细胞的生活范文

细胞的生活篇1

[关键词] CIK细胞；细胞毒活性；增殖率；表型

[中图分类号] R-331 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）01（a）-0012-03

肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视[1]。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军[2]。其主要的效应细胞为CD3+、CD56+表型T淋巴细胞，因此，培养高纯度CD3+、CD56+细胞是提高CIK细胞毒活性，增强对肿瘤细胞杀伤的关键[3]。本研究通过体外的CIK细胞毒实验及流式细胞仪分析检测CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，观察不同培养时间CIK细胞的增殖能力、杀伤活性，以探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系。

1 资料与方法

1.1 主要试剂

人淋巴细胞分离液Ficoll Paque Plus，基因重组人IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3单抗（Sigma公司），RPMI1640培养基（美国GIBCO），小牛血清（NCS）（美国GIBCO），四甲基偶氮唑盐MTT（华美公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，美国）。流式试剂CD3FITC/CD56PE（BD公司，美国），肺癌细胞株A549均为本实验室保存和传代培养。

1.2 实验方法

1.2.1 CIK细胞的培养 抽取恶性肿瘤患者的外周血，Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞（PBMC），用RPMI1640调整至2×106个/mL进行培养，培养基中含10%小牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素和50 μmol/L、巯基乙醇、IFN-γ 1 000 U/mL，于当日加入IFN-γ（1 000 μ/mL），置于37℃和体积分数为5%的CO2培养箱中培养24 h，第1天加入IL-2（1 000 U/mL）、IL-1α（100 μ/mL）、McAb（50 μg /mL），以后每3天换液1次，培养42 d，于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞。

1.2.2 CIK细胞扩增分析 在培养扩增后第7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞制成细胞悬液，用台盼蓝排除法计数活细胞，并除以初始细胞数，求出实际扩增倍数。

1.2.3 CIK细胞的表型分析 分别收取培养第0、7、14、21、28、35、42天CIK细胞，用PBS洗2遍，重悬后分别加入1.5 mL管中，每管106个细胞，离心后，加FITC标记的抗CD3mAb和PE标记的抗CD56mAb各50 μL，于4℃孵育30 min。PBS洗2遍，离心后，每管加1 mL FACS保存液。用流式细胞仪分析CIK细胞的表型。

1.2.4 CIK细胞体外细胞毒活性检测 采用96孔培养板用MTT法测定CIK细胞的杀伤活性，收取第0、7、14、21、28、35、42天培养的CIK作为效应细胞，肺癌细胞株A549细胞作为靶细胞，取对数生长期A549细胞调整浓度为1×105个/mL，CIK细胞浓度分别调整为1×106/mL、2×106/mL、4×106个/mL，效靶比依次为10∶1、20∶1、40∶1，分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组3个复孔，实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100 μL，靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100 μL，效应细胞组每孔加入效应细胞、1640培养液各100 μL，置37℃，5%CO2培养箱中培养40 h，加入MTT试剂每孔100 μL，37℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入DMSO溶液100 μL，震荡溶解沉淀后于全自动酶标检测仪（波长571 nm）检测吸光度值（A值）计算杀伤率，杀伤率=[1-（实验孔A值-效应孔A值/靶细胞孔A值] ×100%。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 采用直接计数活细胞

观察培养第7、14、21、28、35、42天的CIK细胞扩增倍数的变化，结果见表1，培养第21天细胞扩增倍数为（372±1.87），培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）；培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P??0.05）。

2.2 用流式细胞仪分析不同培养时间CIK细胞的表型变化

结果培养第0天CD3+、CD56+双阳性细胞仅占（6.20±1.12）%，第14天达（18.60±4.50）%，第28天为（35.60±2.30）%，达最高峰，其后逐渐降低。见表1。

2.3 MTT法检验培养

第0、7、14、21、28、35、42天的CIK细胞对肺癌细胞系A549效靶比10∶1时杀瘤率分别是14%、51%、86%、95%、68%、50%、27%效靶比20∶1时杀瘤率为15%、88%、98%、100%、81%、67%、53%；效靶比40∶1时杀瘤率为17%、98%、100%、100%、95%、75%、70%。见图1。结果显示，当效靶比为10∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率是95%，达最高峰；当效靶比为20∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时，培养14 d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%。

3 讨论

CIK细胞是在体外条件下通过加入不同的细胞因子（IFN-γ、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血单个核细胞培养诱导而成，同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子。与既往临床使用的过继免疫疗法相比，CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点[4]，是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强，适合临床应用的一种理想的效应细胞[5]，其主要效应细胞为CD3+、CD56+T淋巴细胞，且细胞毒作用几乎唯一存在于CD3+、CD56+表型中。CD3+、CD56+细胞可释放大量的具有细胞毒性的胞浆颗粒而对靶细胞发挥溶细胞作用[6]。这种效应细胞在正常外周血中极其少见，仅为1%～5%。已经证实培养过程中CIK细胞毒作用的增加源于单个细胞基础上的细胞毒作用的提高和非活性细胞被激活，成为有细胞毒作用的细胞，即共表达CD56+和CD3+的细胞数量的显著增加[7]。由此可见，就免疫治疗来说，足够数量的、高免疫毒性的免疫效应细胞是保证治疗效果的必备条件。李文等[8]报道，CIK细胞总数应>5×109才具有治疗作用。李香丹等[9-11]根据实验研究，认为每杀伤1个肿瘤细胞需要40个淋巴细胞，所以在肿瘤生物治疗中，输注细胞数量与疗效呈正相关，应重点研究如何培养出高数量、高杀瘤活性的CIK细胞。从实验结果可以看出，培养时间可能是影响CIK细胞总数、CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率和CIK细胞杀伤活性的重要因素。因此笔者对不同培养时间的CIK进行了分析，期望寻找CIK细胞最佳培养时间区间。结果显示：培养第21天细胞扩增倍数为（372.00±1.87）倍，培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05）。培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍，与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P??0.05）。通过流式细胞仪检测不同培养时间CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率，结果显示培养至第28天CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率为（35.60±2.30）%，达最高峰，其后逐渐降低。故此可以认为，培养时间的延长有利于增强CIK细胞的细胞毒活性，但不是培养时间越长细胞质量越好，综合上述实验结果，笔者认为CIK细胞的最佳培养时间应为28 d左右。笔者用MTT法测定CIK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性，结果显示：效靶比为10∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率是95%，达最高峰；当效靶比为20∶1时，培养21 d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时，培养14 d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%。由此可见增加效应细胞的数量，会大大提升对肿瘤细胞的杀伤力。至于在培养过程中什么因素导致CIK细胞数量上显著的增加，有人认为是抗CD3单抗对CD3+T细胞的刺激导致了CD56+细胞群通过细胞与细胞接触或分泌某种细胞因子而得以表达和扩增，但确切的机制尚待进一步研究。

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细胞的生活篇2

关键词：CytationTM 3；活细胞分析系统；实践教学

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）29-0234-02

荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置，常用于研究细胞内物质的吸收、运输、及分布等。酶标仪，是酶联免疫吸附试验的专用仪器，可广泛应用于核酸的定量及纯度分析、蛋白定量、酶活力和动力学检测等。目前，这两种仪器是生物学实验室里的常备仪器，用途广泛，使用率高。吉林大学公共卫生学院辐射肿瘤学与肿瘤转化医学科研平台（依托于卫生部放射生物学重点实验室）于2014年购进一台CytationTM 3活细胞分析系统（BioTek），将荧光显微镜和酶标仪的功能整合到一起，为广大师生的教学、科研工作提供有力支持。为提高CytationTM 3活细胞分析系统的使用率，充分发挥大型仪器设备的先进功能，现拟将CytationTM 3活细胞分析系统应用于本科生实践教学当中，提升本科生的科研思维和创新能力。

一、本科生实践教学的实施

本科生实践教学主要包括大学生创新性实验计划、本科生开放性创新实验项目和本科生毕业实习等。①大学生创新实验计划是由本科生个人组织团队，在导师的指导下申请项目，自主进行研究性学习，自主进行实验设计、准备材料、实施实验、处理分析数据、撰写总结报告等；②本科生开放性创新实验项目是一种新兴的教学模式，是对传统实验教学模式的改革和补充。学生通过开放性实验教学不仅能动手操作、分析，而且能够主动查阅一定量的文献、初步学习设计实验方案，从而达到本科生主动获取知识、分析问题、解决问题的目的；③本科生毕业实习是本科教学最后一个重要的实践性教学环节，是本科生创新思维、综合素质与实践能力培养效果的全面检验。目前，本科研平台的CytationTM 3活细胞分析系统每年用于上述三个类型的本科生实践教学活动的实施，使本科生通过该分析系统掌握核酸的定量及纯度分析、蛋白定量、酶活力和动力学检测、酶联免疫测定、细胞增殖与毒性分析、报告基因检测等操作技术，提高所承担实践项目的层次。

二、CytationTM 3活细胞分析系统的特点及应用

CytationTM 3是一款细胞成像多功能微孔板检测系统，一套系统兼具全自动数字荧光显微镜和多功能微孔板检测仪的技术手段。全自动数字荧光显微镜用于观测细胞表型的变化，而多功能微孔板检测仪则是在微孔板内对细胞的状态进行快速定量，这种整合设计，为基于孔板的高密度细胞研究提供了大量的细胞表型分析数据，使研究者在培养细胞之后，不但可以对细胞的生长状态进行检测，同时还可得到细胞的影像资料以进行细胞计数。此外，CytationTM 3还配备有BioTek专利的微孔板检测Hbyrid技术，拥有基于滤光片的高灵敏度检测光路和基于光栅的高灵活性检测光路，可以满足不同检测的需求。CytationTM 3的荧光细胞成像模块可升级，为研究者提供了丰富的细胞成像数据。CytationTM 3操作简单，具备荧光及明场成像、自动细胞计数和亚群分析功能，兼容6-384孔板、玻片和T25培养瓶，同时孵育温度可达45°C，并可对CO2和O2 进行控制，是大多数科研实验室预算范围内可以配备的成像检测系统。CytationTM 3用途广泛，如可用于对 DAPI染色的细胞进行分析、对BacMam法转染的U2OS 细胞进行分析、通过荧光显微镜对细胞的活性进行监测等。

三、CytationTM3活细胞分析系统在使用中存在的问题

CytationTM 3活细胞分析系统功能丰富、用途广泛，但使用率较低，原因可能包括以下几方面：首先，由于CytationTM 3属于大型仪器设备，大部分本科生出于担心使用不当损坏仪器的恐惧心理以及学习新设备花费大量时间的畏难心理，不愿意在CytationTM 3上投入过多精力对其功能进行探索，这是导致CytationTM 3得不到广泛应用的重要原因之一；其次，指导教师在承担本科生实践教学的过程中没有充分认识到CytationTM 3的优点、没有针对CytationTM 3的使用进行必要的向导作用，因此忽略了CytationTM 3在实践教学中的优势。要解决以上问题，首先要求指导教师及本科生对CytationTM 3有充分的认识，只有先进的实验方法和仪器设备才能对科研和本科生实践教学的实施给予有力支持，才有可能使教师取得高水平的科研成果、发表高质量的科研论文。目前，国内外使用CytationTM 3进行相关研究已发表学术论文多篇，甚至有文章发表在Nature这样的大牌期刊上。

四、如何将CytationTM 3活细胞分析系统逐步应用于本科生实践教学

1.通过专业培训熟悉仪器基本功能。想要将CytationTM 3活细胞分析系统成功应用于本科生实践教学，首先必须保证参加实践教学的本科生对其功能有足够的了解。CytationTM 3操作简单，功能强大，具备细胞长时培养、微孔板读数、微孔板成像、细胞计数及数据分析的功能，将传统细胞学实验平台如CO2培养箱、酶标仪、荧光显微镜、图像数据分析软件等综合到一起，可完成细胞生长曲线的描绘、干细胞分化研究、细胞迁移及侵袭动力学分析等。通过专业技术人员对CytationTM 3功能的培训，使本科生掌握一定的有关CytationTM 3的基本知识，对其特点及应用范围有初步的了解，为进一步学习CytationTM 3具体操作方法打下基础。

2.通过上机操作掌握仪器使用方法。在充分熟悉了CytationTM 3的特点及功能后，重要的一点是如何上机操作获得各种想要的实验数据。首先由专业技术人员上机操作演示CytationTM 3的各种功能，之后由本科生结合自己的研究内容和实验样品亲自动手操作学习，技术人员在一旁指导，指出其操作中的不当之处，指导本科生快速有效的获得理想的实验结果，从而使研究生对CytationTM 3有感官的认识。

3.通过交流与讨论加深对仪器的认识。CytationTM 3活细胞分析系统属于大型仪器设备，其功能强大，技术先进，承担着重要的科研任务。由于仪器引进的时间尚短，许多功能还有待研究和开发，本科生对于CytationTM 3的功能和使用还不是十分熟悉，因此学生真正接触仪器的时间有限，而这也一定程度地限制了CytationTM 3功能的开发与利用。为了加深本科生对CytationTM 3的认识，以便利用更先进的方法和技术来完成其相应的实践教学内容，我们希望通过组织本科生针对CytationTM 3进行定期的交流与讨论改变仪器使用率低的问题。由于网络交流时间、空间自由，而且覆盖面广，可以同时容纳较多的参与者，因此，我们通过社交软件为研究生创建了网络交流平台，本科生可以在这里针对CytationTM 3提出自己的想法或问题，由其他本科生及指导教师参与讨论与学习。

五、展望

将CytationTM 3活细胞分析系统应用于本科生实践教学，最直接的结果是能够让大型先进仪器在实验室里有用武之地，师生们不再因陌生而ζ渚炊远之，从而实现最初购买时的目的，让CytationTM 3成为科研中的有力武器，提高其使用率。此外，将CytationTM 3活细胞分析系统应用于本科生实践教学，可以使广大本科生有机会接触大型仪器，并且能够亲自动手操作，在理论知识的背景下，强化本科生对仪器的直观认识，使他们了解前沿的知识技术，开拓思维，提升科研兴趣，从而在实践中逐渐培养创新能力。

参考文献：

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Abstract：The CytationTM 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader combines the technologies of automated digital fluorescence microscopy and multifunction microplate reader.In this article，we give an introduction to its features and applications，and explain the problems of using it.We also discuss its application in undergraduate practical teaching，and put forward the prospect of teaching result.

细胞的生活篇3

【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6

【摘要】 目的 探讨prp105132作用下体外小胶质细胞的活化及对il6产生的影响。方法 体外培养大鼠神经胶质细胞，用不同剂量prp105132(0、20、40、80 μmol/l)干预小胶质细胞，elisa法检测24 h后细胞上清液中il6含量。结果 朊蛋白肽段干预后小胶质细胞活化，胞体增大，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp105132剂量的增加，il6分泌量增多(p<0.01)。结论 prp能够诱导体外小胶质细胞分泌il6，并且具有剂量依赖关系。

【关键词】 朊蛋白;小胶质细胞;白细胞介素6

【abstract】 objective to investigate the microglia secret il6 in the condition of prp105132. methods rat microglia culture was exposed to prp105132(0, 20, 40, 80 μmol/l) in vitro. the il6 level in cell supernatant was measured by commercial enzyme immunoassay (elisa) after 24 h. results microglia were activated in the condition of prp peptide. a dosedependent increase in il6 secretion by the prp105132 exposed rat microglia was obtained. conclusions prp may induce microglia secret il6.

【key words】 prion; microglia; interleukin6

朊蛋白病又称传染性海绵状脑病(tses)，是一类人畜共患的致死性神经退行性疾病，主要病理特征为脑组织中存在淀粉样改变，其主要成分为异常prp沉积，周围可见大量的胶质细胞〔1〕。WWw.133229.COM胶质细胞在神经元的生存和整个生命活动中起着支持、营养、保护和修复等重要作用，并具有不同的免疫活性，构成中枢神经系统(cns)抵御病原体入侵的第一防线。细胞因子是固有免疫反应和适应性免疫反应的关键调节剂。在cns感染性疾病中，组织浸润性免疫细胞、cns相关的巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞已经被确定为cns特异性炎症中细胞因子的来源。然而，无论是在疾病条件下还是在培养体系中，是小胶质细胞而不是星形胶质细胞作为关键的前炎症细胞因子和免疫调节性细胞因子的主要来源〔2〕。通过研究克雅氏病患者脑脊液，发现前炎症细胞因子白介素(il)6在脑脊液中含量升高〔3〕。本实验应用prp干预体外小胶质细胞，旨在进一步明确朊蛋白病中il6的可能来源。

1 材料与方法

1.1 朊蛋白肽段处理

prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)采用固相合成法合成，实验前将本条多肽取少量放入离心管中，先用适量的稀乙酸溶解，然后再加入双蒸水稀释，并用稀乙酸将其调回中性ph值。

1.2 细胞培养

1.2.1 神经胶质细胞混合培养

取10只新生wistar大鼠(出生1 d)，在无菌条件下，剪开颅骨，取出脑组织(皮质和髓质)至盛有加糖dhanks液的培养皿中反复冲洗以去除血污。剥离脑表面的脑膜和血管，用加糖dhanks液洗脑组织块1～2次。剪刀剪碎脑组织块至1～3 mm，加入体积比组织块总量多30～50倍的胰酶，在37℃条件下用吸管反复吹打消化液变混浊。加入完全培养液(高糖的dmem/f12 1∶1培养液+10%胎牛血清)终止消化，再次吹打制成单细胞悬液，将细胞悬液转移至消毒离心管中，配平。离心1 000 r/min，10 min，弃上清。加定量完全培养液再次制成细胞悬液，接种入6个50 ml细胞培养瓶，密度为100 000～120 000个细胞/cm2。置于培养箱中，37℃条件下培养。

1.2.2 小胶质细胞的分离、纯化、传代

第3天更换1次培养液，不换液培养10～12 d后再更换培养液，24 h后用dhanks液3∶1稀释胰酶edta溶液(0.25%胰蛋白酶和0.02%edta，1∶1)，37℃下作用40 min。轻轻晃动培养瓶，使贴附在底层星型胶质细胞上的小胶质细胞脱落下来。将含漂浮小胶质细胞的培养液转入培养瓶中，24 h后更换培养液。待细胞长满后，再次用胰酶消化进行传代培养，得到小胶质细胞。

1.3 培养细胞的免疫细胞化学染色

待小胶质细胞长成片后，取出盖片，依次进行0.9%盐水清洗3次，每次5 min;4%多聚甲醛固定40 min;0.01 mol/l磷酸缓冲液(ph7.3)清洗3次，每次5 min，4℃冰箱备用。sp法免疫细胞化学染色。

1.4 prp105132处理体外小胶质细胞

1.4.1 体外小胶质细胞分泌il6含量的测定

体外培养小胶质细胞24、48及72 h，收集细胞上清液，-20℃保存。il6含量检测采用abc夹心elisa法。

1.4.2 不同剂量prp105132对体外小胶质细胞分泌il6含量的影响

应用prp105132，分别为0、20、40、80 μmol/l剂量下干预小胶质细胞，采用abc夹心elisa法检测培养后24 h细胞上清液内il6含量。

1.5 统计学分析

计量数据采用x±s表示，用spss13.0统计软件分析。

2 结 果

2.1 培养小胶质细胞的活体观察

第一代小胶质细胞少，呈漂浮状，圆形，折光性强。传代培养5～10 d后，细胞贴壁，数量增多，并长成片，细胞出现较多短小弯曲的突起。加入prp105132肽段后小胶质细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状。

2.2 培养小胶质细胞纯度的鉴定

cd68单克隆抗体的免疫细胞化学染色显示，成片的细胞cd68免疫反应强阳性(即小胶质细胞)，细胞圆形，部分细胞有较短的突起。用苏木素复染的盖片，在镜下随机抽取5个视野，记数视野下的cd68阳性细胞和cd68阴性细胞(苏木素显示细胞核)，求出cd68阳性细胞的百分比。抽查5张盖片，其小胶质细胞阳性率均>95%。

2.3 il6的含量

体外培养小胶质细胞24、48、72 h上清液il6含量分别为(69.06±6.25)、(68.09±3.04)、(69.61±1.05) pg/ml，组间比较无显著性差异(p>0.05)。分别应用0、20、40、80 μmol/l剂量prp105132干预小胶质细胞，24 h后il6含量依次为(69.06±6.25)、(70.33±0.67)、(87.38±4.16)、(109.64±7.40) pg/ml，表明il6含量随prp105132剂量增大而增大，80 μmol/l组与其他三组组间比较有显著性差异(p<0.01)。

3 讨 论

prp105132肽段(ktnlkhvagaaaagavvgglggymlgsa)对应prpc的跨膜区域，是prpc向prpsc构型转变的关键部位〔4〕，是所有异常prp同工型的共有结构。在不同的环境(离子强度、ph值、溶质成分等)中表现不同的二级结构。prp105132在体外与整个prpsc有某些相同的性质，可形成淀粉样纤维，并具有蛋白酶k抵抗性。在实验中发现，体外培养小胶质细胞中加入该肽段后细胞胞体增大变圆，细胞突起变短、消失，呈圆状、杆状、阿米巴状;并且随prp剂量增加， il6分泌量增多，prp剂量80 μmol/l时il6的分泌量最高，进一步明确了prp105 132肽段对小胶质细胞的激活作用。

小胶质细胞激活是朊蛋白病的神经病理性损害特征，并且这种特征在体内和体外实验中均得到证实〔5〕。组织学研究发现朊蛋白病中，在cns小胶质细胞与异常朊蛋白的聚集有关,并发现体外朊蛋白诱导小胶质细胞介导炎症反应，导致神经元缺失〔6〕。小胶质细胞介导炎症反应需要各种细胞因子的合成和参与。目前已有研究证实prp可使小胶质细胞诱导表达cox2〔7〕，合成il1β、pge2〔8〕。本实验发现prp干预体外小胶质细胞后，培养上清液内il6含量升高，证实了朊蛋白病中小胶质细胞是细胞因子il6来源之一。

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细胞的生活篇4

[关键词] 生物活性因子；骨髓间充质干细胞；基因修饰

[中图分类号] R457.7 [文献标识码]A [文章编号] 2095-0616（2014）13-48-04

[Abstract] Bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） are non-hematopoieticstem cells existing in bone marrow matrix that have multi-directional differentiation potential and they have become the hotspot of domestic and overseas medical research.Bioactive factors distribute all over the tissues of human body and have important regulatory effect on the BMSCs.This paper illustrates the implication，cell characteristics，multiple bioactive factors combination，tissue treatment and other aspects in detail.

[Key words] Bioactive factor；Bone marrow mesenchymal stem cells；Gene modification

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类自我更新能力强、多向分化潜能、可塑性高的干细胞。在特殊的诱导下，能分化为多种细胞，包括心肌细胞、骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞等等。目前，转基因技术的优势已发挥重大的作用，已有多种不同的生物活性因子被导入到BMSCs中，并持续在BMSCs中表达，进而诱导和刺激BMSCs的增殖、分化及成熟。

1 BMSCs的来源及其分子表达

目前研究最多、最为深入的就是骨髓来源的间充质干细胞，它是构成骨髓造血微环境的重要部分，具有支持和造血调控的作用。也有人称其为骨髓基质细胞，是因为它们来自骨髓的支持结构，起到维持造血干细胞存活及其功能的作用。随着对这种细胞研究的逐渐深入，发现其在多向分化、自我更新、免疫调节、分泌细胞因子功能等方面具有独特的性质，故目前学术界一般将其称BMSCs。

一般认为，BMSCs能表达CD34、CD106、CD124、CD105、CD146、CD90、CD13、CD44、CD54、CD29、CD73、CD120a、CD166、SH2、SH3、SH4、STRO-1特异性细胞表面抗原以及ALCAM/CD44黏附分子，但一般不表达类似造血干细胞表面的相关分子[1]。

2 BMSCs的特性

在目前研究的干细胞中，应用较为广泛的就是BMSCs。它具有其他干细胞所没有的的特性：（1）具有多向分化潜能，在适当条件下可被诱导分化为心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞等多种细胞；（2）从骨髓中容易分离，在适宜的培养环境中能快速贴壁生长，容易纯化，可成倍扩增，且具有遗传稳定性，在传代后仍能保持原来的细胞特性，不会发生转化；（3）可分泌多种细胞因子，这些细胞因子能改善重要器官的功能；（4）具有低免疫源性，这种特性的存在降低了BMSCs移植后所产生的免疫排斥反应和相关并发症的发生；（5）易导入外源基因，并可以持续地表达该基因，可以提高BMSCs移植的存活率，促血管生长等作用。这些特性决定BMSCs适合作为一种种子细胞进行有效的移植治疗[2]。

3 修饰BMSCs的生物活性因子

生物活性因子主要有转录因子、营养及生长因子、信号分子及其通路等。下面将介绍近年来主要应用于实验方面的生物活性因子。

3.1 转录因子

GATA-4作为一种特定的蛋白转录因子，在细胞的分化、生长和存活的过程中起着至关重要的作用。它可以促进血管生成、增加细胞存活和分化，减少心肌细胞的凋亡。李红霞等[3]探讨了GATA-4过表达对大鼠骨髓间充质干细胞保护心肌细胞的影响，试验结果表明GATA-4转染后，增加了BMSCs转化为心肌样细胞，并对心肌梗死后的重构产生很大的作用。

SOX9基因是软骨类细胞分化的一个必需转录因子，它除了是维持软骨表型的主要调控基因之外，还可以增加Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖（Aggrecan）基因的表达水平。许云等[4]探讨了SOX9基因修饰骨髓间充质干细胞并诱导其向髓核样细胞分化的实验研究，选用SOX9、Ⅱ型胶原及Aggrecan作为BMSC向髓核样细胞分化的特征指标，结果表明过表达SOX9基因特定环境中能促进骨、关节及软骨细胞的再分化。

低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α）是一种重要的核转录因子，目前被认为是最具有前途的治疗基因之一。它具有促进血管新生、上调下游靶基因、改善组织的血液供应等作用。王君等[5]探讨了大鼠低氧诱导因子-1α基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究，发现转染后BMSCs具有向神经干细胞分化的潜能，并可维持该细胞的特点。更有研究发现，不同类型的HIF-1α基因诱导骨髓间充质干细胞均能向心肌细胞分化，为两者的联合应用提供了实验证据[8]。

还有很多相关的细胞转录因子，如Tbx-5和NKX2-5等均可诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化[6]；Mef2c基因参与介导骨骼肌、心肌以及平滑肌细胞的分化过程；Cbfa-1基因则可促使骨髓干细胞向成骨细胞分化[7]。

3.2 营养因子及生长因子

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异性细胞因子，具有促进缺血心肌的毛细血管的再生，恢复血管内皮的正常组织结构及其生理功能，最终起到改善器官组织微循环的作用。杨锴等[8]研究探讨了VEGF基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗对大鼠心肌梗死组织血管再生以及心功能的影响，可明显改善缺血心肌的心功能，促进血管再生和心肌细胞的形成。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）是调控增殖及定向分化的首选生长因子之一，也是一种重要的营养因子，具有刺激新生血管形成，促进神经细胞生长和纤维再生的作用，同时对软骨细胞的分化和增殖也具有生物学效应，是目前发现的最强的促细胞生长因子。缪黄泰等[9]研究了碱性成纤维细胞生长因子体外诱导犬骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，还得出了bFGF体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最适浓度（10?/L），为今后的研究提供了证据。

胶质细胞源性神经营养因子（glialcell line-derivedneurotrophic factor，GDNF）是一种强效的神经营养因子，除对神经元具有保护作用外，对中枢神经系统神经元的分化、发育、生长和存活具有重要意义。杜杰等[10]探讨了GDNF基因修饰的BMSCs向神经元样细胞的分化及神经营养因子的表达，试验结果提示GDNF具有诱导BMSCs向神经元样细胞分化的作用。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神经营养因子家族中的重要成员，可以促进感觉神经元谱系分化，维持运动神经元的存活，对神经细胞的生长发育及修复有重要的保护作用。于泽洋等[11]研究发现脑源性神经营养因子转染BMSCs可以有效表达该蛋白，并且使BMSCs向成骨细胞的分化进程加快，对骨折后损伤部位的组织修复等具有重要的作用，为临床疾病提供了新的方向。

血管生成素-1（Angiopoietin-1）是一类重要的血管生长因子，可以提高血管内皮细胞的存活力，对细胞凋亡有着抑制作用，可使血管通透性降低，减少血管的萎缩和退化。侯淑红等[12]研究了Ang-1基因修饰骨髓间质干细胞移植后心肌梗死大鼠的心功能变化，不仅稳定了Ang-1基因的表达，提高了BMSCs存活率，而且对新生血管起到了很好的调控作用，改善了梗死心肌的功能。

血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是一种细胞生长因子，具有调节水钠代谢及血管张力的生理作用，可刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞的增生，还可诱导人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞[13]。张蕾等[14]研究还发现血管紧张素Ⅱ联合生长因子诱导人骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化。

胰岛素样生长因子1（Insulin-like growthfactor 1）是软骨发育过程中一种强有力的合成代谢刺激生长因子，能够促进软骨细胞的增殖和成熟，延缓基质的降解，抑制软骨细胞的凋亡。邬波等[15]探讨了胰岛素样生长因子1对骨髓间充质干细胞软骨分化及基质金属蛋白酶表达的影响，结果显示胰岛素样生长因子1能够促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，还可保护软骨胶原纤维的稳定性。

转化生长因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）是属于TGF-β超家族的一组重要的生长因子，对细胞的增殖、分化、黏附和凋亡具有调控作用。目前研究较多的是TGF-β1和TGF-β3。吕洋等[16]采用了转化生长因子β1对骨髓间充质干细胞进行定向诱导，得到其定向可分化为心肌样细胞，且分化的细胞还具有心肌细胞的特性。而王体俊等[17]研究了转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞，发现TGF-β3能增加骨形态发生蛋白的诱导成骨量，从而促进BMSCs的分化。

骨形态发生蛋白2（Bonemorphogenetic protein2）是一种多功能的细胞生长因子，在骨形态发生蛋白家族中是骨诱导性能最强的，对骨形成有调控作用。段智霞等[18]通过实验证明骨形成蛋白2活性多肽在体外能诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，且这种诱导效应存在明显的剂量依赖关系。

还有一些营养因子如神经营养因子（NT）、神经生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF），均能促使BMSCs向神经元样细胞分化[19-21]；肝细胞生长因子（HGF）体外诱导BMSCs可向肝细胞分化[22]；血小板源性生长因子（PDGF）则可促使BMSCs向心肌细胞和平滑肌细胞分化。

3.3 信号分子及信号通路

Wnt信号通路是一条高度保守的信号传导通路。Wnt家族成员通过自分泌或旁分泌作用与细胞膜上的受体相结合，激活细胞内的信号通路，调节靶基因的表达，在细胞增殖及迁移，心脏及神经系统发育，干细胞分化及增殖等多种生理过程和肿瘤的发生和转移等病理过程中起着至关重要的调节作用。近年来已有研究证实Wnt信号通路参与骨髓间充质干细胞的定向分化及增殖的过程[23]。Wnt基因家族中研究最多的当属Wnt3a，Wnt5a和Wnt7a这三种蛋白信号因子。Wnt3a主要促进神经干细胞以及成骨细胞的分化，且可使体外培养的BMSCs大量增殖[24]。沈亚莉等[25]的研究证明了通过腺病毒实现了外源性wnt5a基因转染bMSCs，促进了BMSCs的增殖。而Wnt7a对促进BMSCs向神经元样细胞分化有重要作用[26]。

Notch信号通路是一条保守而重要的通路。Notch通路几乎涉及到了所有的细胞，对细胞的分化、增殖及凋亡起到了重要的调控作用。Notch信号通路还参与BMSCs分化的调节过程。柳柯等[27]研究了Notch信号通路在骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的动态表达特征，用实验方法检测到在Notch信号通路中关键因子的表达作用，为干细胞的临床未来治疗提供了基础。

Hedgehog信号通路是一条保守而高效的通路，对各种组织器官的形态功能有着调节作用。Hedgehog家族蛋白是一种分泌型信号蛋白，主要包括Shh、Ihh和Dhh。其中的Shh和Ihh，不仅能调控成骨细胞的分化，还能促进BMSCs的增殖分化[28]。Hedgehog信号通路被抑制剂激活后还能抑制BMSCs向脂肪细胞分化[29]。目前尚有许多关于Hedgehog信号通路及相关分子机制研究的不确定性，还需要我们进一步去证实。

4 存在问题及展望

骨髓间充质干细胞是重要的组织工程学细胞，具有广阔的应用前景，它可以诱导分化为多种细胞，如心肌细胞、成骨细胞、神经细胞等。而基因对骨髓间充质干细胞的修饰作用，不仅可以增强其定向分化的能力，还能促进细胞的增殖，调控细胞的凋亡。目前骨髓间充质干细胞的研究已经取得了很多的成绩，但还有很多问题需要我们去解决，比如如何提高被修饰后的骨髓间充质干细胞的机体存活率；某些基因对骨髓间充质干细胞的作用机制尚不是很清楚，应用于人体当中会不会有负性作用，还有待进一步的验证。

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细胞的生活篇5

【关键词】

生殖器疱疹;超氧化物歧化酶; 自然杀伤细胞

生殖器疱疹(genital herpes, GH)是常见的性传播疾病之一，由I型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1，HSV-1)或Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)引起的一种性传播疾病，临床主要由HSV-2感染引起[1]。GH发病率逐年增高，易反复发作，给患者和社会带来沉重的心理和经济负担[1,2]。GH的发病机制尚未完全清楚，有研究显示HSV病毒感染机体后，引发机体的细胞免疫紊乱及氧化应激状态失衡，主要是T细胞水平表达低下、Th细胞及Tc细胞分化偏态[2,3]。本研究探讨GH患者氧化应激状态与细胞免疫水平，以探讨GH的发病机制，可用于指导GH的治疗、判断预后。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集24例GH患者，所有患者来自我院2010年8月至2011年1月性病科门诊，诊断符合2000年我国卫生部疾病控制司和全国性病麻风病控制中心联合颁布的GH诊断标准。24例GH患者中男16例，女8例，年龄18～40岁(平均23.6岁)，病程2 d～2年，平均病程10.1个月。患者就诊前3个月内均未系统性应用免疫抑制剂、免疫调节剂、皮质类固醇制剂。收集24例健康体检者作为正常对照，其中男14例，女10例，年龄18～36岁(平均22.9岁)，患者与健康对照者年龄、性别差异无统计学意义。

1.2 实验方法

1.2.1 SOD的检测 早晨空腹肘静脉取血2 ml, 分离血清待测。采用透射比浊法, SOD 标准试剂合由南京建成生物研究所提供, 检测方法参照试剂说明书和文献进行[3]。

1.2.2 NK细胞表达的流式细胞术分析 取GH患者肝素抗凝血100 ul，加入淋巴细胞检测试剂25 ul，混匀，室温避光染色20 min；加入2 ml红细胞裂解液，室温避光放置10 min； 1500 r/min离心5 min弃上清液，加磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml，混匀；1500 r/min离心5 min弃上清液，加2%多聚甲醛PBS 500 ml固定，放置4℃~8℃冰箱待检测。每管加细胞液100 μl，加入10 μl抗CD4 mAb-PerCP,温室避光放置15 min;红细胞溶解液0.5 μl溶解红细胞15 min; 破膜剂I、II固定和破膜；加PBS3 ml，1200 r/min离心5 min，弃上清；加细胞因子抗体，每份标本分别加同型对照IgG1-FITC；温室避光放置15 min；加PBS 4 ml，1200r/min；离心10 min，弃上清；适量PBS重悬细胞上流式细胞仪检测；每份标本检测1万个细胞结果经Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。

1.3 统计学方法 采用SAS 8.01 统计软件进行统计学分析，组间比较方差分析后采用t检验，以P

2 结果

GH患者SOD活力明显低于健康对照组(t=-4.14, P=0.0001)；NK细胞的水平明显低于健康对照组(t=-2.67, P=0.0133)(见表1)；SOD活力与NK细胞表达无显著相关性(r=-0.02566, P= 0.9170)。

3 讨论

SOD 是组织细胞中清除自由基的主要预防系统, 活力反映了机体清除氧自由基的能力, 对有害的超氧阴离子自由基产生特异的歧化反应, 阻止自由基攻击核酸、蛋白质、不饱和脂肪酸等生物大分子, 使之发生交联或断裂, 保护细胞免于损伤[4,5]。SOD 与产生的自由基发生歧化反应, 保护组织细胞免受损伤; 而信息蛋白迅速传递信息, 反馈到控制SOD 表达的基因快速作出应答, 产生足量的SOD,以满足组织细胞代谢的需要,当这种异常的应答一旦长时间的存在下去, 必然要导致组织细胞内代谢失去平衡, 导致细胞发生异变。NK细胞是机体免疫系统的重要免疫细胞，是抗病毒感染的第一道防线[4,5]。在免疫过程中，NK细胞的存在决定着细胞毒性T淋巴细胞体细胞向成熟细胞毒性T淋巴细胞的分化并且控制着记忆T细胞的形成。MHC-I 类分子将感染HSV的细胞首先呈递给NK细胞，NK细胞直接而迅速地杀灭病毒[2]。最近的研究显示GH患者外周血NK细胞数量减少；此外，患者皮损内HSV-2病毒载量与NK细胞水平呈显著的负相关[6], 提示NK细胞活性减低,抗病毒作用减弱,抑制T淋巴细胞的增殖。癌症患者NK 细胞活性降低, SOD与过氧化氢酶协同能够恢复患者的NK细胞活性[7]。

本研究旨在探讨GH患者SOD与过氧化氢酶协同能否恢复患者的NK细胞活性，提高患者的免疫水平。研究结果显示，GH患者外周血中SOD活力明显减低，可能与HSV感染消耗了抗氧化物SOD, 造成了机体的氧化应激失衡。GH患者NK细胞数量明显低于正常人群，但SOD活力与NK细胞数无显著相关性，可能与HSV病毒感染属于局限性，未引起全身性炎症反应有关，本研究结果与易勤等人[7]报道的结果基本一致。提示GH患者存在氧化应激状态失衡、细胞免疫抑制，抗病毒作用减弱现象；在治疗上除了给予抗病毒治疗, 同时给予免疫增强剂和抗氧化剂能有效地降低GH的复发率。

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细胞的生活篇6

关键词：豌豆（Pisum sativum L.）；酸性成纤维细胞生长因子；分离；纯化；活性

中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4211-03

Separation， Purification and Bioactivity of Acidic

Fibroblast Growth Factor

FAN Ya-jun， NI Xiu-zhen

（Department of Biology， Changchun Normal University， Changchun 130032， China）

Abstract： The pea（Pisum sativum L.） plants expressing the foreign protein aFGF were used to extract the total soluble proteins. Western blot was performed to identified the aFGF protein. Heparin-affinity chromatography was used to separate and purify the aFGF. The bioactivity of the aFGF purified was analyzed by MTT. The result of western blot confirmed that the exogenous protein aFGF was expressed and purified successfuly from pea plants. The MTT results showed that the pea plants derived aFGF had the mitogentic activity.

Key words： pea（Pisum sativum L.）； aFGF； separation；purification； bioactivity

酸性成纤维细胞生长因子（Acidic fibroblast growth factor，aFGF）是一种重要的有丝分裂原，在胚胎发育期间能够促进细胞分裂、增殖并参与细胞的迁移与分化[1，2]。有研究表明，aFGF可以通过促进溃疡底部血管增生而使溃疡得以快速修复，另外在受损的大脑皮质中内源性的酸性成纤维细胞生长因子及其受体表达水平均有提高，这说明aFGF在伤口愈合、神经系统的保护及再生过程中具有重要作用[3，4]。基于aFGF在机体发育及多种伤病治疗中的功能，选择高效、安全的生产平台表达酸性成纤维细胞生长因子对基础研究及医疗方面均具有重要意义，而利用植物作为生产平台瞬时表达药用蛋白质是当前生物技术领域的一个研究热点[5-9]，本研究以瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的豌豆（Pisum sativum L.）为试验材料，提取植物可溶性总蛋白质，利用肝素亲和柱层析法分离了外源蛋白质aFGF，并对目的蛋白质的生物学活性进行了分析，为研究酸性成纤维细胞生长因子提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆种子购买于长春市市场，瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的豌豆植株由长春师范大学分子生物学实验室构建完成，小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3细胞）由本实验室保存。

肝素琼脂糖凝胶（Heparin SepharoseTM CL-6B）购自北京鼎国生物技术有限公司，Microcon YM-10超滤管购自美国Millipore公司，蛋白质杂交所用二抗-辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司，低分子量蛋白质预染Marker购自北京鼎国生物技术发展中心，化学发光检测试剂盒Super Singnal West Pico Trial Kit购自Pierce公司，IMDM培养基、标准品aFGF购自美国Sigma-Aldrich公司。

蛋白质磷酸盐（PBS）提取缓冲液配制：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.42 g Na2HPO4、0.27 g KH2PO4、pH 7.4。

1.2 方法

1.2.1 豌豆可溶性总蛋白质的提取及检测 称取瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的豌豆植株0.1 g充分研磨，加入100 μL预冷的蛋白质PBS提取缓冲液于冰上充分溶解蛋白质2～3 h，4 ℃ 12 000 r/min离心，得到上清液备用。目的蛋白质电泳后进行转膜处理，用5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜于4 ℃过夜反应，次日洗膜后加入aFGF抗体（按体积比1∶500稀释），室温下轻轻混合90 min后使用PBST（1 L PBS加入2 mL的Tween 20）洗膜，加入用PBST缓冲液稀释（1∶5 000）的二抗溶液，室温轻轻混合反应1 h后洗膜并进行显色、压片处理。

1.2.2 目的蛋白质的分离纯化及蛋白质杂交检测 采用肝素亲和层析法分离纯化目的蛋白质。首先用去离子水多次冲洗层析柱柱体，并用结合缓冲液（10 mmol/L PBS、0.15 mol/L NaCl，pH 7.4）对柱体进行平衡，将豌豆植物蛋白质与Heparin SepharoseTM CL-6B混合后置于冰上匀浆混合2 h，将混合后的液体缓慢加入柱中静置30～40 min后，用10倍体积的结合缓冲液洗脱杂蛋白，配置不同盐浓度的PBS缓冲液（0.5、0.8、1.0、1.5 mol/L NaCl）进一步洗去杂蛋白，收集洗脱液进行电泳并对蛋白质进行杂交检测。

1.2.3 目的蛋白质的脱盐处理 将洗脱得到的目的蛋白质加入到Microcon YM-10超滤管柱中14 000 r/min离心40 min，并将离心后的Microcon YM-10柱子倒置于新的离心管中加入50 μL PBS缓冲液，1 000 r/min离心10 min得到脱盐后的目的蛋白质。

1.2.4 MTT法检测目的蛋白质aFGF的促细胞分裂活性 将培养后的NIH3T3细胞用胰酶消化，并用不含血清的IMDM培养基调节细胞浓度为5×104 个/mL，将稀释后的细胞均匀加入96孔板，每孔100 μL置于37 ℃细胞培养箱中培养24 h。用蛋白质PBS缓冲液将标准品aFGF和植物中表达纯化的样品（aFGF）稀释成不同浓度梯度（125、250、375、500、625 ng/mL），并以蛋白质PBS缓冲液作为阴性对照，将不同浓度aFGF样品加入培养后的细胞中，每个梯度4次重复，加样后于37 ℃再次培养24 h，次日每孔加入5 mg/mL的外源四甲基偶氮唑盐（MTT）10 μL，37 ℃培养4～6 h后去掉上清液，加入溶解液二甲基亚砜（DMSO）每孔100 μL，震荡混匀后于波长570 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 目的蛋白质的提取和鉴定

根据植物蛋白质表达特点，在接种后12～14 d提取豌豆植株可溶性总蛋白质，并对目的蛋白质进行Western blot检测，杂交结果表明目的蛋白质酸性成纤维细胞生长因子在豌豆植株中成功表达，结果如图1所示。

2.2 目的蛋白质的分离纯化及杂交检测

研究表明，肝素与酸性成纤维细胞生长因子能够特异性结合[10]。通过肝素亲和柱层析法从豌豆植株总蛋白质中分离纯化目的蛋白质aFGF，通过不同盐浓度的PBS缓冲液洗脱，最终在含1.5 mol/L NaCl的PBS缓冲液中得到目的蛋白质，分离结果如图2 a所示。通过Western blot方法对所得到的蛋白质进行检测，以标准品aFGF为阳性对照，杂交结果表明从豌豆植株中成功纯化出外源蛋白质aFGF，结果如图2 b所示。

2.3 目的蛋白质活性分析

利用MTT法检测豌豆植株表达的aFGF的生物学活性，以aFGF标准品及PBS缓冲液分别作为阳性及阴性对照，结果表明豌豆植物表达的aFGF具有明显的促细胞分裂活性，在终浓度500 ng/mL时活性最高，结果如图3所示。

3 小结与讨论

利用植物系统表达药用蛋白质具有重要的发展及应用前景。由于植物表达系统相较于动物及微生物表达系统具有更高的安全性，因此近年来受到广泛的关注，而作为良好的生物反应器的基本条件是该体系能够成功表达外源蛋白质并且能够保证外源蛋白质的生物学活性。本研究以肝素亲和层析法分离纯化了豌豆植株中表达的外源蛋白质aFGF，并对其生物活性进行了检测。肝素是一种黏多糖，可以作为亲和柱层析中的吸附剂，研究表明酸性成纤维细胞生长因子是一种可以与肝素特异性亲和的蛋白质，当豌豆植株可溶性总蛋白质与肝素混合后二者发生特异性结合，通过不同盐离子浓度的缓冲液可以将非特异性结合的杂蛋白质洗脱掉[11]。本研究在含1.5 mol/L NaCl的PBS缓冲液中得到目的蛋白质，试验过程中发现混合液在亲和柱中静置的时间是影响目的蛋白质洗脱的关键条件，一般静置30 min左右可得到较高浓度的目的蛋白质。

MTT法是检测细胞活性常用的一种方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源四甲基偶氮唑盐（MTT）转化成蓝紫色甲瓒颗粒并沉积在细胞中，二甲基亚砜（DMSO）可将细胞中的甲瓒颗粒溶解，其吸光度（OD）值与活细胞数量呈正相关。酸性成纤维细胞生长因子具有促细胞分裂活性，在细胞中加入aFGF可提高细胞分裂速度，增加细胞数量，利用MTT法可检测aFGF的促细胞分裂活性。本试验结果表明，豌豆植株中表达的酸性成纤维细胞生长因子具有促细胞分裂活性，豌豆是一种良好的表达药用蛋白质的生物反应器。

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细胞的生活篇7

关键词：护理干预；非小细胞肺癌；放化疗；生活质量

非小细胞肺癌大多属于中晚期，临床治疗多以放化疗为主。放化疗的目的是抑制肿瘤细胞的生长繁殖，使肿瘤组织处于休眠或退缩状态，延缓患者生命[1]。但放化疗的毒副作用较剧烈，表现恶心、呕吐、脱发、穿刺部位坏死等，患者常因不能耐受而拒绝相关治疗。本院于2011年1月～2012年12月，对放化疗的非小细胞肺癌患者实施综合护理干预，有效地缓解了放化疗的不良反应，使患者得以顺利完成放化疗，取得了满意的疗效。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2011年1月～2012年12月，来我院接受放化疗治疗的128例非小细胞肺癌患者的临床资料。所有患者均符合非小细胞肺癌诊断标准[2]，并经CT和（或）磁共振确诊。入选患者男81例，女47例；年龄31～76岁，平均（50.4±7.2）岁；其中鳞癌84例，腺癌28例，腺鳞癌7例，大细胞癌9例。按照护理方法的不同，随机分为实验组和对照组各64例。两组患者性别、年龄、疾病类型等一般资料，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2护理干预

1.2.1对照组 对照组实施常规护理，严密观察病情，及时准确完成各项治疗及护理。

1.2.2实验组 实验组实施综合护理干预。

1.2.2.1心理干预 癌症患者的心理比较复杂，大多表现为悲观、绝望、自暴自弃或不甘心甚至脾气暴躁。护理人员要多关心患者，观察患者的情绪变化，耐心倾听患者的倾诉，适时让患者发泄一下心中的负面情绪。并从精神上和心理上给予患者安慰，不断鼓励患者，消除惧怕感，让患者以积极的心态接受放化疗。

1.2.2.2治疗护理 化疗药物对局部血管有强烈的刺激性，一旦外渗可引起周围组织水肿、疼痛、局部组织坏死等。护理人员要苦练穿刺技术，提高穿刺成功率。治疗时先输入少许生理盐水，再输入化疗药物；化疗药物输完后，再输入少许生理盐水，然后再行拔针。如若不慎出现药物渗漏，应立即停止给药；局部组织有烧灼感时，给予50%硫酸镁湿热敷[3]。

1.2.2.3消化道护理 ①放化疗患者常发生口腔炎、口腔溃疡等副作用。做好口腔护理，给予患者复合维生素B溶液口服；②化疗药物对消化道有较强刺激性，患者发生恶心、呕吐、厌食。化疗前30min～1h，肌肉注射胃复安20mg；化疗药物输完后，给予维生素B6 0.2g+5%葡萄糖溶液100ml，静脉滴注。可有效缓解恶心、呕吐症状；③化疗药物像氟尿嘧啶大剂量或连续用药时，可引起患者严重腹泻[4]。护理人员要严密观察患者腹泻次数、程度，大便性状，有无血性大便等，及时告知医生做出处理决定。

1.2.2.4脱发护理 脱发常见于放化疗后的2～4w，患者自身形象受到影响，造成较大的心理压力。告之患者脱发是化疗药物的副作用，不影响患者的身体，而且放化疗疗程结束后，头发会重新长出来。帮助患者正确认识脱发，以开朗乐观的心态接受治疗。

1.3观察指标 观察两组患者心理状态、疼痛、恶心、呕吐等症状，对比两组疗效及生活质量。

1.4统计学方法 数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料用均数加减标准差（x±s）表示，计数资料用频数（n）或率（%）表示，分别采用t检验和χ2检验，检验标准：P

2 结果

2.1治疗效果比较 实验组显效37例，有效19例，无效18例，治疗有效率（87.50%）明显高于对照组（P

2.2生活质量比较 实验组患者在情感认知、躯体功能、社会功能、整体健康状况的分值均优于对照组，差异均有统计学意义（P

3 讨论

临床治疗非小细胞肺癌患者，多采用放化疗方案。放化疗引起的毒副反应非常大，如恶心、呕吐、脱发等。部分患者因无法耐受副反应而直接放弃治疗，导致患者的相对存活率减少。

通过对小细胞肺癌放化疗患者实施综合护理干预，为其提供心理支持，使患者以积极的心态接受治疗；加强穿刺技术，减轻化疗药物对静脉局部造成的刺激；注重口腔护理，提供药物支持，缓解患者的恶心、呕吐、腹泻等不良反应；对患者就进行健康教育，告之脱发是药物副作用，不影响身体健康，并且治疗结束后会长出新头发。经过上述护理措施后，实验组治疗总有效率高于对照组，患者在情感认知、躯体功能、社会功能、整体健康状况的分值均优于对照组。

综上所述，对非小细胞肺癌放化疗患者实施综合护理干预，可消除患者不良情绪，提高治疗效果，改善患者生活质量，有积极的临床意义。

参考文献：

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细胞的生活篇8

【摘要】

目的: 重组人白细胞介素12(rhIL12)真核表达质粒(pcDNA6/v5hisp70)转染CHO细胞， 筛选高效稳定表达克隆; 并对表达产物进行生物学活性分析。方法: 采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5hisp70转入CHO细胞; 用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳性表达克隆， 并进行单克隆扩增; RTPCR进行表达鉴定; ELISA检测各克隆rhIL12的表达量; 应用淋巴细胞增生实验及细胞内细胞因子染色方法分析rhIL12的生物学活性。同时， 对筛选出的阳性克隆进行表达稳定性观察。结果: RTPCR结果显示， 选取的20个阳性克隆均可扩增出1 800 bp的特异性片段; ELISA 表明， 其中6个克隆rhIL12表达水平较高(312.69～719.10 ng/L)， 最高表达量达到719 ng/L (5×104个细胞， 48 h); 生物学活性分析表明， 表达的rhIL12可明显提高献血员外周血PBMC对 PHA/HCMV反应的CD4/IFNγ及CD8/ IFNγ双标记阳性细胞克隆的频数; 并且， 可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV刺激的增生反应效能。阳性克隆在维持量的筛选药物(2 ng/L Blasticidin)压力下传代6个月， 其表达水平无明显变化。 结论: rhIL12真核表达载体(pcDNA6/v5hisp70)能在CHO细胞中高效稳定表达; 其表达产物具有良好的生物学活性。

【关键词】 白细胞介素 12 中国仓鼠卵巢细胞; 基因表达

［Abstract］ AIM: To transfect the constructed recombinant human IL12 (rhIL12) eukaryotic expression plasmid (pcDNA6/v5hisp70) into CHO cells and screen the efficiently and stably expressed clones; and to identify the biological activities of rhIL12. METHODS: pcDNA6/v5hisp70 was transfected into CHO cells using polyethyleneimine (PEI) and positive clones were screened with Blasticidin as well as single clone amplification. Then the expression clone was identified by RTPCR and the rhIL12 expression of each clone was measured using ELISA. Finally， biological activities of the expressed rhIL12 were analyzed with proliferation of lymphocytes in vitro and intracellular cytokine staining(ICS) . The stability of the selected clones was observed as well. RESULTS: The RTPCR results showed that a specific fragment of 1 800 bp could be amplified in all positive clones， among which six clones had rather high expression of 312.69 ng/L-719.10 ng/L with the highest expression of 719 ng/L (5×104 per cells， 48 h) by ELISA test. Biological activities analysis indicated that the expressed rhIL12 could significantly increase the percentage of CD4+IFNγ+ and CD8+ IFNγ+ cells in normal PBMC as well as the proliferation of PBMC to PHA/HCMV stimulation. The efficient expression of positive clones still remained stable after 6 months under maintenance of Blasticidin (2 ng/L). CONCLUSION: The constructed human recombine hIL12 eukaryotic expression vector can express stably with high efficiency in CHO cells and the expressed products show expected biological functions.

［Keywords］interleukin12; CHO cells; gene expression

IL12主要是由巨噬细胞、 树突状细胞和中性粒细胞产生的细胞因子， 是目前所知对细胞免疫活性诱导和调节作用最强的多功能细胞因子。重组IL12的生物学活性及其治疗作用为近十年研究的热点， 取得了令人鼓舞的成果［1， 2］。rhIL12是目前被认为在肿瘤治疗中最具有研究前途的免疫制剂之一。课题组前期成功地构建了rhIL12单链双亚基共表达真核表达质粒pcDNA6/v5hisp70， 将其转染HEK293细胞瞬时表达， 并进行了表达鉴定。还研究了其对人巨细胞病毒(human cytomegalovirus， HCMV)核酸疫苗的基因佐剂功能及其对实验小鼠肿瘤模型的基因治疗作用［3］。本研究中， 将pcDNA6/v5hisp70转染CHO细胞， 筛选高效稳定表达克隆， 并对其表达产物进行鉴定及生物学活性分析， 为制备rhIL12及其进一步用于研究和开发提供实验。

1 材料和方法

1.1 材料 rhIL12单链双亚基真核表达质粒(pcDNA6/v5hisp70)、 CHO细胞、 HCMV培养裂解物(1×1010 pfu/mL)由本室构建［4］、 传代保存和制备， 其筛选标记为杀稻瘟菌素(Blasticidin)。培养基RPMI1640购自Gibco公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司; 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司; 多聚乙烯亚胺(PEI)、 Blasticidin、 四甲基偶氮唑盐(MTT)、 Brefedin A、 PHA均为Sigma 公司产品; 人IL12 (p70)抗体捕捉ELISA试剂盒购自晶美生物工程(北京)有限公司; TRIzol购自Invitrogen公司; 逆转录酶(AMV)购自Promega 公司; 透膜试剂盒(IntraPrepTM Permeabilization Reagent)、 PEmouse antihuCD4、 PEmouse antihuCD8、 FITCmouse antihuIFNγ为法国Immunotech公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 pcDNA6/v5hisp70上游引物: p40KS 5′gcggtaccaccatgtgtcaccagcagttggtcatctc3′ (37 bp); 下游引物: p35NotAS 5′ttgcggccgcggaagcattcagatagctcatcactc3′(36 bp)由Sigma公司合成。

1.2.2 pcDNA6/v5hisp70转染CHO细胞 CHO细胞培养于含100 mL/L胎牛血清(FBS)RPMI1640培养液中， 置于37℃含50 mL/L CO2的培养箱中孵育。取对数生长期细胞制成单细胞悬液， 调节细胞密度到5×107 /L。应用多聚乙烯亚胺(PEI)转染CHO 细胞［5］。简述如下:溶液A: 5 mol/L NaCl 3 μL(终浓度150 mmol/L)， 10 mmol/L PEI 12 μL(终浓度0.02 μmol/L)， H2O 85 μL， 室温10 min。溶液B: 5 mol/L NaCl 3 μL(150 mmol/L)， pcDNA6/v5hisp70质粒 DNA 4 μg (4 μL)， H2O 93 μL， 室温10 min。溶液C: A 、 B等量混合， 室温10 min。(24孔板上2个转染孔用量)。弃细胞培养孔的培养液， 加无FBS的培养液1 mL/孔， 每孔加溶液C 100 μL，平行转染3孔。37℃ 1 h。加入FBS 110 μL/孔。继续培养24～48 h。转种于细胞培养皿。

1.2.3 阳性细胞克隆的筛选 转染细胞在含Blasticidin (终浓度为10 mg/L)的RPMI1640培养液中培养， 每2～3 d更换相同培养液并观察阳性克隆生长情况， 2周后可观察到单克隆形成， 而未经转染的正常CHO细胞在筛选筛选压力下1周内死亡脱落。经胰蛋白酶消化后套取阳性克隆， 转移入24孔培养板中以含维持量的Blasticidin(终浓度为2 mg/L)培养液进行克隆扩增。

1.2.4 RTPCR扩增rhIL12 mRNA 用TRIzolTM常规提取各抗性克隆总RNA， 以Oligo(dT)为引物在AMV作用下反转录获得cDNA第1链， 再以此作为模板， 用rhIL12上下游引物p40KS及p35NotAS进行PCR扩增。

1.2.5 ELISA法检测rhIL12 收集各阳性克隆24、 48 h的培养上清液(5×104 /孔)。用人IL12p70抗体捕捉ELISA试剂盒检测 rhIL12的表达量， 按试剂盒说明书操作。

1.2.6 rhIL12的生物学活性分析 取献血员抗凝血(来自青岛市血站)， 淋巴细胞分离液(Ficoll)常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)。分别应用MTT法测定淋巴细胞增生反应及细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine stain， ICS)分析表达的rhIL12的生物学活性。PBMC(5×107/L ， 100 μL /孔， 96孔板) 培养于含重组IL12(50 ng/L)营养液中并分别应用PHA(5 mg/L)、 HCMV裂解物抗原(1010 pfu/mL; 5 μL/孔)刺激培养72 h。终止前4 h加MTT (5 g/L)20 μL /孔; 离心弃上清后加DMSO (Sigma) 100 μL/孔; 自动酶标仪(550 nm)测吸光度(A值)。PBMC(109/L) 400 μL/孔(24孔板)培养于含rhIL12 (100 ng/L)的RPMI1640中(100 mL/L胎牛血清)， 同时加PHA(5 mg/L)或HCMV裂解物(1010pfu/mL; 5 μL/孔)刺激72 h; 于最后16 h加Brefedin A ( BFA， 终浓度10 mg/L) 5 μL/孔。分别应用PEantihu CD4/CD8、 FITCantihu IFNγ单克隆抗体(mAb)进行ICS。简述如下: 预冷的PBS洗细胞1次， 用50 μL PBS(0.1 mmol/L EDTA及5 mL/L BSA)重悬细胞， 37℃ 10 min。 分别加PEantihu CD4/PEAntihu CD8 mAb 10 μL， 37℃ 30 min。 PBS洗细胞2次， 加细胞内穿透试剂A(100 μL)， 轻摇混匀， 室温固定30 min。PBS 洗细胞1次， 加细胞内穿透试剂B (100 μL )及FITCantihu IFNγ mAb 10 μL， 轻摇混匀; 室温避光孵育15 min。 PBS 洗细胞2次， Fcm检测PE/FITC双标记阳性细胞的百分率。

1.2.7 rhIL12表达稳定性检测 选取6株阳性克隆在含维持量的Blasticidin的培养液中5～7 d传代1次， 连续培养6个月， 用ELISA检测rhIL12表达量。

2 结果

2.1 CHO细胞转染及阳性克隆的筛选 pcDNA6/v5hisp70转染CHO细胞(CHOIL12)后， 经Blasticidin(终浓度为10 mg/L)筛选， 14 d获得20株抗性细胞克隆; 而正常CHO细胞加筛选压力培养7 d细胞大多数死亡(图1)， 14 d后全部脱落。

图1 CHOIL12细胞与CHO细胞加筛选压力后的生长状态（略）

Fig 1 Effects of Blasticidin on the growth of CHOIL12 and CHO cells(×100)

A: Positive clones of CHOIL12(14 d); B: CHO cells(7 d).

2.2 RTPCR进行rhIL12表达鉴定 提取抗性细胞克隆的总RNA， 经RTPCR扩增， 均获得特异的rhIL12 cDNA片段(1 800 bp)(图2)。

2.3 ELISA检测rhIL12表达量 ELISA检测显示， 20株阳性克隆培养上清液中均可检测到rhIL12表达产物， 其中有6株表达水平较高， 分别为312.69、 336.77、 436.54、 523.35、 570.78、 719.10 ng/L (平均483.2 ng/L， 5×104细胞， 48 h)。

2.4 rhIL12的生物学活性分析 献血员的PBMC 在rhIL12的作用下， 对PHA非特异性及HCMV特异性刺激的增生反应能力明显增强(t=2.707， P

图2 CHOIL12细胞克隆的RTPCR鉴定 （略）

Fig 2 RTPCR analysis of rhIL12 expression in the CHOIL12 colones

1: DL 2 000 marker; 2-10: RTPCR products; 11: Negative control.

图3 rhIL12增加PBMC 对PHA、 HCMV 反应的CD4/CD8及IFNγ双标记阳性细胞百分率（略）

Fig 3 Effects of rhIL12 on percentage of CD4+IFNγ+ /CD8+ IFNγ+ cells to different stimuli

2.5 rhIL12表达稳定性检测 6株阳性表达克隆在含维持量Blasticidin的培养液中连续培养6个月， 经3次冻存、 复苏， rhIL12表达水平无明显变化。

3 讨论

本课题组成功构建和筛选了rhIL12稳定高效表达细胞系， 为其后利用基因工程方法生产rhIL12建立了平台， 也可为临床病毒性疾病、 肿瘤及多种自身免疫性疾病的治疗开辟新的研究领域。

Otmane等［5］研究证明， PEI对多种哺乳动物细胞(3T3、 COS7、 HepG2、 K562、 HeLa、 MRC5)均具有较强的转染能力。我们应用PEI成功地将pcDNA6/v5hisp70导入CHO细胞。在7 cm的细胞培养皿中， 获得阳性克隆20余个; RTPCR 结果显示， 所有的阳性克隆均有rhIL12的特异性表达， 表明其转染效率较高。而且，该方法操作简单， 成本低廉(不需要购买转染试剂盒)， 适用于一般的实验室。对其中6个克隆扩增并进行表达产物鉴定， ELISA检测结果显示， 其表达量平均为483.2 ng/L， 最高达到719 ng/L， 5×104 细胞(48 h)， 与李昌麟等［6］报告的结果相近(0.1 μg/106细胞)。阳性克隆在维持量的筛选压力作用下传代6个月(经几次冻存、 复苏)， 其表达水平未见明显变化。研究结果表明， 筛选到的CHOIL12可稳定、 高效地表达rhIL12。

我们分别应用淋巴细胞增生及ICS分析rhIL12的生物学活性。由于我国人群HCMV感染率在90%以上［7］， 即体内有HCMV特异性记忆细胞， 故直接采用HCMV培养裂解物刺激献血员PBMC， 以使其HCMV 特异性T细胞克隆激活并扩增。研究结果显示， rhIL12可明显增强献血员PBMC对PHA非特异性及HCMV特异性刺激的增生反应能力。ICS检测结果表明， rhIL12不仅能增加献血员PBMC对PHA及HCMV刺激发生反应的CD4/CD8细胞的数量， 而且伴有其免疫应答效能(产生IFNγ)的增强。因为ICS能够对参入应答的淋巴细胞亚群的数量及功能进行双向分析［8］。因此， 无论对特异性或非特异性刺激， ICS 用于体外评价rhIL12 的生物学活性比常规淋巴细胞增生反应更为敏感和精确。

随着对IL12研究的深入， 使用rhIL12调节肿瘤患者的免疫应答成为肿瘤治疗的一个新策略， 已被广泛地应用于多种肿瘤的免疫治疗研究［3］。因此， rhILI2在真核细胞中高效稳定表达细胞系的建立， 对于进行rhILI2的理论和临床应用研究均具有重要的意义。

参考文献

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［4］ 张文卿， 王丽娜， 刘志军， 等. 用细胞因子流式细胞计数术体外检测重组人IL12的生物学活性［J］. 中华微生物学和免疫学杂志， 2006， 26(4): 383-384.

［5］ Otmane B， Frank L， Maria AZ， et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethyenmine［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1995， 92(16): 7297-7301.

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［7］ 尹国才， 栾 佐. 人巨细胞病毒潜伏激活及其实验诊断［J］. 中国人兽共患病杂志， 2004， 20(8): 710-713.