时间：2023-03-20 02:11:27
摘要：目的制定柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量测定方法。方法用高效液相色谱蒸发光散射检测法（HPLCELSD）,AlltimaC18色谱柱,流动相甲醇水（80∶20）,速度0.8ml・min1；蒸发光散射检测器参数：漂移管温度40℃，气压3.5bar。结果柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分别在1.908~19.08μg（r=0.9996）和1.804~18.04μg（r=0.9992）范围内线性关系良好,平均回收率分别为98.35%（RSD=1.26%）和97.64%（RSD=1.58%）。结论该方法简便、灵敏、可靠、准确、重现性好,可作为柴胡药材的质量控制方法。
关键词：柴胡；高效液相色谱蒸发光散射检测法；柴胡皂苷
DeterminationofSaikosaponina,dinRadixBupleuribyHPLCELSD
Abstract：ObjectiveTodeterminesaikosaponina,dinRadixBupleuribyHPLCELSD.MethodsHPLCELSDwasusedinthequantitativeanalysisbyusingAlltimaC18chromatographycolumnandmethanolwater(80∶20)asamobilephase.Theflowrateofmobilephasewas0.8ml・min1.Thetubetemperatureofthedetectorwas40℃.Thepressofpureairwas3.5bar.ResultsThelinearrangesforsaikosaponinaanddwere1.908~19.08μg（r=0.9996）and1.804~18.04μg（r=0.9992）,theaveragerecoverieswere98.35%(RSD=1.26%)and97.64%(RSD=1.58%),respectively.ConclusionThismethodiseasy,sensitive,reliable,accurate,reproducibleandcanbeusedasthequalitycontrolmethodofRadixBupleuri.
Keywords：RadixBupleuri;HPLCELSD;Saikosaponin
柴胡药材来源于伞形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狭叶柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根。为常用中药,在我国已有2000多年药用历史,具有和解表里、疏肝、升阳之功效［1］。其主要有效成分为柴胡皂苷,其中柴胡皂苷a，d的活性较强,具有抗炎、保肝、降低血中胆固醇等药理活性［2］。应用高效液相色谱法测定柴胡皂苷a，d含量的报道较多［3，4］。但由于检测波长在210nm,杂质峰干扰十分严重,检测灵敏度低,影响了含量测定的准确性。本文应用HPLCELSD法同时测定柴胡皂苷a，d的含量,其杂质峰干扰小,分离度好,灵敏度高,出峰时间短,便于操作。
1仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent1100系统，SEDEX75型蒸发光散射检测器；超声波清洗机（中国华南超声波设备厂），工作频率25kHz，功率250w。柴胡皂苷a，d对照品购自中国药品生物制品检定所，含量测定用,批号分别为110777200303和110778200402；甲醇为色谱纯（CALEDONLABORATORIESLSD.），水为重蒸水，其它试剂均为分析纯；柴胡药材经鉴定为柴胡BupleurumchinenseDC.的根。
2方法与结果
2.1色谱条件色谱柱为AlltimaC18(250mm×4.6mm,5μm);流动相：甲醇水（80∶20）；速度0.8ml・min1，柱温25℃；检测器参数：漂移管温度40℃，气压3.5bar。在选定的条件下，柴胡皂苷a、d对照品与样品中其它组分色谱峰可基线分离，峰形好。按柴胡皂苷d峰计算，理论板数为3000以上。柴胡皂苷a，d对照品，供试品的高效液相色谱图见图1。
1.柴胡皂苷a2.柴胡皂苷da供试品图谱b对照品图谱
图1高效液相色谱图（略）
2.2对照品溶液的制备精密称取柴胡皂苷a9.54mg和柴胡皂苷d9.02mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。
2.3供试品溶液的制备取柴胡药材粉末（过60目筛）约1g，精密称定，置25ml量瓶中，加入5%氨水甲醇20ml，超声处理40min，放置至室温，加5%氨水甲醇至刻度，摇匀，静置，精密吸取上清液20ml置蒸发皿中，水浴蒸干，加甲醇溶解，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.4线性关系考察分别精密吸取柴胡皂苷a和d的混合对照品溶液2，5，10，15，20μl注入高效液相色谱仪中，分别测定柴胡皂苷a和d的峰面积。以峰面积自然对数值为纵坐标，进样量的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线。柴胡皂苷a在1.908~19.08μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=5.89721.5336X，r=0.9996；柴胡皂苷d在1.804~18.04μg范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=5.86191.4965X，r=0.9992。
2.5精密度实验精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样5次，测定峰面积，结果柴胡皂苷a和d的RSD分别为1.18%和1.53%，表明仪器的精密度良好。
2.6稳定性实验取样品溶液,按含量测定方法及色谱条件分别置0，2，4，6,8h测定，结果柴胡皂苷a和d的RSD分别为1.29%和1.68%，表明样品溶液在8h内稳定。
2.7重复性实验精密称取同批号样品6份，按含量测定方法及色谱条件进行测定，结果样品中柴胡皂苷a和d的平均含量分别为11.4541，8.3612mg・g1，RSD分别为1.34%和1.82%。
2.8回收率实验采用加样回收法，，取已知柴胡皂苷a，d含量的样品6份，每份约0.5g，精密称定，分别加入柴胡皂苷a对照品6.0544mg和柴胡皂苷d对照品4.4621mg，按含量测定方法及色谱条件进行测定，结果柴胡皂苷a和d的平均回收率分别为98.35%（RSD=1.26%）和97.64%（RSD=1.58%）。
2.9样品测定取不同批号的药材，按上述供试液的制备方法制备供试液。精密吸取对照品溶液5，20μl及供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，按外标两点法测定柴胡皂苷a，d含量，结果见表1。
3讨论
3.1柴胡皂苷a，d为柴胡的主要有效成分,但在提取过程中其结构易发生变化,因此，严格控制提取条件十分重要。本实验比较了甲醇、5%吡啶甲醇、5%氨水甲醇的提取效果。结果表明，5%氨水甲醇溶液超声提取效果最佳。
表1样品含量测定结果（略）
3.2采用5%氨水甲醇溶液超声处理，分别测定了不同提取时间（20，30，40，50min）样品中柴胡皂苷a，d的含量，结果在40～50min内样品中柴胡皂苷a、d的含量基本不变。故文中采用超声40min的方法。
3.3本文采用HPLCELSD法测定柴胡中柴胡皂苷a，d的含量,较采用紫外检测器检测,能明显减少杂质峰的干扰,峰形好,出峰时间短,有利于提高检测的准确度和工作效率。
参考文献：
［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：198.
［2］张本.柴胡属植物药理作用研究概况［J］.吉林中医药，1983，3(1):39.
［3］王鹏，贾凌云，孙启时，等.不同产地柴胡中柴胡皂苷的含量测定［J］.沈阳药科大学学报，2004，21(3):193.
高效液相色谱技术概述
在色谱法中，高效液相色谱技术是重要分支，使用的流动相为液体，能够利用高压输液系统将流动相泵入色谱柱。而色谱柱内装有固定相，能用于进行不同极性单一溶剂、缓冲液和不同比例混合溶剂的分离，并将分离得到的各成分送入检测器，以实现试样分析。作为在农学、化学和商检等多个领域得到应用的重要分离分析技术，该技术具有较低检测限度，并且灵敏度较高，因此能够在食品检测中得到运用。
高效液相色谱技术在食品检测中的运用分析
在营养成分检测中的运用。在食品检测中，高效液相色谱技术可用于检测营养成分。在食品中的糖含量检测上，运用该技术能够完成多种糖的测定，比如酒类糖分和果聚糖异构体等。在脂肪酸检测方面，运用该方法能够对二十碳五烯酸等脂肪酸物质进行检测，从而为食品的加工、贮存和配比提供科学依据。而蛋白质具有相对分子量大和易发生变性等特点，以至于难以实现分离分析。运用高效液相色谱技术，则可以完成蛋白质和氨基酸分离，所以能够对这些营养成分进行灵敏测定。在食品保鲜方面，有机酸发挥着防腐的作用，同时也是食品鲜味和酸味的组成成分之一。运用高效液相色谱法进行检测，可利用反向C18柱完成有机酸分离，然后利用紫外吸收检测器等设备进行乳酸、柠檬酸和苹果酸等物质的检测。此外，在维生素检测上，可运用高效液相色谱法进行保健食品中多种水溶性维生素的检测。
在添加剂检测中的运用。在食品加工过程中，一般都要使用添加剂进行食品色、香、味得到改进，并对食品进行保鲜。而添加剂为人工合成或天然的物质，可以划分为甜味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂等。但是，人工合成的添加剂具有一定毒性，需限制其使用，所以还要进行食品中添加剂含量的检测。在甜味剂检测方面，运用高效液相色谱技术使用的色谱柱通常为C18柱、-NH2柱和阴离子交换柱，使用的检测器包含电导检测器和紫外-可见光检测器，可完成甜蜜素、糖精钠、安赛蜜和甜味素等多种甜味剂的测定。在防腐剂检测方面，可使用R高效液相色谱法进行脱氢乙酸、BA和对羟基苯甲酸乙酯等防腐剂的测定，具有准确、灵敏和操作简便的特点。在色素检测方面，联合使用高效液相色谱技术和紫外-可见光检测器，并使用C18柱分离的梯度洗脱系统，可完成胭脂红、亮蓝、柠檬黄和日落黄等多种色素的测定。在抗氧化剂检测方面，运用R高效液相色谱法能够完成油脂中的9种抗氧化剂的同时测定，最低检测浓度可以达到2mg/kg。另外，运用高效液相色谱法进行BHA、PG、BHT等物质的分离，可分别达到84%、95%和99%的样品回收率。运用高效液相色谱法检测食品中的增白剂，可使用阴离子柱进行亚硫酸盐的分离，最低检出限能够达到0.2μg/kg。
在有毒有害物质检测中的运用。在食品中，可能含有多种有毒有害物质，如农药兽药残留和霉菌毒素等。如果误食含有霉菌毒素的食品，可能导致人出现急性或慢性中毒现象，甚至引发人体细胞癌变。运用高效液相色谱法，可进行食品中霉菌毒素的检测。从原理上来看，利用该方法能够结合不同微生物的化学组成或代谢产物进行样品中各种细菌的分析，以确定病原微生物的特异性化学组分，进而判定食品是否存在微生物超标问题。比如，在黄曲霉毒素检测方面，运用高效液相色谱法和质谱法进行食品检测，最低检测限可达0.02μg/kg，回收率则在77%-102%范围内。在农兽药残留检测方面，运用高效液相色谱法可完成热稳定性差和沸点高的农药残留检测，使用的色谱柱通常为C18或C8，联合使用的检测器包含荧光检测器、紫外检测器等。比如，联合使用高效液相色谱法和紫外检测器，可完成除虫脲、氟苯脲等蔬菜中苯甲酰脲类农药残留量的测定。此外，还可以利用高效液相色谱法与质谱法完成水果、蔬菜等多种食品中四溴菊酯残留检测。在兽药检测方面，联合使用高效液相色谱法和质谱法，则能完成多种磺胺类药物残留的测定，检出限在1.0-4.5μg/L的范围内，回收率在92%-100%之间，具有准确、方便和快速等检测优势。
通过分析可以发现，由于具有检测灵敏度高、分离效能高和分析速度快等优点，高效液相色谱法在食品营养成分、添加剂和有毒有害物质检测等方面得到了广泛应用，所以能够为食品安全提供更多保障。而相信随着该项技术的不断发展，其未来也将在食品检测领域获得更好的发展前景。
【关键词】高效液相色谱分析；食品检测；应用
1.HPLC在食品添加剂领域的应用
1.1食品甜味剂的检测
甜味剂是指能够赋予食品甜味的食品添加剂。按其营养价值可分为营养型与非营养型甜味剂，通常所讲的甜味剂系指人工合成的非营养型甜味剂，如糖精钠、环己氨基磺酸钠(甜蜜素)、乙酰磺胺酸钾(安塞蜜)和天冬酰苯丙氨甲酯(甜味素和阿斯巴甜)等。目前，糖精钠价格低廉，应用广泛，但过量添加会损害人的健康。采用液相色谱-气相色谱联用技术， SpherigelC18色谱柱，电喷雾负离子采集模式，甲醇-甲酸-三乙胺缓冲盐梯度洗脱，定量测定果冻等食品中安赛蜜、糖精钠和甜蜜素含量，结果加样回收率为93.19%～100.90%，相关标准偏差(RSD)为1.05%～2.04%。该方法选择性好，定性定量准确，分析时间短，同时也适用于饮料等其他食品的定性定量检测。
用高效液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)测定食品中的糖精钠，最低检出限在0.005～0.200mg/ml，与高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)相比较，HPLC-FLD法重现性好，准确度更高，由于FLD的选择性响应，降低了对色谱柱的性能要求，更适合复杂样品的快速分析，使其具有比UV法更高的可靠性，是一种较为理想的糖精钠检测方法。
1.2食品防腐剂的检测
常用的防腐剂有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钠盐等，因其具有毒性小的特点，故国标法中允许一部分食品中加入少量的防腐剂。但防腐剂的富集对人体机能会产生一定的影响，所以食品中防腐剂含量的测定显得非常重要。
利用HPLC测定含乳饮料中苯甲酸的含量。用Zn(Ac)2和KFe(CN)3溶液作为沉淀剂进行样品的预处理，磷酸盐缓冲液和甲醇混合溶液为流动相，C18色谱柱，于波长225nm处紫外检测，方法简单快速、灵敏度高，既适用于大部分含乳饮料，也适用于纯牛奶的测定。苏爱梅采用加沉淀剂沉淀法对火腿肠样品进行预处理，过滤后用RP-HPLC法测定火腿肠中防腐剂苯甲酸和山梨酸的含量。色谱柱为Symetry-C18，以0.02mol/L乙酸铵-甲醇(97∶3)为流动相，检测波长为230nm。苯甲酸和山梨酸浓度在0～0.05g/L范围内线性很好(r=0.9996)；山梨酸最低检出限为0.024g/L，平均回收率为100.4%，RSD为0.68%。
1.3食品色素的检测
目前已经公认人工合成食用色素应逐步限制使用，但值得注意的是，在我国至今仍有少数不法商人，超标准使用人工合成食用色素，甚至利用不能用作食品添加剂的染料，严重地危害了人们的健康。采用HPLC法测定保健食品黄金搭档包衣片中食用合成色素，样品前处理用粉碎提取法和漂洗法，聚酰胺吸附纯化LichrospherC18柱，甲醇-乙酸铵流动相梯度洗脱，单波长或多波长测定柠檬黄、靛蓝和诱惑红3种色素。其线性范围宽(0～100g/ml)，回收率高(91.3%～103.1%)，重现性好(RSD=2.11%～5.63%)，最低检出限为2～11ng。其中，尤以粉碎提取法，梯度洗脱，多波长检测效果更佳。
2.HPLC在食品营养成分领域的应用
2.1碳水化合物的检测
对于碳水化合物的测定，HPLC法操作简便，灵敏度高，可同时测定各种糖，国际上已将HPLC法作为酒类糖分含量测定的仲裁法。
2.2氨基酸的检测
氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元，准确灵敏地测定食物中氨基酸的含量具有十分重要的意义。目前，柱前衍生化高效液相色谱法以其灵活和易于推广的特点。
采用邻苯二甲醛(OPA)-9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)进行氨基酸柱前衍生，RP-HPLC法测定氨基酸含量。3个不同浓度梯度的氨基酸标准溶液线性关系良好，样品保留时间绝对误差小于0.1min，重现性RSD值低于4%，加标回收率均在90%～110%。
2.3脂肪酸的检测
脂肪酸是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是有机物。饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸和三脂酰苷油磷脂卵磷脂等，对人体的健康起到了重要的作用。用HPLC法与基质辅助激光解吸电离飞行时间技术联用，分析蛋黄中磷脂粗提物。将从蛋黄中提取的多种磷脂通过HPLC预先分离，收集各组分后分别进行MALDI-TOF-MS分析得到比较清晰的质谱图。选用RP-HPLC与电容耦合非接触电导检测(C4D)结合的方法分离测定肉蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸与亚油酸5种未衍生化长链脂肪酸，采用HypersilODSC18色谱柱，以甲醇-1mmol/L醋酸钠(78∶22，V/V)为流动相，结果表明，硬脂酸在5～200μg/ml范围内与峰面积线性关系良好，其他4种酸线性范围为2～200μg/ml。将此种方法用于检测南瓜、大豆、米糠及棕榈油中脂肪酸，与标准气相色谱检测方法相比，简单、快速、灵敏度高。
3.HPLC在食品污染物领域的应用
3.1食品农药、兽药残留的检测
农药残留是由于使用农药而导致的在食品、农产品或动物饲料中残留的一定物质，国家相关标准都有明确的药物最大残留量，超过其值有可能对人体造成危害。运用HPLC柱后衍生荧光检测法，测定苹果、梨、桃、葡萄、香蕉和芒果等水果样品中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威和甲萘威7种氨基甲酸酯类农药的残留量，结果7种农药3种不同浓度平均添加回收率在72.5%～116.2%，最低检出限为0.0037～0.0074mg/kg。
3.2食品中其他来源化学污染物的检测
环境污染物以及在工业生产中所产生的有毒有害化学物，如包装材料等均可通过植物或动物进入食物链，并引起人类的疾病或健康问题。
3.3食品中霉菌毒素的检测
食品中存在多种霉菌毒素，主要的霉菌毒素有黄曲霉毒素、镰刀菌毒素和玉米赤霉烯酮等。粮食及食品由于霉变不仅会造成经济损失，有些还会造成误食人畜急性或慢性中毒，甚至导致癌症。
4.小结
目前在食品安全检测高标准的情况下，HPLC分析技术以其分辨率、灵敏度及定量精度高等特点，已被广泛应用于食品检测领域。现今科学技术日益更新，高效液相色谱仪器也在不断地更新发展，并且与各种检测技术的联用越来越普遍，包括液相色谱(LC)和质谱仪(MS)及核磁共振谱仪的集成(LC-MS-NMR)、气相色谱-液相色谱联用(GC-HPLC)、固相微萃取-液相色谱联用(SPME-HPLC)、聚焦微波辅助萃取-液相色谱联用(FAME-HPLC)，大大拓宽了HPLC的应用范围，提高了检测水平，在今后HPLC也会有更广阔的发展空间。
【参考文献】
1仪器与材料
美国waters2695高效液相色谱仪，VWD检测器；鬼针草采自云南红河州、广西，经刘圆副教授和戴斌教授鉴定为菊科鬼针草属植物狼杷草BidenstriparticaLinn.，白花鬼针草BidenspilosaL.var.ratiataSch-Bip.，婆婆针BidensbipinataLinn.，三叶鬼针草BidenspilosaLinn.的干燥全草；槲皮素（批号081-9304，中国药品生物制品检定所，含量测定用）；甲醇为色谱纯；水为二次重蒸水；其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件KrosmasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），柱温30℃，流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液（41∶59），检测波长360nm，流速1ml·min-1。槲皮素峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好，按照槲皮素峰计，理论塔板数不应低于5000。见图1～8。
图1槲皮素对照品色谱图（略）
图2三叶鬼针草（云南产）根色谱图（略）
图3三叶鬼针草（云南产）茎色谱图（略）
图4三叶鬼针草（云南产）叶色谱图（略）
图5狼杷草色谱图（略）
图6白花鬼针草色谱图（略）
图7婆婆针色谱图（略）
图8三叶鬼针草色谱图（略）
2.2供试品溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇配置成0.04mg·ml-1的溶液。
2.2.2样品溶液的制备称取鬼针草药材粉末（过40目筛）约1.0g，精密称定，置圆底烧瓶中加入甲醇-25﹪盐酸溶液（4∶1）25ml，称定重量，加热回流1h，取出，冷却至室温，用上述混合溶液补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm的微孔滤膜，作为样品溶液。
2.3线性关系的考察分别精密量取上述对照品溶液0.5，2，4，8，20μl，在上述色谱条件下测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=3×106X-33404，R2=0.9999(n=5)。结果表明槲皮素在0.02～0.80μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.4精密度实验精密吸取对照品溶（0.04mg·ml-1）10μl，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.97%（n=6）。结果表明精密度良好。
2.5稳定性实验精密量取样品溶液10μl，分别于0，2，4，6，8h测定。按照槲皮素对照品峰面积计算RSD为0.6%（n=6）。结果表明样品溶液在配制后8h内稳定。
2.6重复性实验取同一批样品溶液，精密称取6份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定槲皮素的含量，RSD为1.6%（n=6），表明重复性良好。
2.7回收率实验精密称取9份已知含槲皮素量的药材粉末0.25g，依次加入低、中、高3种质量浓度槲皮素对照品溶液，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。结果平均回收率为99.87%，RSD为0.9%（n=9）。
2.8样品含量测定按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.1”项下方法测定，不同部位测定结果见表1，不同种测定结果见表2。
表1三叶鬼针草不同部位中槲皮素的含量（略）
表2鬼针草属不同种中槲皮素的含量（略）
3讨论
实验曾考察了甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55）；甲醇-0.4%磷酸溶液（40∶60）；甲醇-0.4%磷酸溶液（41∶59）为流动相，流速1ml·min-1，柱温30℃，以KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）为分析柱。本实验以甲醇-0.4%磷酸溶液（41∶59）为流动相，槲皮素峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好。本法简便、准确、重复性好，可以作为控制鬼针草属药材质量的标准之一。
[关键词] 高效液相色谱法；优点；应用；缺点；前景
[中图分类号] R927[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）08（a）-028-02
Generality of HPLC
ZHANG Jian-hong,CHEN You-sheng
(Department of Pharmacy, Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520，China)
[Abstract] This paper summarizes the advantages, disadvantages, types, applications and foreground of HPLC
[Key words] HPLC; Advantage;Application;Disadvantage;Foreground
高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。
1高效液相色谱法具有的优点
与其他谱法相比具有以下优点：①高分离率(应用10 μm以下规则均匀的极细颗粒为固定相，所以传质阻抗小，柱效高,一般在1×103~5×105 n/m)；②高速(采用2×103~3×104 kPa的高压输液泵输送液体流动相，使其具有高流速,数分钟至几十分钟可完成试样分析)；③自动化操作，重复性高；④高效相色谱柱可反复使用；⑤高灵敏度(广泛使用了高灵敏检测器,只需要试样10-7~10-2 g)。
2高效液相色谱法分类
高效液相色谱法按照分离机制可分为以下4种：
2.1液-液分配色谱法（liquid-liquid chromatography)
LLC根据流动相和固定相的极性不同又可分为，①正向LLC：流动相极性固定相极性，极性大的组分先流出色谱柱，适合非极性物质分离。
理论上应不相溶的固定相和流动相，实际上仍有少量微量固定相溶解，并且机械冲击作用也会导致固定相流失，从而使柱的分离效率和选择性降低, 目前主要采用化学键合固定相(即通过固定相的有机基团与载体（硅胶）表面的游离羟基发生化学反应，从而使固定相与载体键合起来)来克服这一问题。
2.2液-固吸附色谱法（liquid-solid adsorption chromatogramphy）
在吸附色谱中，组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附，利用组分和固定相吸附力的不同而分离。
2.3离子交换色谱法(ion exchange chromatography)
离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换，利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法。
2.4空间排阻色谱法（凝胶色谱法）
试样中分子量大小不同的组分进入凝胶柱时，组分分子渗入微孔的程度不同，大分子直接从间隙中越过，首先出柱，分子越小，进入微孔越深，保留值越大，溶剂分子通常最小，最后流出。主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。
3高效液相色谱法的应用
HPLC已成为应用最为广泛和有效的分离分析手段，应用非常广泛，目前，HPLC在医药、生化、天然产物主要成分的分析、食品分析、环境分析等方面都有广泛的用途：
3.1医药方面
广泛用于药物的分离、分析、定量等[1-3]。
3.1.1药物合成的分离精制在药物合成反应中，作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。值得提出的是，药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制，需要拆分光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离目的。
3.1.2天然产物的分离分析天然产物的组分非常复杂，例如中草药等，用高效液相色谱法进行分离分析，具有简单快速的特点。
3.2在生命科学中的应用[4,5]
其在生化领域的应用主要集中于两个方面：①低分子量物质，如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇等的分离和测定。②高分子量物质，如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。 过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术，但都有一定的局限性，远远不能满足生物化学研究的需要。因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质，如培养基、发酵液、体液、组织中对感兴趣的物质进行有效而又特异的分离，通常要求检测限达ng级或pg级，或pmol，fmol，并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活。在这些方面，HPLC具有明显的优势。
3.3食品方面[6-8]
高效液相色谱法已经被广泛应用于下面二个领域：①食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；②食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；③食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等。
3.4环境分析方面[9]
在对大气中污染物的成分分析，废水、废汽和汽车尾气中有害组分的分析中，高效液相色谱法发挥着很大的作用。
3.5农业方面[10]
在农业的发展中，高效液相色谱也发挥着很大的作用。它主要用来对各种农作物中营养成分进行分析，特别是对多糖、脂肪酸、蛋白质等分析都是极为有效的方法。
4 高效液相色谱法存在的问题
4.1涡流扩散（Eddy diffusion）
流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流速就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
4.2分子扩散（Molecular diffusion）
分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
4.3质量转移（Mass transfer）
被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡流动相就向前移，产生物质的非平衡移动，使区带变宽。
4.4流动相流速
当流速太低时，分子扩散严重。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速加大会降低柱效率。
4.5固定相颗粒大小
固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。
5展望
高效液相色谱法虽存在上述不足之处，但由于分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等优点，从而在医药、食品、生化、环境分析等领域还是有着广泛的应用前景。
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液相色谱其主要优势体现在其能够将复杂混合物进行良好的分离，其分离纯度高，在各个学术领域都得到了广泛的使用。但是这种方式最大的缺点是不能对分离化合物的结构信息进行及时分析，需要在分离后提取化合物的样本再对其进行鉴定，才能对比未知化合物的性质。
质谱技术能够对化合物的结构信息进行高度分析，并且需要的化合物的样本较少，尤其适合用于分析化合物的化学结构以及成分。但是质谱技术需要获得较为纯净的化合物样本。
根据两种方式的使用性质，相关研究人员试图将这两种检测方式进行串联使用，采用取长补短的方式将两种方式的优点更好的发挥出来，弥补缺点。通过这种想法，液相色谱与质谱技术联用技术就此诞生。在这项技术中，将液相色谱作为将化合物进行分离的工具，而质谱检测成为了主要的检测手段。液相色谱与质谱联用接口将色谱与质谱进行连接，利用液相色谱的高度分离能力以及质谱的高灵敏度与选择性，对混合化合物进行分离、检测。这种检测方式已经成为了现代科学检测中一项重要的检测方式。
由于液相色谱与质谱有鉴定、分离的有特点。随着近年来科技的不断发展，这项技术已经在食品安全分析检测中发挥着巨大的作用。国内外也出现了大量关于HPLC-MS对食品中有害成分的安全监测报道。就目前来说，我国也进行了串联四级杆液质联用对粮食种8种真菌毒素进行测定、三重串联四级杆液质混合监测糖果、牛奶中三聚氰胺含量等研究，都取得了良好的研究结果。
试验研究
本文采用液相色谱与质谱联合检测方式对核桃油中19种游离氨基酸进行检测，现报道如下。
氨基酸标准品。19种纯氨基酸为： 纯氨基酸标准品：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、撷氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、半肤氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、天冬酞胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、赖氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg） ，酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）。
样品处理。取核桃油样品1ml，加入10ml甲醇与水体积比例1：9溶液，提取核桃油样本中的氨基酸。将溶液进行搅拌5min，保证溶液混合均匀后静置15min等待提取，采用12000rpm离心转速进行离心，温度控制在5°C，时间应控制在15min。待离心完成后，采用氮气进行吹干，并采用2mL0.1%乙酸与甲醇体积比1：1溶液进行复溶，采用0.22μm的滤膜进行过滤测量。
结果。在上述条件中，采用色谱与质谱优化，将19种氨基酸进行提取，绘制其标准曲线，具体结果如表2。结果表明，在线性范围0.1―2.5μg/mL以内。R>0.99，从而可以检测出限为0.001-0.05μg/mL。
讨论。在此次研究中，采用了高效液相色谱与质谱进行联用的检测技术，对核桃油中19N游离氨基酸含量进行了检测。并对其中直接采用了体积比为19：1的0.1%甲酸以及乙氰作为流动相，对其进行C8柱反向液相色谱分离，并采用电喷雾对其中的离子源进行离子化处理，从而使其能够进行三重四级质谱测定，从而提高检测效果。在这项测量研究中，测量线性范围为0.1-2.5μg/mL，R>0.99，其中检出限为0.001-0.05μg/mL。这种检测方式能够更加简便的对氨基酸进行检验和测量，对试验结果的影响较小。
总结
食品是人们进行生命活动的物质基础，而食品安全对于人们的身体健康来说也是至关重要的。现代社会中，食品安全问题也频频发生，人们对食品的安全以及营养健康的要求也越来越严格。所以，采用高水平的检测技术作为食品安全的保障支柱是现代科学研究中一项不可或缺的工作。就目前来说，食品类型以及混合物也愈加复杂化，对食品中的多含量进行同时分离和检测，对类似物进行区分与检测也是食品成分分离检测中的一项重点研究内容，也是食品检测工作的难点所在。
液相色谱与质谱技术联合使用具有液相色谱优秀的分离能力和质谱的良好鉴定能力，是现代进行食品成分安全监测定性的常用技术。
关键词：葛粉;葛根素;HPLC
Abstract:Object:DeterminationofPuerariainPuerariaPowderMethods:PuerariaweredeterminedbyHPLC.ThemobilephasewasMeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）.Detectionwavelengthwasat250nm.Results:Puerariashowedagoodlinearrelationship.Theaveragerecoverywas98.6%andRSDwas1.76%.Conclusion:Thismethodwassimple,quickandaccurate.
Keywords:PuerariaPowder;Pueraria;HPLC
葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,是常用中药材,具有解肌退热，生津，透疹，升阳止泻功效，用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，高血压颈项强痛等[1]。现代研究证实，葛根中的主要有效成分为葛根素等异黄酮类化合物，具有抗炎解热、扩张冠状动脉血管、增加冠状动脉血流量的作用，同时也有降低血压的作用。有关葛根中葛根素等异黄酮的含量测定研究已有不少报道[2-5]，但对葛粉中葛根素含量测定报道不多。本文对葛粉中葛根素的提取条件和测试条件等进行比较研究,并采用高效液相色谱法对葛粉样品进行了定量分析,结果令人满意。
1实验部分
1.1仪器与试剂
岛津LC－10Atvp高效液相色谱仪；SPD－10Avp紫外检测器；岛津UV－265紫外分光光度仪，多功能榨汁机/搅拌机SG300－I（上海科骏电器有限公司）。甲醇（色谱纯），水（二次蒸馏），其余均为分析纯。葛根素对照品（中国药品生物制品检定所）；鲜葛（浙江省永嘉县潘坑乡）。
1.2色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱C18diamonsil5ul(150×4.6mmI.D)，MeOH－H2O－HAc（30：70：0.5）为流动相，紫外检测波长250nm。
2结果与讨论
2.1提取溶剂浓度的选择
精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇、50%乙醇和80%乙醇10ml，超声提取60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明30%乙醇提取最好。
2.2超声提取时间的选择
精密称取同一样品约0.1g,分别加30%乙醇10ml，超声提取30分钟、45分钟、60分钟，进样5ul,比较峰面积，实验结果表明超声60分钟为最佳提取条件。
2.3流动相及流速的选择
试验时曾采用下述流动相进行测定：甲醇－水（25：75）、甲醇－水－醋酸（30：70：0.5）、甲醇－水（30：70）为流动相，结果采用甲醇－水－冰醋酸（30：70：0.5）为流动相，样品分离好。而流速也以1.0ml/min为合适。
2.4标样溶液的制备
称取一定量葛根素对照品,用30%乙醇溶解配制成浓度为13ug/ml的葛根素标准液。
2.5葛粉制备
取鲜葛用水洗净切片,称取20g放入搅拌机内，搅拌三次，每次1分钟，每次加水200ml，150ml，100ml，合并浆汁放置二天，去掉上面的水，下面的粉浆用定量滤纸过滤，低温干燥，放入干燥器中备用。
2.6供试品溶液制备
精确称取一定量葛粉于10mL容量瓶中,加30%乙醇10ml,超声提取1h,滤纸过滤,滤液过0.45um滤膜作为供试品溶液。
2.7线性关系考察
在上述色谱条件下，分别进标样溶液0.5、3、5、7、10μl，测得各峰面积。以葛根素为横座标（A），以峰面积（Y）为纵座标，计算得回归方程：Y=3.90×106x+728.14,相关系数r＝0.9999；结果紫外检测葛根素在0.0065-0.13μg范围内呈良好线性关系。
2.8精密度试验
取上述标样溶液，连续进样5次，测定，RSD为1.11%。
2.9重复性试验
取同一样品重复测定5次，RSD为1.61%。
2.10稳定性试验
取上述供试品溶液，0、2、5、7、10h进样，RSD为2.1%，10小时内进样稳定。
2.11回收率试验
取已知含量的样品，分别加入葛根素标样，按上述方法测定5次，平均回收率为98.6%,RSD为1.76%。见表1。
2.12样品分析
精密吸取标样溶液5μl与供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，结果:葛粉中葛根素的含量为0.06%（n=3），见下图。
3讨论
本文采用高效液相色谱法测定葛粉中葛根素的含量,方法简单、快速、准确，结果满意，可用于葛粉中葛根素的含量测定。
[参考文献]
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【关键词】高效液相色谱；曲妥珠单抗；定量分析
曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2（HER2）的细胞外部位。此抗体属IgGl型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185 HER2抗体的互补决定区。本文所用的药物为锆89标记的曲妥珠单抗。
本文采用的是外标法定量分析锆89标记的曲妥珠单抗注射液中曲妥珠单抗的药物含量，已达到能基本了解注射入动物体内时的药物含量。外标法操作简单快键，影响其实验结果的主要因素是进样量的误差对最终结果影响较大。
1 试剂和仪器
2 实验方法
2.1 流动相配制
分别用电子天平称取11.50g磷酸氢二钠，2.96g磷酸二氢钠，11.60g氯化钠于1L的溶剂瓶中。用量筒量取1L超纯水于瓶中，超声震荡并搅拌溶解。用抽滤装置除去其中的颗粒状杂质。
2.2 标准液配制
用电子天平精确称量1mg的曲妥珠单抗于西林瓶中，用移液枪移取1mL超纯水于西林瓶中，涡旋混匀器震荡溶解配制为1mg/mL的标准液标注为1号标准液。用移液枪移取500μL上述标准液于另一个西林瓶中，再加入500μL超纯水稀释为500μg/mL的标准液，标注为2号标准液。按上述方法逐次稀释分别配制250μg/mL、100μg/mL、10μg/mL标准液，分别标注为3、4、5号标准液。
2.3 HPLC的工作条件
流速为0.8mL/min，流动相为已配置的磷酸缓冲液。
检测波长为280nm，进样量30μL。
3 实验结果
3.1 标准品HPLC数据
3.2 标准曲线
以标准液浓度为横坐标，以紫外吸收峰面积为纵坐标建立标准曲线。如下图1所示，浓度与峰面积呈线性关系，标准曲线方程为y=3422x+4246.1，相关系数R2=0.9952。
3.3 未知样品的浓度
未知样品的色谱图如图2所示，样品的保留时间为11.910min，峰面积为708269。根据标准曲线方程计算位置样品浓度x=（y-4246.1）/3422，最终计算结果为未知样品浓度x=205.73μg/mL。
4 结果与讨论
外标法建立标准曲线方程从而计算得出未知样品的浓度是定量分析中一种常用的方法。但是也有很多的缺点和不足，其受到操作误差的影响较大，进样量以及柱效都ψ钪战峁有很大的影响。
由标准液中浓度为10μg/mL的5号标准液的紫外吸收峰面积与标准曲线方程计算得到的紫外吸收峰面积的y值相比较，差距很明显。再比较1号标准液和标准曲线方程计算值之间的差距，由此可以得出在越低浓度的情况下，标准曲线方程的精确度受到操作误差的影响就越大。
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[关键词]高效液相色谱法、色谱柱、检测器、矫正
中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）11-0365-01
高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高等优点，其应用范围之广，是其它分析仪器所不能比拟的。随着仪器的普及和蒸发光散射检测器、质谱检测器的商品化，本法已成为生药含量测定的首选和主流方法。
1.对仪器的一般要求
（1） 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和分离效果。孔径在15nm以下的填充剂适合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填充剂。
以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2～8的流动相。当pH大于8时，载体硅胶会被溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用 pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。这些特殊的色谱柱已有商品供应。
（2） 检测器最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关。示差折光检测器和蒸发光散射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关。二极管阵列检测器可以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱测定和色谱峰的纯度检查。
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。
不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至少符合紫外 - 可见分光光度法对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。
（3） 流动相 可采用固定比例（等度洗脱）或按规定程序改变比例（梯度洗脱）的溶剂组成作为流动相系统。由于C-18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
2.系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。
通常用规定的对照品对色谱系统进行系统适用性试验。
（1） 色谱柱的理论板数（n）在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位） 和半高峰宽（Wh/2），按n=5.54（tR/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
（2） 分离度 （R） 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。
（3） 重复性取对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。
（4） 拖尾因子（T）为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合相关规定。
3.测定法
（1） 内标法加校正因子测定供试品中某个成分含量精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照品溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
校正因子（f）=式（3-8）
式中As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；CS为内标物质溶液的浓度；CR为对照品溶液的浓度。
再取含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：
含量（Cx）=f×式（3-9）
式中Ax为供试品峰面积或峰高；Cx为供试品溶液的的浓度；A′s为内标物质的峰面积或峰高；C′s为内标物质的浓度。f为校正因子。
当配制校正因子测定用的对照品溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量同一浓度的内标物质溶液时，Cs=C′s，则配制内标物质溶液不必精密称 （量）取。
（2）外标法测定供试品中某个成分含量 精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。
（3）面积归一化法 是测量色谱图上某色谱峰和除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算某色谱峰占总面积的百分率。该法通常用于对照品纯度的检查。
参考文献
[1] 《高效液相色谱》吴宁生，顾光华编，中国科学技术大学出版社，1989.
关键词：高效液相 邻苯二甲酸酯类 残留
当今社会食品安全问题愈来愈受到广大百姓的关心 ,食品安全的范围很广,它不仅仅指食品本身 ,还涉及到与食品相关的诸多方面 ,如食品所用原材料、食品加工工艺过程污染控制、食品放置与储存、食品包装所用材料等方面。
邻苯二甲酸酯（PAEs）也称为酞酸酯，主要用作塑料增塑剂，随着塑料工业的发展和塑料制品的大量使用，邻苯二甲酸酯已成为环境中无所不在的污染物，极为普遍地存在于土壤、底泥、大气、水体和生物体等环境样品中，酞酸酯类物质是一类环境雌激素，它可以扰乱内分泌, 对人体健康危害巨大。世界卫生组织（WHO）1995年公布的必须控制的[5]。其中有6种商品化的邻苯二甲酸酯被美国EPA列为重点控制的污染物（邻苯二甲酸二甲酯 DMP 、二乙酯 DEP 、二丁酯 DBP 、邻苯二甲酸二 2-乙基己 酯 DEHP 、二辛酯 DOP 、丁基苄基酯 BBP）,3种被我国列为优先控制污染物（DMP、DBP和 DOP）,8种被列在世界野生动物基金会(WWF)的环境激素名单中。本文针对食品用塑料包装中添加的增塑剂邻苯二甲酸酯类化合物展开研究 ,建立一种方便、快捷、准确的检测方法。
1实验部分
1.1仪器与试剂
高效液相色谱仪(Waters Allance 2695-2996),Empower2色谱工作站,PDA检测器； SunFire C18 ,15cm×4.6mm×5μm色谱柱；吉尔森GX271全自动固相萃取仪。固相萃取小柱，Waters公司的 OASIS.HLB（6mL,200mg）小柱；分析天平：感量0.1mg；美国Organomation N-EVAP112型氮吹仪；IKAR werke T25型均质机；离心机；溶剂过滤装置；0.45μm有机滤膜；Milli-Q超纯水机。
甲醇、乙腈为HPLC级（美国Fisher公司）；丙酮、氯化钠、无水硫酸钠无为分析纯试剂。
邻苯二甲酸酯类标准品：邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）、邻苯二甲酸二己酯（DHXP）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）、邻苯二甲酸二辛酯（DNOP）。标准品纯度均在97%以上,美国进口,购于百灵威化学品部。
1.2标准溶液的配制[4，7，8]
准确称取上述标准品各0.1000g,分别用甲醇定容至100mL容量瓶中,配成100mg/mL的单标储备液。分别移取上述单标储备液各10mL，放置到100mL容量瓶中。用甲醇定容，配制成100mg/L的混合标准储备液，置于4℃冰箱中保存备用。标准储备液每6个月更换一次，或与标准品比较，发现问题时，必须立即更换。
混合标准系列溶液的制备：取一定量的100mg/L的混合标准储备液，用甲醇分别稀释成质量浓度为0.16、1.60、16.00、40.00mg/L的标准系列，置于4℃冰箱中保存。混合标准系列溶液每1～2个月进行更换，或与标准品比较，发现问题时，必须立即更换。
1.3样品前处理[6]
1.3.1 食品
（1）油脂类固体或半固体样品：称取均匀样品2g(精确至0.1mg)置于离心管中，加入10mL正己烷，均质2min，2500r/min离心3min，己烷层转入125mL分液漏斗中，再用10mL正己烷重复提取一次，己烷层并入125mL分液漏斗中。用90ml乙腈分三次提取，合并三次乙腈提取液于500mL分液漏斗中，加入250mL10%氯化钠溶液，用200mL正己烷分两次提取，经装有10g无水流酸钠的漏斗收集于梨形瓶中，40℃下蒸发近干。残留物用5mL正己烷溶解，待过柱用。
（2）油脂类液体样品：称取均匀样品1g(精确至0.1mg)于小烧杯中，加入20mL正己烷充分溶解，转入125mL分液漏斗中，用30mL乙腈洗烧杯后也转入分液漏斗中，其余处理同（1）进行。
（3）不含油脂的固体或半固体样品：称取混匀试样5.00g，置于50mL离心管中，加适量水（使总水量约10mL），加入20mL丙酮+正己烷混合液（2+3），均质2mim，2500r/min离心3min，取上层清液经装有5g无水硫酸钠的漏斗收集于梨形瓶中。再用20mL正己烷提取一次，合并提取液于40℃下蒸发近干（若含色素较多按（1）过柱净化），用正己烷定容至2mL,待分析。
(4) 不含油脂的液体样品（不含啤酒）：称取均匀样品20g，置于100mL具塞量筒中，加入10mL饱和食盐水，再加入30mL正己烷剧烈振摇，静止分层，上清液经装有5g无水硫酸钠的漏斗收集于梨形瓶中，再用30mL正己烷重复提取一次，合并上清液，40℃下蒸发近干（若含色素较多按（1）过柱净化），用正己烷定容至2mL,待分析。
（5）啤酒：称样20g，置于100mL具塞量筒中，加入10mL饱和食盐水，再加入20mL乙腈、20mL正己烷剧烈振摇，静止分层，上清液经装有5g无水硫酸钠的漏斗收集于梨形瓶中，再用20mL 、20mL正己烷重复提取两次，合并上清液，40℃下蒸发近干，用正己烷定容至2mL,待分析。
1.3.2．食品包装材料：称取经粉碎混匀的试样0.2g(精确至0.1mg)于三角瓶中，加入50mL正己烷，超声提取30min，取上清液直接进行分析（视含量作相应的稀释或浓缩）。
1.3.3净化
(1)．层析柱的制备：玻璃层析柱底部放入少许脱脂棉，加入1cm高的无水硫酸钠，然后依次干法装入2g弗罗里硅土（层析用，200℃烘3h后备用），0.5gPSA（硅胶键合氨基吸附剂），上部再加入1cm高的无水硫酸钠。使用前依次用10mL丙酮、10mL正己烷预淋洗。
(2)．净化与浓缩：待淋洗液下降至无水硫酸钠层时，将试样提取液加入，再用5mL正己烷洗梨形瓶，洗液加入层析柱中，待其下降至无水硫酸钠层时，用25mL丙酮+正己烷（2+98）混合液洗脱，将洗脱液收集于合适的容量瓶中，用正己烷定容，待分析。
1.4测定
1.4.1．色谱条件：
色谱柱：SunFire C18 ,15cm×4.6mm×5μm
波长:224nm
柱温度:30℃
进样量:10μL
流速：1.0mL/min
流动相：A-水；B-乙腈 ，梯度配比如表1。
Empower色谱工作站
检测器:PDA检测器
定量方法 ： 取10μL进样，根据保留时间定性，以峰面积计算，以外标法定量。
1.4.3．结果计算
食品及食品包装物中邻苯二甲酸酯类化合物的含量（mg/kg）
式中：x―试样中某种邻苯二甲酸酯的含量（mg/kg）；
v―试样定容体积（mL）；
m―试样质量（g）；
c1--试样中某种邻苯二甲酸酯峰面积对应的标准品组分的浓度（mg/L）；
c0―空白试样中某种邻苯二甲酸酯峰面积对应的标准品组分的浓度（mg/L）
2．实验结果与讨论
2.1 样品前处理：由于食品包装材料及部分样品中成分比较复杂，含有一定量的蛋白、脂肪和纤维等成分，处理不好将直接影响进样，对液相色谱柱损害较大，所以应将样品充分混匀提取后，过净化柱，最后再经高速离心，可较好的去除大分子杂质物质，得到进样溶液。
2.2 波长的选择[3-4]:通过对几种邻苯二甲酸酯标准溶液进行210～400nm扫描,发现在220～240nm之间,吸收峰较强,本实验选择224nm作为方法的固定波长。
2.3标准及样品：在本方法的实验条件下，七种邻苯二甲酸酯类均得到了较好的分离，能够满足实验要求。
2.4 加标回收率：向5份样品中分别加入不同量的邻苯二甲酸二丁酯标准溶液，按本法处理、测定并计算回收率，结果见表2：
2.4 检出限：本方法检出限0.50mg/kg。
3.结论
实验表明，本方法所用乙酸铵流动相浓度低，样品进样量少，对分析柱的损害较小；样品加标回收率在78.00%～114.80%之间；线性系数R>0.9999；检出限为0.50mg/kg；能够满足一般食品等样品中邻苯二甲酸酯类残留量的分析要求。另外本方法具有简便快速、准确灵敏、成本低、可靠性强等优点，应用前景广泛。
参考文献
[1] 修丽华,王陆玲等.高效液相色谱法测定畜、禽肉中土霉素的残留量[J].现代食品科技,2007,Vol.23,No.10
[2] 中华人民共和国国家标准, GB/T18932.5-2002.
[3] 何华, 倪坤仪. 现代色谱分析[M]. 化学工业出版社, 2000, 228-245.
[4] 阎吉昌. 环境分析[M]. 化学工业出版社, 2002, 308.
[5] 陈珠灵, 黄瑜奎, 王桂美, 陈飞.化妆品中邻苯二甲酸酯类环境激素检测方法研究[J] . 环境科学与技术, 2007,Vol30,No.4
[6]佟克兴等食品包装材料中邻苯二甲酸酯的测定.监督与选择[J],2008,64-66.
[7]GB/T5009-2003,食品卫生检验方法[M].中华人民共和国国家标准.
[8]GB/T19681-2005,食品中苏丹红染料的检测方法.中华人民共和国国家标准.