细胞骨架范文
时间：2023-02-22 08:37:25
细胞骨架范文第1篇
【关键词】 心肌缺血；细胞骨架
The myocytoskeleton damaging in ischemic myocardium
【Abstract】 Objective To study the damaging of several cytoskeleton proteins in ischemic myocardium in animal model.Methods 15 Wistar white mouse，all male，weighing approximately 160g，are selected for study.Ischemia model are made by tie up the left coronary artery，after 30min，60min，120 min，the ischemic tissue is taken out for study，the samples are investigated by immunohistochemistry using monoclonal antibodies against actin，vinculin，desmin and myosin.Results Ischemia can induce disruption of the cytoskeleton in myocardium，early in 30 minuses actin，myosin，may be injuryed，desmin and vinculin is a little endurable to anoxia，but also showed damaged after 120 minutes of ischemia（anoxia）.Conclusion Ischemia can cause the injury of cytoskeleton in myocardium，which is in response to the irreversible injury to myocardium.
【Key words】 myocardial ischemia;cytoskeleton
心肌缺血的病理生理改变一直是心脏科学研究的热点，近年研究发现，心肌细胞骨架在心肌缺血时的改变具有其独立的特点，对心肌缺血时心肌细胞的不可逆损伤具有极为重要的意义［1］。心肌缺血的保护与临床有密切的联系，尤其为临床研究所关注。心肌缺血时细胞骨架发生变化的一些特点，国外有所研究，并通过药物干预，解释了一部分可能的机制［2，3］，国内较少有相关研究。
1 对象与方法
1.1 实验动物与分组 15只清洁级健康Wistar大白鼠，均为雄性。体重138～165g，由同济医科大学动物实验中心提供。分为3小组，每组5只，分别为缺血30min、60min、120min组。对照组：未缺血区心肌。
1.2 试剂 采用鼠抗动物骨架蛋白肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、波形蛋白（vimentin）、肌球蛋白（myosin）、结蛋白（desmin）均购于Boster生物工程有限公司。
1.3 方法
1.3.1 心肌缺血模型制备与缺血心肌标本的制备 心肌缺血模型与缺血心肌标本的制备采用Barbosa［6］的方法：依次麻醉动物、气管切开、插管进行人工呼吸、切开胸壁、暴露心脏，左冠状动脉根部2～3mm处结扎，观察心肌缺血区的变化。于心肌缺血30min、60min、120min时迅速切取完整心脏，于生理盐水中清洗干净后，切取3mm大小缺血组织块，放入4％多聚甲醛中固定。切取未缺血组织作为对照。标本固定、石蜡切片。
1.3.2 形态学观察 采用常规HE染色，显微镜下观察心肌细胞的形态结构。
1.3.3 免疫组织化学染色 α-sarcomeric actin、vimentin、myosin、desmin单抗免疫组化染色。
2 结果
心肌缺血时大体标本上可以见到，缺血区心肌呈现出颜色变浅、缺血区周围充血、色彩加深。心肌细胞的病理改变在HE切片上可以见到缺血时心肌细胞肿胀，梗死区周边形成出血带。在细胞骨架的免疫组化染色中观察到，actin、myosin在缺血30min的心肌细胞中即有断裂、减少，60min时更加明显；desmin缺血60min也可以见到减少。vimentin在缺血120min的心肌组织中可见减少（见图1～5）。
计算机图像模拟分析计算细胞骨架蛋白相对量的变化（见表1）。可以看到在缺血30min时即可以见到actin、myosin的减少，在缺血60min、120min时actin、myosin明显减少，与未缺血心肌比较差异有显著性，同时desmin及vimentin也开始减少，在120min时更加显著。 表1 心肌缺血时细胞骨架蛋白密度值随时间变化的情况 （x±s）
注：与0min相比，*P＜0.05
3 讨论
心肌缺血是心血管临床极其常见的问题之一，对其病理生理研究一直是心血管研究的热门。怎样加强对心肌缺血时心肌细胞的保护，从而保护心功能，更是临床工作者关注的重点。对缺血心肌的保护应当最好是在心肌虽然发生缺血，但是尚且没有发生心肌不可逆损伤之前，因而对心肌缺血不可逆损伤的机制进行研究也就显得极其重要。对心肌缺血不可逆损伤的研究曾有多种学说，如溶酶体作用说、线粒体受损说、代谢终产物作用说、钙超负荷说及脂质过氧化物作用说［1，2］等，但都只是揭示了心肌细胞不可逆损伤的某一方面，而没有一种学说能完满解释各种现象，而以细胞骨架受损作为细胞不可逆损伤的原因，则可以解释很多其他学说所解释不了的物理学现象［3，4］。认为当ATP严重耗竭时，细胞骨架之间的连接减弱，使在机械力的作用下而发生断裂，进而促使细胞的各种功能失常，细胞骨架与膜脂质有关，参与维持膜的完整性，当细胞骨架损伤时，导致细胞膜的破坏，进而发生不可逆损伤并进一步导致细胞死亡［5］。Sschneijdenberg等［6］证明，心肌缺血时表现出的肌膜蛋白（intramembranous particle，IMPs）的聚集现象的发生与细胞骨架的作用消失没有必然的联系，而IMPs的聚集是可逆的。细胞骨架在心肌缺血不可逆损伤中起如此重要的作用，是与心肌细胞骨架自身的重要作用分不开的。心肌细胞骨架的首要作用是起着连接细胞内各种结构成分的作用，而且心肌细胞的分化、分泌、代谢都与它的参与有关［7，8］，不仅如此，细胞骨架还与心肌细胞的电依赖性钠通道的开放、钾通道内流的整体调节中起着一定的作用［9～11］。心肌细胞骨架主要有以下几种：actin、myosin、desmin以及vimentin等。它们对缺血的耐受能力各不相同，其中，actin、myosin的耐受力最弱，在缺血15min时超微病理下即可以见到损伤的发生［12］。细胞骨架的损伤与细胞内的Ca2+无关，但是再灌注损伤与Ca2+有关［13］，我们的研究也证实了心肌缺血时心肌细胞骨架在早期即可以出现损伤的变化。具体表现为细胞骨架的断裂、变形、数量减少。无论是在动物的在体实验还是离体实验都可以看到这一变化。在缺血60min时即发生几种细胞骨架的比较全面的受损。desmin、vimentin损伤程度较轻。在120min时有明显损伤。
（本文图片见封三）
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细胞骨架范文第2篇
［中图分类号］ R730.2［文献标识码］ A［文章编号］ 1672-4208(2008)21-0048-03
细胞骨架是真核细胞质内蛋白质丝组成的复杂网状结构，它一方面决定和维持着细胞的形态，另一方面也参与细胞的运动、分裂、胞浆运输，对信号传递有重要意义。近年来的研究进一步证实，细胞骨架系统与癌变等生命现象密切相关。本文对细胞骨架与癌的转移方面作一综述。
1 细胞骨架概述
细胞骨架是横越在真核细胞细胞核和细胞膜内侧面的一种纤维状蛋白基质，它由微丝、微管及中间纤维组成，三者高度协调分布，与胞核、质膜、细胞器相连，构成了细胞形态骨架和运动协调系统，以保持细胞的形态和行使运动功能，并对信号传递有重要意义。
1．1 微管的结构与特征
1．1．1 微管蛋白 微管(microtubule，MT)是由许多亚单位聚合成的长管，直径约15 nm，呈中空圆柱状管状纤维，是真核细胞所特有的结构。微管对细胞形状、运动、极性、胞质内运输都起了很大作用，在细胞分裂时微管会解聚并重新形成纺锤体。微管基本化学单位为微管蛋白，一般以异二聚体的形式存在。如果将异二聚体用变性剂处理，可以产生两个稍有不同的亚单位分别叫做α微管蛋白和β微管蛋白。
1.1.2 微管结合蛋白 研究发现，有些蛋白总是与微管蛋白共存，参与微管组成，故称之为微管结合蛋白。一是微管相关蛋白质(microtubule-associated protein，MAP)，主要有MAP-1、MAP-2等。另一是Tau蛋白质。它们与调节微管聚合范围及速率有关。 MAP参与微管的组装及结构的稳定。当MAP被磷酸化后失去结合微管的能力，从而使微管处于不稳定状态。对人或牛来说，Tau被PKA磷酸化后可以减弱它与微管蛋白的结合，从而使微管聚合减弱。微管结合蛋白与微管运动的产生、聚合和解聚的调节或微管和其他细胞组成之间的连接均有关。因此，它们同微管蛋白一道构成了完整的系统。
1.1.3 微管的功能 微管构成细胞的网状支架，维持细胞形态；参与细胞的收缩与伪足运动；参加细胞器的位移，尤其是染色体的分裂和位移，需要在微管的帮助下进行。还可能参与细胞内物质运输。微管在细胞内可能起者运输大分子颗粒的微循环系统的作用。现已证明，病毒与色素颗粒可沿着微管移动，而且速度很快。
1．2 微丝结构与特征
1.2.1 肌动蛋白 （1）微丝(microfilament，MF)普遍存在于多种细胞中，在具有运动功能或非对称性的细胞内尤为发达。微丝常成群或成束存在，在一些高度特化的细胞（如肌细胞），它们能形成明确而稳定的结构，但更常见是形成不稳定的束或复杂的网，并且细胞周期和运动能量的需要改变其在细胞内的形态和空间位置，说明微丝也是一个可变的结构，能根据所在细胞的不同需要而聚合或解聚。（2）微丝的主要成分是肌动蛋白(actin)，它是微丝的基础蛋白质，常被称为肌动蛋白丝（actin filament）。纯化的肌动蛋白是单体的，它能与相同的单位联合形成多聚体。这种肌动蛋白称球形肌动蛋白（globular actin，G-actin）。微丝是由肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维。微丝也是具有极性的。在含有ATP和Ca2+以及很低浓度Na+、K+等含阳离子的溶液中，微丝趋向于解聚或成球形肌动蛋白。而在Mg2+和高浓度的K+或Na+的溶液诱导下，球形肌动蛋白则装配成纤维状肌动蛋白（fibrous actin，F-actin）。微丝的装配和解聚是一个动态过程，并与细胞质的溶胶――凝胶状态的转换相对应，只有聚合态的肌动蛋白才具有生物作用。
1.2.2 肌动蛋白结合蛋白质 同样的肌动蛋白微丝，在细胞内功能不一致，这在很大程度上和细胞质存在许多种类的肌动蛋白结合蛋白质（actin-binding proteins）有关。它们和肌动蛋白结合，控制着肌动蛋白的构型和行为。胞浆中存在着多种蛋白质可与肌动蛋白结合，并调节微丝的聚合与解聚，如thymosin属于隔绝蛋白，它抑制肌动蛋白聚集形成微丝纤维。前纤维蛋白(profilin)主要是促进微丝的装配。另外，与肌动蛋白功能有关的蛋白质分子还有纽蛋白42(vincnlin)、α-辅肌动蛋白(α-actimin)、踝蛋白(talin)、肌球蛋白(myosin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、细丝蛋白(filamin)、束捆蛋白(fassin)、丝束蛋白(fimbrin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、原调蛋白(tropomoknlin)、帽Z蛋白(capZ)等，它们能与G-actin、F-actin结合，调节肌动蛋白的聚合，或帮助微丝与其他细胞结构如微管、浆膜相连接。
1.2.3 微丝的功能 微丝最主要的功能是参与肌肉的形成和功能，参与脏器、肌体、血管等的运动。微丝与免疫细胞相关的功能主要是细胞内应力纤维的形成和细胞的阿米巴样运动。
1.2.4 肌动蛋白微丝功能受到信号转导系统的调节 微丝骨架与许多细胞功能相关。最近研究表明，它控制着细胞内与mRNA传递有关的信息，以及细胞内囊泡和受体的转移、传输及激素作用的起动等，与此同时，微丝的这些功能受到信号转导系统的修饰调节[1]。
1.3 中间纤维(intermed- iatefilament)
1.3.1 中间丝分类 在大多数真核细胞胞质内存在一种坚韧的、耐久的蛋白质纤维，因其直径(10 nm左右)在微丝与微管之间而称之为中间纤维。近年来，用免疫和生物化学的方法已鉴定出动物细胞内含有多种类型的中间纤维，根据它们的氨基酸序列有5种类型：（1）细胞角蛋白：细胞角蛋白（cytokeratin）首先在上皮细胞发现，有两种亚型角蛋白组成酸性角蛋白（acidic keratin）和中性或碱性角蛋白（neutral or basic keratin），分子量为40000~70000。细胞角蛋白是由这两种亚型角蛋白等量组成异多聚体，它是中间丝中最复杂的一类，在人类上皮细胞中细胞角蛋白至少有19种不同的形式，在毛发和指甲中就有8种以上。许多形态与功能不同的上皮细胞通过它们组成的细胞角蛋白分子结构可以进行鉴别。（2）波形蛋白：波形蛋白（vimentin）又名波形纤维蛋白，分子量为53000，广泛分布于间充质细胞，如成纤维细胞、血管内皮细胞、白细胞，体外培养细胞和正在发育的细胞也能短暂出现。（3）结蛋白：结蛋白（desmin）分子量为52000，可在横纹肌及平滑肌两种细胞中出现。（4）胶质细胞原纤维酸性蛋白：胶质细胞原纤维酸性蛋白（gliafibrillary acidic protein）分子量为45000，在神经系统的某些类型胶质细胞中存在，形成了胶质细胞细丝（glial filament）。（5）神经丝蛋白：神经丝蛋白（neurofilament protein）分子量较大，有3种成分多肽，分子量分别为130000、100000和60000。它们组装成神经纤维，是神经细胞轴突和树突中主要的细胞骨架成分。
1.3.2 中间纤维的结构 大部分中间纤维蛋白的氨基酸顺序和分子结构已经清楚。它们是具有一个约310个氨基酸的α螺旋组成的杆状中心区域，长短不等，在这个区域内其蛋白质是非常相似的，组成的氨基酸也有30~70是相同的。这种杆状相似区域是中间纤维聚合的结构基础。杆状区的长度和氨基酸的顺序是高度保守的，杆状区的两端分别是非螺旋的头部区（氨基端）和尾部区（羧基端），头尾两端是高度可变的具有不同的氨基酸组成和化学性质，因此，中间纤维亚基在分子量大小和性质上不同基本上完全取决于其头尾端的不同，而完全不同的中间纤维的结构统一的基础是保守的杆状区结构。
1.3.3 中间纤维的功能 中间纤维比微管及微丝是更耐消化的成分。如用盐和消化剂处理，当大部分微管和微丝被消化时，而中间纤维仍连接在核膜上。因此，可能中间纤维对细胞核有固定作用。在细胞内，中间纤维还可能与微丝和微管共同发挥运输作用。在细胞分裂时，中间纤维对纺锤体与染色体起空间定向支架作用，并负责子细胞中细胞器的分配与定位。多种细胞在体外培养传代时，常常出现波形蛋白纤维增多的现象，在体内肿瘤细胞也有类似现象。说明它在细胞癌变调控中起一定作用。近来发现，中间纤维的一些重要功能，不以纤维的形式发生，中间纤维蛋白本身是一种信息分子，而中间纤维的纤维结构主要是其蛋白质非活性的储存形态。中间纤维蛋白可能与DNA复制与转录有关。
2 细胞骨架与癌转移的关系
2.1 细胞骨架与细胞粘附能力 癌的侵袭与转移是癌细胞与宿主细胞、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间一系列复杂的、多步骤的、多因素相互作用的动态过程。按Liotta等提出的癌细胞侵袭转移的三步骤假说，从分子水平上将这个过程分为：（1）粘附：首先，癌细胞通过细胞表面受体和细胞外基质成分的粘附蛋白发生特异性结合；（2）降解：随之激活癌细胞或宿主细胞的蛋白水解酶，是贴近肿瘤细胞表面的有限区域内基质发生降解；（3）运动：癌细胞移入被蛋白酶水解后的基质区，其运动方向被趋化因子诱导，癌细胞得以向纵深方向移动[2]。因此，癌细胞的转移可认为是一个动态的粘附运动过程，它包含了癌细胞与胞外基质之间十分复杂而又精细的生理和生化作用。细胞粘附能力下降为肿瘤转移因素之一。正常细胞表面存在多种介导细胞之间、细胞与细胞外基质(ECM)之间粘附的分子，如NCAM、E-cadherin、选凝素，细胞通过其粘附分子的胞外部分和ECM发生粘附、识别，然后通过粘附分子的胞内部分与骨架蛋白(αβcatenin、vinculin、radixin等)相连，从而将细胞外信号传入胞内，调节细胞生长。因此上述过程任一环节的缺失将使细胞粘附能力下降，促使肿瘤的发生与转移。所以，细致地了解癌细胞的粘附特性已成为细胞水平上研究癌侵袭和转移的关键。目前已发现有多种抑癌基因编码的骨架蛋白和细胞粘附有关，它们的失活将使细胞的转移潜能增加[3]。如nm23基因位于17q21.3区位，具有编码核苷二磷酸激酶的功能，参与微管、微丝等细胞骨架蛋白的生物活动，通过参与调节细胞内微管系统的状态而抑制癌的转移。因此，一般认为nm23基因的改变可能引起细胞内细胞骨架系统的改变而导致肿瘤的浸润转移。这提示，相对于正常细胞，癌细胞细胞骨架的改变可能是其粘附性异常的结构基础。
2.2 细胞质骨架结构成分改变与癌转移
2.2.1 中间纤维 近几年的研究更多地发现上皮细胞角蛋白的异常表达与癌的发生及癌的侵润转移有关，临床上可根据细胞角蛋白的异质性表达来对癌作出准确诊断和预测，并采取正确的治疗措施。Masayo等[4]将分离自同一病人的舌鳞状细胞癌株A（SQUU-A）和舌鳞状细胞癌株B（SQUU-B）分别植入裸小鼠身上，结果发现被植入SQUU-B有86.7%发生颈淋巴结转移，被植入SQUU-A的小鼠无淋巴结转移。经组织学分析，SQUU-B表现出侵袭生长和血管内渗特点，而SQUU-A只表现为过度生长而无侵袭特性。通过蛋白印迹技术分析，SQUU-A表达CK 13/4CK14、CK16/6CK18/8CK19；而SQUU-B表达CK18/8和CK19。通过逆聚合酶链反应技术分析，CK13/4在两者都表达，但在SQUU-A表达强度是SQUU-B的10倍以上；CK14和CK16mRNA仅表达在SQUU-A；CK18在SQUU-B表达比在SQUU-A强烈。以上实验提示随着口腔鳞癌转移能力的提高，CK13、CK14或 CK16的表达缺失或下降，CK18/19表达增强。这说明细胞骨架系统中细胞角蛋白的变化与癌细胞的恶性表型有关。聂敏海等[5]收集正常口腔粘膜上皮单纯增生上皮异常增生和口腔鳞癌活检标本，用免疫组化电泳和Western杂交方法研究上皮中CK19的表达。结果发现CK19表达于有上皮异常增生的复层鳞状上皮基底上层和口腔鳞癌尤其是低分化鳞癌的癌细胞中，当口腔鳞癌有角化珠存在时，CK19呈斑片状表达，而无角化珠存在时则呈强阳性表达。癌细胞的分化程度与它的侵润转移能力有关，分化程度越低，其发生侵润转移行为的几率越大。这也提示CK19的表达强弱可能与癌细胞的侵润转移能力有关。章慧平等[6]对经病理证实的膀胱移行癌标本经免疫组化实验，结果发现CK20的表达在不同病理分级和临床分期之间的差异有统计学意义，其异常表达率随恶性程度侵润转移程度的增加而增加。提示CK20的表达可作为膀胱移行细胞癌恶性程度高、易侵润转移的标记之一。波形蛋白是间叶组织的标记物，以往常用来鉴别间叶组织与上皮组织来源的肿瘤，但近年来发现在某些癌中也有表达。任秋华等[7]应用免疫组化S―P法，对86例乳腺癌进行了波形蛋白标记分析，结果显示波形蛋白阳性表达率50.6%。统计分析表明，波形蛋白的表达与肿瘤的分级大小及淋巴结转移均呈显著相关。这表明，波形蛋白在上皮癌中异常表达，与癌细胞的侵袭和转移潜能有关。
2.2.2 微丝及微管 多个实验室[8]报道，癌细胞的微管数量远低于正常组，正常组的微丝系统在癌细胞大量缺失，同时癌细胞又增加表达一些新的骨架蛋白。韩立群等对数种人癌细胞胞质骨架的形态分布进行了研究，并将其与成纤维细胞和肾上皮细胞质骨架加以比较。结果表明，癌细胞胞质骨架系统发育不良，骨架纤维细碎，排列无规则；而正常细胞胞质骨架发达，富有应力纤维束（主要由肌动蛋白束构成），排列有极向[9]。说明癌细胞的胞质不发达，尤其是应力纤维束稀少，可能是其恶的形态学基础之一。他们同时发现，人鼻咽癌细胞CNE-2Z的克隆细胞株L4的细胞胞质骨架相对丰富，并可见少量微管样结构及应力纤维束。结合其形态上相对分化和生长缓慢等特点，他们认为上述结构特点可能与L4的体内低侵袭、低转移的生物学行为有一定关系。现已证实高转移人肺巨细胞癌PG细胞与LM-51系[10]及临床高转移的乳癌细胞，除有微丝破坏外，均有F-肌动蛋白小体形成，可能代表高转移的恶性表型特点。微丝束和其末端的膜粘着斑破坏及肌动蛋白小体的出现，可能与肿瘤的侵润转移特性有关[10]。苏长青等[11]则研究发现胃腺癌细胞肌动蛋白表达增强，随癌细胞侵润深度增加和周围淋巴结转移的发生，肌动蛋白阳性率明显增高，提示部分癌细胞亚群运动成分增加与细胞运动性增强、易于侵润转移的特性相一致。癌细胞活跃运动能力主要来自肌动蛋白，细胞亚群骨架蛋白含量增多可能是癌侵润转移发生的关键。最近，发现微管的减少及解聚与恶性肿瘤的转移潜能有关。许多资料表明：癌变或转化细胞的细胞骨架破坏，微管解聚，细胞内钙调蛋白含量升高[12]。张红英等[13]研究发现微丝及微管的完善程度与肿瘤的转移潜能呈负相关。微丝及微管正常聚合或解聚、装配或去装配的动态变化和平衡是细胞运动附着及细胞分裂的重要调控因素，微管解聚与DNA合成的启动有关。骨架的变化不仅在细胞恶性转化中起重要作用，还为衡量恶性肿瘤细胞生物学行为的研究提供结构性标志。此研究提示：细胞内微丝骨架的发育不良使微丝不能呈束且不能与质膜相连加之微管的减少、解聚致使细胞刚性降低，细胞变得更圆，更易在组织中穿行。陆锐等[14]对人胃癌细胞系BGC-823微丝结构研究也表明，微丝骨架组装的改变与肿癌的转移能力相关。
国外对细胞骨架的研究十分重视，发现恶性肿瘤细胞微丝骨架均有不同程度的异常[15]。Verderane[16]的研究表明：从高危险性结肠癌病人分离的皮肤成纤维细胞比来自正常人的对照细胞具有较少的肌动蛋白纤维。Rao等[17]提出假说，肌动蛋白细胞骨架在膀胱癌发展过程中发生渐进式的变化，随着肿瘤发展的不同阶段而表现不同的重组图谱，这些图谱可用以作为早期诊断和预后的分子标记。
3 展望
癌的侵润转移是一个令全世界学者都十分关注和头痛的问题。到目前我们仍缺乏有效的治疗方法来抑制癌的转移。我们是否可以从细胞骨架的角度出发，应用一种或多种药物作用于癌细胞，使癌细胞的原有骨架结构得以恢复，从而抑制癌的转移？近年来已有研究者尝试用维甲酸作用于癌细胞以后，致使微丝骨架得到部分恢复，癌细胞侵袭及转移能力明显降低。另外细胞骨架与癌基因抑癌基因的关系如何？癌基因抑癌基因如何通过信号传导引起细胞骨架结构和成分的改变，从而导致了细胞生物学性质的改变？其分子机制也尚待阐明。也许在不久的将来随着荧光显微镜、CLSM透射电镜技术、超高压电镜技术、免疫组化等技术的发展以及分子生物学等基础理论的重大突破，将进一步揭示细胞骨架在癌转移发生中的作用，癌的治疗也会找到新的突破点。
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细胞骨架范文第3篇
摘要细胞骨架在调控向重力性反应早期的信号感受和传导过程中起重要作用。阐述了植物根系材料的力学特性,介绍了植物感受重力的2种假说,分析了细胞骨架蛋白在重力信号传导链中的作用及细胞骨架与高等植物向重性的关系,以期为细胞骨架和植物向重性的研究提供依据。
关键词微重力;植物;细胞骨架;影响
向重力性反应是植物适应地球重力场环境的一个重要生理过程,是植物能够正常生长发育不可缺少的反应机制。高等植物根的向重力性使其能够充分吸收土壤中的水分和矿质营养,茎的负向重性使其能够充分接受光照。研究表明,植物感受重力与信号传递之间的精确调控可能是通过不同细胞器之间的相互作用来实现的。细胞骨架被认为是与植物向重性有关的重要细胞器之一。细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系[1]。细胞骨架不仅在维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还与细胞运动、物质输运、能量转化、信息传递、细胞分裂和分化、细胞凋亡、细胞的癌变、基因表达等生命活动密切相关。
1植物根系材料的力学特性
植物根系材料不同于一般的工程材料,研究其力学特性,最大的困难在于它参与代谢活动,具有多相、非均匀、各向异性等特点,其应力不仅与应变有关,还与流动因素有关。在不同生理和生长环境下,其力学性质存在很大差异[2]。许多国内外专家学者对木本植物、草本植物、农作物的根系进行了大量的拉伸、压缩、弯曲、冲击、应力松弛、糯变试验等研究,得到了少数根系的拉伸最大载荷、应力、应变、弹性模量、弯曲应力等参数,得到了个别根系的冲击韧性、应力松弛、糯变试验数据和曲线,推得了本构方程、应力松弛方程和糯变方程等。尽管这些研究成果是初步的、不全面的,但它们已在防风治沙、防水土流失等生态环境建设工程中发挥了重要作用,为植物根系力学的进一步发展奠定了基础。
2植物感受重力的2种假说
植物重力信号感受机制一直是生物学界争论不休的话题。截至目前对于重力信号感受的解释主要有2种,即淀粉平衡石假说与原生质体压力假说。
淀粉平衡石假说认为,重力信号是由一类结构特殊的细胞即平衡细胞来感受的。在根中平衡细胞是位于根冠的柱状细胞,而在下胚轴和花序轴中平衡细胞是内皮层细胞。这2种细胞都是高度极化的细胞,但存在结构上的特异性。平衡细胞的细胞核位于细胞的中部或顶部,细胞质可以分为2层,包含内质网的周边区域和富含肌动蛋白微丝的中央区域。平衡细胞最显著的结构特征是都含有淀粉体[3]。淀粉体起平衡石的作用,其比重大于细胞质。在垂直生长的器官中,这些淀粉体沉降在细胞的底部,当植物器官在重力场中的方向发生改变,这些淀粉体因为比重较大,重新沉降到新的物理学底部。中柱细胞和内皮层细胞就是通过这些淀粉体的沉降来感受重力的变化。
原生质体压力假说是平衡石假说之外的另一种关于重力感受的假说。在拟南芥无淀粉体的突变体中,尽管重力敏感性降低,但给予植物长时间的重力刺激,其根仍能发生一定程度的向重力方向弯曲。因此,有人认为在植物体中除了结构特异的平衡细胞外,植物的原生质体本身也可以感受到重力的改变。原生质体压力假说的主要内容是:当植物体的原生质体在重力场中的取向发生改变时,原生质体上部的细胞膜与细胞壁之间的张力增强;这种张力的改变通过特异的区域,即细胞膜与细胞壁通过细胞骨架相连接的区域,传递到细胞膜上改变细胞膜的张力,从而活化质膜上张力敏感的离子通道,特别是钙离子通道;胞质中钙离子浓度的改变引发下游的信号传导,最终引起植物器官的向重性弯曲。
3细胞骨架结合蛋白在重力信号传导链中的作用
3.1微丝结合蛋白
细胞骨架结合蛋白可分为微丝结合蛋白(abps)和微管结合蛋白(maps)。在植物中研究得最清楚的abps是微丝单体结合蛋白以及抑制蛋白和微丝解聚因子,如adf/丝切蛋白。这2类蛋白都是由多个基因家族编码,在微丝骨架组成方面起着重要的作用。过量表达adf的拟南芥植株生长缓慢,细胞纵向的微丝束消失;而抑制adf表达则可刺激细胞伸展和细胞伸长生长,同时细胞形成粗的纵向微丝束。细胞周边部位的微丝网络可能是这一蛋白的作用靶点,但是由于周边微丝的动态性与不稳定性,通常很难通过图像观察到其变化[4]。重力刺激可能调控某些细胞骨架结合蛋白的活性,进而引起细胞骨架重组。如在受到重力刺激的早期拟南芥根的柱状细胞和玉米的胚芽鞘细胞质的ph值发生改变,adf的活性受到磷酸化与去磷酸化的调控。在高的ph值条件下adf调控微丝的解聚,并可能因此改变平衡细胞中微丝骨架的动态性。
3.2微管结合蛋白
与微丝相似,微管重组的过程中微管聚合和解聚的调节可能与结合蛋白有关。利用拟南芥突变体分析微管结合19蛋白的功能取得了巨大的进展。最近发现的细胞壁束间纤维束机械强缺失突变体(fra2)和下胚轴减少伸长突变体(botero 1)都表现为周边微管的扰乱。
4细胞骨架与高等植物向重性的关系
细胞骨架不仅在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还参与许多重要的生命活动。如在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离;在细胞物质运输中,各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运;在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。
研究认为,细胞骨架一方面在细胞质中形成网络,受到沉淀的淀粉体的牵动,另一方面与质膜上的受体相互作用,激活受体,启动重力信号传导过程。最近的研究表明,细胞骨架不仅是细胞感受重力信号的重要环节,而且对根尖细胞中的生长素运输起重要的调控作用。对生长素运输载体(pin)突变体根向重力性反应的研究表明,生长素的极性运输与其向重力性反应有关。微丝解聚剂(如cytochalasin)可减少生长素的极性运输,也影响根的向重力性[5]。
5结语
细胞骨架和植物细胞向重性研究表明,植物向重性现象是一个集研究细胞骨架排列、信号传导、植物激素行为、植物生长调控于一体的完美系统。传统的研究细胞骨架和植物向重性的方法已加入了新的生物学技术,如免疫荧光技术、套笼探针技术和其他新发展的显微技术。免疫荧光技术可以观察到向重力性过程中细胞骨架的重排,套笼探针的微注射技术可以观察到细胞骨架的实时动态变化过程[6]。利用修饰细胞骨架的荧光报告蛋白可以观察到活细胞中细胞骨架的变化,采用荧光蛋白显示剂监测细胞质中钙和ph值变化已用于保卫细胞中信号传导的研究,以及根的发育和向重力性的研究。
6参考文献
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细胞骨架范文第4篇
[关键词] 微弧氧化； 激光共聚焦显微镜； 成骨细胞； 细胞骨架
[中图分类号] R 783.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.006
种植体成功的关键在于形成良好的骨结合，而成骨细胞是骨结合的关键。种植体植入后，成骨细胞首先在种植体表面黏附、丛集，然后分泌骨基质，启动新骨生成。新骨从种植体表面逐渐向骨创面生长、延伸，最终形成种植体与骨组织的骨结合。由此可见，提高成骨细胞的成骨活性是提高种植成功率的有效途径。目前种植体表面改性的主要方法有表面形貌改性、表面化学成分改性及表面功能涂层改性。微弧氧化是目前研究中的热点。有研究[1-3]报道，微弧氧化表面对成骨细胞的黏附、增殖、分化均有促进作用。本实验在打磨和喷砂基础上，采用微弧氧化法处理钛片，研究微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架（cytoskeleton，CSK）的影响。
1 材料和方法
1.1 钛片的表面处理和分组
将直径为15 mm、厚度为1 mm的钛片，按处理方法不同分为4组：机械打磨（G）组、喷砂（SB）组、打磨微弧氧化（GMAO）组和喷砂微弧氧化（SBMAO）组。
G组采用机械打磨方法，依次用防水砂纸240、360、600、800目同向打磨钛片，使表面光滑，呈金属光泽，肉眼观划痕一致。SB组在机械打磨的基础上，使用40～60目的二氧化钛砂在6.5 kPa、10 cm距离条件下均匀喷砂。GMAO组为将经过机械打磨的钛片用丙酮在超声波清洗机中清洗，干燥后进行微弧氧化。微弧氧化电解液的基本组成成分为20 g·L-1 Ca（CH3COO）2·H2O、9.3 g·L-1 Na5P3O10和Na2SiO3·9H2O，去离子水为溶剂，试剂均为分析纯。将钛片作为阳极，不锈钢电解槽为阴极进行微弧氧化。实验所用的电参数为：正向电压350 V，负向电压160 V，频率800 Hz，处理时间20 min，电解液通过冷却水循环系统进行冷却，微弧氧化过程中温度控制为15～
30 ℃。SBMAO组为将经过40～60目喷砂的钛片用丙酮在超声波清洗机中清洗，干燥后进行微弧氧化。
1.2 成骨细胞的体外培养
采用改进后的贴壁组织块分步消化法体外培养成骨细胞。
1.3 钛片表面成骨细胞的形态变化
取生长至第3代的成骨细胞，无菌PBS冲洗后0.25%胰酶消化，吹打均匀后调整细胞密度至每毫升4×104个，用加样器吸取500 ?L细胞悬液接种于放有预置清洁钛片的24孔板内，每组3枚钛片。当分别培养至2、4、12 h后弃去培养液，PBS冲洗，室温加入4%多聚甲醛固定10 min，乙醇梯度脱水（体积分数分别为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，前6种体积分数每种脱水2次，每次3 min，100%体积分数脱水3次，每次3 min），真空干燥，喷金，扫描电子显微镜（scanning electron micro-scope，SEM）观察成骨细胞形态并拍照。
1.4 钛片表面成骨细胞内CSK的变化
将接种好成骨细胞的各组钛片进行异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽（fluorescein isothiocyanate-phalloidin，FITC-phalloidin）室温染色60 min，PBS清洗细胞3次，置于激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）下观察CSK的微丝形态变化并拍照。
2 结果
2.1 钛片表面成骨细胞形态的变化
成骨细胞接种于钛片表面不同时间的细胞形态见图1。
成骨细胞接种2 h（图1第1行），与刚消化下来时的圆形细胞相比，各组细胞已经有明显的伸展，体积也有增大。G组细胞向四周伸展，无方向性，细胞边缘与钛表面结合紧密。SB组细胞有选择性地附于喷砂形成的孔洞内，细胞形态不规则，细胞足进一步伸展攀附于孔洞边缘，与钛片粗糙表面结合紧密。GMAO组细胞完全平铺于基底上，周围细胞足伸入火山状孔洞内。SBMAO组细胞完全铺展开，大部分细胞位于凹陷处，形态不规则，细胞覆盖于大量火山状孔洞上，细胞扁平，甚至可以见到整个细胞覆盖于孔洞之上，周边细胞足伸入孔洞内，与孔洞结合紧密。
成骨细胞接种于钛片表面4 h（图1第2行），各组细胞的体积进一步增大。G组细胞形状扁平，细胞长轴方向与表面划痕方向一致。SB组细胞体积已经大于表面孔洞，细胞跨越孔洞凹陷，周边细胞足明显伸入周围的细小孔洞内。SBMAO组细胞与SB组一样跨越孔洞凹陷，周边细胞足已经完全伸入上下联通的孔洞内。GMAO组细胞较SBMAO组更为扁平。
成骨细胞接种于钛片表面12 h（图1第3行），各组细胞铺展面积进一步增大。G组细胞沿着表面划痕方向完全铺展开。SB组细胞完全跨越表面孔洞凹陷，位于凹陷上方，周边细胞足伸长更加明显。GMAO和SBMAO组细胞之间有伪足相连，细胞有连接成片的趋势，周围可见伸入孔洞内的三维网络状结构。
2.2 钛表面对成骨细胞内CSK的影响
成骨细胞接种于钛片表面不同时间的细胞内CSK的微丝形态见图2。成骨细胞接种2 h（图2第1行），G 组肌动蛋白纤维成束状，有沿打磨形成的划痕方向铺展的趋势；SB组细胞陷于喷砂形成的孔洞中，肌动蛋白纤维束沿孔洞的边缘铺展，形态不规则；GMAO和SBMAO组肌动蛋白纤维沿小孔边缘伸展，微丝结构密集且不清晰，两组的差异不明显。
成骨细胞接种4 h（图2第2行），G组成骨细胞肌动蛋白纤维沿划痕方向生长，纤维伸长。SB组肌动蛋白纤维沿着表面形态排列，将细小的孔洞覆盖，有的伸入孔洞内。GMAO和SBMAO组表面的细胞均铺展开生长，将火山口状结构覆盖，火山口处肌动蛋白纤维沿火山口形成圈；GMAO组较SBMAO组细胞的形态更规则，类似于G组，而SBMAO组细胞形态更近似于SB组。
成骨细胞接种12 h（图2第3行），各组细胞体积均增大，肌动蛋白纤维均清晰可见，纤维束平行排列与细胞长轴一致。G组肌动蛋白纤维束沿划痕方向排列。SB组细胞向四周铺展，肌动蛋白纤维沿孔洞边缘排列，细胞覆盖在孔洞上方。GMAO和SBMAO组细胞肌动蛋白纤维平行排列，圈形排列的肌动蛋白纤维减少，肌动蛋白纤维在细胞边缘处汇聚成束，伸向孔洞内。
3 讨论
本实验采用LSCM观察不同钛片表面对成骨细胞CSK的影响。传统荧光显微镜是采用很宽的照明光束照射样品进行观察，因此存在样品在焦平面时的结构能清晰成像，但是在非焦平面的结构成像模糊的问题。LSCM采用点照明和点探测，利用照明针孔与探测针孔的共轭原理，可以得到连续的光切图像，呈现样品真实清晰的三维结构[2]。
本文所用抗体FITC-phalloidin能特异性地与聚合态的肌动蛋白结合。肌动蛋白是微丝的主要成分，参与维持细胞正常形态和结构，以及力学信号传导等多种功能，其结构重排及聚合和解聚的动态变化在一定程度上反映了细胞的功能状况。本研究中，成骨细胞接种于钛片表面2 h后各组细胞肌动蛋白纤维聚集，分布于表面隆起处；接种4 h后，2个微弧氧化组表面火山口处细胞肌动蛋白纤维均沿火山口形成圈，这可能与成骨细胞分泌的纤连蛋白多集中于表面粗糙孔洞的边缘处有关[3]。
整合素分子能特异性地与细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）中的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列结合，将细胞外的ECM分子与细胞内的骨架蛋白连接起来，形成ECM-整合素-CSK黏着斑，传导细胞内外的双向信号[4]。整合素与ECM结合后就与CSK发生联系，并发生簇集，从而介导细胞的黏附和迁移。材料表面经处理后，其粗糙度增加，细胞与材料的接触面积增大，这样在植入体内后，ECM会在材料表面形成一层生物大分子层，与细胞表面的整合素结合[5]。本实验中，经过微弧氧化处理的钛片表面的粗糙度明显高于G组及SB组。当成骨细胞黏附于材料表面后，开始铺展并伴随着伪足形成。ECM-整合素-CSK黏着斑在信号传导过程中重组肌动蛋白骨架，细胞变平并铺展[6]。本实验结果显示，12 h后各组细胞均已完全铺展，细胞肌动蛋白纤维排列成束且有规律，GMAO与SBMAO组均可见细胞之间的肌动蛋白纤维束相互连接，这与SEM观察到的细胞有连接成片的趋势相一致，提示SBMAO组与GMAO组钛片表面均有利于成骨细胞的ECM与整合素结合，从而介导细胞的黏附和迁移。本实验发现，随着培养时间的延长，各组细胞之间的肌动蛋白纤维铺展的差异逐渐减小，到培养12 h时，肌动蛋白纤维的铺展无明显差异，只是2个微弧氧化组细胞有连接成片的趋势。
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细胞骨架范文第5篇
基金项目：全军医学科学技术研究“十二五”发展计划重点项目（BWS12J018）；国家自然科学基金（81071529，81101467，81101406）
作者单位：510010 广州，广州总医院重症医学科 全军热区创伤救治与组织修复重点实验室
通信作者：苏磊，Email：
【摘要】目的 研究热打击对培养人骨骼肌细胞（HSKMC）通透性、细胞骨架及细胞周期影响。
访法 流式细胞仪钙离子内流检测热打击对HSKMC细胞膜通透性的影响，考马斯亮蓝R-250染色法检测热打击对HSKMC细胞骨架影响，流式细胞仪检测热打击对HSKMC细胞周期改变。结果 给予培养人HSKMC细胞不同温度梯度热打击1 h后， 43 ℃热打击组钙离子流式检测的中位数为91.63，37 ℃对照组中位数为22.98。同对照组相比，随着热打击程度加强，显微镜高倍镜下可见骨骼肌细胞骨架逐渐出现变粗、变短、出现明显的应力纤维。骨骼肌细胞在热打击情况下，各组G0/G1期DNA含量在44.13～62.98之间，与正常对照组对比，当细胞离开热打击环境后培养18 h前G0/G1期DNA含量明显高于对照组，培养第18 小时恢复才同对照组基本相同。
结论 热打击的情况下造成细胞钙离子内流效应，导致细胞内钙超载。可改变HSKMC骨架结构，使骨架失去正常的网状有序排列结构，间隙增大。细胞周期出现阻滞，细胞被阻滞在G0/G1期。
【关键词】热打击；骨骼肌细胞；通透性；钙超载；细胞骨架；细胞周期；考马斯亮蓝染色；流式检测
The effect of heat stress on the permeability， cytoskeleton and cell cycle of human skeletal muscle cellPan Zhiguo， Shao Yu， Wan Jun， Geng Yan， Chen Jinghe， Su Lei.ICU Department of Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command， Guangzhou 510010， China
Corresponding author：Su Lei， Email：
【Abstract】Objective To study the effect of heat stress on the permeability， cytoskeleton and cell cycle of human skeletal muscle cell （HSKMC）. Methods The HSKMC membrane permeability was detected by calcium ion inflow with flow cytometer， the cytoskeleton was stained by CBB 250， and the cell cycle was determined by flow cytometer.Results After 1 h of heat stress on human HSKMC cells under different temperature gradient， the median level of calcium ion was 91.63 in 43 ℃ heat stress group compared with 22.98 in 37 ℃control group. As temperature increased， thicker and shorter cytoskeleton and stress fiber were shown under the high power lens of microscope. The DNA expression of skeleton cells at G0/G1 stage was 44.13-62.98 in groups under heat stress. Compared with normal control group， DNA expression was much higher in heat stress group， when HSKMC was cultured under 37℃ temperature for another 18 h， it kept decreasing DNA expression to a similar level as control group.Conclusions Heat stress can cause calcium iron inflow resulting in intracellular calcium overload， and affect the cytoskeleton leading to loss of normal web ordered arrangement and increased gap in HSKMC cells， which give rise to blocking cell cycle into G0/G1 stage.
【Key words】Heat stress；Skeletal muscle cells；Permeability；Calcium overload；Cytoskeleton；Cell cycles；Coomassie brilliant blue； Coomassie brilliant blue；Flow cytometry
中暑的特征为中心体温过高伴随着系统炎症反应致多脏器功能障碍，患者中心体温可超过40 ℃，导致机体主要脏器如心、肝、肺、肾、肠、血管和骨骼肌等发生一系列损伤[1-7]。中暑并发横纹肌溶解症的发病率约为25%[8]。骨骼肌占成人体质量的40%～50%，骨骼肌细胞内外的电解质失衡、炎症因子变化对整个机体的影响十分巨大。本课题组前期实验证实热打击对骨骼肌细胞具有细胞毒效应，抑制骨骼肌细胞的增殖，并促进细胞因子IL-6和TNF-α的释放，提出重症中暑的“第二关键点”理论[9-10]。笔者在前期的研究中发现热打击是导致横纹肌溶解的重要原因[11-12]，本实验拟通过研究在热打击条件下骨骼肌细胞的钙离子内流情况、细胞骨架改变和细胞周期变化情况，观察热打击对于骨骼肌细胞的影响，进一步研究骨骼肌在重症中暑发生、发展中的作用和机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料及试剂
人骨骼肌细胞株（HSKMC）从中国科学院昆明细胞所购买。流式细胞仪购自BD公司，Fluo-3 AM钙离子荧光探针试剂盒购自invitrogen公司，Olympus荧光显微镜，细胞周期与凋亡检测试剂盒购自武汉碧云天公司。
1.2 方法
1.2.1 HSKMC细胞培养 HSKMC细胞复苏后，将细胞收入离心管中，1000 r/min离心10 min，弃上清，用高糖DMEM培养液（含20%胎牛血清，10 0000 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）混匀细胞，转入25 mL玻璃培养瓶中，在37 ℃、5% CO2浓度及饱和湿度条件下培养，次日换液，以后根据细胞生长情况每48～72 h更换培养液一次，每周传代1～2次。
1.2.2 流式细胞仪钙离子内流检测热打击对HSKMC细胞膜通透性的影响 将Fluo-3AM钙离子荧光探针溶于1 mL DMSO中，制成1 μg/μL，取对数生长期细胞，按1×104个/皿密度铺入60 mm×15 mm细胞培养皿，培养至单层融合后，给予消化，然后将悬浮液按下述方法给予刺激：①对照组（即将细胞置于标准37 ℃、5%CO2浓度培养箱中同其余各组等时间培养）；②43 ℃热打击组（将细胞置于43 ℃细胞培养箱中培养1 h）。打击后同一时间每瓶悬浮液按2 μL/100 μL加入Fluo-3AM钙离子荧光探针，置于标准37 ℃、5%CO2浓度培养箱共同避光孵育1 h，予以上机检测。
1.2.3 考马斯亮蓝R-250染色法检测热打击对HSKMC细胞骨架影响 取对数生长期细胞，消化后按5×103个/片密度铺入6孔板培养玻片，培养至单层融合后，按下述方法给予刺激：①对照组（即将细胞置于标准37 ℃、5%CO2浓度培养箱中同其余各组等时间培养）；②43 ℃热打击组（将细胞置于43 ℃细胞培养箱中培养1 h）。应用考马斯亮蓝R250染色：①配制M-缓冲液；②倾弃培养上清，加入1 mL PBS冲洗3次；③吸去PBS，用1.5%TritonX-100摇床震荡处理8 min，3次；④吸去TritonX-100，用M-缓冲液摇床震荡洗4次，每次3 min；⑤用3%戊二醛固定10 min，给予M-缓冲液洗3次，每次3 min；⑥用0.2%考马斯亮蓝R250震荡染色40 min；⑦蒸馏水洗3次，每次孵箱烘干；⑧然后将细胞玻片置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察；⑨如染色效果好，可用二甲苯处理样品，5 min，两次，最后一次不要等样品干；⑩加一滴中性树胶，加盖玻片封片，制成永久切片。普通光学显微镜高倍镜下照片。
1.2.4 流式细胞仪检测热打击对HSKMC细胞周期改变 取对数生长期细胞，按1×104个/皿密度铺入60 mm×15 mm细胞培养皿，培养至单层融合，按下述方法给予刺激：①对照组（即将细胞置于标准37 ℃、5%CO2浓度培养箱中同其余各组等时间培养）；②43 ℃热打击组（将细胞置于43 ℃细胞培养箱中培养1 h）。将43 ℃热打击组继续置于标准37 ℃、5%CO2浓度培养箱孵育，于0、6、18、24 h分别取出后消化，用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。具体操作按武汉碧云天公司细胞周期与凋亡检测试剂盒说明书进行。染色完成后在24 h内完成流式检测。用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
2 结果
2.1 热打击对HSKMC细胞膜通透性的影响
流式细胞仪检测结果提示，给予培养人HSKMC细胞不同温度梯度热打击1 h后，如图1所示，43 ℃热打击组钙离子流式检测的中位数为91.63，37 ℃对照组中位数为22.98。
2.2 热打击对HSKMC细胞骨架影响
本实验中，同对照组相比，随着热打击程度加强，显微镜高倍镜下可见骨骼肌细胞骨架逐渐出现变粗、变短、出现明显的应力纤维，见图2。
2.3 热打击对HSKMC细胞细胞周期改变
同正常对照组相比，骨骼肌细胞在热打击情况下，DNA含量与细胞周期中各期百分构成比统计结果分别见图3及表1。3 讨论
胞浆Ca2+是细胞的第2信使。细胞内钙不仅作为一种重要的第2信使广泛参与细胞的运动、分泌、代谢和分化等多种细胞功能活动的调节，而且胞内钙离子浓度的变化与调控对于参与维持存在于细胞质膜或细胞器膜两侧的跨膜梯度差，以及介导细胞对外界刺激的应答反应具有重要的调节作用[13]。研究发现， 钙在细胞损伤过程中起重要作用，各种因素导致的细胞或细胞器内钙过度集聚可引起细胞结构和功能损害，线粒体和细胞内钙异常增加程度常作为细胞损伤指征之一[14]。
引起横纹肌溶解的一个重要的理论就是线粒体Ca2+超载导致线粒体功能障碍[15]。细胞内外的Ca2+水平变化是微小和迅速的，极难测定，目前定量这些变化在技术上仍存在一定困难[16]。通过测定荧光强度来反映细胞中的钙离子浓度是目前普遍采用的细胞内钙离子检测方法。本实验通过应用流式细胞仪及Fluo-3/AM检测不同温度热打击后细胞内钙离子变化。本实验结果显示，Fluo-3/AM负载的HSKMC细胞在37 ℃基础状态下就有少量钙离子内流，但随着热打击温度及时间延长，43 ℃热打击组钙离子流式检测的中位值为91.63，而37 ℃对照组中位值仅为22.98，提示细胞内钙离子浓度明显增加，说明在热打击的情况下造成细胞钙离子内流效应，导致细胞内钙超载，最终导致骨骼肌细胞损伤、坏死。
细胞骨架是细胞内不同蛋白质纤维的聚合物和各种调控蛋白交错连接的网络结构，它参与细胞分裂及运动、细胞内物质运输等多种功能，在维持真核细胞的形态、承受外力、胞内运输、变形运动、信号转导等方面发挥着重要的作用，而且还参与许多重要的生命活动，包括染色体分离、细胞中各类小泡和细胞器的定向转运以及白细胞迁移、游动、神经细胞轴突伸展等[17-18]。一般而言，应力纤维是支撑细胞形态的主要结构，其表达的改变往往代表细胞的变形和增殖等变化[19]。本实验通过应用考马斯亮蓝R250染色法检测热打击对HSKMC细胞骨架影响，随着热打击时间及程度加强，同对照组相比，显微镜高倍镜下可见HSKMC细胞骨架逐渐出现变粗、变短，出现明显的应力纤维。提示热打击可改变HSKMC骨架结构，增加HSKMC通透性，同时使骨架失去正常的网状有序排列结构，引起细胞收缩，使HSKMC间隙增大，最终会导致HSKMC结构和功能出现改变。
多细胞有机体的发生与发育有赖于细胞增殖、分化和死亡的精密结合， 即细胞周期的正常运行。本研究通过流式细胞仪检测热打击后骨骼肌细胞细胞周期分布，发现骨骼肌细胞在热打击情况下，各组G0/G1期DNA相对含量在44.13～62.98之间，与正常对照组对比，当细胞离开热打击环境后培养18 h前G0/G1期DNA相对含量明显高于对照组，培养第18小时才恢复同对照组基本相同，说明热打击情况下，细胞周期出现阻滞，细胞被阻滞在G0/G1期，细胞内部活动减缓，处于“休眠”状态，不能进一步发展到S期和G2/M期，从而不能完成整个细胞的分裂过程，大约18 h左右才恢复至正常状态。
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（收稿日期：2014-01-17）
细胞骨架范文第6篇
[关键词]软骨细胞；细胞骨架；细胞形态
关节软骨处在一个具有压应力、张应力、流体剪切力等机械应力作用的复杂力学环境中，而机械应力在调节关节软骨细胞生物学行为中具有十分重要的作用，能够对软骨细胞新陈代谢进行调控，是保证软骨基质正常状态的必要条件。可调控软骨细胞的新陈代谢，是维持正常软骨基质必不可少的条件。关节软骨组织缺乏血液供应、细胞代谢缓慢、自我修复能力较差，即使较小的软骨损伤也会引起严重的后果。我们的前期动物实验表明，中等强度的炮台运动能促进大鼠软骨缺损的修复重塑，但其作用机制尚不清楚。
本研究拟通过体外实验对大鼠关节软骨加载周期性压应力，观察应力下的软骨细胞形态和细胞骨架的变化，为软骨细胞内力一生物信号转化研究提供基础，为适度应力促进关节软骨缺损修复重塑的机制研究提供依据。
1.资料与方法
1.1一般资料
主要包括大鼠来源及所用试剂的来源。本研究中所用大鼠为7d龄，且身体健康，均由南方医科大学实验动物中心提供。主要试剂：鼠抗人Tubulin B单克隆抗体（北京中杉金桥生物进口分装）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培养基（HyClone公司）；0.01mol/L磷酸缓冲液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；链菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番红（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；双乙酸荧光素（Salarbio公司）；甲苯胺蓝（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型胶原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC思牵ū本猩冀鹎派物进口分装）；I型胶原蛋白裱衬的6孔培养板（Flexercell公司）。
1.2仪器设备
主要包括四点弯曲加力装置（四川大学华西口腔医学院研制）；流式细胞仪（Coulter，美国）；CO2培养箱（ShelLab，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；数码相机（Olympus，日本）。
1.3实验方法
主要包括细胞培养、染色以及检测。
1.3.1软骨细胞的分离培养及应力加载 体外分离大鼠四肢的关节软骨并进行传代培养，细胞培养传至第3代，随机分为对照组（A组）和周期性机械应力组（B组）。A组：在正常条件下培养软骨细胞；B组：软骨细胞置于周期性机械应力体系中（4000u strain）培养30min，连续3d。加载应力组细胞卸载后与对照组细胞同时进行以下检测。
1.3.2番红及甲苯胺蓝染色 软骨细胞生长于柔性的硅胶膜上，选择PBS进行冲洗，并加入0.25%番红以及1%甲苯胺蓝染液，在室温条件下，进行孵育2h。随后利用显微镜进行观察拍照。番红染色可以明确氨基葡聚糖合成情况；甲苯胺蓝染色可以明确蛋白多糖合成情况。
1.3.3免疫荧光检测 当细胞的80%贴合于盖玻片后，在超净的工作台上放置一24孔的培养板，并取出贴有细胞的盖玻片，使用PBS液进行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，进行固定。固定后，使用0.5%的Triton液清洗细胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板上，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。后加如异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的二抗（sigma公司），37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板，0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。将所有盖玻片放置于24孔板中，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min，后将清洗液弃去，加入4’，6-二脒基2-苯基吲哚（4’，6diamidino2-phenylindole，DAPI）进行染核，在室温条件下，进行5min。后在长方形的载玻片上低落封片剂，盖上盖玻片，并在室温条件下5min封片。用LCSM（LeicaSPS Germany）观察并记录图像。
1.3.4 RT-PCR检测cofilin基因表达 以TrizolRNA试剂盒提取细胞总RNA，依据GenBank上登陆cofilin基因序列，以B-actin作为内参照，设计引物序列。cofilin正义引物：TGTGGCTGTCTCTGATGGAG，反义引物：3TGTCTGGCAGGATC 3TGAC：B-acfin正义引物：CAC GTA CGT TGC TAT CCAGGC，反义引物：CTC CqT AAT GTC ACG CAC GAT。PCR条件95℃变性4min：95℃变性45s：53℃复性45s：72℃延伸90s：72℃温育10min：4℃保存24h。扩增结束后取最终产物10 u L，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（含EBO.5ug/mL）。15mA、90V稳压45min，采用kodak电泳凝胶观察系统EDASl20扫描，分析结果。
1.3.5Western印迹检测cofilin蛋白表达 选择实验组与对照组中贴壁生长的软骨细胞悬浮液，并进行蛋白样品提取，以pierce公司生产的BCA蛋白定量检测试剂盒说明为标准稀释样品，进行蛋白浓度的检测，并选择5mg/mL的BSA液体将蛋白质标准品完全溶解，置于-20℃的环境下保存。选择取标准品用PBS 10mL，并将其稀释为100uL，保证液体的最终浓度为0.5mol/mL。进行SDS-PAGE电泳，再完成转膜的过程中加入一抗与二抗，并进行ECL发光。通过扫描仪进行扫描，将图像输入到Image J软件中进行图像的定量分析。
1.4统计学分析
应用SPSS15.0软件进行统计分析。计量数据用（x±s）表示，行配对t检验，P
2.结果
2.1软骨细胞的形态学观察
体外分离的大鼠关节软骨细胞培养24h后开始贴壁，72h后能够完全贴壁。并且大部分细胞表现为多边形，而细胞核表现为椭圆形或者圆形，能够清晰的观察到1～2个核仁。进行甲苯胺蓝染色后，形态学观察可见：大部分聚集于细胞内的呈深蓝色的蛋白多糖。而细胞核则被染色为深蓝色或者蓝紫色。进行番红染色后，形态学观察可见：大部分呈深红色的氨基葡聚糖阳性物质聚集于细胞内。加载组和对照组无显著差别，而应力组的关节软骨细胞发生形态改变，并且其取向逐渐趋于相同。见图1A～D。
2.2微丝的形态学观察
实验组软骨细胞微丝为与细胞长轴平行的线状均匀纤维，排列整齐，呈线状拉伸，核深染。对照组软骨细胞微丝形态及分布较散乱，纤维显稀疏，与对照组比较核淡然。见图2A～B。
2.3微管的形态学观察
实验组软骨细胞边缘平整、锐利，细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。对照组软骨细胞微管荧光强度明显较弱，边缘模糊，未见明显核周聚集区。见图2C～D。
2.4中间纤维的形态学观察
实验组软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带，中间纤维扩展的细胞外基质的部分呈现为亮带外周的微弱绿色荧光。对照组软骨细胞中间纤维排列紊乱，荧光强度普遍较弱，呈波浪状围绕细胞核分布，个别细胞中存在中间纤维的斑块状聚集，膜周亮带较弱或无，亮带以外微弱绿色荧光较宽。见图2E～F。
2.5RT-PCR检测cofihn基因表达
RT-PCR检测显示实验组软骨细胞cofilin基因表达为（1 52±0.12），对照组为（0.99±0.01），两组相比差异具有统计学意义（t=31.123，P=0.000）。见图3。
2.6Western蛋白印迹检测cofifin蛋白表达
实验组软骨细胞中cofilin蛋白表达明显高于对照组软骨细胞cofilin蛋白的表达。见图4。
3.讨论
软骨在动物全身关节活动中发挥着重要作用，其含有特殊的软骨基质，因而能够承受一定的机械力而不会发生永久变形。同样，在软骨的生长发育过程中，其形态和功能的维持及损伤后的修复也离不开力学刺激，缺乏力学刺激会导致软骨退行性变。
软骨细胞在机械力的传导和转化方面起着举足轻重的作用。细胞形态是细胞功能的体现形式，是细增殖分化与凋亡等诸多胞内事件的参与者，同时，细胞形态与细胞所处的力学环境密不可分，是细胞内部力平衡的最直观外在表现，因此，对软骨细胞的形态研究，是研究机械应力影响软骨修复机制的基础。
本实验中在周期性机械应力刺激下，大鼠关节软骨细胞附壁生长良好，能够合成有软骨细胞生物学特点的粘多糖和氨基葡聚糖，并促进软骨细胞的规则排列，说明在软骨细胞的生长过程中，周期性的机械应力具有较为积极的刺激作用。临床研究证实，外力施加载荷的频率、时间与大小等均是影响软骨细胞新陈代谢和生长的刺激因素。本实验中的细胞特殊染色技术只能定性分析粘多糖及氨基葡聚糖的含量，而无法从蛋白表达的基因水平辨别蛋白合成过程中的微小差别。仍然需要更加深刻的定量分析研究，对基因和蛋白层面进行探讨，进一步阐述周期性机械应力对软骨细胞的刺激作用。
细胞骨架是维持细胞形态的重要部分，同时在维系软骨细胞功能方面也具有十分显著的作用。细胞骨架包括微丝、中间z与微管是胞骨架的组成部分，联合各种具有不同作用的调控蛋白共同构成细胞内部蛋白纤维网络体系。细胞骨架明显的为力学信号发生转导提供了十分理想化和有效化的途径。在细胞受到外界力学的刺激后，会导致细胞骨架发生重新排列，导致使细胞内应力随之发生相应的重新分布。细胞骨架的改变不仅会造成细胞形态的变化，同时也会导致细胞力学特征及生物学特征发生变化。
微丝是真核细胞中含量最丰富的一种蛋白复合体，是细胞骨架的主要成分之一，是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝，又称肌动蛋白丝，F-actin是细胞骨架微丝蛋白的主要成分，与细胞黏附、吞噬、运动、分裂等密切相关。细胞伸出的丝状伪足参与细胞间的通讯并使细胞具有趋化性，产生细胞形态的变化，而成束的微丝对丝状伪足起支持作用。压应力作用于软骨细胞后，微丝会出现不同方向的变化，增加细胞顶-底纵向的微丝张力，但横向微丝张力未发生变化。外界刺激到达阈值后，会破坏Actin微丝和Vimentin中间纤维聚集以及解聚的动态平衡，导致微丝发生生物学降解。应力信号通过细胞骨架网络结构传递至细胞内激活相应的信号转导通路，反馈调控，使其与组蛋白、DNA相互作用来调节复制和转录过程，细胞骨架发生重组，使细胞维持一定的机械强度适应机械力。
本研究中免疫荧光染色显示应力组较对照组微丝致密且分布均匀，荧光强度增强，取向趋于一致。实验组细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。而加载周期性机械应力后的软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带。这些现象均表明周期性应力可促进软骨细胞的骨架重排，提高其力学适应性，而细胞骨架在软骨细胞的力学一生物学信号转导中发挥着重要作用。
Cofilin蛋白是广泛存在于真核细胞胞质内的一种可解聚的蛋白，研究表明其在细胞骨架动态改建过程中发挥着重要作用。本研究发现，在周期性的应力作用下，软骨细胞内的cofilin通路的相关基因以及蛋白的表达均发生明显的变化，这表明cofilin通路在软骨细胞力学一生物学信号的转导过程中具有十分重要的参与作用。同时进一步的研究应力传导中软骨细胞cofilin信号通路生物学相关的调控机制，有希望为明确关节软骨的修复重塑中机械应力的作用机制提供可靠的证据。
细胞骨架范文第7篇
[关键词] 阿魏酸;血管平滑肌细胞;F-actin
[中图分类号] R36[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(a)-037-02
Effect of ferulaic acid on F-actin cytoskeleton of rabbit arterial vascular smooth muscle cells
ZHANG Xian, ZENG Xing, SUN Jingbo, OU Runmei, HUANG Yu
(The Central Laboratory, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China)
[Abstract] Objective: To observe the effect of ferulaic acid on the F-actin cytoskeleton of rabbit vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods: VSMCs were cultured with high glucose DMEM containing 20% deactivated fetal bovine serum, the cells were treated with ferulaic acid for 24 h and then F-actin was labeled with FITC-phalloidin, and the fluorescence intensity was detected with FCM, and then observed with confocal microscopy. Results: FCM result showed that F-actin of VSMCs was decreased after treated with ferulaic acid for 24 h. The fluorescence intensity of F-actin was obviously weakened, and it showed a significant difference compared with control group. The confocal microscopic observation showed that the outlines of F-actin of VSMCs were longer, and the fluorescence was weaker, and the fluorescence density was also weaker compared with control group. Conclusion: Ferulaic acid can inhibit F-actin formation of VSMCs.
[Key words] Ferulaic acid; Vascular smooth muscle cells; F-actin
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖及其向内膜下迁移是动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病的共同病理基础,在平滑肌细胞增殖和迁移过程中依赖于细胞骨架蛋白的改变[1]。阿魏酸(ferulaic acid,FA),化学名为4-羟基-3-甲氧基苯丙烯酸,是一种有机酚酸,是当归、阿魏、川芎、升麻、木贼等多种活血化瘀中药的有效成分之一,具有多种药理作用,动物实验表明FA具有拮抗动物VSMCs增殖的效应,对高血压病患者小动脉VSMCs具有抑制作用,可直接抑制VSMCs的黏附、迁移和游离Ca2+浓度升高,抑制其迁移[2-6],但目前仍少见其对血管平滑肌骨架蛋白的研究。本实验观察阿魏酸对动脉血管平滑肌骨架蛋白F-actin的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂
高糖DMEM、胎牛血清为Gibco公司产品,异硫酸氢荧光素-鬼笔环肽(FITC-phallodin)、RNA酶、牛血清清蛋白均为Sigma公司产品,碘化丙啶(prodidium iodide,PI)为Coulter公司产品。FA购于广东省药品检验所。
1.2 实验仪器
SP型激光共聚焦显微镜(Leika),ELITE ESP型流式细胞仪。
1.3 方法
1.3.1细胞培养兔主动脉平滑肌细胞(SMC)购于中国医学科学院细胞中心。SMC细胞培养于含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中,置37℃、5% CO2培养箱中培养。每周更换2次培养液,用0.25%-0.02% EDTA的胰酶消化传代培养。
1.3.2 倒置显微镜观察阿魏酸作用24 h后,在倒置显微镜下观察细胞。
1.3.3 激光共聚焦样品制备取出培养细胞爬片,用磷酸缓冲液(PBS)洗2遍,4%多聚甲醛溶液4℃固定过夜,用PBS轻洗2遍,0.2% Triton X-100室温下渗透10 min,再用PBS轻洗2遍,加入2 μg/ml RNA酶37℃作用30 min,用PBS轻洗2遍,1%牛血清清蛋白覆盖,室温作用20 min(不洗),5 μg/ml(PBS稀释)FITC-phallodin室温下避光染色35 min,PBS洗2遍后加入200 μl PI染液,室温避光染色30 min,甘油封片,上机观察。
1.3.4 流式样品制备取出24孔培养板,吸去上清,用PBS洗2遍,同激光共聚焦标本一样固定、渗透、洗涤、FITC-phallodin及PI染色,染色完毕后,吹打并吸出细胞悬液,加入PBS离心洗涤,弃上清,加入300 μl PBS重悬细胞,上机分析。
1.4 统计学处理
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析,P
2 结果
2.1阿魏酸对VSMCs细胞形态的影响
从倒置显微镜下观察,对照组的细胞呈多角形或短梭形,细胞多有板状突起。在加入阿魏酸24 h后,与对照组比较,阿魏酸0.1 mg/ml组与对照组接近;0.5 mg/ml组细胞多细长,呈梭形,少见分裂象细胞;1.0 mg/ml组细胞形态细长,未见分裂象细胞。见图1。
图1 阿魏酸对兔VSMCs形态的影响
(A.对照组;B.FA 0.1 mg/ml组;C.FA 0.5 mg/ml组;D.FA 1.0 mg/ml组)
2.2 阿魏酸对VSMCs细胞骨架的影响
2.2.1 流式细胞仪检测阿魏酸对VSMCs细胞骨架F-actin含量的影响在阿魏酸作用24 h后,与对照组比较,阿魏酸0.5 mg/ml和1.0 mg/ml组VSMCs细胞内F-actin的荧光强度明显减低,与对照组比较,有显著性差异(P
表1 阿魏酸对兔血管平滑肌细胞F-actin荧光强度的影响(x±s)
与对照组比较,*P
2.2.2 激光共聚焦观察阿魏酸对VSMCs细胞骨架F-actin的影响对照组可见较明显的F-actin存在,纵向平行排列,可见整齐的应力纤维丝,贯穿细胞长轴。在阿魏酸作用24 h后,0.1 mg/ml组细胞内F-actin未见明显变化;0.5 mg/ml组细胞内F-actin减少,应力纤维丝排列较散在;1.0 mg/ml组细胞内F-actin明显减少,或仅存在少许无规则、散在分布的F-actin。见图2。
3 讨论
真核细胞骨架由微丝、微管和中间丝组成。肌动蛋白(actin)是构成微丝的基本成分,以单体(G-actin)或聚合体(F-actin)形式存在,不仅出现在具有收缩能力的骨骼肌原纤维中,而且也出现在平滑肌细胞中。肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能,同时参与细胞增殖过程[7]。血管平滑肌细胞是血管壁的主要成分,其增殖及向内膜下迁移在动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等多种心血管疾病的病理过程中有重要作用[8-9],在此过程中依赖于细胞骨架蛋白的改变。研究证明,阿魏酸钠具有拮抗VSMCs增殖的效应,可直接抑制VSMCs的黏附、迁移和游离Ca2+浓度升高,抑制其迁移[10],但目前仍少见其对血管平滑肌骨架蛋白的研究。本试验观察阿魏酸对动脉血管平滑肌骨架蛋白F-actin的影响。通过对阿魏酸作用的VSMCs的直接观察和对其F-actin染色后的流式细胞术和激光共聚焦的观察,发现阿魏酸对VSMCs的形态有明显的影响,能使细胞形态变狭长、处于较稳定的分化形态,同时使肌动蛋白聚合体F-actin的形成和荧光强度明显降低,这些结果提示阿魏酸能抑制VSMCs F-actin的形成,这可能是阿魏酸抑制VSMCs增殖和迁移的途径之一。
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细胞骨架范文第8篇
[关键词]衰老； 血管老化； 细胞骨架；人参三七川芎提取物
[Abstract]To observe the effect of extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome on the cytoskeleton protein F-actin and G-actin of the replicative senescence vascular smooth muscle cells， with human aortic smooth muscle cells （HASMC） as the research object， and the replicative senescence 9th generation cells as the senescence models， the experiment was divided into youth group （5th generation cells）， model group （9th generation cells）， Chinese medicine low dose group （100 mg・L-1）， middle dose group （200 mg・L-1）， and high dose group （400 mg・L-1） and resveratrol group （10 μmol・L-1）. The intervention time was 48 h. β-Galactosidase specific staining method was used to calculate the ratio of blue dyeing cells. CCK-8 method was used to detect the cells proliferation. The flow cytometry was used to analyze the cell cycle. Immunofluorescent staining was used to observe morphological changes of F-actin and G-actin. The western blot assay was used to determine the expression of F-actin protein. Compared with the model group， the Chinese medicine groups and resveratrol group significantly reduced the number of blue dyeing cells， improved the ability of cells proliferation， reduced the number of cells in G0/G1 phase， increased the number of cells in S phase， and reduced the protein expression of F-actin and the formation of stress fibers， with obvious intervention effect and statistically significant difference. Therefore， the replicative senescence vascular smooth muscle cells can be used as the models for senescence research， with significant changes in morphology and protein expression of cytoskeleton protein F-actin and G-actin in the process of cells aging. The extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizome have obvious intervention effect on F-actin and G-actin， and it might be indirectly associated with delaying the aging of blood vessels.
[Key words]senescence； vascular aging； cytoskeleton； extracts of ginseng， notoginseng， and Chuanxiong Rhizoma
目前我国已进入老龄化社会，且形势十分严峻，预计到2050年，老龄化将达到峰值，65岁及以上人口将超过3亿，占总人口的20%以上[1]。衰老是疾病发生重要的决定性因素[2]，能够加速心血管疾病的其他危险因子。血管老化是人体衰老发生的关键因素，不仅导致动脉粥样硬化的发生，促进机体衰老的进程，而且可以诱发多种疾病[3]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）作为血管壁中膜的主要细胞成分，其表型转化及伴随出现的生物学行为改变是血管老化的重要病理学基础[4]。目前有研究表明，细胞骨架的动态改变是促使平滑肌细胞迁移、增殖及表型变化的重要细胞内信号[5]。肌动蛋白（actin）是细胞骨架微丝的主要成分，通常以单体（G-actin）或聚合体（F-actin）形式存在于细胞内，是研究 VSMCs中细胞骨架改变的重要检测指标，且其表达变化受细胞内相关信号因子的调控，如热休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、整合素蛋白和凝溶胶蛋白等[6]，其中HSP27调控作用最为肯定。
本课题组一直致力于益气活血中药延缓血管老化的研究，对增龄导致的生理性血管老化和高血压病导致的病理性血管老化进行了较系统的研究，同时，明确了益气活血中药延缓血管老化的一些关键作用机制，比如抗氧化应激、抗AngⅡ干预等，并明确了益气活血中药对血管老化的干预疗效。本研究以人主动脉平滑肌细胞骨架的微丝蛋白F-actin和G-actin为对象，观察益气活血中药人参三七川芎提取物对骨架蛋白F-actin和G-actin的干预作用，为进一步研究细胞骨架与血管老化的关系提供实验依据。
1材料
人主动脉平滑肌细胞HASMC（美国Sciencell公司，Cat No：6110，Lot No：7463）。
SMCM基础培养基（美国Sciencell公司）；胎牛血清（FBS，美国Sciencell公司）；生长因子（SMCGS，美国Sciencell公司）；双抗P/S Solution（美国Sciencell公司）；DPBS溶液（美国Sciencell公司）；细胞冻存液CFM（美国Sciencell公司）；胰酶/EDTA消化酶（美国Sciencell公司）；细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒（杰美基因医药上海科技有限公司）；细胞DNA含量检测试剂盒（细胞周期）（南京凯基生物科技发展有限公司）；CCK-8增殖试剂盒（上海东仁公司）；4%多聚甲醛（北京索莱宝公司）；Triton X-100穿透液（北京索莱宝公司）；罗丹明鬼笔环肽（美国Molecular Probes）；Alexa Flour 488（美国Molecular Probes）；二甲基亚砜（DMSO，北京索莱宝公司）；噻唑蓝MTT（北京索莱宝公司）；小鼠F-actin单克隆抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（上海碧云天生物技术公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术公司）；高效RIPA组织/细胞裂解液（北京索莱宝公司）。
人参、三七、川芎合剂冻干粉由北京因科瑞斯医药科技公司制备提供。药物均为道地药材，单味药成分检测符合药典的规定和标准，按3∶2∶4破碎成最粗粉，经乙醇回收提取，滤过，药渣弃去，醇提液回收乙醇至无醇味浓缩液，继续浓缩至稠膏，真空减压，干燥至干膏，粉碎装袋，每1 g冻干粉含生药4.286 g。中药冻干粉用PBS配制成贮存液，以0.22 μm滤器过滤并分装，质量浓度25 g・L-1，-20 ℃保存。白藜芦醇（中国食品药品检定研究院，批号111535-200502）用DMSO溶解并配制成贮存液，质量浓度50 g・L-1 ，4 ℃保存。
倒置相差显微镜及成像系统（德国Leica，型号4000B）；流式细胞仪（美国Beckmam，型号Cytomics FC500）；全自动酶标仪（美国Thermo，型号Multiskan MK3）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus，型号FV1000）；发光凝胶成像系统（SYNGENE，型号GeneGnome XRQ）。
2方法
2.1细胞培养及传代细胞培养一般隔天换液，待培养瓶细胞密度在90%以上时进行传代，弃去原培养基，用DPBS洗2次；加入1 mL DPBS与胰酶/EDTA混合液（比例为1∶4）；室温放置1.5 min，待细胞变圆时，轻敲瓶底，后加入2 mL完全培养基停止消化，用吸管进行吹打，收集细胞，1 000 r・min-1离心5 min，弃上清加入培养基2～3 mL吹悬，按照1∶2或1∶3传代培养。
2.2分组及药物浓度 实验分为6组，分别为青年组（5代细胞）、模型组（9代细胞）、中药低剂量组（100 mg・L-1）、中药中剂量组（200 mg・L-1）、中药高剂量组（400 mg・L-1）及白藜芦醇组（10 μmol・L-1），药物干预时间为48 h。
2.3β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色鉴定衰老的程度 β-半乳糖苷酶染色法是鉴定细胞衰老的重要指标[7]。将细胞以8×103个/孔接种于24孔板，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。实验前将GENMED染色液与GENMED稀释液以1∶20配制成工作液，混匀，置入37 ℃水浴箱预热。吸去原细胞培养基，加入500 μL/孔的GENMED清理液，并轻微摇晃24孔板；吸去清理液，加入500 μL/孔的GENMED固定液，室温孵育5 min；吸去固定液，加入500 μL/孔的GENMED酸性液，清洗细胞表面，并重复此操作一次；加入400 μL/孔预热的工作液，37 ℃孵育过夜，次日在光学显微镜下观察并计数，随机选取3个视野，计算蓝色细胞的数量占总视野细胞数量的比值。
2.4CCK-8检测细胞增殖能力将细胞以6×103个/孔接种于96孔板，每组设5个复孔，次日细胞贴壁后，实验组给予药物干预，作用时间为48 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入37 ℃培养箱中孵育2 h，上机检测，记录酶标仪所测定450 nm波长的吸光度（A）。
2.5流式细胞仪分析细胞周期常规进行细胞培养，实验组药物干预48 h，消化后离心并用DPBS洗涤2次，去除上清，每组加入70%冰乙醇1 mL吹悬固定，4 ℃保存过夜。次日离心后去除固定液，DPBS洗涤1次，离心去上清，每组加入100 μL RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI混匀染色，4 ℃冰箱避光放置30 min，后上机检测。
2.6激光共聚焦显微镜观察细胞F-actin和G-actin结构的改变将细胞以6×103个/孔接种于黑色96孔板，贴壁后，实验组药物干预48 h。吸去原培养基，用DPBS清洗细胞2次，加入4%多聚甲醛100 μL/孔，室温下固定15 min，再用DPBS清洗细胞5 min×3遍；加入0.1% Triton X-100 100 μL/孔，室温下穿透5 min，再用DPBS清洗5 min×3遍；最后加入罗丹明鬼笔环肽2.5 μL（0.5 U）/孔和Alexafluor488 DNase I 2 μL/孔共染色，避光室温放置30 min，再用DPBS清洗5 min×3遍，上机观察F-actin和G-actin的形态学改变。
2.7Western blot 检测F-actin蛋白的表达细胞样品中加入100 μL含蛋白酶抑制剂、PMSF的RIPA 裂解液，超声波破碎仪破碎10 s，4 ℃16 000×g离心10 min，按BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书对样品蛋白总浓度进行测定，加入样品1/4体积的5×Loading buffer，100 ℃加热10 min。进行电泳及转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，完成后用TBST洗膜3次，一抗稀释比例1∶250，4 ℃水平摇床孵育过夜。二抗用5%脱脂奶粉封闭液稀释，稀释比例1∶3 000，室温孵育60 min，TBST洗涤3×10 min。将膜平铺在干净的保鲜膜上，滴加配置好的ECL反应液反应2 min，曝光及扫描。
2.8统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计分析，其中计量数据以±s表示，多组样本采用单因素方差分析，用Levene法检验方差齐性，若方差齐，采用LSD法进行两两比较；若方差不齐，则采用Tamhane法。以P
3结果
3.1对SA-β-gal衰老染色的影响通过对各组染色结果的观察和计数，与青年组相比，模型组细胞蓝染数比例增多，具有显著性差异；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组细胞蓝染数比例均明显降低，均有显著性差异（图1，表1）。
3.2对细胞增殖能力的影响各组CCK-8细胞增殖能力的检测表明，与青年组相比，模型组A明显减少，具有显著性差异；与模型组相比，中药中剂量组A明显增加，具有显著性差异，中药低剂量组A增加，具有差异性，而中药高剂量组及白藜芦醇组A增加，但无统计学意义（表1）。
3.3对细胞周期的影响通过对各组流式细胞周期的检测表明，与青年组相比，模型组G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少，均有显著性差异；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞增多，具有显著性差异，中药低剂量组则无统计学意义；G2/M期细胞数目变化均无统计学意义（表2）。
A.青年组；B.模型组；C.中药低剂量组（100 mg・L-1）；D.中药中剂量组（200 mg・L-1）；E. 中药高剂量组（400 mg・L-1）；F.白藜芦醇组（10 μmol・L-1）（图2，3同）。
3.4对细胞F-actin和G-actin形态学的影响激光共聚焦显微镜显示，青年组细胞排列紧密，F-actin（红染）主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续；G-actin（绿染）主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润。模型组细胞体积变大，形态不规则，F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，形成大量应力纤维；G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱。模型组与青年组相比，F-actin/G-actin荧光强度比值增大，具有显著统计学差异。各给药组F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。与模型组相比，中药低、中剂量组及白藜芦醇组F-actin/G-actin荧光强度比值降低，具有统计学意义，中药高剂量组则无统计学意义（图2，表3）。
3.5对F-actin和HSP27蛋白表达的影响与青年组相比，模型组的F-actin蛋白表达明显增多，具有显著差异性；与模型组相比，中药中、高剂量组及白藜芦醇组F-actin蛋白表达减少，具有显著差异性；与青年组相比，模型组HSP27蛋白表达明显减少，具有显著差异性；与模型组相比，中药低、中、高剂量组及白藜芦醇组HSP27蛋白表达明显增多，具有显著差异性（图3，表3）。
4讨论
衰老是不可抗拒的自然规律，而血管衰老是人体衰老的关键始发因素[8]。 在血管老化的过程中，中膜平滑肌细胞高增殖、高移行、分泌性改变是内膜增厚、血管重构的关键因素。VSMC发生表型转化的过程中伴随着细胞骨架的重构，同时骨架重构又是VSMC由收缩型向合成型转化过程中细胞收缩能力下降、发生迁移和黏附等改变的病理生理基础[4]。肌动蛋白是构成细胞骨架微丝的基本成分，以单体G-actin或聚合体F-actin形式存在，肌动蛋白具有收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等多种功能，同时参与细胞增殖过程[9]。有研究表明，调节机体衰老的多条通路均与F-actin的改变密切相关，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路、胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF-1）通路和去乙酰化酶（SIRTS）通路等[10-12]。
气血是构成机体的基本物质，二者关系密切，随着衰老的进行，气虚血不行，血虚气不化，气虚血少，气血运行不畅，最终导致气虚血瘀之证，从而加速了机体衰老的进程。中药人参、三七、川芎合方属于益气活血治法的范畴，在心脑血管疾病中被广泛应用，三药合剂具有延缓血管衰老、保护血管内皮细胞及调节血管活性物质等作用[13-14]。白藜芦醇具有激活SIRT1通路、抗氧化、调节自噬及保持端粒酶活性等作用，是目前比较公认的延缓衰老的对照药物。
本研究以复制性衰老的血管平滑肌细胞为对象，以β-半乳糖苷酶染色、CCK-8细胞增殖活性和细胞周期作为判断细胞衰老程度的指标，并观察人参三七川芎提取物延缓细胞衰老的作用。实验结果表明衰老的细胞多停滞在细胞周期的G1期，S期细胞数量则减少，且体外增殖能力相对减弱，同时形态学表现出细胞扁平、胀大、颗粒增多的特征，并且在酸性环境下，细胞内β-半乳糖苷酶活性增加，表现为细胞蓝染数目增多。药物干预后，停滞在G1期的细胞数量减少，同时S期细胞数量增加，且β-半乳糖苷酶染色细胞蓝染数目减少，表明人参三七川芎提取物具有延缓血管平滑肌细胞衰老的作用。细胞骨架方面，青年组细胞微丝结构以单体G-actin为主，主要在细胞的中央区域分布，呈致密的椭圆形，染色清晰、饱满、圆润；聚合体F-actin主要在细胞表面及外周分布，线条完整连续。模型组G-actin向细胞周边区域伸展，部分出现边缘变模糊呈絮状，细胞中央区域染色变弱；F-actin边缘毛糙不规整，出现锯齿样断裂，部分呈纵向平行排列，且蛋白表达量增加，形成大量应力纤维。药物干预后，F-actin边缘较模型组清晰光滑，且较少断裂，蛋白表达量减少；G-actin则主要集中于细胞中间，染色略欠饱满，尚清晰圆润。而HSP27作为细胞骨架蛋白的主要调控因子，反向调节着F-actin的表达。
综上所述，复制性衰老的血管平滑肌细胞可以作为衰老研究的模型；细胞骨架微丝蛋白G-actin和 F-actin形态及蛋白表达在细胞衰老过程中改变明显，其可能直接参与平滑肌细胞由收缩型向合成型转化等衰老的进程；人参三七川芎提取物可以一定程度上延缓血管老化，且对于细胞G-actin和 F-actin有明显干预作用，其可能间接通过此作用延缓了血管老化的进程。
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细胞骨架范文第9篇
Differentiallyexpressionofgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingofperipheralbloodeosinophilsduringasthmaticattack
【Abstract】AIM:Todeterminethedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingofperipheralbloodeosinophils(EOS)inpatientsduringasthmaticattack.METHODS:DoublestrandedcDNAwasamplifiedfromtotalRNAofEOSatthetimeofasthmaticattackandafterimprovementrespectivelybySuperSMARTcDNASynthesistechology,Suppressionsubtractivehybridization(SSH)andPCRselectdifferentialscreeningtechnologywereusedtodetectdifferentiallyexpressedgenesandthendifferentiallyexpressedgenesweresequenced.HomologyanalysiswasconductedbycomparingthesegenesequencesbasedonGenBankdatabase.RESULTS:HighefficientlyupregulatedanddownregulatedsubtractivecDNAlibrarieswereconstructedsuccessfully;differentialscreeningandhomologyanalysisidentified6differentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodeling,includingslingshot2L(SSH2L),PP1catalyticsubunit,betaisoform(PP1Cβ),dedicatorofcytokinesis8(DOCK8),Homosapiensproteintyrosinephosphatasenonreceptortype6and12(PTPN6,PTPN12),myosinregulatorylightchaininteractingprotein(MIR).CONCLUSION:Thedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithcytoskeletalremodelingmayparticipateinexacerbationofasthma.Furtherstudyonthegenesfunctionmayprovidenewgenetargetforasthmatreatment.
【Keywords】suppressionsubtractivehybridization;asthma;eosinophils;cytoskeletalproteins
【摘要】目的：研究外周血嗜酸性粒细胞(EOS)在哮喘发作时与细胞骨架相关基因的差异表达.方法：应用SuperSMARTcDNAsynthesis技术从总RNA合成足量的双链cDNA.经液相杂交消减两组共同序列，以抑制性PCR方式扩增差异表达序列.构建上调与下调cDNA文库，菌落PCR扩增差异片段，应用差异筛选技术进一步鉴定差异表达基因并测序，结果通过核酸数据库进行同源性比较.结果：构建了高效的上调与下调消减cDNA文库，经鉴定及同源性分析有6个与细胞骨架重建有关，包括上调基因slingshot磷酸酶(SSH2L)，蛋白磷酸酶1β亚型(PP1Cβ)，无功能糖基转移酶样蛋白(DOCK8)，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型6(PTPN6)与非受体型12(PTPN12)；下调基因，肌凝蛋白调节轻链结合蛋白(MIR).结论：这些骨架重建相关基因的差异表达可能参与了哮喘发作，进一步进行功能研究可能为哮喘治疗提供新的作用靶点.
【关键词】抑制性消减杂交技术；哮喘；嗜酸细胞；细胞支架蛋白质类
0引言
哮喘是一种复杂的多基因遗传病，病理上是以伴随淋巴细胞与嗜酸性粒细胞（eosinophils,EOS）浸润为主的慢性炎症性疾病.有证据表明外周血EOS数目与哮喘的症状，一秒用力呼气量（Forcedexpiratoryvolumeinonesecond,FEV1）及气道反应性相关，尤其在持续性及重症哮喘，外周血EOS增多与持续性气流阻塞显著、独立相关［1-2］.细胞骨架重建在细胞黏附，伸展，运动及细胞内众多信号转导调控等过程中发挥重要作用［3］.哮喘患者外周血EOS已经被激活或活化，但其真正分子机制远未清楚，因此我们利用SSH技术研究哮喘患者在发作与缓解时外周血EOS与细胞骨架重建相关基因差异表达，探索其调控分子本质，为哮喘诊治提供帮助.
1材料和方法
1.1材料分离哮喘患者外周血EOS的Percoll试剂购自瑞典AmershamPharmacia公司；Trizol总RNA分离试剂购自美国Invitrogen公司；SuperSMARTcDNAsynthesis试剂盒及Chromaspin1000depc水纯化柱购自美国Clontech公司.DIG标记和检测试剂为Roche公司DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI；构建文库的cDNA来自哮喘患者治疗前与缓解时外周血EOS总RNA经SuperSMARTcDNAsynthesis技术合成［4］.
1.2方法
1.2.1抑制性消减杂交以治疗前后EOScDNA互为检测子(Tester)和驱动子(Driver).取纯化Tester及Driver的双链cDNA各2μg，分别用限制性内切酶RsaⅠ37℃酶切1.5h，酶切完全后鉴定酶切效率.SSH其他过程按照SSH试剂盒说明及参考文献［5］进行.
1.2.2差异基因片段分离将第二次PCR产物纯化并定量，混合1μL(100ng)及3μL(155ng)纯化后的PCR产物及1μLPBSTT载体(50mg/L)，在1μLT4DNA连接酶作用下，12℃连接16h.取2μL连接质粒与50μL感受态细胞DH5α混匀，用Cacl2将质粒导入大肠杆菌.取100μL转化菌液均匀涂布于Xgal,IPTG的氨苄青酶素琼脂培养板上，37℃过夜培养.随机挑取100株白斑菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，置37培养箱中，250r/min振摇过夜，重复实验直至获得250株转化菌.
1.2.3目的基因片段的获取转化菌株进一步分别以接头1和接头2R的内、外侧序列为引物，进行菌落PCR扩增，参数：94℃30s,68℃30s,72℃2min,20循环后电泳分析.
1.2.4差异筛选鉴定差异表达基因采用PCRselect差异筛选技术对目的片段进行杂交鉴定.实验步骤严格按照DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI试剂盒说明书进行.
1.2.5测序及同源性分析进一步用巢式PCR确认质粒内差异片段，然后纯化质粒，测序由上海博亚公司协助完成，编码序列提交美国国立医学图书馆GenBank数据库进行同源性比较.
2结果
2.1酶切及连接效率酶切后经1.5g/L琼脂糖/EB凝胶电泳分析，表现为平均大小在0.1~2.0kb之间的条带，说明cDNA酶切较完全.接头序列引物与G3PDH3’引物扩增产物的灰度值较G3PDH5’,3’引物所得产物的灰度值比值大于50%，说明连接效率较高.
2.2消减杂交效率用G3PDH基因特异性引物分别扩增两次消减杂交前后的cDNA产物(图1)，经消减杂交的cDNA33循环可见扩增产物，而未消减在18循环就可见，说明杂交效率较高.
2.3目的基因片段的电泳以转化菌株重组质粒为模板行PCR扩增目的基因片段，结果采用1.5g/L琼脂糖凝胶电泳分析，显示目的基因片段分子质量分布范围均在200~800bp，250个菌株扩增获得阳性目的基因片段228个，阳性率达91.2%.
M:1000bpDNAMarker；1,5:18循环；2,6:23循环；3,7:28循环；4,8:33循环.
图1消减杂交效率分析（略）
M:1000bpDNAMarker；1,5:18循环；2,6:23循环；3,7:28循环；4,8:33循环.
图2目的基因片段的电泳分析（略）
2.4序列分析及同源性对确定的12个阳性克隆测序后，通过BLAST进行同源性比较，经查阅文献共确定6个与细胞骨架重建相关的基因，分别为上调基因SSH2L,PPP1Cβ,DOCK8,PTPN6及PTPN12；下调基因MIR(表1).
表1哮喘治疗前后EOS差异cDNA克隆同源性比较（略）
P:上调表达基因；R:下调表达基因.
2.5消减cDNA文库的筛选采用PCRselect差异筛选技术对72个目的基因(包括45个上调表达克隆与27个下调表达克隆)进行进一步鉴定，根据Clontech公司提供的参考标准确定真正差异表达克隆.
3讨论
哮喘的发作和分子病理学过程是由于多种类型细胞特异性基因的表达变化决定的，对常见疾病哮喘进行基因表达的分析，可帮助寻找疾病诊断与疗效判断的分子靶点.本研究应用SuperSMARTcDNAsynthesis技术与SSH技术，经测序、同源性比对及文献查询，初步证实了6条在哮喘发作期与EOS细胞骨架重建相关基因差异表达.
细胞骨架在物质运输、白细胞的迁移及基因表达等方面起着重要作用.肌动蛋白结合蛋白(ADP/confilins)家族是影响肌丝重建的关键因素.高度活化的cofilins促进细胞产生片足及可决定细胞运动方向［6］.EOS从外周血向肺组织迁移是过敏性哮喘的重要特点，EOS迁移也依赖于细胞骨架的调节.
我们的初步研究结果提示：
①上调基因SSH2L属于酪氨酸磷酸酶亚类之一，SSH在cofilins去磷酸化上发挥关键作用［7］.本研究SSH2L在EOS表达升高，可加快EOS内肌动蛋白快速组装，促进细胞迁移，趋化，跨膜运动，可能是EOS内重要的分子调控机制.
②下调基因MIR可以被多种因素所调节，MIR可以通过泛素化作用降低肌球蛋白轻链(myosinlightchain,MLC)功能，其在EOS表达的下调可能使其抑制肌球蛋白功能作用下降，从而促进马达蛋白活性，可能参与EOS的趋化调节.
③蛋白磷酸酶1(PP1)参与调控糖代谢，基因表达，细胞分化等.果蝇PP1β可以调节非肌细胞肌球蛋白，如果缺失PP1β功能会导致MLC磷酸化水平升高及肌动蛋白结构破坏［8］.PP1β在EOS表达的增高可能通过cofilin，肌球蛋白及微管等途径引起细胞骨架重建.
④DOCk8是一种潜在的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),GEF可以激活某些小分子鸟苷三磷酸酶.DOCK8参与细胞内具体作用机制尚不清楚，可能通过介导Rho激酶家族某一成员参与协调细胞骨架运动.
⑤蛋白酪氨酸磷酸酶（proteintyrosinephosphatase,PTPase）是一个多基因家族，主要分为受体和非受体样PTPase两类，PTPase参与多种激素（如胰岛素等）介导的信号转导、细胞增殖和促进MHCI类抗原表达.PTPN6属于PTPase家族成员之一，主要在血细胞发育，增生及受体介导的丝裂原信号转导通路发挥作用.
⑥PTPN12也是PTPase家族成员之一，PTPN12可以参与蛋白与蛋白相互作用，与细胞内蛋白半衰期有关，可以去磷酸化众多细胞骨架蛋白及细胞粘附分子，参与控制细胞的形态及运动［9］.
【参考文献】
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细胞骨架范文第10篇
【Abstract】 AIM: To observe the changes of the cell cycle and cytoskeleton of rat calvarial osteoblasts after stimulated by recombinant human growth hormone (rhgh ). METHODS: Osteoblastic cells from rats were incubated in the medium supplemented wiht rhgh at different doses (10, 200 μg/L), and then the changes of cytoskeleton and cell cycle were detected. RESULTS: Quantitative analysis showed that osteoblasts were arrested in S phase and G2/M phase, however, green fluorescent density and red fluorescent density (nuclei) were not significantly changed. The filamentous Factin distributed in bunches and was stained strongly and evenly. The outline of nucleus was clear. CONCLUSION: Rhgh exerts a direct anabolic effect on osteoblasts, but no obvious effect on cytoskeleton of rat osteoblasts.
【Keywords】 osteoblasts; recombinant human growth hormone; cell cycle; cytoskeleton
【摘要】目的： 观察重组人生长激素（rhgh ）对体外成骨细胞（OB）细胞周期及细胞骨架Factin的影响. 方法：用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素加入大鼠OB培养体系，观察对大鼠OB的细胞周期及细胞骨架的影响. 结果： 定量分析表明，在rhgh 作用下，成骨细胞S期、G2/M期细胞百分比增加,OB的绿色荧光强度、红色荧光强度无显著变化. Factin纤维呈束状平行排列，荧光染色强，分布均匀. 结论：重组人生长激素对OB的合成代谢有直接影响,但对细胞骨架无显著影响.
【关键词】 成骨细胞；重组人生长激素；细胞周期;细胞骨架
口腔颌骨、牙槽骨骨量丢失是影响牙齿留存、义齿及种植体修复效果的重要因素. 骨质疏松症(osteoporosis, OP）患者的颌骨具有不同程度的骨量丧失,OP与牙齿脱落之间也有密切的相关性［1］. 生长激素在人体生长发育中起着重要的作用，能促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，促进内脏、骨骼和全身生长. 基因重组人生长激素（recombinant human growth hormone, rhgh ）与人体生长激素具有同等的作用. rhgh 影响骨代谢的作用机制一般有直接和间接两种方式. 直接方式是指rhgh通过成骨细胞（osteoblast, OB）的相关受体发挥作用［2］；间接方式是可以通过促进胰岛素样生长因子(IGFI)的合成促进骨形成［3］. 我们观察不同浓度的rhgh 对体外培养OB细胞周期及细胞骨架的影响，以期对颌骨骨质疏松的防治提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料rhgh(长春金赛药业有限责任公司）；出生2 d的SD大鼠（第四军医大学实验动物研究中心）；FITC标记的鬼笔环肽（Phalloidin）（Sigma） ；碘化丙啶（PI）（Sigma）; Triton X100(华美生物工程公司)；流式细胞仪（美国）；激光共聚焦显微镜 BioRad MRC1024 （美国）.
1.2方法
1.2.1大鼠颅骨OB的体外培养取出生2 d的SD大鼠，弯剪断头，将头部浸入PBS培养液中分离颅盖骨. 将分离好的颅盖骨在含血清的DMEM的培养液中剪碎，大小约为1 mm3. 用眼科镊将组织块接种于25 mL培养瓶的底部并用探针均匀拨开，每瓶接种约20～30块. 将培养瓶底部向上加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，盖好瓶盖后再松半圈，放入CO2孵箱中，37℃ 500 mL/L CO2孵育2 h，然后翻转使瓶底朝下,以后每3 d换液1 次,待细胞铺满培养瓶时,以2.5 g/L胰蛋白酶消化,并传代培养,所用实验细胞均为第6代细胞.
1.2.2OB的鉴定免疫组化检测细胞I型胶原的表达阳性，重氮盐法检测细胞具有碱性磷酸酶活性，四环素荧光染色法检测细胞具有矿化能力，提示实验原代培养细胞为OB.
1.2.3实验分组① 空白对照组用基础培养基；② 实验组培养基中含有重组人生长激素，浓度为10和200 μg/L.
1.3观察指标
1.3.1OB细胞周期的测定将培养的细胞经胰蛋白酶消化、混匀后，以5×107/L的密度接种于6孔板中，培养24 h，再每两孔分别换用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素培养液和基础培养液，继续培养48 h, 2.5 g/L胰蛋白酶消化收集各组细胞. 加入PI染料，4℃染色30 min，上机流式细胞术（FCM），联机专用软件进行处理. 同样步骤重复测定3次.
1.3.2OB细胞骨架的激光共聚焦显微镜（laser confocal scaning microscope, LSCM）观察① 将含有不同浓度重组人生长激素的OB悬液接种于内含多聚赖氨酸包被的盖玻片的培养板中，置于孵箱中，使细胞贴壁并均匀铺于盖玻片上. 对照组和不同浓度的实验组各制备6块细胞爬片. ② 取出细胞爬片，PBS轻洗1遍，950 mL/L乙醇固定30 min. 2 mL/L Triton X100室温下渗透10 min，PBS轻洗1遍. 5 mL/L牛血清蛋白（BSA）37℃孵育10 min，以封闭非特异性抗原，PBS轻洗1遍. 50 mg/L（PBS稀释）FITC鬼笔环肽室温下染色30~40 min，PBS清洗2遍. 加入5 mg/L碘化丙啶（PI），染色8~10 min，PBS轻洗2遍，缓冲甘油封片. 上述过程均需避光操作. ③ 通过LSCM 观察OB微丝结构. 选用可见光激光光源，可输出488，514 nm波长激光，LSCM对细胞的扫描参数均为PMT1：Iris,1.2; Gain,1105; offset,0. PMT2: Iris,6.4; Gain,1052;offset,0. 计算机采集和保存图像. 应用Lasersharp图像处理软件，随机测量爬片上的OB荧光强度，进行定量分析.
统计学处理： 计量数据用x±s表示. 用SPSS12.0 for Windows软件进行方差分析（analysis of variance, ANOVA），多个样本均数两两比较（multiple comparison）用SNKq检验.
2结果
2.1OB细胞周期的测定细胞周期可分为间期和M期两个阶段. 细胞中多数细胞处于间期. 在间期中，包括DNA合成期（S期)，S期DNA含量将加倍. S期荧光强度占受测细胞总荧光强度的百分数为S期分数. FCM检测OB表明, 在10和200 μg/L重组人生长激素作用以后, OB细胞周期发生了改变, S期细胞百分比高于空白对照组，差异有统计学意义,两实验组间无统计学意义（P>0.05）.表1OB细胞周期定量分析
2.2OB细胞骨架的改变鬼笔环肽仅与Factin结合,与微丝有强亲和作用. 细胞图像中由FITCPhalloidin标记的Factin呈绿色荧光，主要见于胞质中(图1)；PI标记的核酸呈红色荧光，主要分布于胞核中(图2);两者重叠处为黄色(图3). 激光共聚焦显微镜观察在不同浓度的rhgh作用下，OB绿色荧光密度及红色荧光密度与对照组相比无统计学意义. 实验组间比较也无统计学意义（P>0.05）（表2）.表2成骨细胞荧光强度定量分析结果
3讨论
传统的治疗骨质疏松药物如雌激素、降钙素等都是通过降低骨转换、抑制破骨细胞性骨吸收而发挥作用，可以阻止患者骨量进一步丢失，但不能恢复已经丢失的骨量和退变的骨结构［4］. 人体生长激素的分泌量随着衰老而递减，特别是妇女绝经后rhgh 的分泌量将明显下降. rhgh具有刺激骨形成的作用，有可能成为一种新的能够防止骨丢失的药物. 国外临床实验表明对生长激素缺乏的患者，注射重组人生长激素1 a后，可以提高患者腰椎的骨矿物质密度［5］. 体外研究也显示，重组人生长激素对大鼠的OB增殖和碱性磷酸酶活性具有显著影响［6］.
本结果表明，重组人生长激素改变了OB细胞周期, 提高了细胞的S 期百分比，表明OB的DNA 合成速度增高, 细胞增殖加速. 同时，本实验采用激光共聚焦显微镜扫描成像系统结合FITCphalloidin标记的Factin, PI标记核酸的荧光探针双重标记技术对OB的细胞骨架进行形态观察，结果显示在不同浓度的重组人生长激素作用下OB的细胞骨架并未发生显著改变 . 细胞骨架系统是细胞质内的一种纤维状蛋白基质，包括微管、微丝、中等纤维和微梁网格等. 细胞骨架参与细胞运动、分裂分化、细胞内物质运输以及跨膜信息传递等多种功能［7-8］. 完整的细胞骨架是细胞内源性信使协调作用的基础，而微丝则是参与介导细胞变形及运动等重要生理活动的蛋白. Factin是微丝的主要成分，参与细胞形态维持、细胞正常结构等多种功能，其结构重排及聚合和解聚的变化，在一定程度上反映了细胞的功能状况. 细胞骨架的改变是细胞凋亡的一个重要标志［9］. 实验观察到在不同浓度的重组人生长激素作用下OB的细胞骨架Factin纤维呈束状平行排列，荧光染色强，分布均匀；细胞体中央可见椭圆形红染的细胞核. 定量分析也证明绿色荧光强度和红色荧光强度并无显著差异，说明Factin在重组人生长激素作用下并未发生明显改变.
本结果表明, 在所用的实验条件下,重组人生长激素能促进OB的DNA 合成速度增高, 使细胞增殖加速；同时并未引起细胞骨架改变而引起细胞凋亡. 在细胞学水平上为国产rhgh治疗骨质疏松疾病、防止口腔骨量丢失，促进口腔保健提供了一定的实验参考.
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