维生素E脂质体的制备工艺筛选优化及其性质研究

摘要：目的优化维生素E(v。)脂质体的制各工艺并考察其性质。方法采用乙醇注入法、乙醚注入法、逆相蒸发法、薄膜水化法和复乳法分别制备v。脂质体，以包封率和保留率为考察指标，选择最优制备方法；经L9(34)正交试验设计优化选择，确定脂质体的最佳配方。结果薄膜水化法制备所得的脂质体包封率最高，vE保留率较高；用薄膜水化法制备脂质体的最佳配方为磷脂：VE：胆固醇20：0.8：1.5；用透射电镜观察最佳实验组VE脂质体发现其具有指纹状结构，Zeta电位-为30.9±0.9 mV，平均粒径为33.7 rim。结论薄膜水化法制得的v。脂质体具有包封率高，v。保留率高，粒径均匀等特点。

关键词：维生素E；脂质体；制备工艺；性质

中图分类号：R977.2+5

文献标识码：A

文章编号：1672-979X(2012)03-0095-05

收稿日期：2011―10―15

基金项目：国家基金委国际合作(中韩)交流项目(40911140282)；国家自然科学基金项目(40876065)；国家国际科技合作(中韩)项目(2011DFA31270)；省重大科技成果转化项目(BA2010112)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(841111042，201213006)

作者简介：党奇峰(1982―)，女，山东潍坊人，讲师，主要从事海洋生物材料的研究

通讯作者：刘成圣，教授E.mail：liucs@ouc.省略.

维生素E(vitamin E,VE)又称生育酚，是主要存在于植物油如麦胚油、玉米油、大豆油中的一种脂溶性维生素。V。能有效地捕捉机体代谢过程中产生的自由基，如羟基自由基、过氧化物自由基、超氧离子自由基等，使苯并吡喃环上的酚基失去一个氢原子而形成生育酚自由基，生育酚自由基又可进一步与另一自由基反应生成非自由基产物一生育酚。因此VE是动物和人体中有效的抗氧化剂。但是，VE有对光和热敏感、极易氧化、水溶性差，生物利用度低等缺点。脂质体(1iposome)在食品、化妆品和医药领域逐渐显现出巨大的应用潜能。采用脂质体包埋VE能增强其稳定性，并能改善其水溶性，提高生物利用率。近年，虽然对VE脂质体制备工艺的研究取得了一定的进展，但仍然存在很多问题，比如包封率低、稳定性差、粒径分布不均匀等。为了寻求包封率高、稳定性好的VE脂质体制备方法，本文分别采用乙醇注入法、乙醚注入法、逆相蒸发法、薄膜水化法和复乳法制备VF脂质体，以包封率和保留率为考察指标，选出最优的制备方法，用正交试验设计优化选择该方法，并研究了最佳实验组vE脂质体的性质。

1材料和设备

1.1材料

蛋黄卵磷脂(99％，国药集团)；二棕榈酰磷脂酸(DPPA，99％，德国Lipoid)；磷脂酰丝氨酸(PS，99％，德国Lipoid)；混合磷脂(20％DPPA，10％Ps，70％蛋黄卵磷脂，自制)；胆固醇(99％，Sigma)；VE(医药级，国药集团)。

1.2设备

MB99―2A自动液相色谱分离层析仪(上海沪西)；RE，52AA旋转蒸发器(上海亚荣)；HL-2流泵(上海沪西)；Zetasizer2000激光衍射粒度分析仪(英国马尔文)；UV-2802PCS紫外／可见分光光度计(尤尼柯)；透射电镜(TEM，100CXII，日本电子公司)。

2方法

2.1 VE脂质体的制备

V。脂质体的整个制备过程都处于避光条件下。

2.1.1乙醇注入法参考成差群等的方法并加以改进，精确称取0.08 g混合磷脂，0.007 5 g胆固醇，0.004 g VE注入4 mL／,醇中，30℃下搅拌，充分溶解后用注射器将其快速注入盛有10 mL pH 5.8的磷酸缓冲液(PBS 5.8)的圆底烧瓶，磁力搅拌30 min后常压下旋转蒸发除去乙醇，得大型脂质体混悬液。将其转移到西林瓶中冰水浴超声(750 w，20 kHz，ls／2s)8min，磁力搅拌15 min得小粒径脂质体混悬液。

2.1.2乙醚注入法方法同2.1.1，将乙醇替换为乙醚。

2.1.3逆向蒸发法根据李可欣等的方法加以改进，精确称取0.08 g混合磷脂，0.007 5 g胆固醇，0.004 gv。，加入4 mL三氯甲烷搅拌至完全溶解，减压除去三氯甲烷，在圆底烧瓶内壁形成均匀的脂质薄膜。加入3mLT,醚，溶解脂质膜，然后加入10 mLPBS 5.8并充氮。冰水浴超声至混合溶液形成单相体系，室温减压条件旋转蒸发除去有机溶剂。此过程中，首先逐渐形成高黏度凝胶粘在烧瓶内壁，继而凝胶逐渐崩溃，继续减压蒸发5~10 min即形成大型脂质体悬浊液。将其转移至体积约20 mL直径相同的小瓶中冰水浴超声(750w，20 kHz，1 s／2 s)8 min后静置15 min得小粒径脂质体混悬液。

2.1.4薄膜水化法根据穆筱梅的方法m，精确称取0.08 g混合磷脂，0.007 5 g胆固醇，0.004 g VE，加入4 mL有机混合溶剂(乙醇与三氯甲烷的体积比为2：1)搅拌至完全溶解后，转移至50 mL圆底烧瓶中，在0.2~0.3大气压下旋转蒸发使有机溶剂完全挥发，继续真空抽吸30 min后停止，在圆底烧瓶底部形成均匀薄膜。充氮并加2.10 mL PBS 5.8，旋转振摇30~40min使圆底烧瓶壁上的脂质完全脱落，形成均匀的乳白色悬浊液。将其转移至体积约20 mL直径相同的小瓶中冰水浴条件下超声(750 w，20 kHz，1s／2 s)8min，搅拌15 min得纳米级脂质体。

2.1.5复乳法根据张伟光等的方法加以改进，精确称取0.08 g混合磷脂，0.0075 g胆固醇，0.004 g vE用4mL有机混合溶剂(乙醇与三氯甲烷的体积比为2：1)完全溶解，然后在5 mL PBS 5.8中乳化，形成W／O型乳状液，避光减压条件下旋转蒸发除去部分有机溶剂，再加入5 mL PBS 5.8第二次乳化，形成W／OAV型复乳；减压去除有机溶剂，得大型脂质体混悬液。将其冰水浴条件下超声(750w，20 kHz，1 s／2 s)8min得粒径较小的脂质体混悬液。

2.2混合磷脂V。脂质体包封率和保留率的测定

精确称取V。对照品100 mg，置入50 mL容量瓶，用无水乙醇溶解定溶。精确量取该溶液1，2，3，4，5 mL分别置入50 mL容量瓶，无水乙醇定容，于285,5nm的波长处测定吸光度以4对浓度c(mg／mL)绘制标准曲线。

交联葡聚糖G-50凝胶色谱柱(柱高450 mm，内径1 5 mm)分离VE脂质体和游离VE。VE脂质体混悬液5 mL上柱，用PBS 5.8洗脱，流速1 mL／min，每5 mL收集一份，紫外检测。分离游离Vz和脂质体中的VE，用含5％TritonX.100乙醇溶液破碎溶解VE脂

质体和未载药脂质体，取上清用紫外分光光度计在200~400 nnl波长之间扫描，发现未载药脂质体无吸收峰。选用285.5 ／n为测定波长，紫外分光光度计法测定包封于脂质体内v。的含量。用同法测定VE脂质体混悬液体系中v。的总含量和4℃避光保存24 h后脂质体中V。的含量。

每种方法制备的VE脂质体做3组平行实验，根据公式1和2计算包封率、保留率。

公式中，A为加入的V。总含量；B为包入脂质体内v。的含量；c为4℃避光保存24 h后仍包在脂质体内的vE含量。

2.3薄膜水化法制备混合磷脂V。脂质体配方的优化

根据预试验以及文献，选择影响脂质体包封率的4个主要因素：体系中VE含量、胆固醇含量、混合磷脂含量及有机溶剂加入量，设置3个不同水平，用L。(3。)正交表设计试验，确定制备V。脂质体所用材料的最佳比例。

2.4混合磷脂Vs／l~质体的形态学观察

对正交试验得出的最佳组合试验组Vz脂质体用2％磷钨酸染色剂负染，透射电镜下观察脂质体的形态结构并拍照。

2.5混合磷脂、E脂质体的Zeta电位和粒径分析

对正交试验得出的最佳组合实验组混合磷脂v。脂质体用激光衍射粒度分析仪测定其粒径分布，检测角度90。温度25℃，L=670nin。用Zeta电位分析仪考察其Zeta电位。

3结果与讨论

3.1不同方法制备的混合磷脂Vs)1％质体的包封率和保留率

Vs对C的线性回归方程为A=4.555 C+0.000 2(R2=0.999 7)。结果表明：vE与C在0.04-9.2 mg／mL之间有良好的线性关系。

采用乙醇注入法、乙醚注入法、逆相蒸发法、薄膜水化法和复乳法制备所得的Vz脂质体包封率见结果显示，薄膜水化法制备所得的VE脂质体的包封率最高，达到82.50％，其次是乙醇注入法为80.32％，复乳法制备的V。脂质体包封率最低。4℃下避光保存24 h后，乙醇注入法制备所得的脂质体对v。的保留率最高，但与薄膜水化法的相差不大，综合考虑脂质体的包封率和保留率，最终选择薄膜水化法作为以后制备实验用脂质体的方法。

3.2薄膜水化法制g-VE脂质体配方的优化

选择影响脂质体包封率的4个主要因素，设置3个水平，如表2所示，用Lq(3‘)表正交试验设计法进行实验，确定制备V。脂质体所用材料的最佳比例。Lq(3。)正交表及实验结果。

试验结果的直观分析表明，B因素的极差最大，A因素、C因素次之。因此，结果表明，参试的4个因素中，胆固醇质量的影响最大。试验结果的方差分析(表5)表明，不同质量的胆固醇对VE脂质体的包封率有较显著的影响。统计分析结果可得最优水平组为A2BICID，。得出原料最佳比例为磷脂：VE：胆固醇=20：0.8：1.5；有机溶剂与原料的体积质量比(mL：m为53.81：1。

3.3混合磷脂V。脂质体的形态学观察

正交试验得出的最佳组合试验组VE脂质体的透射电镜图片。脂质体呈球形或近球形，颜色较浅，单个观察脂质体可明显观察其粒径大小，并能清楚看见其外观呈现脂质体的典型特征一指纹状结构。

3.4混合磷脂V。脂质体的Zeta电位和粒径分布

正交试验得出的最佳组合试验组VE脂质体的Zeta电位为30.9±0.9 mV，说明所得的Vr脂质体呈负电性。最佳组合试验组所得的vF脂质体的粒径分布平均粒径为33.7 nm。由粒径分布图可见，所得的vE脂质体粒径分布比较集中，分布范围较窄。4结论

本实验以包封率和4℃避光条件下保存24 h后v。的保留率为指标，筛选了5种v。脂质体的制备方法，确定薄膜水化法为最佳方法。用L，(3)正交试验设计优化选择薄膜水化法，得出了包封率最高的制备脂质体需要原料的最佳比例。透射电镜照片显示制备的脂质体呈球形或近球形，颜色较浅，并能清楚观察到脂质体的特有结构一指纹结构。最佳比例制备的Ⅵ脂质体呈负电性，粒径小且粒径分布范围较窄。