时间：2023-02-22 02:15:00
关键词：纤维素乙醇；木质纤维素；产业化；生物精炼；乙醇联产
Abstrct：Withtheenergycrisisandenvironmentalproblems?becomingincreasinglyprominent，worldenergydevelopmentisenteringanewperiod.Thatis,theworldisexperiencingtherevolutionthattheenergy?isbeingrestructuredfromfossilenergyconsumptiontofocusingmainlyontherenewableenergyrevolution.Celluloseethanolisbeenthebestalternativeliquidfuelandindustrialbiotechnologyresearchfocusesonecologicalbenefits.Inthispaper,theauthorssummarizethestatusofcelluloseethanolathomeandabroad,andanalyztheimpact?factors?affectingcelluloseethanolindustrydevelopmentandthedevelopmenttrendofthecelluloseethanolindustry.
Keywords：Celluloseethanol;lignocellulose;industrialization;bio-refining;co-productionofethanol
0引言
能源问题是当今世界各国都面临的关系国家安全和经济社会可持续发展的中心议题，已经成为全球关注的焦点。因此，人们开始把目光转移到有利于社会可持续发展的可再生能源体系。专家认为，生物质资源转化体系是引领第三次世界能源革命的技术平台。在此背景下，燃料乙醇已经被视为替代和节约汽油的最佳燃料，其高效的转换技术和洁净利用日益受到全世界的重视，已经被广泛认为是21世纪发展循环经济的有效途径。
在中国，燃料乙醇的主要原料是玉米和小麦。随着燃料乙醇的快速发展，原料问题日益突出，成为制约燃料乙醇发展的瓶颈；另外，以粮食作物为原料的燃料乙醇产业发展还有可能引发国家粮食安全问题。因此，中国政府提出生物乙醇坚持非粮之路，即“不与人争粮，不与粮争地”。经济分析显示，中国发展纤维素乙醇有更大的优势。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，也是当前利用率最低的资源，是各国新资源战略的重点。中国可利用的木质纤维素每年在7亿吨左右，这些丰富而廉价的自然资源主要来源于农林业废弃物、工业废弃物和城市废弃物。所以，纤维素乙醇是未来发展的必然方向。
1木质纤维素原料组成及性质
木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素和少量的可溶性固形物组成。纤维素大分子是由葡萄糖脱水，通过β-1,4葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体。在常温下不发生水解，高温下水解也很缓慢。只有在催化剂的作用下，纤维素的水解反应才显著进行。常用的催化剂是无机酸或纤维素酶，由此分别形成了酸水解和酶水解工艺。半纤维素是由不同的多聚糖构成的混合物，这些多聚糖由不同单糖聚合而成，有直链也有支链，上面连接有不同数量的乙酰基和甲基。半纤维素的水解产物主要有己糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、戊糖和阿拉伯糖等几种不同的糖。半纤维素的聚合度较低，相对比较容易降解成单糖。二者的水解机理可以用下列方程式简单地表示：
(C6H10O5)n+nH2OnC6H10O6
(C5H804)n+nH2OnC5H10O5
2国外纤维素乙醇的研究与应用现状
随着现代工业的迅速发展，大规模开发利用作为清洁能源的可再生资源显得日益重要。许多国家都制定了相应的开发研究计划，例如：美国的“能源农场”、巴西的“酒精能源计划”、印度的“绿色能源工程”和日本的“阳光计划”等发展规划。其它诸如丹麦、荷兰、德国等国，多年来一直在进行各自的研究与开发，并形成了各具特色的生物质能源研究与开发体系，拥有各自的技术优势。
自1973年世界石油危机后，巴西就实施了“国家乙醇生产计划”，主要依靠本国丰富的甘蔗资源，积极发展燃料乙醇产业，目前已经发展320多家燃料乙醇生产企业，1400万吨/年的乙醇生产规模。大部分企业实行燃料乙醇和糖联产。美国在燃料乙醇的生产上仍然是世界乙醇生产的领头羊，在将纤维素转化为燃料酒精的研究、生产和应用方面也走在世界的前列。美国加州大学Berkeley分校采用的流程是纤维素水解与发酵同步进行，该工艺以粉碎的玉米芯为原料，再用稀酸水解，将半纤维素水解成木糖等产物。该流程的酸水解是连续进行的，反应器中的纤维原料含量为5%，玉米芯水解率达40%，水解液中糖为2.6%，然后采用多效蒸发器浓缩至糖浓度为11%再进行发酵。美国维吉尼亚州立大学利用80%的浓磷酸循环使用进行木质纤维素“溶解性分离”的研究，然后经纤维素酶水解，得到较纯的葡萄糖，其得率达到35%。瑞典隆德大学KarinOhgren等研究了将蒸汽爆破预处理后的玉米秸秆进行同步糖化与发酵的工艺研究，试验结果表明，发酵结束后乙醇达到25g/L。
近年，随着纤维乙醇技术的快速发展，一些大公司开始计划建造较大规模的试验性工厂。美国的GulfoilChemical公司建成了可处理1t/d纤维废料的中试车间，年产纯乙醇2亿升，乙醇产率为27.7%。加拿大的Iogen生物技术公司，在渥太华开设了以麦秸为原料的3.2万加仑/年纤维素乙醇厂，采用稀酸结合蒸汽气爆预处理半纤维素，随后用纤维素酶水解，分离后的液体进行木糖和葡萄糖联合发酵。经评估，其生产成本比谷物乙醇高出30%～50%。
3国内纤维素乙醇研究与应用现状
我国在纤维素乙醇技术开发上也取得了一些重要进展。浙江大学主持的“利用农业纤维废弃物代替粮食生产酒精”的项目已在河北完成中试生产，以玉米芯为原料，乙醇产率为22.2%（W/W）。南京林业大学建立了玉米秸秆间歇蒸汽爆破预处理、纤维素酶水解和戊糖己糖同步发酵技术制取纤维乙醇的中试装置。水解得率为71.3%，还原糖利用率和乙醇得率分别为87.17%和0.43%。华东理工大学于2005年已建成了纤维乙醇600吨/年的示范性工厂，以废木屑为原料，以稀盐酸水解和氯化亚铁为催化剂的水解工艺以及葡萄糖与木糖的发酵，转化率达到了70%。河南农业大学利用黄胞原毛平革菌和杂色云芝的复合预处理，对选择性降解木质素的能力和规律进行了试验研究。生物降解后原料水解率达到了36.67%。山东大学微生物技术国家重点实验室主要开展“纤维素原料转化乙醇关键技术”研究。对纤维素酶高产菌的筛选和诱变育种、用基因手段提高产酶量或改进酶系组成、纤维素酶生产技术等研究。吉林轻工业设计研究院“玉米秸秆湿氧化预处理生产乙醇”在实验室规模为10L发酵罐条件下，经湿氧化预处理和酶水解后酶解率86.4%；糖转化为乙醇产率48.2%。
近年来，以河南天冠集团和中粮集团为代表的几家大型燃料乙醇生产企业，与高校联合进行纤维素乙醇的工业化技术的探索性研发。目前，河南天冠集团将建成300吨/年的乙醇中试生产线，原料转化率超过了16%。中粮集团于2006年在黑龙江肇东启动建设500吨/年纤维素乙醇实验装置。吉林九新实业集团建立了3000吨/年的玉米秸秆生产纤维乙醇示范性工厂。
迄今为止，全世界已经建有几十套纤维质原料经纤维素酶水解成单糖的中试生产线或小试生产线。纤维燃料乙醇在国内外研究正步入一个新的时代，在一些关键技术上取得了重要的进展，并建立了多个示范性工厂。但整体上，由于在纤维素酶生产技术、戊糖己糖发酵菌株构建等方面还没有取得根本性的突破，所以距离纤维素乙醇的产业化还有一定的距离。
4影响纤维乙醇产业化的主要因素
近年来，国内外对利用木质纤维转化乙醇进行了大量的研究，工艺路线已经打通，但当前要想实现工业化生产，在原料收集、预处理、糖化、发酵和精馏各工艺过程中还存在着制约纤维素乙醇生产的问题，主要表现为以下四个方面
（1）木质纤维素原料分散，季节性强，尤其是农作物秸秆。
（2）木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高。由于天然纤维素原料的结构复杂的特性，使得其纤维素、半纤维素和木质素三者不能有效分离；另外伴随产生一些中间副产物，实验表明，这些物质抑制酵母的生长和代谢，最终影响乙醇产率。
（3）缺乏高效的纤维酶菌株，现有的纤维素酶制剂效果较低，使得酶解糖化经济成本较高，当前生产一吨纤维乙醇需要酶制剂成本在2200～2600元。
（4）缺乏能够同时高效利用戊糖和己糖的发酵菌株。在木质纤维水解中，其中有相当比重的木糖（葡萄糖/木糖约为2）。因此，戊糖的利用是影响纤维乙醇综合成本的关键一项。
5未来纤维素乙醇产业化发展趋势
目前，国外纤维素乙醇产业化的研究已经成为了热潮，正步入一个关键时期，中国在这方面也有良好的基础。为了使纤维素乙醇尽早地实现产业化，除了以上几项关键技术进一步解决好外，还应当借鉴石油化工的经验，坚持走生物精炼和乙醇联产的模式，尽可能地最大提升和拓展底物的各组分的经济价值，也许是促使纤维素乙醇产业化的重要途径。
尽管木质纤维素原料本身非常廉价，但是将其转化成乙醇的工艺过程非常复杂，需要大量的能耗。这主要是由木质纤维素自身的结构特性决定的，而得到的目标产物是经济附加值并不很高的乙醇，致使单位乙醇的经济效益并不具备较强的市场优势。而生物精炼和乙醇联产模式就打破了原来由生物质生产单一产品的观念，实现原料充分利用和产品价值最大化，就是所谓的“吃干榨净”，正如目前的利用粮食生产乙醇一样。例如，利用玉米同时生产燃料乙醇、玉米油、蛋白粉、高果糖浆、蛋白饲料和其他系列产品，这样提升了整个工艺产品的经济附加值，同时取得良好的经济效益和社会效益。同样利用木质纤维素的三大类组分也可以衍生出多种产品。例如：目前，大多的木糖醇厂主要是利用玉米芯中的半纤维素生产木糖醇，结果剩下大量的木糖渣（主要是纤维素和木质素），如果进行联产模式，将剩下的纤维素与木质素进行组分分离，分别生产纤维乙醇和优质燃料或木素磺酸盐，就有可能进一步提升产品的综合效益。
综上所述，中国应该利用纤维素乙醇作为主要的生物能源，加快以纤维素乙醇为核心的综合技术开发，尽早实现其产业化发展的目标。相信经过“十一五”计划的实施，中国在利用纤维素废弃物制取燃料乙醇方面，必将取得更大的进展，为缓解液体燃料短缺、促进环境保护和社会可持续发展等方面发挥重要作用。
参考文献
[1]杜风光，史吉平，张龙等.纤维质生产燃料乙醇产业化研究进展.[J]中国麻业科学.2007，（29）72-74.
[2]孙智谋，蒋磊，张俊博，等.世界各国木质纤维素原料生物转化燃料乙醇的工业化进程[J].酿酒科技，2007（1），91-94.
[3]SunY,ChengJ.Hydrolysisoflingocellulosicmaterialsforethanolproduction[J].BiomassTechnology.2002,83:3-9.
[4]KeikhosroKarimi,MohammadJ,Taherzadeh.Conversion?ofricestrawtosugarsbydilute-acidhydrolysis[J].BiomassandBioenergy,2006,30:247-253.
[5]CheungSW,AndersonBC.Laboratoryinvestigationofethanolproductionfrommunicipalprimarywasterwatersolids[J]BioreourceTechnology，2003.59：81-96.
[6]勇强等.玉米秸秆生物转化制取酒精的中间试验.济南:中国资源生物技术与糖工程学会研讨会论文集.2005.[c]
[7]宋安东.生物质（秸秆）纤维燃料乙醇生产工艺试验研究[D].郑州:河南农业大学,2003,25-27
关键词：纤维素乙醇；木质纤维素；产业化；生物精炼；乙醇联产
abstrct：with the energy crisis and environmental problems? becoming increasingly prominent， world energy development is entering a new period .that is, the world is experiencing the revolution that the energy? is being restructured from fossil energy consumption to focusing mainly on the renewable energy revolution. cellulose ethanol is been the best alternative liquid fuel and industrial biotechnology research focuses on ecological benefits. in this paper, the authors summarize the status of cellulose ethanol at home and abroad, and analyz the impact? factors? affecting cellulose ethanol industry development and the development trend of the cellulose ethanol industry .
key words：cellulose ethanol ;lignocellulose; industrialization ;bio-refining ;co-production of ethanol
0引 言
能源问题是当今世界各国都面临的关系国家安全和 经济 社会 可持续发展的中心议题，已经成为全球关注的焦点。因此，人们开始把目光转移到有利于社会可持续发展的可再生能源体系。专家认为，生物质资源转化体系是引领第三次世界能源革命的技术平台。在此背景下，燃料乙醇已经被视为替代和节约汽油的最佳燃料，其高效的转换技术和洁净利用日益受到全世界的重视，已经被广泛认为是21世纪发展循环经济的有效途径。
在 中国 ，燃料乙醇的主要原料是玉米和小麦。随着燃料乙醇的快速发展，原料问题日益突出，成为制约燃料乙醇发展的瓶颈；另外，以粮食作物为原料的燃料乙醇产业发展还有可能引发国家粮食安全问题。因此，中国政府提出生物乙醇坚持非粮之路，即“不与人争粮，不与粮争地”。经济分析显示，中国发展纤维素乙醇有更大的优势。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，也是当前利用率最低的资源，是各国新资源战略的重点。中国可利用的木质纤维素每年在7亿吨左右，这些丰富而廉价的 自然 资源主要来源于农林业废弃物、工业废弃物和城市废弃物。所以，纤维素乙醇是未来发展的必然方向。
1木质纤维素原料组成及性质
木质纤维素是由纤维素、半纤维素、木质素和少量的可溶性固形物组成。纤维素大分子是由葡萄糖脱水，通过β-1,4葡萄糖苷键连接而成的直链聚合体。在常温下不发生水解，高温下水解也很缓慢。只有在催化剂的作用下，纤维素的水解反应才显著进行。常用的催化剂是无机酸或纤维素酶，由此分别形成了酸水解和酶水解工艺。半纤维素是由不同的多聚糖构成的混合物，这些多聚糖由不同单糖聚合而成，有直链也有支链，上面连接有不同数量的乙酰基和甲基。半纤维素的水解产物主要有己糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、戊糖和阿拉伯糖等几种不同的糖。半纤维素的聚合度较低，相对比较容易降解成单糖。二者的水解机理可以用下列方程式简单地表示：
(c6h10o5)n + nh2onc6h10o6
(c5h804) n + nh2onc5h10o5
2国外纤维素乙醇的研究与 应用 现状
随着 现代 工业的迅速发展，大规模开发利用作为清洁能源的可再生资源显得日益重要。许多国家都制定了相应的开发研究计划，例如：美国的“能源农场”、巴西的“酒精能源计划”、印度的“绿色能源工程”和日本的“阳光计划”等发展规划。其它诸如丹麦、荷兰、德国等国，多年来一直在进行各自的研究与开发，并形成了各具特色的生物质能源研究与开发体系，拥有各自的技术优势。
自1973年世界石油危机后，巴西就实施了“国家乙醇生产计划”，主要依靠本国丰富的甘蔗资源，积极 发展 燃料乙醇产业， 目前 已经发展320多家燃料乙醇生产 企业 ，1400万吨/年的乙醇生产规模。大部分企业实行燃料乙醇和糖联产。美国在燃料乙醇的生产上仍然是世界乙醇生产的领头羊，在将纤维素转化为燃料酒精的 研究 、生产和 应用 方面也走在世界的前列。美国加州大学berkeley分校采用的流程是纤维素水解与发酵同步进行，该工艺以粉碎的玉米芯为原料，再用稀酸水解，将半纤维素水解成木糖等产物。该流程的酸水解是连续进行的，反应器中的纤维原料含量为5%，玉米芯水解率达40%，水解液中糖为2.6%，然后采用多效蒸发器浓缩至糖浓度为11%再进行发酵。美国维吉尼亚州立大学利用80%的浓磷酸循环使用进行木质纤维素“溶解性分离”的研究，然后经纤维素酶水解，得到较纯的葡萄糖，其得率达到35%。瑞典隆德大学karin ohgren等研究了将蒸汽爆破预处理后的玉米秸秆进行同步糖化与发酵的工艺研究，试验结果表明，发酵结束后乙醇达到25g/l。
近年，随着纤维乙醇技术的快速发展，一些大公司开始计划建造较大规模的试验性工厂。美国的gulfoil chemical公司建成了可处理1t/d纤维废料的中试车间，年产纯乙醇2亿升，乙醇产率为27.7%。加拿大的iogen生物技术公司，在渥太华开设了以麦秸为原料的3.2万加仑/年纤维素乙醇厂，采用稀酸结合蒸汽气爆预处理半纤维素，随后用纤维素酶水解，分离后的液体进行木糖和葡萄糖联合发酵。经评估，其生产成本比谷物乙醇高出30%～50%。
3国内纤维素乙醇研究与应用现状
我国在纤维素乙醇技术开发上也取得了一些重要进展。浙江大学主持的“利用农业纤维废弃物代替粮食生产酒精”的项目已在河北完成中试生产，以玉米芯为原料，乙醇产率为22.2%（w/w）。南京林业大学建立了玉米秸秆间歇蒸汽爆破预处理、纤维素酶水解和戊糖己糖同步发酵技术制取纤维乙醇的中试装置。水解得率为71.3%，还原糖利用率和乙醇得率分别为87.17%和0.43%。华东理工大学于2005年已建成了纤维乙醇600吨/年的示范性工厂，以废木屑为原料，以稀盐酸水解和氯化亚铁为催化剂的水解工艺以及葡萄糖与木糖的发酵，转化率达到了70%。河南农业大学利用黄胞原毛平革菌和杂色云芝的复合预处理，对选择性降解木质素的能力和 规律 进行了试验研究。生物降解后原料水解率达到了36.67%。山东大学微生物技术国家重点实验室主要开展“纤维素原料转化乙醇关键技术”研究。对纤维素酶高产菌的筛选和诱变育种、用基因手段提高产酶量或改进酶系组成、纤维素酶生产技术等研究。吉林轻 工业 设计研究院“玉米秸秆湿氧化预处理生产乙醇”在实验室规模为10l发酵罐条件下，经湿氧化预处理和酶水解后酶解率86.4 %；糖转化为乙醇产率48.2 %。
近年来，以河南天冠集团和中粮集团为代表的几家大型燃料乙醇生产企业，与高校联合进行纤维素乙醇的工业化技术的探索性研发。目前，河南天冠集团将建成300吨/年的乙醇中试生产线，原料转化率超过了16%。中粮集团于2006年在黑龙江肇东启动建设500吨/年纤维素乙醇实验装置。吉林九新实业集团建立了3000吨/年的玉米秸秆生产纤维乙醇示范性工厂。
迄今为止，全世界已经建有几十套纤维质原料经纤维素酶水解成单糖的中试生产线或小试生产线。纤维燃料乙醇在国内外研究正步入一个新的 时代 ，在一些关键技术上取得了重要的进展，并建立了多个示范性工厂。但整体上，由于在纤维素酶生产技术、戊糖己糖发酵菌株构建等方面还没有取得根本性的突破，所以距离纤维素乙醇的产业化还有一定的距离。
4 影响 纤维乙醇产业化的主要因素
近年来，国内外对利用木质纤维转化乙醇进行了大量的研究， 工艺路线已经打通，但当前要想实现工业化生产，在原料收集、预处理、糖化、发酵和精馏各工艺过程中还存在着制约纤维素乙醇生产的 问题 ，主要表现为以下四个方面
（1）木质纤维素原料分散，季节性强，尤其是农作物秸秆。
（2）木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高。由于天然纤维素原料的结构复杂的特性，使得其纤维素、半纤维素和木质素三者不能有效分离；另外伴随产生一些中间副产物，实验表明，这些物质抑制酵母的生长和代谢，最终 影响 乙醇产率。
（3）缺乏高效的纤维酶菌株，现有的纤维素酶制剂效果较低，使得酶解糖化 经济 成本较高，当前生产一吨纤维乙醇需要酶制剂成本在2200～2600元。
（4）缺乏能够同时高效利用戊糖和己糖的发酵菌株。在木质纤维水解中，其中有相当比重的木糖（葡萄糖/木糖约为2）。因此，戊糖的利用是影响纤维乙醇综合成本的关键一项。
5未来纤维素乙醇产业化 发展 趋势
目前 ，国外纤维素乙醇产业化的 研究 已经成为了热潮，正步入一个关键时期， 中国 在这方面也有良好的基础。为了使纤维素乙醇尽早地实现产业化，除了以上几项关键技术进一步解决好外，还应当借鉴石油化工的经验，坚持走生物精炼和乙醇联产的模式，尽可能地最大提升和拓展底物的各组分的经济价值，也许是促使纤维素乙醇产业化的重要途径。
尽管木质纤维素原料本身非常廉价，但是将其转化成乙醇的工艺过程非常复杂，需要大量的能耗。这主要是由木质纤维素自身的结构特性决定的，而得到的目标产物是经济附加值并不很高的乙醇，致使单位乙醇的经济效益并不具备较强的市场优势。而生物精炼和乙醇联产模式就打破了原来由生物质生产单一产品的观念，实现原料充分利用和产品价值最大化，就是所谓的“吃干榨净”，正如目前的利用粮食生产乙醇一样。例如，利用玉米同时生产燃料乙醇、玉米油、蛋白粉、高果糖浆、蛋白饲料和其他系列产品，这样提升了整个工艺产品的经济附加值，同时取得良好的经济效益和 社会 效益。同样利用木质纤维素的三大类组分也可以衍生出多种产品。例如：目前，大多的木糖醇厂主要是利用玉米芯中的半纤维素生产木糖醇，结果剩下大量的木糖渣（主要是纤维素和木质素），如果进行联产模式，将剩下的纤维素与木质素进行组分分离，分别生产纤维乙醇和优质燃料或木素磺酸盐，就有可能进一步提升产品的综合效益。
综上所述，中国应该利用纤维素乙醇作为主要的生物能源，加快以纤维素乙醇为核心的综合技术开发，尽早实现其产业化发展的目标。相信经过“十一五”计划的实施，中国在利用纤维素废弃物制取燃料乙醇方面，必将取得更大的进展，为缓解液体燃料短缺、促进环境保护和社会可持续发展等方面发挥重要作用。
参考 文献
[1] 杜风光，史吉平，张 龙等.纤维质生产燃料乙醇产业化研究进展.[j]中国麻业 科学 .2007，（29）72-74.
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[3] sun y ,cheng j.hydrolysis of lingocellulosic materials for ethanol production[j].biomass technology.2002,83:3-9.
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[5] cheung s w,anderson b c.laboratory investigation of ethanol production from municipal primary wasterwater solids[j] bioreource technology，2003.59：81-96.
[6] 勇强 等.玉米秸秆生物转化制取酒精的中间试验.济南:中国资源生物技术与糖工程学会研讨会论文集.2005.[c]
[7] 宋安东.生物质（秸秆）纤维燃料乙醇生产工艺试验研究[d].郑州:河南农业大学,2003,25-27
[8] sun y ,cheng j.hydrolysis of lingocellulosic materials for ethanol production [j]. biomass? technology.? 2002, 83: 3-9.
关键词：纤维素原料；纤维素酶；预处理；水解；发酵；生物能源乙醇；精馏和脱水；产业化
长期以来我国能源生产以煤炭、石油、天然气等化石能源为主，不仅消耗了大量的自然资源，而且对环境造成了严重污染。根据国家统计局的中国统计年鉴的数据显示，2003年能源生产总量为1．7亿t标准煤，2012年为3．3亿t标准煤，增幅达93％，我国迫切需要一种可再生能源来代替化石能源。在美国、巴西及欧洲已形成新的可再生能源－燃料乙醇产业。随着粮食价格的不断上涨，土地资源日益紧张，以粮食为原料的生物液体燃料技术发展前景并不乐观。而木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，发展纤维素生物乙醇成为我国和其他能源发达国家的必然选择。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，以其作为原料生产生物乙醇是最具发展前景的生产路线，利用现代化生物技术手段开发以纤维素为原料的生物能源，已成为当今世界发达国家能源战略的重要内容。
1纤维素乙醇主要技术
路线纤维素乙醇的工艺技术路线主要包括预处理、水解、发酵、蒸馏脱水等几大环节。其中关键步骤是酶水解，该过程具有反应条件温和、过程可操纵性、对环境友好等优点。
1．1纤维素原料的预处理方法
目前，纤维素原料的预处理方法可分为物理法、化学法、物理化学相结合法以及生物法等。
1．1．1物理法
常见的物理法预处理技术包括机械粉碎法、高温热水处理法、微波辐射、射线处理等等，该类处理方法操作简单，无环境污染，但需要较高的动力，其耗能约占糖化总过程耗能的60％以上。机械粉碎法：用振动磨等物理外力将纤维素原料进行粉碎处理，可以破坏木质素和半纤维素与纤维素之间的结合层，但是木质素仍然会被保留，其结果降低三者的聚合度，改变纤维素的结晶构造。该处理方法可提高反应性能和提高糖化率，保证酶解过程中纤维素酶或木质素酶发挥作用。高温热水处理法：即酸催化的自水解反应，原理就是在高温（200℃以上）且压力高于同温度下饱和蒸汽压时，使用高温液态水去除部分木质素及全部半纤维素，但高温作用会使产物有所损失，并产生一些有机酸等次级代谢产物抑制酶解与发酵过程。按照水与底物的进料顺序不同，可分为以下3种，即流动水注入、水与物料相对进料及两者平行进料，这3种方式都是利用沸水的高介电常数去溶解所有的半纤维素和1／3～2／3的木质素，但反应需要的pH值要求较高，一般控制在4～7之间，来减少副作用。
1．1．2化学法
稀酸预处理和浓酸预处理：浓酸具有腐蚀性，生产过后需要回收，因此大大增加了成本，所以稀酸水解应用的范围广，稀酸水解一般是在高温高压下进行，稀酸能够断裂纤维素内部的氢键，使得纤维素易水解且提高木聚糖到木糖的转化率，虽然该方法较其他方法比较而言有很高的转化率，但是据Selig等研究表示，在高温条件下（如140℃处理时），在纤维素表面可能会形成一些木质素与碳水化合物复合物形成的球状液滴。碱预处理技术：该方法原理是破坏木质素和碳水化合物之间的连接，破坏生物质的结晶区，使木质素溶于碱液从而促进水解的进行。常用的碱包括Ca（OH）2和氨水等。Chen等采用价格便宜的Ca（OH）2处理TK－9芒草秸秆半纤维素，其水解率大于59．8％，木质素的去除率为40．1％。Kim等发现利用NH4OH、在60℃条件下、采用1∶7的料液比处理废弃秸秆9h可以去除70％～80％的木质素，若酶用量充足，可以将所有的纤维素水解掉。
1．1．3物理化学方法
氨冷冻爆破法：类似于蒸汽爆破法，其区别之处在于氨处理对设备的要求和所需的能耗降低，在蒸煮的过程中加入氨，同时还要注意氨的有效回收，其原理是液氨在50～80℃、1．5MPa条件下，采用物理方法，将压力骤降，使液氨蒸发，使木质素晶体爆裂，破坏木质素与糖类的连接，脱去部分木质素，使得木质素的结构得以破坏，增加纤维素表面积和酶解的可及度。随后向系统加入固液混合物，经过蒸发的氨通过压缩可以得到有效回收。Alizadeh等采用柳枝为原料，将葡聚糖的转化率从20％提高到90％，木质纤维素原料的酶解速率得到较大提高，另外该方法避免了酶的降解，无干扰抑制物的产生，因此处理过后无需处理。
1．1．4生物方法
自然界中有多种能够分解木质素的微生物，其中分解能力最强的是木腐菌，包括3种：百腐菌、软腐菌、褐腐菌。百腐菌能分泌胞外氧化酶包括漆酶、过氧化酶、锰过氧化酶等，因此百腐菌是自然界最主要的木质素降解菌，这些木质素降解酶能有效、彻底地将木质素降解成为水和二氧化碳。
1．2发酵酶解
发酵酶解技术是木质素生产纤维素乙醇技术的关键，国内研究人员经过多年的探索，取得了较好的进展，如生产成本下降，生产工艺流程简化。酶解发酵主要将五碳糖或六碳糖经过微生物发酵同时转化为乙醇。利用木质纤维素原料生物转化乙醇主要有4种途径：分步水解和发酵（SHF）、同步糖化发酵（SSF）、同步糖化共发酵（SSCF）和直接微生物转化（DMC）。
1．2．1分步水解和发酵（SHF）
分步水解和发酵的原理是，2个过程独立进行，其优点就是各步能在各自适宜的温度下（50～55℃酶解，35～340℃发酵）进行，有利于反应完全，纤维素酶首先将纤维素原料水解，再将得到的C5或C6分别发酵生产乙醇，也可共发酵产乙醇，该途径最大的缺点就是酶解过程中的水解产物积累会抑制酶的活性，导致水解不彻底。世界上第一座纤维素乙醇示范装置是加拿大Iogen公司于2004年在渥太华建立的，该公司以纤维素为原料利用SHF工艺，固液分离水解糖，利用工程菌生产乙醇，产能1800t／年。瑞典的O－Vik公司以木屑为原料采用SHF工艺建立的乙醇厂，成本只有0．46欧元。美国的Verenium则以甘蔗渣为原料，采用稀酸水解，采用基因工程大肠杆菌发酵生产乙醇，1t干生物质年产100加仑乙醇。
1．2．2同步糖化发酵（SSF）
同步糖化和发酵，即在同一个反应容器里，纤维素酶解与葡萄糖的乙醇发酵同时进行，微生物能直接利用酶解产生的糖，这样避免了对纤维素酶的反馈抑制作用，SSF是目前生产乙醇最主要的方式，国内外的中试装置上基本都采用此方法，主要代表就是瑞典Lund大学，采用木屑为原料，利用工程酵母发酵，其原料转化率可达90％，提高乙醇产量。在生产过程中，原料在经过预处理之后，加入纤维素酶和酵母共发酵，不能被酶解的木质素则被分离出来，通过再利用提供能量，通过乙醇蒸馏工艺进行回收。
1．2．3同步糖化共发酵（SSCF）
SSCF法是SSF法的改进，最主要的优势在于对戊糖的利用。半纤维素中含有丰富的戊糖，如木聚糖、阿拉伯聚糖，在SSF法中大量戊糖并未能转化成乙醇；如果在发酵过程中接种能够将戊糖转化为乙醇的微生物，将大大提高发酵液中最终乙醇含量。Su等研究发现，利用重组的Zymomonasmobilis发酵玉米秸秆，在SSCF法中，当葡萄糖存在时，缩短了木糖的发酵时间；但葡萄糖与木糖会竞争相同的膜转运蛋白，而且蛋白优先转运葡萄糖，在培养基中葡萄糖含量降低到一定程度后，菌种才开始利用木糖进行发酵。现阶段SSCF法采用混合菌种发酵居多，在下一步研究过程中，应开发能够同时利用戊糖和己糖发酵产乙醇的新菌种。
1．2．4直接微生物转化（DMC）
直接微生物转化又称为统合生物工艺，即原料中木质纤维素成分通过某些能够产生纤维素酶的微生物群生产乙醇的工艺，同时该微生物还能利用发酵糖生产乙醇，这就要求该种微生物同时具有以下3个步骤：产纤维素酶、酶解纤维素、发酵产乙醇。目前，研究最多的就是粗糙脉孢菌和尖镰孢菌这2种真菌，该菌有独立的纤维素酶生产，在有氧和半通氧2种状态下，分别产水解后的底物和发酵糖为乙醇，方法简便，和普遍使用的SSF相比，无需额外酶的加入，能够同时利用五碳糖或六碳糖，具有很广的应用前景。Mascoma公司利用酵母和细菌共同完成产生纤维素酶和发酵产乙醇的工艺步骤，酶生产单元大大减少，在中试装置上使用该技术，降低了成本，减少了费用。
1．3精馏和脱水技术
精馏和脱水技术主要是提纯产物乙醇，其工艺类似于淀粉燃料乙醇的生产过程。精馏和脱水技术可以借鉴淀粉质原料燃料乙醇生产工艺中已经发展成熟的工业化技术，木质纤维素类原料发酵液中乙醇浓度比较低，一般情况下均在5％以下，致使精馏操作能耗高。有研究者建议，在木质纤维素水解液乙醇发酵工艺中耦合渗透蒸发技术来提高进入精馏系统发酵液中乙醇浓度，但是渗透蒸发系统本身的动力消耗也比较大，而且渗透蒸发所用的透醇膜容易被菌体污染的问题也很突出。
2纤维素乙醇发展展望
2．1纤维素乙醇产业化发展的局限
目前，木质纤维素类生物质制备生物乙醇因其在生产、能耗和政策支持3个方面存在问题，不能实现大范围的工业化生产。生产技术方面存在工艺流程和预处理技术2个方面的限制，能源利用率存在成本和产出之比高低问题，以及存在政府是否颁布相应的支持条例的问题。首先，从原料上来看，木质纤维素由于自身坚固的细胞壁结构和难以水解的结晶纤维素，使得生产燃料乙醇需要较高的成本费用，其次，从生产工艺流程来看，制备燃料乙醇要经过预处理、酶解、发酵等过程，在预处理过程中，不同的处理方法针对不同的原料有不同的处理效果，虽然对燃料乙醇提供了有力的支持，但是也存在不同程度的局限之处。在水解和发酵方面，一般采用的技术工艺是分步水解和发酵（SHF）、同步糖化发酵（SSF）、同步糖化共发酵（SSCF）和直接微生物转化（DMC）。分步水解和发酵的反应特点是纤维素水解和水解液发酵可以在不同的反应容器中进行，所以两者可以选择适宜条件。其缺点在于，水解产物糖对纤维素酶有反馈抑制作用，使水解不完全，同时在转移产物过程中，由于在不同容器中进行，易造成微生物污染。而SSF则与此相反，在酶水解糖化纤维素的同时加入能产生乙醇的纤维素发酵菌，使两者在同一装置中连续进行，工艺大大简化，又能消除底物葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用。但是也存在局限因素，如木糖的抑制作用、酶解温度和发酵温度不一致等。研究最多的假丝酵母菌、管囊酵母菌能够将木糖转化为乙醇，解决此难题。同步糖化共发酵（SSCF）是由该方法衍生出的新工艺，同样具有广阔应用前景。中国科学院生化工程国家重点实验室陈洪章等在了解了SSF法之后，提出秸秆分层多级转化液体燃料的新构想，在秸秆不经过添加化学药品的低压爆理之后，采用发酵－分离乙醇耦合系统，多级转化燃料乙醇和生物油，降低成本费用和酶的用量，简化生产工艺，提高酶解效率。
2．2纤维素乙醇产业化发展的趋势目前，国外纤维素乙醇产业化研究正进入一个关键时期，中国在这方面也有很好的基础，为了更快地实现产业化，应当吸取国外石油化工的实践经验，坚持生物精炼和乙醇联产的创新模式，促使纤维素乙醇实现产业化。该模式即实现原料的充分利用和产品价值最大化，就是所谓的“吃干榨净”，具体含义指利用玉米生产燃料乙醇，还能生产相关产品，如玉米油、高果糖浆、蛋白粉、蛋白饲料和其他系列产品，这样既提升了纤维素乙醇经济附加值，又能取得良好的经济和社会效益，一举两得。燃料乙醇将很快进入全球的成品油市场，在替代汽油供应方面发挥不可替代的作用。
在未来几年，随着中国对石油进口依赖度加深，扩大国内燃料乙醇产能已经成为必需。但是由于粮食生产乙醇的工艺不适合我国采用，因此，纤维素乙醇研究已经成为目前研究工作的重点。纤维素乙醇研究工作涉及物理、生物工程、化学等多个领域，为了早日实现纤维素乙醇产业化，应当提出相应的发展战略，首先，应该制定生物质能源产业的国家和地方的发展战略，政府应采取鼓励政策继续加大科研资金投入；其次，利用己糖发酵菌种的构建及木质纤维原料生物量全利用等方面来提升纤维素乙醇的经济效益：最后，要建立工业示范装置，为纤维素乙醇产业发展提供实践经验。纤维素乙醇作为主要的生物能源，应加快以纤维素乙醇为核心的综合技术的开发，整合多方力量，实现优势互补，使其在我国能源结构转变中发挥重要的作用。
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［3］刘娜，石淑兰．木质纤维素转化为燃料乙醇的研究进展［J］．现代化工，2005，25（3）：19－22，24．
诺维信中国总裁柯铭在会上表示：“诺纤力・赛力二代是目前全球开发出的成本最低的纤维素乙醇商业化生产技术，商业化设施的逐步建设，将为纤维素乙醇的工艺优化以及酵母活性和适应性提供进一步提升的空间，从而使纤维素乙醇的生产成本进一步降低。”
当代面临的最大的挑战之一就是缺乏可再生且持续的燃料，而生物燃料技术则是目前唯一可用的能够替代石油燃料的技术。近十年来，生物燃料工业界的研究热点一直集中在开发出一种商业上可行的由木质纤维素制造的纤维素乙醇。继上世纪90年代将第一代以粮食为原料的生物乙醇技术带入中国后，诺维信一直致力于第二代纤维素乙醇的技术研究。
与传统汽油相比，纤维素乙醇能够减少二氧化碳排放量达90%。作为发酵法生产纤维素乙醇的一种关键成份，酶制剂可被用来降解生物质中的纤维素，经过预处理和酶解糖化过程发酵生产出乙醇，再以一定的掺混比添加到汽油中成为乙醇汽油。
会上，诺维信亚太区生物燃料市场经理封雯瑞介绍了诺纤力赛力二代的领先性能，它内含独特的蛋白质复合体，能促进酶性能的发挥并可减少用于将纤维素转换为可发酵糖类的酶使用剂量，从而有效地加快转化过程并增加乙醇的产量。“二代酶的添加量与第一代相比可以降低一半以上，并可在更高总固形物含量下实现良好的转化率，有助于生产商减少固定资产投入”。
诺维信于2000年开始研发用于生产纤维素乙醇的酶制剂产品，曾两次获得美国能源部总金额高达2930万美元的项目开发援助金。凭借在酶制剂研制领域的技术储备，诺维信成功地将生产纤维素乙醇所需酶的成本在过去两年中降低了约80%，达到目前的50美分/加仑。诺维信预计纤维素生物燃料的成本还会进一步降低，目前国际上已建设有多套工业示范装置。目前，诺维信正在通过与全球生物燃料工业中众多业界领袖合作，加速纤维素乙醇生产过程中的技术开发和实施，进一步降低纤维素乙醇生产用酶的成本。
[关键词] 支架；细菌纤维素；聚乳酸乙醇酸；羟基磷灰石；性能
[中图分类号] R783.1[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）03（c）-0101-04
Preparation and properties of porous bacterial cellulose-poly lactic-co-glycolic acid-hydroxyapatite scaffolds
YAO Zhiwen1 WANG Hongzhong1 CAI Shen1 YANG An1 LIU Wei1 LI Hongjiu1 CHENG Youyong1 LI Chunhua1CHEN Zhiqing2
1.Department of Stomatology, the Affiliated Shenzhen Shajing Hospital of Guangzhou Medical College, Guangdong Province, Shengzhen 518104, China; 2.Department of Dental Materials, West China College of Stomatology of Sichuan University, Sichuan Province, Chengdu 610041, China
[Abstract] Objective To prepare porous bacterial cellulose-poly lactic-co-glycolic acid-hydroxyapatite scaffolds and study their properties. Methods The porous BC-PLGA-HA scaffolds were prepared by solvent casting/particulate leaching method. The morphology and the structures of the scaffolds were observed and analyzed by SEM. The tensile strength and porosity were also measured. The SEM-scanning, MTT and ALP test were done to assess the attachment, proliferation and osteogenic differentiation of Osteoblasts(MG-63) cultured on porous BC-PLGA-HA scaffolds, which was compared with those cultured on cell culture plate. Results The porous BC-PLGA-HA Scaffolds had good physical properties with (8.923 1±0.901 2) N/mm2 tensile strength and (64.73±5.65)％ porosity. The SEM-scanning, MTT and ALP test showed that MG-63 cells cultured on porous BC-PLGA-HA scaffolds exhibited a higher proliferation and ALP activity. Conclusion The porous BC-PLGA-HA scaffolds has good mechanical properties,porosity and biocom
组织工程支架材料应用时，单一的材料往往难以同时满足生物体对其力学强度、亲水性、易成型性和生物相容性等多方面的要求，为了尽量同时满足这些要求，人们往往通过几种生物材料的组合来达到预期目的。基于这个思路，本课题选用细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）、聚乳酸乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）和羟基磷灰石（HA）通过溶剂浇铸/粒子浸出法制备多孔BC-PLGA-HA复合支架，分析其相关理化性能，通过体外MG-63细胞培养，初步评价其体外生物相容性及在组织工程中的应用可行性。
1 仪器与试剂
1.1 主要仪器
电热恒温鼓风干燥箱（跃进医疗器械厂，上海），CO2培养箱（Sanyo，日本），LDZ5-2台式离心机（北京医用离心机厂），YJ-1450型超净工作台（苏净集团安泰公司，江苏），倒置相差显微照相系统（Olympus，日本），JSM-6360LV电子显微镜（EJOL，日本），HTS7000 plus多孔板紫外/荧光/可见光高效分析仪（PE，美国）。
1.2 主要试剂
高糖DMEM培养基（Gibco，美国），胎牛血清（Gibco，美国），胰蛋白酶（Gibco，美国），四甲基偶氮唑盐（MTT）（Sigma，美国），二甲基亚砜（Sigma，美国），乙二胺四乙酸（Sigma，美国），Braford蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），成骨样细胞MG-63（四川大学口腔疾病国家重点实验室）。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 多孔BC-PLGA-HA复合支架的制备
取1.0 g的PLGA和5 mL氯仿配成溶液，加入经过目筛的粒径为100～200 μm的NaCl晶体1.0 g和HA 0.3 g，磁力搅拌和超声振动使其均匀分散。室温下将以上配好的PLGA溶液倒入底层铺有BC膜的玻璃皿中。静置24 h，干燥后PBS液反复漂洗，冷冻干燥后裁剪成直径5 mm圆片。25 kGy 60Co照射24 h消毒灭菌。4℃保存备用。
2.1.2 多孔BC-PLGA-HA复合支架相关理化性能分析
2.1.2.1 表面形貌观察多孔BC- PLGA-HA复合支架表面喷金后放置样品台进行扫描电镜观察。
2.1.2.2 抗张强度（δb）多孔BC- PLGA-HA复合支架裁剪成一定的形状，用千分尺测其厚度和宽度。使用万能电子拉力实验机进行测试，根据公式δb＝F/A（F：支架的最大拉力，A：支架的截面面积）计算出支架的抗张强度（δb）
2.1.2.3 孔隙结构测定用乙醇装满一个小瓶记录重量为W1，支架称重记录为Ws，然后浸泡于该瓶乙醇中，支架的孔中都充满乙醇后，瓶子再加满乙醇，称重记录W2，然后把浸满乙醇的支架取出，剩余乙醇和小瓶称重记录为W3，ρ=0.79 kg/m3为乙醇的密度。根据以下公式计算孔隙率：
复合支架本身体积：Vs=（Wl+Ws-W2）/ρ
复合支架孔体积：Vp=（W2-W3-Ws）/ρ
复合支架孔隙率：ε=Vp/（Vs+Vp）=（W2-W3-Ws）/（W1-W3）
2.1.3 多孔BC-PLGA复合支架体外生物相容性分析
2.1.3.1 MG-3细胞在支架表面的形态学观察MG-63细胞从冻存管复苏后培养换液，2.5 g/L胰酶常规传代，倒置相差显微镜下观察生长状态， 选取生长良好的第3代细胞在24孔板内以2×105/mL的细胞浓度接种至多孔BC-PLGA-HA复合支架表面，置于37℃、体积分数为5% CO2恒温培养箱中进行培养，隔天换液。培养5 d后取出标本，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥，样本表面喷金后电镜扫描观察。
2.1.3.2 MTT比色法检测细胞在支架材料表面的增殖MG-3细胞在24孔板内以2×105/mL的细胞浓度接种至多孔BC-PLGA-HA复合支架表面，培养1、3、5 d后各孔内分别加入MTT液100 μL，37℃孵育4 h。吸出孔内液体后每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，吸取上清液用酶联免疫分光光度计（490 nm）测定各孔光吸收值。同时以MG-3细胞直接接种于培养板底部作为对照组。
2.1.3.3 ALP 活性检测MG-3细胞在24孔板内以2×105/mL的细胞浓度接种至多孔BC-PLGA-HA复合支架表面，培养5 d后取相应样本，提取和制备支架材料上生长的全部细胞冻融液，参照ALP试剂盒和Braford试剂盒步骤测定细胞匀浆的中蛋白含量和ALP活性。同时以MG-3细胞直接接种于培养板底部作为对照组。结果进行统计学分析。
2.2 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行分析，对MTT实验所得数据采用重复测量数据方差分析法，对ALP检测所得数据采t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2.3 结果
2.3.1 多孔BC-PLGA-HA复合支架相关理化性能分析
2.3.1.1 表面形貌观察支架内部可见各种裂隙样或孔洞样的结构将材料分割为多孔的海绵状，孔大小为20～200 μm不等，部分孔表面可见覆盖膜样结构。10 000倍电镜下可见粒径约为几百纳米到几个微米形状不规则的HA分布在不平整的PLGA膜上。制备的多孔BC-PLGA-HA复合支架扫描电镜观察见图1、2。
2.3.1.2 抗拉强度结果本实验制备的多孔BC-PLGA-HA复合支架的抗张强度测试结果为（8.923 1±0.901 2）N/mm2，理论上能够满足一定的组织工程支架力学的要求。
2.3.1.3 孔隙率测定在测定支架的孔隙率时发现，所制备的多孔支架没有发生明显的溶胀现象，保持了原来的大小和形貌。本实验制备的多孔BC-PLGA-HA复合支架的孔隙率测定结果为（64.73±5.65）%，提示所得支架具有较好的内部贯通结构。
2.3.2 多孔BC-PLGA复合支架体外生物相容性分析
2.3.2.1 MG-3在支架表面的形态学观察 培养5 d后有一定数量的细胞黏附在复合支架表面并开始增殖（图3），细胞与支架表面贴壁紧密，细胞间以伪足连接，已达到一定程度的汇合，胞体丰满，折光较为明显，部分细胞已经深入到材料表面裂隙中生长。
2.3.2.2 MG-3在支架材料上的增殖活性检测重复测量方差分析结果显示，不同实验组差异有统计学意义（P < 0.001）；不同时间组差异有统计学意义（P < 0.001）；其中，第1天多孔BC-PLGA-HA组和空白对照组间光密度值差异无统计学意义（P = 0.217），第3、5天多孔BC-PLGA-HA组的光密度值均高于对照组（P ＜ 0.005），差异有统计学意义，提示MG-3细胞在多孔BC-PLGA-HA支架材料表面具有更强的增殖活性。MTT法测定多孔BC-PLGA-HA组和对照组细胞的成活和增殖能力结果见图4。
2.3.2.3 MG-3在支架材料上的ALP活性检测MG-63细胞在多孔BC-PLGA-HA组和对照组培养基中生长5 d后，测定ALP表达，结果显示，多孔BC-PLGA-HA组高于对照组，差异有统计学意义（t = 4.207，P < 0.05），表明多孔BC-PLGA-HA复合支架材料更有利于成骨细胞生长分化和成骨活性的表达。见表1。
3 讨论
生物支架是组织工程重要要素之一，对种子细胞起到支撑和模板作用， 是其附着的基本框架和代谢场所，支架的孔结构形状、尺寸大小和孔隙率对细胞的黏附、增殖和分化有着很重要的影响，但具体多大孔径为最佳目前尚未有统一的说法，Freyman等[1]认为孔径为100～200 μm较适合细胞生长。此外支架的高孔隙率（> 90%）和相互贯穿的孔形态有利于细胞的种植生长、营养物质的传输以及血管和神经的内生长，但孔径和孔隙度的[2]增加同时会降低支架的生物力学强度。
支架材料种类的选择和制备方法对支架性能的影响有着重要的影响。本课题将BC、PLGA和HA三种材料通过溶液浇铸/粒子沥滤法制备多孔BC-PLGA-HA复合支架，基于如下考虑：（1）溶液浇铸/粒子沥滤法是较为成熟的制备可控孔径多孔生物支架的方法[3]；（2）HA中有接近正常骨组织钙/磷比，同时具有良好的骨传导性[4]；（3）PLGA降解后在局部积聚的酸性代谢物容易引起无菌性炎症发生。HA表面溶解后呈弱碱性，能够缓冲或中和PLGA降解产生的酸[5]；（4）BC有着良好的理化性能[6-7]：①具有厚度为3～8 nm的纳米级超细纤维，大小仅为人工合成纤维的1/10；②具有高抗张强度和弹性模量，扬氏模量可达1.5×1010 Pa，抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要强5倍；③具有良好的持水性和透气性能，内部有很多“孔道”使其能吸收60～700倍于其干重的水份。预期BC的加入可以补偿材料因降解过程中产生的物理机械性能下降，从而使复合支架在修复功能区和负荷区时可以较长时间地保持良好的力学性能。本课题选用粒径为100～200 μm的造孔剂，扫描电镜观察制备的多孔BC-PLGA-HA复合支架呈多孔状结构，孔形状略不规则，大小20～200 μm不等，孔的形状可能和造孔剂形状相关，出现部分较小孔径原因可能是在筛选造孔剂时混杂有小部分更小尺寸造孔剂所造成。高倍率下可见粒径不等的HA散在支架孔的底部。
抗拉强度和孔隙率是衡量生物材料理化性能的两个重要指标。材料断裂前所达到的最大应力值称为抗拉强度，它可以代表材料的部分力学性能。孔隙率和材料的亲水性相关，通常孔隙率越高，材料的吸水率就越高，生物相容性就越高。本课题所制备的多孔BC-PLGA-HA复合支架孔隙率为（64.73±5.65）%，抗拉强度（8.923 1±0.901 2）N/mm2，能够同时具有较高的力学强度和孔隙率，高强度可能来源于BC的本身的优良物理机械性能和支架制备时PLGA溶液渗透入BC内部立体网状结构并与其牢固结合有关，高孔隙率可能和BC本身的高亲水性和支架的多孔结构有关。因此有望用于修复人体功能和负荷区。
本实验将成骨样细胞MG-3植于多孔BC-PLGA-HA复合支架上体外培养5天后电镜扫描结果显示：细胞能够紧密黏附并有所伸展，达到一定程度的汇合并已开始增值，表明细胞生长状况良好。MTT检测结果显示培养1 d后多孔BC-PLGA-HA组与对照组组间数值差异无统计学意义（P ＞ 0.05），可能是因为在接种早期MG-3细胞处于潜伏适应期，支架材料对其增殖的影响作用尚未发生；培养3～5 d，多孔BC-PLGA-HA组细胞增殖速度明显快于对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。在培养5 d后测量MG-3细胞内ALP的活性发现：多孔BC-PLGA-HA组细胞内的ALP的合成量明显高于对照组。说明多孔BC-PLGA-HA复合支架更有利于MG-3细胞的增殖和成骨分化。
综上所述，本课题采用溶剂浇铸法制备的多孔BC-PLGA-HA复合支架具有良好的力学性能、孔隙率和生物相容性，有望作为修复功能区和负载区的生物材料，为组织工程支架材料提供新的选择和思路。针对缺点与不足，实验在支架的制备、理化性能和生物相容性方面进行了初步的探讨，有关复合支架其他相关性能、支架成分对支架本身性能的影响等方面内容，还需要进更多的实验来进行分析和讨论。
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【关键词】藤本豆秸秆；纤维素酶；热带假丝酵母；酿酒酵母；乙醇
一、材料与方法
1.材料。藤本豆秸秆，取自吉林省九台市郊，当年产。菌种：纤维素酶产生菌（Trichoderma reesei TJK108）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae SQY-002），由吉林工程技术师范学院食品工程学院实验室保存。热带假丝酵母（Candida tropi
calis），购于中国菌种保藏中心。液体种子培养基：YEPD培养基。发酵培养基：取一定量预处理后的藤本豆秸秆，冷却后用30%的NH4HCO3调节pH=4.8，并于121℃下湿热灭菌20min。
2.藤本豆秸秆生产乙醇的总工艺流程（图1）。（1）藤本豆秸秆的预处理。采用稀硫酸预处理玉米秸秆，将玉米秸秆风干后磨碎，于75℃烘箱中烘一昼夜至水分含量恒定，与1.0 %的稀硫酸按一定比例混合（固液比为1：10），121℃下蒸煮120min。（2）纤维素酶的生产―Trichoderma reesei TJK108的固态培养。采用固态发酵工艺。取预处理后的藤本豆秸秆，过滤，滤渣用水和丙酮洗至pH 值呈中性，其主要成分为纤维素。添加0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4・7H2O，3%（NH4）2SO4，0.2%吐温-80，10%酒糟，调节pH值至4.8，含水量至70%，121℃灭菌60min，接入1.5×107～2.0×107个/g底物Trichoderma reesei TJK108 孢子悬浮液，于30℃培养，发酵7d。
（3）菌种活化与稀释。从试管斜面上分别取热带假丝酵母和酿酒酵母，在YEPD液体培养基中活化（150r/min，30℃，18h）血球计数板计数，并稀释至108个细胞/ml。（4）酵。向发酵培养基中添加适量的纤维素酶，按10%（体积比，下同）的接种量接入一定比例的热带假丝酵母和酿酒酵母，根据影响发酵的条件进行发酵试验，并选取乙醇产率（乙醇/藤本豆秸秆，g/g）作为测试指标。一是最佳温度的确定。藤本豆秸秆在不同温度下进行发酵（发酵周期为72h，转速为120r/min，纤维素酶用量为40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳温度。二是最佳时间的确定。藤本豆秸秆在不同时间下进行发酵（发酵温度为30℃，转速为120r/min，纤维素酶用量为40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳时间。三是最佳转速的确定。藤本豆秸秆在不同转速下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72h，纤维素酶用量为40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10 %），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳转速。四是最佳纤维素酶用量的确定。藤本豆秸秆在不同纤维素酶用量下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72 h，转速为120r/min，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳纤维素酶用量。五是最佳酵母菌接种量的确定。藤本豆秸秆在不同酵母菌接种量下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72h，转速为120r/min，纤维素酶用量为40I
U/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳酵母菌接种量。六是最佳酵母菌接种比例的确定。藤本豆秸秆在不同酵母菌接种比例下进行发酵（发酵温度为30℃，发酵周期为72h，转速为120r/min，纤维素酶用量为40IU/g对底物，酵母菌接种量为10%），分别测定乙醇产率，确定发酵的最佳酵母菌接种比例。（5）蒸馏。取100g发酵样，加入200ml蒸馏水，缓慢蒸馏出100ml馏出液。
3.乙醇含量测定。采用气相色谱法。
二、结果与分析
（一）稀硫酸预处理藤本豆秸秆的结果
采用稀硫酸预处理藤本豆秸秆，在主要成分中，半纤维素是第一个参与反应的，木聚糖部分解聚和溶解，然后水解成木糖（反应1），外源硫酸的存在对于木糖单体的形成尤为重要，若缺乏外源酸，就会形成木糖低聚物。该过程中，只有少量的纤维素发生水解反应生成葡萄糖，而木质素经历了解聚作用，但在水或酸中维持不溶解状态。稀硫酸处理后，溶液中主要是半纤维素分解得到的木糖等五碳糖，粉状固体中主要含有已分离开的纤维素和木质素。正常条件下，纤维素的水解需要十分苛刻的条件，但是经稀硫酸处理，半纤维素水解、纤维素和木质素分离开后，可以大大增加纤维素的水解性，这时加入纤维素酶，纤维素酶先吸附到纤维素表面，然后其中的内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，外切酶从葡聚糖链的还原或非还原端进行水解产生纤维二糖，β-葡萄糖苷酶水解纤维素二糖为葡萄糖。这3类酶“协同作用”最终将纤维素降解为葡萄糖（反应2）。反应1（木聚糖的解聚反应）：（C5H8O4）n+H2O（C5H8O4）（n-1）+C5H10O5，反应2（在纤维素酶的作用下纤维素降解生成葡萄糖的反应）：（C6H12O6）nnC6H12O6。
（二）纤维素酶的生产情况
在Trichoderma reesei TJK108的固态培养期间，每天测定1次酶活力。酶活力随时间的变化见表1。固态培养过程中各主要影响因素的变化见表2。由表1可知，发酵前期（0～2d），由于孢子要萌发成菌丝，故纤维素酶生成较慢，酶活较低；发酵中期（2～7d），孢子已完全萌发成菌丝，菌丝代谢旺盛，纤维素酶大量生成，酶活增长较快，酶活力在第7天时达到最高，为
333.4U/g底物；第8 天以后再延长发酵时间，菌体老化，纤维素酶活力增长缓慢，呈下降趋势。可见，纤维素酶产生菌（Tricho
derma reesei TJK108）的固态培养时间以7d为最佳。
表1 酶活力随时间的变化
由表2可知，发酵第1天，纤维素、还原糖和培养基中的营养被消耗，菌体开始生长；2～4 d，当菌体消耗30%左右还原糖后，其生长开始进入旺盛期，该阶段为纤维素的主要消耗期，纤维素消耗了36%左右；4 d 后，纤维素的消耗开始减缓。产酶培养基初始pH值为4.8；0～2d，由于铵根离子被消耗，pH值迅速下降；2～4d，由于培养基中无机盐金属离子的缓冲作用，pH值基本维持在4.0左右；随着纤维素酶的大量合成，到产酶末期，pH值迅速上升。纤维素酶主要是胞外酶。这表明随着纤维素酶的合成，胞外蛋白质随即开始形成。
（三）发酵温度对乙醇产率的影响
由于藤本豆秸秆中含有47.2%的纤维素及20.6%的半纤维素，稀硫酸预处理藤本豆秸秆过程中半纤维素被水解成戊糖，主要为木糖，预处理纤维素再经纤维素酶酶解成纤维二糖继而在葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。若温度较低，纤维素酶解速率较低，且乙醇发酵过程中所需要的各种酶酶活较低，影响乙醇产率；温度过高，发酵过程中所需要的一些酶会因此失活，也影响乙醇产率。该试验采用混合菌种发酵使藤本豆秸秆水解成的葡萄糖及木糖均能发酵成乙醇。试验中所采用的热带假丝酵母与酿酒酵母最适发酵温度分别为30℃与31℃。有研究发现，当发酵温度为32℃时乙醇产率较高。
（四）发酵时间对乙醇产率的影响
乙醇发酵需要一个合理的发酵周期，发酵时间的长短直接影响着乙醇产率的高低。在发酵前12h内，乙醇产率变化很小；从12h开始，乙醇产率迅速增加；当达到72h左右时，乙醇产率达到最大值；发酵72h以后，乙醇产率开始降低。分析造成这种现象的原因：在发酵初期，酵母以发酵醪中的糖分为碳源，酵母不断代谢糖分发酵成乙醇；发酵一段时间后，发酵醪中的糖分含量减少，酵母可能开始利用自身的代谢产物乙醇为碳源来维持自身的生长和繁殖。所以，在利用该菌株生产乙醇过程中，应该尽量控制好发酵时间，当发酵达到72h时，就可终止发酵。
（五）转速对乙醇产率的影响
纤维素酶解需要与底物充分接触；一定的转速能保证纤维素底物与纤维素酶充分接触；此外，由于菌株热带假丝酵母一般在“限氧”条件下发酵，这是由酵母本身的代谢方式所决定的。酵母对木糖的代谢分别依赖于：木糖还原酶将木糖转化为木糖醇；木糖醇脱氢酶将木糖醇转化为木酮糖；木糖激酶将木酮糖转化为5-磷酸木酮糖，后者再经3-磷酸甘油醛进入糖酵解途径，在木糖醇转化成木糖酮的过程中，需要有氧的参与。一定的转速可提供该酵母发酵所需要的溶解氧，转速过高，可能会使发酵生成的一部分乙醇挥发掉，而且转速过高，发酵液中的溶解氧增加，还可能导致生成的乙醇氧化成醋酸等其他产物。该试验的适宜转速约为120r/min。
（六）纤维素酶用量对乙醇产率的影响
预处理的藤本豆秸秆经纤维素酶酶解成葡萄糖及纤维二糖，纤维素酶的用量直接决定着预处理玉米秸秆纤维素的最终水解情况及乙醇产率。纤维素酶最适作用条件为温度50℃，pH=4.8，纤维素酶最适用量25IU/g。乙醇产率随着纤维素酶量的增加而增加，当酶活力达到45IU/g时，乙醇产率最高。分析原因可能是50℃时，温度太高，不适于酵母的生长代谢所致。因此，该试验中发酵温度较低为30℃。这个温度对于纤维素酶解所需最适温度要低，会使纤维素酶解速率降低，所以纤维素酶的用量要高一些，以提高纤维素酶解速率，最优量为45IU/g。尽管45IU/g是最优的酶量，但是使用如此高活力的纤维素酶，在经济上是不合算的。当纤维素酶活力从40IU/g增加到45IU/g时，乙醇产率增加甚微。因此，选用40IU/g纤维素酶浓度较为合适。
（七）酵母菌接种量对乙醇产率的影响
酵母菌接种量对乙醇产率有一定的影响，接种量过低，菌体产生的生物量较少，发酵过程不充分，乙醇产率较低；接种量过高，增加了细胞的维持能需要，乙醇产率也无法积累到较高水平。接种量在10%时，乙醇产率最高。
（八）酵母菌接种比例对乙醇产率的影响
采用混合菌种发酵生产乙醇，2种菌的比例对乙醇产率有着一定的影响，热带假丝酵母既能发酵葡萄糖又能发酵木糖生产乙醇，但其发酵葡萄糖产乙醇能力较差，发酵木糖产乙醇能力较强，而酿酒酵母一般不能发酵木糖，但它能快速有效地发酵葡萄糖生产乙醇。采用混合菌种发酵就很好地解决了预处理藤本豆秸秆酶解生产乙醇的技术问题，同时由于纤维素酶解藤本豆秸秆是一个复杂的酶解过程，而预处理藤本豆秸秆水解液中木糖的含量很高，所以采用混合菌种发酵时具有较强发酵木糖能力的热带假丝酵母比例要高一些。热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比为2：1时，乙醇产率最高。
三、结论
植物纤维资源是地球上分布最广、含量最大、品种最多、价格低廉且可再生时间短的有机资源之一，利用可再生的植物纤维资源生产燃料乙醇对于缓解能源危机具有重大意义。该试验得到的纤维素酶生产的最适条件是：藤本豆秸秆由稀硫酸处理后，滤渣中添加适量营养，接入15×107～2.0×107个/g底物Trichoderma reesei TJK108孢子悬浮液，于30℃固态培养7d。发酵的最适条件为：发酵温度31℃，发酵周期72h，转速120r/min，纤维素酶用量40IU/g对底物，热带假丝酵母与酿酒酵母的接种比2：1，酵母菌接种量10%，在该条件下乙醇产率最高为0.30g/g。藤本豆秸秆生产乙醇是利用再生资源解决液体燃料的一个国际性大问题，不少国家已在多年以前就开展该项工作。但目前还没有实现大规模工业化生产，主要是经济方面的问题。因此，今后应开发预处理新技术，培育价廉高活力的新型纤维素酶及五碳糖和六碳糖同步发酵的新菌种，研发出流程短、效率高和能耗低的玉米秸秆生产乙醇新工艺，从而降低乙醇生产成本，这将是今后科研的主攻方向。
参 考 文 献
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《财经》记者获悉，研发中心将以推动中粮集团纤维素乙醇的发展为主要任务。在此之前的5月27日，中粮集团宣布与中石化、丹麦诺维信公司(Novozymes)联手打造中国规模最大的纤维素乙醇工厂。新工厂将于2011年正式投建，规模为1万吨／年。
中粮集团科学研究院副院长兼生化研发中心总经理郝小明透露，中粮集团的万吨级纤维素乙醇项目，国家能源局会给予10％的资金补助。该项目的前期投资是2.7亿元，这意味着2700万元的政府补助。
燃料乙醇是明显受政策驱动的行业，2007年后，由于政策转向，一度火爆的燃料乙醇产业陷入停顿。国家能源局此举，让整个行业的前景再度变得光明起来。
中粮集团早在2006年即涉足乙醇行业，至今已投入逾百亿元资金，2009年乙醇产量为84.6万吨，几乎占全国产量(172万吨)的一半，但均为粮食和木薯乙醇。按中粮集团的规划，2020年纤维素乙醇的产量将达到百万吨级。
6月29日，中粮集团董事长宁高宁对《财经》记者表示，中粮一直致力于突破纤维素乙醇的技术瓶颈，中粮希望纤维素乙醇成为下一代能源。
纤维素乙醇上台
作为一种可再生能源，乙醇最广泛和最新的用途是和汽油调配形成车用燃料，即乙醇汽油。目前，中国试点推广的E10乙醇汽油，就是在汽油中掺入10％的乙醇而成。专家认为，推广乙醇汽油不但可减少石油消耗，还可减轻环境负担。在很多国家，乙醇汽油都被推崇为走向能源独立的“国产入场券”。
中国推广乙醇的最初设想出现在1999年，当时，连年的粮食大丰收使得时任总理朱基将粮食称为“甜蜜的负担”，这促使中国思考如何在粮食与能源之间搭建桥梁。
2001年，国家五部委颁布《陈化粮处理若干规定》，规定陈化粮主要用于生产乙醇、饲料等，并批准建立四家乙醇企业：丰原生化(000930.SZ)、中粮生化能源(肇东)有限公司(前身为华润酒精，下称中粮生化)、吉林燃料乙醇公司(下称吉林乙醇)、河南天冠集团。
2003年年末，中央政府针对四家乙醇企业制定了五年补贴计划：2004年企业每生产1吨乙醇可享受2736元补贴，此后逐年降低，到2006年降为1373元(2007年，财政部又制定《生物燃料乙醇弹性补贴财政财务管理办法》，不再实施固定补贴，转而实行弹性补贴政策)。
得益于政策扶持，乙醇产业当红一时。众多企业参与其中，而中粮集团最为强势。通过或并购或入股，中粮染指四家定点企业中的三家――全资拥有中粮生化、控股丰原生化、入股吉林乙醇。
但好景不长。陈化粮很快消耗殆尽，企业不得不加入抢购玉米、小麦的行列。四家定点企业中，丰原生化、中粮生化和吉林乙醇均以玉米为乙醇主要原料，河南天冠集团则以小麦为主要原料。
很快，燃料乙醇被指责为“与民争粮”“与粮争地”“消耗的资源比提供的能源还多”。
乙醇企业另一个受人指责之处是生产成本过高，严重依赖财政补贴。
以玉米为例。目前玉米市场价每吨价格在1900元－2000元，按生产1吨乙醇消耗3，3吨玉米计算，1吨乙醇仅玉米的成本就达6270元－6600元，再加上其他成本，成本超过8000元。
丰原生化是上述四家定点企业中惟一的一家上市公司。2009年丰原生化全年净利润2.52亿元，而国家补贴额为8.83亿元，补贴额是利润的2.7倍。
2007年，乙醇的发展形势急转直下。当年6月，政府停止审批粮食乙醇项目。
显然，当务之急是发展非粮乙醇和降低生产成本。
2008年年初，中粮集团的20万吨木薯乙醇项目正式投产，这是中粮集团第一个、亦是中国惟一一个非粮乙醇项目，负责运作此项目的广西中粮生物能源有限公司(下称广西中粮)成为中国第五家乙醇定点生产企业。
然而广西中粮的发展同样难言顺利。6月27日，广西中粮副总经理任连彬对《财经》记者坦言，公司目前仍未盈利，原因同样是原料(木薯)价格过高。中粮集团曾计划在广西再建一个30万吨的木薯乙醇项目，但时至今日尚未启动。此外，虽然木薯和玉米、小麦相比，已属“非粮”，但仍有“与粮争地”的问题。
“中国适合种植木薯的地方有限，且能种植木薯的地方也可以种植玉米、小麦等，还是涉嫌“与民争粮”。中国农村能源行业协会生物质能专业委员会秘书长肖明松接受《财经》记者采访时强调：“目前的共识是，再用玉米这类粮食作物发展乙醇肯定不行了，木薯这类非粮作物也只能是一种过渡性原料。今后的发展方向只能是用纤维素生产乙醇。”
肖明松介绍，中国拥有发展纤维素乙醇的原料优势。纤维素广泛分布于农作物秸秆、皮壳当中，价格低廉。
农业部的数据显示，中国每年可利用的秸秆资源量为6亿-7亿吨，除了喂养牲畜和秸秆还田，多余的秸秆即可用来生产乙醇。在目前的技术条件下，大约5吨7吨秸秆可转化为1吨乙醇。
“真正有意义的就是发展纤维素乙醇。”生化工程国家重点实验室副主任陈洪章告诉《财经》记者。陈1985年即开始投身纤维素乙醇的研究，是该领域的权成。在他看来，目前我国掌握的纤维素乙醇技术并不比国外落后，技术一旦进一步突破，最终的产量可能比玉米、木薯所生产的乙醇之和还要多。
但正是因为受制于技术瓶颈，纤维素乙醇的成本远高于粮食及木薯乙醇，这使得目前全球范围内均未能实现纤维素乙醇的商业化生产。
降低成本是关键
目前看来，在纤维素乙醇技术的探索上，中粮集团在国内企业中走得最远。
2006年4月，中粮集团在黑龙江肇东投资兴建了一个500吨／年的纤维素乙醇试验装置。该装置当年10月投料试车成功。据《财经》记者了解，该试验装置最初的生产成本高达2万元／吨，随后成本逐步下降，目前最低能控制在6000元7000元／吨。
利用纤维素生产乙醇一般要经过原料预处理、发酵、乙醇粗提、乙醇精提和成品燃料乙醇五大工艺流程。目前，中粮集团的多项技术已接近国际先进水平。以500吨／年的纤维素乙醇试验装置为例，其多项关键技术指标在行业内均处于领先地位，比如纤维素转化率超过了90％、半纤维素转化率超过95％、糖转化率超过85％等。
被中粮集团寄予厚望的万吨级纤维素乙醇项目将于2011年三季度在黑龙江投建，中粮作为投资方负责投资，中石化作为终端销售渠道辅助，诺维信为工厂提供技术支持。各方对具体投资比例避而不谈，但这种强强组合值得期待。
中粮集团内部人士预估，该项目成本可能在8000元-9000元之间。
其中酶(用于将纤维素转化为糖)的成本最高，为2400元左右(占总成本30％)；原料成本2100元左右(占总成本26％){水电约占2000元(占总成本25％)；人员工资和设备折旧等1500元左右(占总成本19％)。
按现行政策，乙醇是以90#汽油出厂价的91.11％卖给中石油或中石化，后者再以90％汽油加10％乙醇混配销售给终端消费者。也就是说，没有政府补贴的话，纤维素乙醇的成本只有降到汽油的九成以下，才有利可图。目前，90＃汽油出厂价在7000元／吨左右。
显然，对纤维素乙醇而言，8000元／吨的成本，还是太高了。
“我们有很大的信心，将万吨级纤维素乙醇项目的成本做到和汽油出厂价相当的程度。中粮上一个项目会经过非常严格的评审和论证，只有有了充足把握才会去做。”面对《财经》记者的疑问，郝小明如是作答。
按规划，中粮集团万吨级示范项目成功后，会进一步扩大规模，以真正实现商业化生产。“这是一个革命性的项目。”郝小明说，“项目成功后，中粮集团会进一步扩大规模，上马5万吨项目，从而真正实现商业化。”
过去几年，主管部门对纤维素乙醇难言热情，核心原因就是生产成本太高，补贴负担过重。“发展纤维素乙醇是方向，也是共识。”6月21日，发改委能源研究所副所长王仲颖接受《财经》记者采访时强调，“只要企业能将成本降下来，国家愿意给政策支持。”
商业化前景趋明朗
“之前业内普遍预测纤维素乙醇会在2015年实现商业化，现在看来，这个时司很可能会提前。”中国农村能源行业协会生物质能专业委员会秘书长肖明松乐观预计。
纤维素乙醇的高成本，很大程度上在于生产过程中所用酶的成本过高。今年5月底，丹麦诺维信宣布，公司已开始向市场供应诺纤力赛力二代(CeliicCTec2)酶产品。“新的酶只占纤维素乙醇成本的30％左右，而以前酶最高时占成本的80％以上。”诺维信研究发展中心高级总监吴文平告诉《财经》记者。
中粮集团即将投建的万吨级纤维素乙醇示范工厂使用的酶正是诺纤力赛力二代。《财经》记者获知，按照中粮集团和诺维信签署的相关合作协议，未来酶的成本仅占总成本的20％左右。这意味着每吨800元左右的成本下降。
中粮人士还向《财经》记者透露：目前的技术水平，7吨秸秆方能制成1吨纤维素乙醇。很快，中粮将做到5吨秸秆制1吨乙醇，从而将成本再降低600元。到2015年，中粮将实现商业化生产纤维素乙醇。
目前，除了中粮集团，河南天冠集团、山东龙力公司、山东泽生公司均在积极研制纤维素乙醇。国外则以美国Poet公司、加拿大logen公司为代表。
Poet公司同样使用诺维信提供的酶，目前该公司的实验装置已能将纤维素乙醇生产成本控制在2.35美元／加仑(约合5330元／吨，相当于国内90#汽油价格的七成五)。
山东泽生公司总经理庞建向《财经》记者介绍，公司早在2004年即意识到纤维素乙醇大有可为，并于2006年上马了一个3000吨／年的纤维素乙醇示范项目。因为没有补贴，这个项目一直亏本。但庞建仍然表示，乙醇是公司的核心战略业务，“我们不会放弃，一直有扩大产能的计划。”
和山东泽生类似，河南天冠集团也在积极谋求产能扩张。“我们下一步计划在南阳建立一个纤维素乙醇的产业群，总产能将达到12万吨／年。”天冠集团总工程师杜风光告诉《财经》记者。
多位接受《财经》记者采访的人士均表示，纤维素乙醇实现商业化生产，还需要扩大乙醇汽油的试点范围，否则将出现有产品无市场的局面。
中国正式推广乙醇汽油是在2002年年初。当时河南省的郑州、洛阳、南阳及黑龙江省的哈尔滨、肇东等五城市成为首批试点，这些地区禁止销售普通汽油。2004年2月10日，试点扩大，黑龙江、吉林、辽宁、河南、安徽五省全省被列入新的试点范围。此外，湖北省九个地市、山东省七个地市、江苏省五个地市、河北省六个地市也成为局部试点城市。但此后再未有新的城市入选试点。
“中国发展新能源特别需要政府在研发方面的大力支持，这不仅可以省掉每年几十亿元的专利使用费，更为重要的是能帮助中国在垒球竞争中赢得优势地位，并彻底改变中国的节能减排形势。”埃森哲大中华区能源业战略咨询负责人杨葳对《财经》记者表示。
根据埃森哲的研究，乙醇属于新能源中的“革命型技术”能源，一旦“技术获得突破，将大大改变新能源行业的竞争格局。”
当然，除了纤维素，乙醇还有别的技术方向。
6月20日，宝钢、中科院与新西兰LanzaTech公司签订了“利用钢厂尾气生产乙醇”技术商业化战略合作意向书。按照协议约定，宝钢将与合作单位共建生物能源研发中心，并在中国建立第一个商业化、大规模利用钢厂尾气生产燃料乙醇的工厂。
这是一个全新的乙醇技术方向，其要旨是将钢厂排出的一氧化碳尾气收集后，再通过生物技术进行转换，使之成为添加于汽油中的燃料乙醇。
而在生物质能这个行当中，燃料乙醇又算得上最默默无闻的一个。当生物质发电项目陆续上马，企业出现大面积亏损与政府出台补贴政策交相辉映之时，因商业化过程中存在技术、经济性风险以及原材料“与民争粮”的桎梏，燃料乙醇被迫沉寂了多年。
而今，跨越技术性和经济性这两道鸿沟后，新一代燃料乙醇（纤维素乙醇）技术粉墨登场。与第一代燃料乙醇（粮食乙醇）相比，除了减少对化石燃料依赖和温室气体的排放方面能锦上添花，纤维素乙醇更解决了原料来源难题，其生产成本也将有更强的竞争力。
燃料乙醇递变史
作为燃料，乙醇（俗称酒精）历史悠久当仁不让。鲜为人知的是：早在1896年，亨利・福特HenryFord便制造了第一辆使用纯乙醇作为燃料的汽车“Quadricycle”，并在其后的第12年即1908年制造了著名的T型轿车，该车实际上可使用乙醇、汽油以及用两者以任意比例混合而成的燃料，是名副其实的最早的灵活燃料汽车FFC（Flex-FuelCar）。现在的美国硬地赛车也是100%使用乙醇燃料。在中国，乙醇作为车用燃料同样历史悠久：解放前，在汽油匮乏的时候，乙醇更是成为不可或缺的替代品。
世界乙醇燃料行业经历了几个发展阶段：第一次大规模使用是在第二次世界大战期间。二战结束以后，由于乙醇燃料的生产成本大大超出来自石油的燃料，应用大幅度下滑，直到七十年代由于OPEC石油禁运引发的全球性经济危机开始后，以巴西、美国为首的燃料乙醇工业开始复苏，尤其是巴西开始大规模地使用乙醇作为车用燃料，并将发展燃料乙醇作为一项基本国策。
上世纪末本世纪初，由于在地表水中发现MTBE，而且MTBE开始被认为是一种长期存在于地表水中潜在的致癌物，美国的一些州开始禁止使用MTBE。2000年，美国联邦环保局建议禁止使用MTBE。2003年，美国的加利福尼亚州、纽约州和康涅的格州等开始使用乙醇替代MTBE作为抗爆剂，进一步促进了乙醇的需求和生产。
同期，由于公众对空气质量和健康越来越关注，世界对减少温室气体排放的呼声日益渐高。美国的汽油和柴油消耗占其温室气体排放总量的41%，燃料乙醇作为迄今为止惟一一种可大规模生产的替代交通燃料的可再生能源再一次得到了美国政府和公众的关注。
2004年，美国就业机会法案推出联邦营业税减免办法，乙醇的混配可得到乙醇营业税减免。2005年，美国总统布什8月签署了新的能源政策法案（EPACT05），制订了可再生燃料标准（RFS）要求使用乙醇和其它生物燃料，并且对E85加油的基础设施给予税收鼓励。从法律高度激励可更新能源的开发利用。该法案规定到2007年，美国总供给可再生燃料的供应量应达到47亿加仑/年（约1400万吨/年）；到2012年应达到75亿加仑（2200万吨/年）。这几项政策的出台给美国的以玉米为原料的乙醇工业的发展带来了非常好的发展契机，同时也引发了以美国为首的世界燃料乙醇发展的又一次高潮。
尽管乙醇作为燃料的大发展是美国带动的，但中国同样不落其后。随着中国经济的持续高速发展，对环境保护的关注以及对原油进口依赖的担心越来越深入人心，利用可再生能源又上升为国家战略。因为关系到国家的长期可持续发展，利用可再生能源不仅成为以美国、欧洲为代表的发达国家的基本国策，也成为中国的基本国策。
而基本与美国在同一时期，中国开始关注燃料乙醇产业，并且中国与西方国家也是基本相同的出发点：一方面减少对进口原油的依赖，另外一方面来探索低碳，减少污染。但在当时，中国还有一个特殊性。因为当时乙醇都是从粮食生产而来，中国通过使用燃料乙醇，增加农民收入，将农业与工业很好地衔接起来。
2000年9月，根据国务院领导批示精神，由原国家计委为组长单位，牵头组建了原国家经贸委、中国石油天然气集团公司、中国石油化工集团公司为副组长单位以及有关部门和相关单位参加的推广使用车用乙醇汽油工作领导小组，建立了联席会议制度。遵循“定点生产、定向流通”的原则按系统工程推进燃料乙醇的生产和应用。
“十五”期间，国家批准建设了4个生物燃料乙醇生产试点项目，形成生产能力102万吨/年，其中黑龙江华润酒精有限公司（现为中粮生化肇东有限公司）10万吨/年、吉林燃料乙醇有限公司30万吨/年、河南天冠燃料乙醇有限公司30万吨/年和安徽丰原生化股份有限公司32万吨/年。2004年2月，经国务院批准，在黑龙江、吉林、辽宁、河南、安徽5个省及河北、山东、江苏、湖北4个省的27个地市开展车用乙醇汽油扩大试点工作。此举被评价为“中国可再生能源发展的一个里程碑事件”，中国也一跃成为当时世界上继巴西、美国之后第三大生物燃料乙醇生产国。
2006年1月，国家颁布实施《可再生能源法》；2007年6月，《中国应对气候变化国家方案》正式颁布。《方案》决定优先发展太阳能、风能以及生物质能在内的可再生能源。2007年9月，国家发改委又在的《可再生能源中长期发展规划》中指出，要逐步提高优质清洁可再生能源在能源结构中的比例，力争到2010年使可再生能源消费量达到能源消费总量的10%左右，到2020年达到15%左右。这是各种可再生能源发展的一个量化目标。根据此规划，燃料乙醇的生产和使用在2010年要达到200万吨/年，到2020年将达到1000万吨/年。
跌跌撞撞的产业化
然而，发展燃料乙醇并非一帆风顺。2007年前后，因为气候变化等种种原因，粮食价格一度飞涨，尤其是东南亚出现的粮食危机更加举世瞩目。粮价的上涨，造成了乙醇的价格飙升，更引起了大家的担心：用粮食生产燃料乙醇会不会出现问题？
据了解，除了巴西的乙醇使用甘蔗作为原料之外，世界上主要的燃料乙醇生产国，美国、中国、加拿大均使用粮食作为主要原料。美国90%以上的燃料乙醇装置都是使用玉米作为原料；加拿大主要使用玉米和小麦。中国与加拿大相同，在第一批试点的四个燃料乙醇项目中，有三个（黑龙江华润、吉林燃料乙醇、安徽丰原生化）用玉米生产燃料乙醇，而河南天冠则是用小麦作为主要原料。尽管按照国家当时的规划，考虑到利用部分陈化粮，因为陈化粮每年都需要轮转，但在粮食危机的重压之下，利好已被大大削弱。
粮食乙醇的叫停，却使以纤维素乙醇（第2代乙醇）得到了空前的关注。实际上，利用纤维素来转化乙醇并不是一个新课题。早在1898年，德国出现了世界上第一套纤维素乙醇生产装置，该装置以废木料为原料，稀酸水解纤维素生成葡萄糖，糖发酵生产乙醇。
中国早期也进行过纤维素乙醇的生产，20世纪50年代，林业部门从前苏联引进植物纤维水解技术及设备，开展了木材稀酸、浓硫酸水解以及机械化学法水解等多种工艺研究。本世纪初以美国带动的二次乙醇燃料建设掀起高潮后，纤维素乙醇技术的开发又重新被提上紧迫的议事日程。
以美国为首的发达国家清楚地认识到：燃料乙醇的将来是纤维素乙醇。美国前总统小布什多次强调要大力开发纤维素乙醇技术，采用农业废弃物、林业废弃物以及能源作物生产纤维素乙醇逐渐替代粮食乙醇。美国政府制定了专门针对纤维素乙醇的政策，并大量投入资金支持该产业的发展。2007年美国国会通过《能源独立和安全法》，以立法形式规定了纤维素乙醇的使用目标，2022年可再生燃料的使用量要达到360亿加仑（1.1亿吨），其中纤维素乙醇160亿加仑（4800万吨）。
欧盟要求到2020年生物燃料要占全欧洲的运输能源的10%。同时，作为哥本哈根大会的签约方，欧洲各成员国政府也有义务实现大会提出的新目标，即到2020年实现减排10%。欧洲在其促进可再生能源使用的指导（renewableenergydirective，RED）中虽然没有制定第二代生物燃料的使用目标，但规定到2013年生物燃料在交通运输中相比于化石燃料温室气体减排35%，2017年减排50%，2018年减排60%，并且规定生物燃料原料不能来源于自然保护区、生物多样性地区等生态脆弱地区，同时要求生物燃料发展不能对环境产生新的影响。要达到这些目标，利用粮食基生物燃料远远不能满足其要求，因此以纤维素乙醇为代表的第二代生物燃料也是欧盟的必然选择。
2005年前后，全世界掀起了纤维素乙醇开发的高潮。一时间仅在美国，就有20多家高科技公司在进行纤维素质生物材料转化的研究。美国政府2007年投资10余亿美元，其中3.75亿美元用于建立3个生物能源研究中心，吸引一流大学和研究机构参与相关的基础研究，另外利用3.85亿美元吸引企业参与此项产业发展，并建立6个万吨级以上的纤维素生物炼制厂建设。包括Shell,BP等在内的世界上主要的石油公司也纷纷直接或间接地参与，投入了大量的资金。
2008年美国粮食、资源、能源法案（Food，ConservationandEnergyActof2008）中规定将提供10亿美元资助生物燃料和生物能源项目，专门针对第二代生物燃料的条款，其中包括对纤维素生物燃料提供0.27美元/升的税务补贴，为生物燃料项目提供贷款等优惠政策。
2009年以来，尽管美国面临严重的经济危机，新任能源部长朱棣文仍宣布从经济复苏计划中追加近8000万美元用于先进生物燃料研发和产业化。
西方的其他发达国家也不甘落美国之后，加拿大提供4.3亿美元建立Next Gen Biofuel基金以促进新技术的开发。澳大利亚拿出1200万美元资助第二代生物燃料开发。欧盟在其FP7（Seventh Research Framework Programmeof Europen Commission）建立了25亿美元的专项资金以资助包括纤维素乙醇的10个第二代生物燃料项目。
福岛“核震”后的机遇
中国的燃料乙醇生产企业、科研院所等，也先后开始了对纤维素乙醇生产技术的开发。产业界看到的首先是纤维素乙醇的广阔前景。根据我国《可再生能源中长期发展规划》，到2010年年底，燃料乙醇的生产和利用要达到200万吨，2020年要达到1000万吨。这就意味着，未来10年中国还需要生产800万吨燃料乙醇。结合2007年的乙醇产业新政，这800万吨的纤维素乙醇都必须用非粮作物生产，而中国恰又具有非常丰富的农业废弃物资源。行业数据显示：到2020年，中国可用来转化成燃料乙醇的农业废弃物可达到2亿吨，可以支持5000万吨燃料乙醇的生产。如此，纤维素乙醇的出现不仅对于国家能源安全、环境保护非常有利，对农民增收也大有裨益。
然而，行业内公认，目前生化法制备纤维素乙醇技术主要存在三方面的瓶颈：缺乏高效的预处理技术与手段，纤维素水解酶成本偏高和有效利用C5单糖的基因工程菌的构建。而利用生物质合成气微生物转化制备乙醇，则存在着投资大、转化率低、反应体系传质难等问题。这些因素造成了纤维素乙醇生产成本过高。尽管一些国家制定的温室气体减排政策有利于纤维素乙醇技术的开发和发展，但大多数投资者担心，仅依靠碳排放费用，纤维素乙醇的生产成本与石化能源乃至第一代生物乙醇相比缺乏经济竞争力，实现商业化可能遥遥无期。
技术是纤维素乙醇产业化首先要迈过的一道槛。何翌告诉记者，“在天然木质纤维素材料中，纤维素被木质素、半纤维素、胶质和蛋白质等组分包围。与传统的生产乙醇的糖质和淀粉质原材料相比，木质纤维素结构更致密，抵抗化学、酶和生物降解等外界作用的能力更强。因此，将木质纤维素原料中的纤维素、半纤维素转化为可发酵性糖，再转化为乙醇的过程中，预处理、酶解发酵、木质素分离等几个关键步骤都非常具有挑战性。”他补充说，“同时，虽然纤维素是大自然中存在最广泛的材料，但如何能够使用在不同地域生长的不同种类不同特性的纤维素质材料，也是纤维素乙醇技术商业化必须要突破的课题。”
而经济性的评价尤为关键。“正如人类社会要追求可持续发展，纤维素乙醇的生产和应用也需要可持续，那么经济可行则是可持续的纤维素乙醇生产技术的必然前提。纵观人类科学技术的发展历史，有不计其数的技术只能在实验室里束之高阁，没有得到推广，都是因为经济性和实用性无法实现。”何翌说。
值得欣慰的是，这些都没有成为纤维素乙醇产业化发展的阻碍。而通过多年的反复研究试验，Chemtex和其母公司M&G已经实现了木质纤维素转化的技术的突破，并将其工程化，基于这一技术的商业化纤维素乙醇项目正在顺利建设之中。在燃料乙醇行业浸淫了近10年的何翌彷佛已经看到纤维素乙醇行业的发展高潮。
兼顾产业链
2003年，Chemtex康泰斯开始参与第一代乙醇工厂的设计和建设，三年后Chemtex果断地将纤维素乙醇生产技术的开发作为一个战略。与众多其他公司只重视纤维素生产链条中的个别关键环节不同的是，康泰斯一开始就定位在要研发可工程化的一整套工艺过程技术。而这被何翌看作是康泰斯区别于其他纤维素乙醇技术研究者的关键。
据了解，2007年，康泰斯针对纤维素乙醇的技术开发专门建立了一个实验室，这个研发中心有50多个科学家和工程师。在研发方面，康泰斯已投入近两亿美元。
在研发初始阶段，根据几十年的工业装置的设计、建设和运行经验，康泰斯就已经考虑到日后的工程化。“我们发现，过去围绕纤维素转化以及生产乙醇所做的大量研发工作忽略了工程化的需要，而工程化的技术是产业大规模发展的前提。”何翌说。“我们的目的是为了商业化而研究，所以研发的每个阶段，技术的每个环节，都和工程化紧密结合。”
何翌打了一个比方：“一栋房子，可能画得很漂亮，但最终不一定能建起来，因为工程上可能无法实现。现实生活中的每一座漂亮的建筑物的设计，比如说鸟巢，一定是建筑师和结构师共同完成的。在纤维素乙醇技术的开发过程中，Chemtex既是建筑师也是结构师，从确定研究计划，筛选技术路线，选择工艺过程和设备的形式，都充分评估工程化和商业化的风险。将研发和工程化科学地结合起来，才能少走弯路，尽快取得商业化的突破。”
为此，康泰斯在2006年制定了一套完整的纤维素转化技术（Pro.E.Sa）开发的五年计划（2007～2011年）：第一，通过基础研究，确定工艺路线；第二，建设一个连续生产的中试装置，验证并改进工艺，同时为进一步放大做准备；第三，建设一个4万吨/年的商业示范工厂。
目前，Chemtex已经完成了Pro.E.Sa技术的工艺包的开发，并从2010年开始设计、建设每年生产4万吨纤维素乙醇的示范装置，该装置位于意大利的Crescentino，将使用当地的主要农业废弃物（麦草）和一种叫芦竹的能源作物作为原料，建成后将成为世界上最大的纤维素乙醇商业化的示范工程项目，生产的乙醇的成本将显著低于第一代乙醇。目前，这个属于欧盟FP7下的项目已经完成了大部分设计和设备采购，即将开始安装，预计将在2012年一季度投产。
恶补农艺学
“为什么第一代的生物燃料有问题，就是因为使用的主要原材料是粮和油，和人类赖以生存的食物体系形成了竞争关系。以纤维素乙醇为代表的第二代生物燃料要持续，就必须要克服这一问题。”何翌说，“就是业内常说的不与人争粮，不与粮争地。”
康泰斯认为，纤维素乙醇生产的推广和产业发展，需要因地制宜，从原料方面，要能充分利用现有的农林资源和作业体系，以降低建立和运营整个产业链条的成本，这样就要求纤维素乙醇的生产工艺能够适应广泛的来自不同地域的原料，不论是农业废弃物、林业废弃物还是能源作物。纤维素乙醇产业要能够与现有的农业体系匹配。“原来农业体系中已有的玉米秸秆、稻草、高粱杆等要能够用上，而新种的能源作物要能融入现有的农业体系，并利用上现有的收割、种植方法。”何翌告诉记者，“我们可以利用种不了粮食的地方――边际土地来种植能源作物。”
事实上，原有农业体系中的废弃物也亟需找到利用的途径。在国内，不论是东北、华北、华东、西南还是华南，农业废弃物的不合理焚烧早已是公认的事实，不仅造成环境污染，严重时甚至影响到民航的正常起落。尽管国家三令五申，一些地方政府还出台补贴政策，阻止焚烧农业废弃物。“如果能把这部分农业废弃物利用起来，这不仅对国家是非常好的一件事，也能够有利于农民增收。”何翌说。“如何利用？只有通过商业化。”
除了农林废弃物，康泰斯还展开了对能源作物的研究。“生物燃料产量的最优效率依赖于从单位生物量中最大化燃料产量和最小化能量输入。”何翌说，“与农业废弃物相比，能源作物有一些明显的优势。首先，能源作物具有更高的能量密度，并能有效地把边际土地利用起来，甚至可以改量土地。同时，选择合适的能源作物可有效减轻农业废弃物所面临的存储问题。”
“比如在中国北方农作物一年耕种一季，使用农作物废弃物生产乙醇就需要把废弃物收集储存起来。”何翌认为，“原材料的来源会逐渐从农业废弃物逐步过渡到农业废弃物和能源作物并举。”
据了解，康泰斯在意大利有60公顷的土地专门用来进行农艺学的研究，包括对已有的农作物和潜在的能源作物的筛选。比如对纤维高粱、芦竹、柳枝稷等能源作物品种的选择、种植、改良和收获进行整套的研究。同时，康泰斯还积极在北美、中美和南美开展农艺学研究，积极寻找当地最适合的能源作物。目前，康泰斯也计划在中国展开类似的工作。
在世界各地寻找适于生产纤维素乙醇的能源作物意义重大。种植能源作物具有诸多优点。第一，可以减少土壤流失，有利于保护生态环境。第二，通过形成可持续循环的能源利用方式,减少温室效应。能源作物通过光合作用可以吸收大气中的CO2，将其转化为能量储藏，并进一步被开发利用，从而良性消耗了社会经济发展与生活中产生的温室气体。第三,能源作物可以作为动物的饲料,而它们的生长区又可以作为动物的栖息地。第四，能源作物的种植又会带动其他相关产业,如运输业、服务业等,促进产业结构的调整,加速农村城镇化和工业化进程。
何翌告诉记者，“到目前为止，很多技术开发者都是针对某一种已有的原材料进行研究，比如有的专门针对玉米秸秆，有的专门针对玉米芯，有的专门针对木材。康泰斯的定位不同，我们的想法是，为全世界提供纤维素转化的技术解决方案，那么开发出的技术要能够在全世界开花结果，就要能够适应全世界的资源。”
神奇预处理
纤维素质原材料进入工厂后，第一步就是预处理。不要小看这一过程，它却是纤维素乙醇生产过程中影响投资成本和运行成本最关键的环节。“预处理过程把纤维素、半纤维素从木质素中游离出来，同时减少木质纤维素的结晶度，提高酶制剂的接及性。如果预处理效果不好，会直接影响后面的工序。首先，如果各组分分离得不好，在后面的酶解工序消耗的酶制剂就多，而目前酶制剂的成本仍然是纤维素乙醇生产成本的一个较重的组成部分。”何翌说。
他补充说，“同时，预处理过程还要兼顾到纤维素和半纤维素的利用率，以及抑制物的产生。纤维素和半纤维素的收率不高，就意味着后面可发酵性糖的收率不高，最终原料消耗大，而生产出的乙醇少。，而抑制物是对后面的工艺流程中加入的酶制剂和酵母是有毒的。”
在何翌看来，理想的预处理技术应该具备如下特点：
第一，对原材料的要求要尽可能低（种类、大小）。秸秆之类的纤维素质生物原材料要先粉碎到一定程度，才能进到设备里，比如有的技术需要把秸秆或者玉米芯切到几个毫米，就要有磨的过程。对粉碎的粒度要求越细，投入的设备和能量就越多。
第二，理想的预处理过程应不需要额外的化学手段。许多技术在预处理过程中必须要借助酸、碱等来促进预处理过程，而所加入的酸、碱，在后续生产过程中又是不需要的，这就面临要将这些酸、碱等物质分离出来、重复利用，而酸、碱又会造成对设备材料的要求也更高，增加技术的复杂性和投资成本。此外，酸、碱的加入也增加了三废处理的难度。
第三，理想的预处理过程，产生的抑制物要尽可能少。抑制物产生得越多，后面需要的酶制剂和酵母就越多，生产成本就越大。
第四，理想的预处理过程，要能适应多种不同的原料。
康泰斯开发了自己的一种独特的预处理工艺。“我们对原材料的要求粉碎到10～15公分就可以进行预处理，而且预处理过程不需要添加任何化学品，只需要蒸汽，这还可以循环利用，同时，我们的技术在预处理过程中抑制物产生水平非常低。”
经过大量的研究和试验，康泰斯已经开发出一套工艺软件模型，根据要处理的不同原材料的成分和特性，预测最合适的预处理操作条件。
“和很多同行不同，我们的研究不是针对某一种特定原料，而是希望所开发的技术能够适应世界各地的广泛的生物质原料。使用Pro.E.Sa技术，通过调整预处理的操作参数，不同的纤维素质原材料可以得到非常接近的预处理效果。”何翌认为，预处理技术的掌握，源于Chemtex和其母公司M&G几十年研发、工程和设计经验的积累。“我们借鉴了很多我们过去在纤维素、石油化工和聚合物领域的知识和经验。”
正是预处理技术具备的优点――不添加任何化学品，使预处理过程中产生的抑制物水平低，得到的纤维素（六碳糖）、半纤维素（五碳糖）和木质素更加纯净，这就等于打开了另一扇门：将这些物质进一步深化加工成其他化学品。而康泰斯的下一步的目标就是，通过进一步开发研究，利用这一纤维素转化技术转化平台，进一步开发出更有价值的可再生的化学品，用来替代许多来自石油的材料。
在预处理后的酶解环节，康泰斯也开发出具有竞争力的工艺和设备。“我们的酶解反应器中干物质浓度可以达到40%以上，酶的添加量也不需要增加。”何翌说，“高浓度酶解是实现高浓度发酵的前提，实现了高浓度酶解和发酵，即可以降低生产成本，同时可以使用尺寸更小的设备，节约一次性投资。”
据了解，第一代乙醇技术的发酵过程就是利用粮食中的淀粉，将淀粉转化成六碳糖，而第二代乙醇技术预处理后出来的半纤维素是五碳糖，用传统的技术无法发酵。而康泰斯的技术能够同时利用六碳糖和五碳糖。何翌告诉记者，“即使有了合适的微生物同时发酵五碳糖和六碳糖，在尽可能短的时间完成浓度尽可能高的发酵仍然是个挑战。”
【关键词】 滇黄芩；总黄酮；提取方法；比较分析
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0021-03
Abstract：Objective To research the extraction rate of different extraction of total flavonoids from Scutellaria amoena.Methods To optimize the extract technology of flovonoids for Scutellaria amoena，five methods such as water extraction，ethanol extraction， cellulose enzyme-phosphate buffer solution extraction，ethanol ultrasonic extraction method，cellulose enzyme-ethanol ultrasonic extraction method，were useed to extract flavonoids for Scutellaria amoena， also were compared and analyzed the flavonoids by adopting the total content of flavonoids and the yield of dry extract as markers. Results The comprehensive values Y ranked in the order of cellulose enzyme-ethanol ultrasonic extraction，ethanol ultrasonic extraction， water extraction， ethanol extraction， Cellulose enzyme-phosphate buffer solution extraction. Conclusion The optimal method to extract flavonoids for Scutellaria amoena is Cellulose enzyme-ethanol ultrasonic extraction.
Keywords：Scutellaria Amoena；Total Flavonoids；Different Extraction Methods；Comparison and Analysis
滇黄芩（Scutellaria amoena C.H.W right）是云南道地中药材，地方本草《滇南本草》（明朝）记其“味苦，性寒，上行泻肺火，下降泻膀胱火”。滇黄芩为多年生草本，生于向阳坡草地、石隙或杂草丛中[1]。
滇黄芩是我国西南地区药用黄芩的主流品种，具有较高的利用价值。现代研究表明黄芩主要含有黄酮类成分及挥发油类、萜类、甾醇类等成分[2]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节脂代谢、抗肿瘤、保护心血管系统等作用[3-7]。滇黄芩与黄芩相似，主要含有黄酮类化合物，目前对黄酮类化合物的提取方法有水提、醇提、酶解等提取方法。据文献报道纤维素酶可以提高药材有效成分的溶出率[8]，赵洪等研究发现乙醇和纤维素酶在提取总黄酮类成分时具有协同作用[9]。高文秀等[10]研究表明超声-酶解法在提取总黄酮成分时同样具有协同作用。为寻找具有较高总黄酮提取得率的提取方法，本文对不同的提取方法进行比较和分析，为滇黄芩的研究和开发奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 滇黄芩（Scutellaria amoena C.H.W right）采自云南玉溪新平；黄芩苷标准品、纤维素酶（酶活力35U/mg）购自于中国药品生物制品检定所；所用试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器 H.H.S11-4电热恒温水浴锅；超声仪（KUDOS）；电子天平（赛多瑞斯北京电子有限公司）；UV759S紫外-可见分光光度计（上海精科）；RE-2000A旋转蒸发仪（亚荣生化仪器厂）。
2 实验方法
2.1 样品溶液及干膏的制备
2.1.1 煎煮法[11] 精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，第1次加10倍量的沸水，100℃回流提取1.5h，趁热抽滤，滤渣再加8倍量的水100℃回流提取1h，趁热抽滤，合并两次滤液，冷却至室温，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。
2.1.2 纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法[12] 精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，加入纤维素酶-磷酸缓冲水溶液（pH=4.8）60ml，煮沸3min，待冷却至室温，加20U/g（干原料）纤维素酶1.7mg，50℃回流提取8h，趁热抽滤，滤液置于沸水浴中灭活酶3min，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。
2.1.3 乙醇回流提取法[13] 精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，第1次加8倍量的60%乙醇水溶液，80℃水浴回流提取2h，趁热抽滤，滤渣再加6倍量的60%乙醇水溶液，80℃水浴回流提取0.5h，趁热抽滤，合并两次滤液，冷却至室温，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。
2.1.4 纤维素酶-乙醇提取法[14] 精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，加入50 %乙醇45ml，煮沸3min，待冷却至室温，加50U/g（干原料）纤维素酶4.3mg，50℃回流提取6h，趁热抽滤，滤液置于沸水浴中灭活酶3min，回收乙醇，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。
2.1.5 纤维素酶-乙醇超声提取法[15] 精确称取3.0g 干燥的滇黄芩粉末，加入55%乙醇90ml，煮沸3min，待冷却至室温，加50U/g（干原料）纤维素酶4.3mg，50℃超声回流提取3h，趁热抽滤，滤液置于沸水浴中灭活酶3min，回收乙醇，加蒸馏水定容至100ml，平行试验三次 ，测278nm处的吸光值。
2.1.6 干膏的制备 精密量取上述各样品溶液各10ml，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，50℃鼓风干燥至恒重，置于干燥器中冷却30min，称重，计算干膏得率。
2.2 标准品全波长扫描 取黄芩苷标准品溶液在200～400nm紫外下扫描，分别在278nm 和315nm处有较大吸收度，278nm有最大吸收，即λmax=278nm。
2.3 标准曲线的制备 精密称取黄芩苷对照品7.1mg，置于 25ml的容量瓶中，用70%的乙醇水溶液定容至25ml，摇匀，分别量取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml置于25ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度。采用紫外分光光度计测其在278nm的吸光度（A）。以吸光度对浓度（C）进行线性回归，得到回归方程 A = 63.248C - 0.0108 （R2 = 0.9998）。
2.4 样品的处理和提取率的计算 采集的样品经普春霞副教授鉴定为滇黄芩，清洗、干燥、粉碎过20目筛。测定方法参照标准曲线的制备流程，根据标准曲线测定总黄酮的含量，根据如下公式计算得率。
η= [（C×V）/m]×100%
式中浓度C为滤液中总黄酮的质量浓度，mg/ml，体积V为滤液体积，m为滇黄芩干质量，g。
2.5 五种提取方法的综合评价
将五种提取方法的总黄酮的得率和干膏得率进行标准化处理。
3 结果与分析
3.1 滇黄芩五种不同提取方法的总黄酮得率 滇黄芩五种不同提取方法对总黄酮得率的影响见表1。
从表 1可以看出，纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法的总黄酮提取得率最低，而纤维素酶-乙醇超声提取法的提取得率最高。由于滇黄芩中的主要成分是黄酮类化合物，黄酮类化合物易溶于乙醇难溶于水，则采用乙醇做溶剂的提取得率均高于水做溶剂的提取方法。植物细胞壁中有大量的纤维素，纤维素酶可以有效的破坏细胞壁，有利于成分的溶出。超声波同样能加速细胞壁的裂解，加速成分的溶出，提高效率，缩短时间，减少杂质。
3.2 滇黄芩五种不同提取方法的干膏得率 五种提取方法得到的滇黄芩总黄酮的干膏得率见表2。
从表2可以看出煎煮法得到的干膏得率最高，但煎煮法得到的总黄酮的得率却不高，说明煎煮法杂质溶出率高，纯化较困难。纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法得到的干膏得率和总黄酮的含量均较低，说明单纯的酶解法作用不明显。纤维素酶-乙醇提取法两个指标相对于纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法以及乙醇回流提取法均有所提高，说明纤维素酶和乙醇对滇黄芩总黄酮的提取存在协同作用。纤维素酶-乙醇超声提取法得到的干膏得率和总黄酮的含量最高，综合评价指标值最大，超声对滇黄芩总黄酮的溶出也有促进作用。
3.3 综合评价比较 对滇黄芩总黄酮的提取得率和干膏得率两个指标进行标准化处理，根据影响因素的主次选择不同的加权系数，计算综合评价指标Y值，其提取方法的综合评价比较见表3。
从表3可知Y值的大小顺序为：纤维素酶-乙醇超声提取法>乙醇超声提取法>对煎煮法>乙醇回流提取法>纤维素酶-磷酸缓冲水溶液提取法。说明纤维素酶-乙醇超声提取法适合滇黄芩总黄酮的提取，超声、纤维素酶、乙醇对黄酮类化合物的提取有协同作用。
4 结论
在中药制剂提取制备工艺流程中，中药制剂的质量受到多方面的影响，不仅要考虑到主成分的溶出度，也要考虑干膏得率，两者综合评价分析得出最佳提取工艺条件。根据实验结果得出滇黄芩最佳提取方法为纤维素酶-乙醇超声提取法，纤维素酶、超声、乙醇、50℃的适宜水浴温度，不仅使得滇黄芩总黄酮提取率增大，而且杂质的含量明显降低，有利于总黄酮的纯化，为中药中黄酮类成分的提取工艺研究奠定基础。
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