提高中期染色体分散方法的研究

【前言】提高中期染色体分散方法的研究由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。适当的低渗时间是很重要的。低渗时间过短，细胞膨胀程度欠佳，染色体的铺展程度不够，最终得到的核型扭曲而且交叠，不便于染色体核型分析。低渗时间过长，细胞膨胀过度，可能会造成细胞破裂， 染色体提前释放，出现不完整的核型。提前释放的染色体在滴片过程中随机分...

【摘 要】如何获得分散良好的染色体至今仍是一个让遗传学工作者头疼的问题，然而分散良好的染色体是进行细胞遗传学研究和临床诊断的前提。为了获得分散良好的染色体，遗传工作者进行了各种探索。本文主要从低渗时间、预固定液剂量和环境的相对湿度、温度方面探讨获得分散良好的中期染色体的方法，以期能够对实验室和临床实验中染色体核型分析起到一定的借鉴作用。

【关键词】染色体；分散方法；影响因素

【中图分类号】R715.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0078-02

染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施，对优生优育工作有着重大意义。人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体，优良的染色体制片技术无疑就成为细胞遗传学研究的先决条件。染色体制备过程复杂，操作步骤繁多，影响染色体分散的因素也较多。各个实验室虽然在实际工作中已经摸索出了一个自己适用的制备方法，但并不是每一次都能够得到分散良好的中期染色体。如何稳定的获得分散良好的中期染色体，在细胞遗传学研究中仍然是一个难题。本综述主要分析影响染色体制备的几个重要因素。

1 低渗时间：

适当的低渗时间是很重要的。低渗时间过短，细胞膨胀程度欠佳，染色体的铺展程度不够，最终得到的核型扭曲而且交叠，不便于染色体核型分析。低渗时间过长，细胞膨胀过度，可能会造成细胞破裂，

染色体提前释放，出现不完整的核型。提前释放的染色体在滴片过程中随机分布在载玻片上，影响其他细胞的染色体计数和核型分析，这不仅会造成中期分裂相的减少，还会给临床上核型分析带来不必要的麻烦，降低核型分析的效率。同时低渗时间过长，染色体会过度膨胀，显带结果模糊不清，同样不利于染色体的核型分析。根据本实验室的临床实验经验，我们采用0.075mol/L KCl为低渗液，在处理外周血淋巴细胞标本时，低渗时间一般掌握在30～40min，37℃，能够得到足够数量的中期染色体，同时还能有较好的分散效果。

2固定液的比例：

实验室常用的固定液是卡诺固定液（冰醋酸：甲醇=1：3 v/v）。冰醋酸能够阻止染色体收缩，保护染色体的结构，抵消乙醇的硬化作用，但是单独用冰醋酸会导致染色体片段的过度膨胀，因此在研究染色体的详细结构时，冰醋酸必须和乙醇或乙醇类似物一起使用。甲醇可以使蛋白质沉淀，具有脱水性，可使蛋白质出现不可逆的变性，使组织硬化。甲醇能够快速的进入组织。一般情况下我们使用的固定液的比例为冰醋酸：甲醇1：3，随着冰醋酸的比例增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展。因此在有必要的时候，可以适当提高冰醋酸的比例来提升染色体的铺展。但是如果膨胀过度，则会导致细胞破碎，染色体过度膨胀，从而使染色体丢失，染色体结构模糊，带显分辨率不高，不利于染色体的分析。因此实际工作中，固定液冰醋酸和甲醇的比例一般控制在1：2～1：4之间。

3预固定液的剂量：

在细胞预固定环节，不同实验室推荐使用的卡诺固定液的剂量各不相同，在方法学上的重复性欠佳。在常规实验中，实验室工作者注意到预固定时的卡诺固定液用量对中期染色体的最终铺展有着明显的影响。为了探究预固定环节卡诺固定液剂量对染色体分散的影响，桂俊豪[1]等设计了一个定量实验。在预固定时，将卡诺固定液的量分别控制在1.25%、2.50%、3.75%、6.25%和12.25%（终体积浓度）。常规制备中期染色体标本，G显带染色后观察不同预固定剂量下淋巴细胞中期染色体的分散质量，计算中期染色体的铺展面积和染色体的分散质量。该研究发现，当预固定剂量占总体积的1.25%、2.50%或3.75%时，染色体的分散质量较好，可用核型多。当预固定剂量比例≥6.25%后，细胞间相互黏连的程度和细胞间相互积聚的倾向愈发明显。对染色体铺展面积的定量结果显示，预固定液剂量比例为1.25%、2.50%和3.75%时，分裂相核型的平均分布面积分别为1246±236?、1143±178?和1017±163?，均显著高于预固定液剂量为6.25%和12.25%时中期分裂相核型的平均分布面积：876±81?和518±65?，双侧t检验显示组间比较差异显著（P

4滴片环境的温度和相对湿度：

细胞遗传学家普遍认为，滴片环境的温度和湿度是影响中期染色体分散质量的重要因素。德国friedrichschiller大学 Grummt UW说，有经验的细胞遗传学家都非常清楚的认识到中期染色体的分散质量主要决定于载玻片上固定液（甲醇-冰醋酸）的挥发过程，而这一过程主要受环境的温度和相对湿度的影响。无独有偶，中国香港大学的Wen Deng[2]也认为载玻片表面的湿度是影响染色体分散质量的最重要因素。美国的Jack L.Spurbeck[3] 则认为，通过不同温度和相对湿度的协同作用，可以保证最佳中期染色体分散面积。意大利学者Terzoli.G认为中期染色体有时不完整，染色体丢失；有时受细胞质干扰严重，显带质量差。这是因为，在天气变化的过程中，没有适当的环境调控措施。此类变化将是实验中的常见问题。

为了探究环境温度和相对湿度对中期染色体分散质量的影响，遗传学家利用相差显微镜观察了滴片后固定液干燥的全过程。在相差显微镜下观察滴片时载玻片干燥的过程，可以描述为五个步骤[4]：（1）细胞悬液在载玻片上扩散时，细胞向各个方向随机飘动，但当细胞最终接触到玻璃表面时，细胞迅速固定到玻片表面。此时染色体不扩散，细胞看起来像小灰球。（2）固定液开始挥发，当固定液的表面接触到细胞表面时，细胞反光，周围有明亮的光圈。染色体完全不分散。宏观上看，载玻片表面变为粒状。（3）因为染色体的扩散，有丝分裂期的细胞比非有丝分裂期的细胞更快的失去光圈和展平。染色体在这一时期变得暗而可见，染色体扩散的大部分是在这一步完成的。非有丝分裂期的细胞仍有光圈，说明核膜及其内容物对挥发的固定液的展平效用有更强的耐受性。（4）随着固定液的挥发，非有丝分裂期细胞继续展平，同时染色体也有小幅度的扩散（不超过中期分裂相扩散直径的7%）。（5）微量的固定液围绕着各个细胞，但是迅速挥发。可见的染色体扩散停止，但是不排除继续进行细小的改变。

由上可知，中期染色体的扩散主要是在固定液干燥的过程中完成的。因此，若想提高染色体的分散度，从理论上来讲，我们可以通过减慢固定液的挥发速度，延长固定液挥发的时间，得到分散良好的中期分裂相。固定液挥发过快时，染色体分散不开，交叠在一起，对核型分析不利。固定液挥发速度合适时，能够得到分散良好的中期染色体，染色体重叠数少，断裂数少，缺失数少。固定液挥发过慢时，染色体容易断裂，卷曲，缺失，虽然分散面积较大，但是同样不利于染色体核型分析。环境中的相对湿度[5]，影响着固定液的挥发速度。当温度不变时，相对湿度越高，固定液挥发越慢，理论上染色体的分散度就越大；相对湿度越低，固定液挥发越快，染色体的分散度就越小。

Jack L. Spurbeck等为探讨环境相对湿度和温度对染色体分散的影响，以2250例羊水细胞和1650例淋巴细胞为材料，通过实验设计控制环境的相对湿度和温度，分析数据后得出：无论是原位还是非原位培养体系，干燥后的中期染色体的分散面积是相对湿度和温度的相互作用的结果。当相对湿度和温度升高时，在到达一个阈值之前，中期分裂相的面积也随之增大。通过不同的温度和相对湿度的组合，可以得到完美的中期分裂相。在他们看来，采用环境控制系统来控制相对湿度和温度是获得最佳染色体分裂相的实用和稳定的手段。

由此可见，相对湿度和温度的升高可以增加染色体的分散程度，其中相对湿度是染色体分散程度的主要影响因素，但随着相对湿度和温度的升高，染色体断裂的比率增加，染色体的质量降低。因此适当的相对湿度和温度对于高质量的染色体制备非常重要。

综上，本文主要总结了低渗时间，固定液比例，预固定液剂量，环境的相对湿度和温度对中期染色体分散的影响。但是，还有一些因素前文并未涉及，如滴片高度，滴片时悬液的浓度，滴片时载玻片的角度等等。我们想要稳定的得到分散良好的中期染色体，可以通过控制主要因素，如环境的相对湿度和温度，从而得到分散良好的中期染色体。基于这种观点，一种封闭的能够提供恒定的相对湿度和温度的染色体分散仪应运而生。这种仪器通过温度、相对湿度和气流的双向调节，能够稳定的得到分散良好的染色体分裂相，提高染色体分析的分辨率和诊断结果的准确性。但是这种仪器在国内还远没有达到普及的程度，绝大多数实验室还必须手工的控制这些因素。希望本文能够为实验室一线工作者提供一些参考。

参考文献：

[1] 桂俊豪等，Carnoy’s 预固定剂量对中期染色体分散度的影响[J].Int J Genet. 2006，Vol 29：416-419

[2] Wen Deng， A new method for improving metaphase chromosome spreading.Cytometry Part A 2003；51A：46-51.

[3] Jack L.， Dynamics of chromosome spreading. American Journal of Medical Genetics 1996；61：387-393.

[4] Octavian Henegariu， Improvements in cytogenetic slide preparation： controlled chromosome spreading， chemical aging and gradual denaturing. Cytometry 2001； 43：101-109.

[5]Claussen U， Demystifying chromosome preparation and the implications for the concept of chromosome condensation during mitosis. Cytogenetic and Genome Research 2002；98：136-146.

作者简介：

梁 娜（1977―）女，山西人，主管检验师，主要从事中孕期唐氏综合征产前筛查和人类染色体检查研究