理密切相关，有效抑制其分泌与合成有利于牙周炎的治疗与预后[5]。本实验研究结果显示牙龈卟啉单胞菌能显著增加人牙周膜细胞分泌、合成IL-1β和TNF-α，诱导细胞炎症反应，能在细胞水平模拟牙周炎的病理状态。

流行病学观察显示牙周健康与维生素D的摄入量密切相关。与每日摄入≥800IU的人群相比，摄入量≤400IU的人群更容易罹患重度牙周疾病并伴随中重度的牙槽骨破坏[6]。25-羟基维生素D和1，25-二羟维生素D血清浓度偏低者牙周炎和牙丧失的发病率更高[7-8]。维生素D不仅能够增加骨密度，抑制骨吸收，减少牙丧失[9- 10]，还能通过其抗炎活性发挥免疫调节作用[11-12]。本实验研究结果也显示1，25-二羟维生素D能显著抑制牙龈卟啉单胞菌诱导的IL-1β和TNF-α的分泌。尽管大量研究显示维生素D在保持骨密度，减少慢性炎症疾病等方面作用显著，但是维生素D缺乏和不足在人群中仍然广泛存在。因此政府呼吁不同年龄段的人群每日口服维生素D 200-600IU[13]。此外，适当日光浴、进食富含维生素D的食物如鱼肝油均是有效的途径。

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[收稿日期]2015-09-28 [修回日期]2015-11-27