时间：2023-03-04 15:16:30
关键词 白蚁；纤维素酶；纤维素；降解
中图分类号 Q556.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）21-0235-02
纤维素是自然界中分布最广、蕴藏最多的一种天然可再生聚合体。自然界年产量纤维素超过1011 t的，按能量换算约等于近7×1011 t石油，而且纤维素无污染可再生，能循环环保使用[1]。白蚁遍布于除南极洲外的六大洲，全世界已知有3 000多种白蚁，初步统计总量超过3.5×1017头，纤维素年均消耗量约7×108 t。目前制约纤维素广泛应用的主要因素是纤维素酶的酶稳定性差、催化效率低、人工提取和表达的酶纯化难度较大、进行工业化大规模经济生产较难。白蚁纤维素酶对纤维素的开发利用具有特别重要的意义，已成为国内外研究的热点。本文就白蚁纤维素酶的研究进展作一简述。
1 白蚁纤维素酶简介
纤维素酶是一组能够水解纤维素的葡萄糖苷键并转化成葡萄糖的多组分酶的总称。纤维素酶包括内切酶、葡萄糖苷酶和外切酶。纤维素需要这些酶的共同出现并且协同作用共同催化才能完全被降解。到目前为止，纤维素酶降解纤维素的催化降解机理仍未得到完全阐明。微生物（包括原生动物、细菌、真菌和放线菌等）、植物和节肢动物等都能分泌产生纤维素酶[2]，但白蚁是分泌产生纤维素酶的最大群体。
白蚁纤维素酶主要包括外源纤维素酶和内源纤维素酶。外源纤维素酶由白蚁消化道特别是中、后肠共生的微生物包括原生动物和细菌及高等白蚁巢体真菌分泌产生。目前，还有部分白蚁暂无内源纤维素酶发现的报道。一直以来，人们认为动物自身不含纤维素酶，以纤维素为食的动物是通过体内共生微生物来降解纤维素的。1963年，Marshall et al首次检测到动物能分泌产生内源纤维素酶。1998年，Watanabe et al在白蚁中克隆到内源纤维素酶，从而证实了白蚁自身也能分泌产生内源性纤维素酶[3]。
到现在，研究发现白蚁内源纤维素酶包括内切酶和糖苷酶，主要在白蚁中肠的上皮细胞和唾液腺分泌产生[4]，暂时还没有关于外切酶的报道。一些研究发现：白蚁纤维素酶的酶学特性、稳定性、含量、组成成分及其分泌部位等与白蚁的品级、产地和种类等相关。白蚁体内的纤维素酶存在着动态的协调平衡。绝大部分白蚁通过内源和外源纤维素酶的协调催化降解作用，在体内形成高效地纤维素酶降解催化体系，在其独特的肠道结构和共生微生物的帮助下，将纤维素转为葡萄糖等营养物质以维持自身和共生微生物的生长。白蚁内源纤维素酶与外源纤维素酶的相互协同降解机制，白蚁与其体内微生物的共生关系现未得到完全阐明。
2 白蚁纤维素酶研究进展
至今，纤维素酶的研究已经历酶的提取纯化和克隆表达2个发展阶段。目前，人们主要集中在对纤维素酶的结构功能研究以及纤维素酶的高表达加以经济应用方面，并已在催化机理、生物合成调控及工业生产应方面用取得较大进展。人们对白蚁纤维素酶的研究，首先是从其共生微生物分泌的外源纤维素酶开始的。
1925年，Cleveland et al指出白蚁共生原生动物在白蚁消化降解纤维素中起着重要作用[5]。1932年，Trager[6]发现白蚁肠道共生的鞭毛虫能够分泌纤维素酶。1938年，Hungate et al发现内华达古白蚁进食的纤维素1/2以上被其共生原生动物降解[7]。
2005年，Inoue et al在家白蚁共生原生动物中克隆到了纤维素酶基因[8]，从分子角度证明白蚁体内存在着原生动物分泌的外源纤维素酶。Knig H、Drge S和Tamburini E et al先后分别在白蚁中分离获到具有纤维素酶活性的细菌[9]。
2007年，Warneck et al [10]对高等白蚁后肠共生微生物进行研究，发现大量纤维素酶基因，表明白蚁肠道细菌对白蚁纤维素的水解具有重要的作用。高等白蚁则能利用蚁巢共生真菌食取纤维素酶来催化纤维素。Martin et al发现撒哈拉大白蚁通过食巢真菌间接获取外切葡聚糖酶[11]。
1998年，Watanabe et al通过试验在白蚁的唾液腺中克隆到纤维素酶，从而证实了白蚁内源性纤维素酶的存在。随着研究的不断深入，越来越多的内源纤维素酶基因得以发现，内源纤维素酶在白蚁降解纤维素过程中的作用越来越为重要。
1925年科学家发现了白蚁共生微生物降解纤维素的现象，但纤维素酶基因方面的研究始于20世纪70年代末。1982年，Whittle et al [12]首次在微生物中克隆到纤维素酶基因。1998年，Watanabe et al首次克隆出白蚁内源纤维素酶基因。1999年，Tokuda et al克隆到纤维素酶全长基因并在大肠杆菌中得到表达[13]。
迄今为止，人们已经在白蚁肠道共生微生物中得到外源纤维素酶基因近1 000个，主要分属于糖基水解酶家族第45家族、第7家族和第5家族[14]，并已在大肠杆菌中成功表达近100个。白蚁内源纤维素酶基因已有20余种得到克隆，主要分属于糖基水解酶家族第9家族，目前也有不少在原核表达成功表达的报道。
目前，纤维素酶基因原核表达存在着产量低、活性弱、稳定性差和纯化难等的缺点，不适于工业大规模经济化生产。人们正尝试用真核表达系统来进行纤维素酶基因的表达研究，主要集中在酵母表达系统，并取得了一定的进展。同时，随着动物内源纤维素酶的发现的不断增多，为克服微生物分泌的纤维素酶原核表达的不足，白蚁内源纤维素酶的真核高效表达成为研究的热点。马斯科马公司发明一项白蚁纤维素酶在酵母中的异源表达的专利，能有效提高表达效果。
纤维素酶的最核心问题是酶稳定性差、催化效率低、人工提取和表达的酶纯化难度较大、工业化经济生产较难进行。因此纤维素酶的生物合成调控、降解催化机理和空间结构功能的基础理论研究，以及克隆和筛选出表达高活性纤维素酶的基因和利用分子生物学技术构建改造活性高、耐高/低温、耐酸/碱的纤维素酶生物工程菌的应用研究成为当今的主要研究方向。
近年兴起了基因重排、分子模拟和定点突变等技术，这些技术主要对蛋白质分子结构进行三维模拟，通过同源建模等手段进行理性分子设计，对天然酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性和耐酸碱性等进行合理化改造，具有较强的预见性和可操作性。
2002年，Attila Nemeth et al [15]对通过突变技术有效提高了纤维素酶的耐热性。2005年，JinFeng NI et al[16]对4种白蚁纤维素酶基因进行改造，酶活性提高了10倍以上。2009年，Kim Y S et al [17]通过定向进化有效提高了纤维素酶的活性，Liu W J et al [18]则提高了纤维素酶的热稳定性。2011年，Liang Chaoning et al [19]将内切葡聚糖酶进行改造，酶活性增加了近2倍。华南理工大学对白蚁 Nasutitermes takasagoensis的纤维素酶和来源于Thermom-onospora fusca 的纤维素酶进行同源建模，并将重组后的纤维素酶在毕赤酵母中成功表达[20]。广西大学对家白蚁内切葡聚糖酶进行饱和突变，并取得一定结果[21]。
3 展望
白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖，白蚁体内就是一个微型的生物发酵器。若能模拟白蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系，必是解决当前环境问题、能源危机的一条重要途径。纤维素酶的结构与催化机理、白蚁与其共生微生物的协同降解机制以及定向设计并高表达活性高、稳定性强的纤维素酶以便工业应用是当前白蚁纤维素酶研究面临的主要任务。随着研究的不断深入，白蚁纤维素酶将在人类生活中发挥出更大的作用。
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关键词 新能源；纤维素酶；应用
中图分类号Q1 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2011）48-0096-01
随着资源枯竭、能源短缺及环境污染等问题日益加剧，世界各国都在寻找开发新能源。纤维素是植物材料的主要组成部分，也是地球上数量最丰富的可再生资源。但是这些纤维素大部分没有被利用，造成巨大的资源浪费，还造成环境污染。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。利用纤维素酶将纤维素转化为人类急需的能源和化工原料，对于人类社会解决上诉问题具有重大的现实意义[1]。
1 纤维素酶的组成及其来源
纤维素酶的组成比较复杂，根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1，4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1，4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH，来自细菌的简称Cex）和β-葡聚糖苷酶（β-1，4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。
微生物是纤维素酶的最主要来源，其余生物生产的纤维素酶缺乏大规模应用的实际意义，采用微生物生产是最为方便和有效的方法[2]。不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的降解能力也大不相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用。而真菌具有产酶的诸多优点：产酶能力强，产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；酶之间有强烈的协同作用，降解纤维素的效率高， 是工业生产的主要菌种[3]。如木霉属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）和枝顶抱雄属（Acremonium）的菌株等就是对纤维素作用较强的菌种。
2 纤维素酶的应用
2.1 在食品业中的应用
纤维素酶可用于谷物和马铃薯中淀粉类的有效分离，果蔬汁及橄榄油的提取，豆类发芽中豆衣的去除，从大豆和叶子中分离蛋白质等方面[4]。它在饮品和调味品的酿造中也有广泛应用。在酱油的酿造过程中添加纤维素酶，既可提高酱油浓度，改善酱油质量，又可缩短生产周期，提高产率。在啤酒生产的大麦发芽过程中加入它可帮助大麦发芽，还可以改进啤酒的过滤性能，有利于酒精蒸馏。而在饮料生产中，它还可促进汁液的提取率，使汁液澄清透明，提高可溶性固形物的含量，并可将果皮渣综合利用。
2.2 在畜牧业上的应用
纤维素酶是畜牧业的一种新型饲料添加剂，能够分解饲料中结构复杂的纤维素，生成易消化的葡萄糖，便于动物吸收。该酶主要有3个作用：1）消除抗营养因素；2）补充内源酶；3）改善胃中微生态平衡。大量试验[5-6]表明，在饲料中添加纤维素酶对各种动物的饲喂效果十分显著。
2.3 在制浆造纸业中的应用
回收利用废纸是我国制浆造纸工业解决原料和环保问题的有效途径。酶法旧纸脱墨可以解决废纸利用过程中的环保及纤维质量下降问题。传统的脱墨方法易使纸的网状结构崩溃，纤维溶胀，纸和墨之间粘接力下降。纤维素酶法旧纸脱墨技术是指利用生物酶代替化学药品处理旧纸， 使油墨从纤维上游离出来，较之旧法具有游离度高、物理性能优、滤水性能好、白度高和残余油墨量低的优点，并且可以缩短脱墨时间[7]，应大力推广应用。
2.4 在生物质能源开发上的应用
资源的日渐枯竭，大规模开发利用可再生资源显得非常重要。而生物质是唯一可以转化为液体燃料的可再生资源，将生物质转化为液体燃料，不仅能够弥补如石油、煤炭、天然气等化石燃料的不足，而且有助于保护生态环境。纤维生物质中的纤维素可被纤维素酶降解生成还原糖，再利用还原糖的发酵来生产具有更强的可持续性的第二代生物燃料-纤维素燃料乙醇。这对解决人类的发展问题具有化时代的意义。目前生物乙醇主要是采用淀粉为原料生产，其成本价较高。为此，以廉价的农作物秸秆等生物废料为原料的纤维素生物乙醇生产技术已成为研究的热点，全球已有几十套中试生产线。我国现在也对生物燃料这方面积极开展科学研究与利用工作。
2.5 在其他方面的应用
纤维素酶也可用于中药的提取。中药酶法提取是选择适当的酶，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁结构而提取有效成分。与传统方法相比，该法具有温度低、效率高、无污染等优点[8]。
3结论
纤维素酶可以安全、高效地降解天然纤维素，这是其它处理方式无法比拟的。特别是在当今能源短缺、污染严重的时代，已经引起全世界的关注，其研究也取得了极大进展。随着研究的不断深入，相信在不久的将来，纤维素酶的应用范围会更加广泛，在更多领域中发挥更大的作用，尤其是在未来生物质能源的开发上。
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摘要：从腐烂秸秆畜禽粪便土层分离得到一株产纤维素酶细菌，经初步鉴定为谷草芽孢杆菌，其产纤维素酶活力在培养42h后达到最大72.18U/ml，最佳pH为7.0。
关键词：腐烂秸秆；纤维素酶；细菌分离
中图分类号：S14 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0070-1
0 前言
纤维素是世界上最为丰富而又可再生的一种多糖类物质，植物每年通过光合作用产生的纤维素类物质高达15.5×1010t[1]，纤维素酶在食品、饲料、纺织、造纸、制药、能源和环保方面有着重要应用价值[2]。纤维素在纤维素酶的作用下被分解成小分子可被利用的葡萄糖，用于食品、饲料生产，还能作为生产乙醇的原料，纤维素被分解后形成的L-乳酸，可用于生产可降解塑料，减少“白色污染”。目前很多研究说明很多真菌、细菌和放线菌都能产生纤维素酶。因此，分离筛选出高效生产纤维素酶的菌种具有重要的研究价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 从腐烂秸秆的畜禽粪便土层（距离地表层10cm）采集样品，将样品装入无菌袋中，带回实验室备用
1.1.2 实验仪器 恒温干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，超净台，紫外分光光度计，水浴锅。
1.1.3 培养基 富集培养基：叶粉或秸秆粉 5g/L，采样地土壤浸提液 100ml；增殖培养基：细菌培养基、大型真菌培养基、霉菌培养基均为常用普通培养基。筛选培养基：（1）纤维素筛选培养基（初筛）KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4g/L，MgSO4 7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4 7H2O 5mg/L，MnSO4 1.6mg/L，ZnCl2 1.7mg/L，CoCl2 1.7mg/L，CMC-Na 2.0g/L；（2）玉米秸秆筛选培养基（复筛） KH2PO4 2.0g/L，(NH4)2SO4 1.4 g/L，MgSO4 7H2O 0.3g/L，CaCl2 0.3g/L，FeSO4•7H2O 5mg/L，MnSO4 1.6mg/L，ZnCl2 1.7mg/L，CoCl2 1.7mg/L，玉米秸秆6.0g/L。
1.2 方法
1.2.1 菌种分离 取的样品用上述土壤无菌水液在无菌环境下振荡30min，制得菌悬液。取10ml菌悬液，添加90ml相对应初始富集培养基，150r/min，37℃，培养14d。
1.2.2 菌种筛选 按菌体富集获得增殖菌液10ml，加入90ml纤维素筛选培养基中，在相对应的富集温度和转速下培养，培养最短时间为细菌7d，每隔2d取筛选后的菌液，作为以后筛选步骤的菌液。取5mL初步富集的菌悬液，分别接入到50mL的增殖培养基中，装入到150ml三角瓶，在对应的富集温度和转速下增殖培养。将菌液梯度稀释到10-7，每一个平板取0.5ml稀释液涂布固体增殖培养基平板，每梯度涂布 10个平板，倒置平板培养，温度和培养时间7d，挑取单菌落或纯菌丝于斜面上培养。
1.2.3 菌种初步鉴定 将筛选出的单菌株进行多次纯化培养后，进行鉴定，一部分用斜面培养基保藏于-4℃冰箱。采用革兰氏染色镜检和纯菌种菌落形态观察，对分离菌种进行初步鉴定。
1.2.4 纤维素酶活力测定 （1）标准曲线绘制；（2）粗酶液制取：将保藏的纯菌种活化后，接种于增殖培养，37℃，150r/min，振荡培养48h，按2%的接种量于30ml液体产酶培养基中，37℃，150r/min，振荡培养，定时取样测定发酵液中的酶活力；（3）DNS法测定酶活力：取发酵液于4℃，5000 r/min，离心10 min，得上清液。取4支带有20ml刻度的试管，每支试管加1ml酶液（其中1支对照，3支平行试验），样品管置于50℃水浴中，预热2min，对照管置于沸水浴10min，然后4支试管中加4ml已预热至50℃的1%羧甲基纤维素钠为底物溶液，样品管置于50℃水浴准确及时3min取出，流水迅速冷却，用蒸馏水定容20ml，摇匀后用分光光度计于485nm处测定吸光度值。1min生产1ug葡萄糖定义为一个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 分离筛选到菌株
通过对分离到的1株菌种的革兰氏染色和纯菌种菌落观察，暂时将其命名为J1。这个菌株经染色呈革兰氏阳性，着生鞭毛，椭圆到柱状，有芽孢生成，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。综上述特性与芽孢杆菌属的谷草芽孢杆菌特征很相似，暂归为芽孢杆菌。
2.2 酶活力测定结果
对J1菌株发酵温度和pH研究说明：纤维素酶活力随发酵时间的变化可以看出当发酵时间达到42h时，酶活力达到最大值；发酵液pH对酶活力也有影响(见图2)，其最佳pH值为7.0。
3 结论
通过从腐烂秸秆畜禽粪便土层分离得到的一个菌株，经初步鉴定为谷草芽孢杆菌同属菌种，对其生理生化特征研究，表明该菌株在42h产纤维素酶活力达到最大值72.214U/ml。我们分离得到的J1菌株产酶活力相对较高，应用产纤维素酶细菌来生产纤维素酶具有自身独特的优势，那就是菌种容易培养，增值速度快。虽然产纤维素酶活力并不具有明显优势，但可以通过菌种诱变技术或者基因工程技术来改良菌种，获得理想产纤维素酶的菌株。
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植物纤维素是是自然界中最丰富的可再生资源。借助纤维素酶的水解作用，将纤维素转化为可直接利用的资源与能源，可以缓解能源危机以及化石能源对环境污染的问题，同时也可以实现对农业剩余资源的高效利用。目前，纤维素酶在食品发酵、生物饲料、工业洗涤等各个领域也都有一定程度的应用。由于细菌产纤维素酶有着生长迅速、容易培养、不产生孢子等优点，其应用范围不断扩大，需求量不断提高，高效产酶菌种的分离筛选和诱变育种显得极其重要[1-3]。本研究以一株产纤维素酶枯草芽孢杆菌BacillussubtilisHAS-8为出发菌株，通过He-Ne激光诱变，选育产酶能力更强、生长更迅速的菌株，并优化其发酵条件，以期扩大纤维素降解菌种的范围，为纤维素发酵生产提供优良菌株。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种从洛阳国家牡丹园土壤中筛选得到一株枯草芽孢杆菌BacillussubtilisHAS-8，其刚果红纤维素酶筛选平板透明圈HC值为1.6，纤维素酶活力为385.97U/mL。1.1.2培养基种子培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，pH7.0，水1000mL；筛选培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，KH2PO41.0g，MgSO47H2O0.2g，葡萄糖2.0g，NaCl10.0g，琼脂20.0g，水1000mL，pH7.0；纤维素酶发酵培养基：麸皮10.0g，玉米粉10.0g，牛肉膏1.0g，蛋白胨2.0g，NaCl1.0g，KH2PO41.0g，K2HPO41.0g，MgSO47H2O0.5g，水1000mL，pH7.0。
1.2方法
1.2.1He-Ne激光诱变以1%的接种量将菌株接种于种子培养基中，30℃培养20h。取10mL，3000r/min离心20min，弃去上清液，将菌体沉淀用无菌生理盐水洗涤，重复洗涤两次。最后将得到的菌悬液放入无菌生理盐水中，控制菌体浓度约108CFU/mL。选择激光器的输出功率为15mW，将0.5mL菌悬液置于已灭菌的试管中，并使其位于激光器的正下方30cm处，照射20min[4-6]。诱变结束后，根据筛选培养基平板上的透明圈与菌株直径的比值（HC值），选择HC值大于1.6的正突变菌株。
1.2.2正突变菌株的酶活力测定及遗传稳定性分析将从纤维素酶筛选培养基平板上挑选5株HC值最大的正突变菌株测定其纤维素酶活力，筛选出性能最优的目标菌株。将最终获得的正突变菌株在斜面培养基上连续传代30次，每5代接入酶发酵培养基中测定纤维素酶活力，分析其遗传稳定性。
1.2.3发酵条件正交试验设计目标菌株在种子培养基中30℃培养10h，接种量3%接入装有80mL发酵培养基250mL的三角瓶中，培养温度30℃，摇床180r/min进行培养。以麸皮、玉米粉、培养时间、起始pH为4种因素，各选取3个水平，以发酵液中的活菌数为指标，采用L9(34)正交表，利用SPSS软件设计正交试验，试验重复两次，且重复采用随机区组设计，进行方差分析和单因素统计[7-9]，如表1所示。
1.2.4纤维素酶活力测定采用DNS法测定纤维素酶活力。50℃条件下，每分钟每毫升酶液水解底物羧甲基纤维素钠产生1μg葡萄糖所需的酶量为1个单位。
2结果与分析
2.1正突变菌株的HC值及酶活力测定根据透明圈HC值和生长速度，从正突变菌株中挑选出5株细菌，编号保存，并转入纤维素酶发酵培养基中，测其发酵液纤维素酶活力，结果见表2。由表2可见，经过诱变后的正突变菌株，其HC值和纤维素酶活力明显提高。其中菌株HAS-8D的HC值及酶活力提高的最为明显，酶活力经过诱变后提高了68.2%。同时它在斜面培养基生长迅速，菌落较大，因此选择菌株HAS-8D为目标菌株，进行下一步研究。
2.2突变菌株的遗传稳定性分析经过菌株的传代培养，每隔5代测定其纤维素酶活力，观察菌株HAS-8D的遗传稳定性，结果见图1。经过ANOVA分析，p=0.872，p>0.05，说明各代的酶活力无显著性差异，正突变菌株HAS-8D具有良好的遗传稳定性。
2.3发酵条件优化碳源麸皮、氮源玉米粉、培养时间和起始pH对发酵液菌数影响的正交试验结果如表3、表4和表5所示。由表4可以看出，碳源麸皮、氮源玉米粉和起始pH的p<0.01，差异极显著；培养时间的p<0.05，差异显著。F检验结果表明，麸皮、玉米粉、培养时间以及起始pH对发酵液菌数的影响达显著水平。由表5可以分析得到各因素水平的优劣顺序是：A3>A2>A1，B2>B3>B1，C2>C1>C3，D2>D1>D3。最后得出最佳的组合是A3B2C2D2，即为麸皮2.0%、玉米粉1.0%，培养时间24h，起始pH为7.0。按照正交试验设计的培养条件进行发酵培养，菌株HAS-8D发酵液活菌数达到1.1×109CFU/mL，酶活力为684.35U/mL。
3结论与讨论
纤维素酶是一组复合酶系,通过多种酶的协同作用水解降解纤维素,纤维素酶主要来源于可产纤维素酶的细菌和真菌。其中,由于丝状真菌纤维素酶产量高于细菌和酵母菌等真菌,被广泛应用于纤维素酶产业化生产。作为丝状真菌中的一员,黑曲霉菌高产纤维素酶,且安全、无毒素,在产纤维素酶微生物研究领域,黑曲霉菌是开发、利用最为广泛的真菌之一。近年来,在高产纤维素酶微生物,发酵产酶工艺,应用领域等方面国内外均开展了相关研究,且取得了一定的进展。
1 纤维素酶的组成与催化机制
纤维素酶是由三种不同酶组成的复合酶系,主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二塘水解酶、β - 葡萄糖苷酶。三种酶通过协同作用将纤维素降解为寡糖和纤维二塘,并最终水解为葡萄糖。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素分子的非结晶区,随机水解β - 1,4 糖苷键并产生大量带有非还原末端的小分子纤维,此外,也能水解纤维素的某些基团取代产物,如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素等。外切葡聚糖酶主要作用于微晶纤维素分子的还原端和非还原端,水解β - 1,4 糖苷键,从而裂解下二糖分子。β - 葡萄糖苷酶可将纤维二糖和其他可溶性寡糖水解为葡萄糖。
2 产纤维素酶微生物
产纤维素酶的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌。放线菌和细菌纤维素酶产量相对较低,放线菌生长缓慢,相关研究较少,细菌纤维素酶多为内切葡聚糖酶,对结晶纤维素无活性,且分离难度较大,影响其产业化开发。高产纤维素酶的真菌主要包括曲霉菌属、木霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属和枝顶孢雄属等。其中,丝状真菌是纤维素酶产业化开发与利用的首选微生物。曲霉菌属是丝状真菌中着名的高产纤维素酶菌属之一,而作为曲霉菌属中的一员,黑曲霉菌除高产纤维素酶外,还能合成木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、α - 半乳糖苷酶、β - 葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、蛋白酶等酶,可促进生物质的高效降解,且安全、无毒素,其研究与产业化开发也较为广泛。
3 黑曲霉菌产酶工艺与影响因素
由于黑曲霉菌需在低含水量固态发酵底物中生长、传代,其生产纤维素酶工艺通常采用固体发酵法。固体发酵法的最大优点是可以利用木质纤维素废弃物作为发酵底物,且固体发酵法提供的生长环境与黑曲霉菌的天然生长环境相似,更有利于其生长、传代。此外,固体发酵法还具备成本低,工艺简单,酶产物回收率高,能源需求低,污水排放少等优点。主要缺点是发酵过程中温度、pH、营养成分含量等工艺条件的控制与监测较为复杂与困难。另外,国外也有学者改良了黑曲霉菌发酵产酶工艺,Cunha 等选用黑曲霉菌为生产菌,甘蔗废弃物为发酵底物,应用固液连续发酵法生产纤维素酶,研究结果表明,应用固液连续发酵法获得内切葡聚糖酶和木聚糖酶产量高于传统的固体发酵法。
黑曲霉菌纤维素酶产量受到多种因素影响,主要包括发酵培养工艺,产酶诱导因子,菌株产酶效率,发酵设备生产效率等均可影响黑曲霉菌的生长状态,从而影响其酶合成量。其中,发酵培养条件( 如pH、温度、培养基氮源、碳源、阳离子等) 可通过优化实验改良。在固体发酵底物中添加不同种类的纤维素和木质素,乳糖等诱导因子,可在一定程度上诱导黑曲霉菌提高纤维素酶产量。
4 产纤维素酶黑曲霉菌应用研究
黑曲霉菌高产纤维素酶,在乙醇等生物燃料开发领域具有一定应用前景。此外,在食品加工,木质纤维素废弃物降解,动物饲料添加剂等领域也取得了相关研究进展。
4. 1 生物燃料
2010 年我国可收集秸秆资源量约为7 亿t,加上工业和林业纤维废弃物,每年木质纤维素资源总量将超过20 亿t。产纤维素黑曲霉菌可将农作物的秸秆、工业和林业纤维废弃物等木质纤维素原料水解为葡萄糖,用于生产乙醇、有机酸和其他化学制品,从而缓解人们对矿物燃料的依赖。Bjorn 等将甘蔗渣和云杉木水解液作为发酵底物,研究了重组黑曲霉菌D15 菌株的产酶特性,结果表明,重组黑曲霉菌D15 不仅可降解木质纤维素,还可降解和转化其衍生物,如乙酸、呋喃醛、紫锥菊多酚等,有利于酵母菌乙醇发酵,从而促进以木质纤维素生物质为原料第二代生物乙醇工厂的发展。
4. 2 食品加工
在保健食品、果汁和蔬菜汁加工和茶叶加工等领域,国内外学者报道了相关研究。Dhillon 等选用苹果酱、稻壳、藜芦醇、硫酸铜、乳糖等原料配制固体发酵培养基,研究了黑曲霉菌NRRL - 567 纤维素酶粗提液中非特异性壳多糖酶和壳聚糖酶的活性,壳多糖酶和壳聚糖酶活性分别达到了70. 28 U/g 和64. 20 U/g,且保存1 个月后酶活性仍达到92% ~94%。高壳多糖酶和壳聚糖酶活性的黑曲霉菌纤维素酶提取液,可用于生产低分子量壳多糖和壳聚糖低聚体。在保健食品生产方面具有重要的用途。Ajay等从黑曲霉菌DFR - 5 酶液中提纯木聚糖酶,并研究了木聚糖酶与果胶酶和纤维素酶混合物对菠萝汁产量和澄清度的影响。与对照组相比,木聚糖酶试验组菠萝汁的生产率和澄清度分别达到了71. 3% 和64. 7%,均高于对照组( 61. 8% 和57. 8%) 。结果表明,黑曲霉菌木聚糖酶提取液可用于提高果汁澄清度,在果汁和蔬菜汁加工领域具有一定的应用前景。另外,在茶叶加工领域,黑曲霉菌是普洱茶发酵过程中的优势菌,通过合成多种酶类,促进酚类物质、纤维素、果胶、蛋白质等物质的分解,可一定程度上改善茶叶感官特性,缩短加工时间,提高茶叶品质。
4. 3 木质纤维素废弃物降解
纤维素类城市固体废弃物作为一类可再生生物质,其资源量巨大,可用于生产纤维素酶,Gautam等选用城市固体废弃物作为碳源,研究了黑曲霉菌和木霉菌纤维素酶活,固体废弃物、蛋白胨、酵母提取液为最理想的碳源和氮源,黑曲霉菌和木霉菌培养物中酶的总量比其他真菌高40% ~ 60%。结果表明,纤维素类城市固体废弃物作为一种碳源,可由黑曲霉菌和木霉菌降解、利用。此外,黑曲霉菌还可降解农作物秸秆、甘蔗渣、椰壳废弃物等纤维素废弃物资源,合成纤维素酶,变废为宝,从而减少资源浪费,降低环境污染。
4. 4 动物饲料添加剂
由于黑曲霉菌安全,无毒素,且高产纤维素酶,在动物饲料添加剂研究与应用领域,已引起国内外学者的关注。Chandra 等分别以牛落花生饲草、麦麸、米糠、锯屑等木质纤维素作为固体发酵底物,研究了黑曲霉菌滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和葡萄糖苷酶酶活,比较了各种底物发酵前后蛋白含量。其中,黑曲霉菌发酵落花生饲草和麦麸底物后滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、β - 葡萄糖苷酶酶均显着高于其他实验组。此外,发酵后的牛落花生饲草蛋白含量有所提高。结果表明,黑曲霉菌可发酵牛落花生饲草、麦麸等木质纤维素合成纤维素酶,且提高了牛落花生饲草营养价值。张福元等研究了黑曲霉发酵玉米秸秆产纤维素酶及降解基质的营养条件,优化营养条件后可使黑曲霉菌株产CMCase、FPase 酶活性达到最高。此外,经黑曲霉菌发酵后,玉米秸秆粗蛋白含量提高了1. 2 倍,粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量分别下降了34%、19%、23%。结果表明,黑曲霉菌可发酵玉米秸秆合成纤维素酶,且提高了玉米秸秆营养价值,为玉米秸秆青贮、黄贮发酵饲料的产业化开
发和应用提供了科学依据。 5 小结
纤维素资源产量巨大,纤维素类废弃物也日渐增多,科学、高效降解纤维素类生物质资源,促进其可循环利用可在一定程度上减少资源浪费,降低环境污染。纤维素酶可高效降解纤维素,然而,降解纤维素耗酶量巨大,如何提高纤维酶产量是关键。微生物发酵是纤维素酶产业化生产的有效途径,可研究、选育高产纤维素酶菌株进行生物发酵产酶。
关键词：生物乙醇 纤维素酶 工程菌株
The study and development progress of Bio-ethanol and cellulase production
Liping Yang1 Shuiwen Cai1 Ling Luo1 Hui Liu1，2
1. Changsha Environmental Protection and Professional technique College, 410004 2 Hunan
2. Agricultural university, 410128, Changsha, China
Abstract: With the fossil fuels from shortage to exhaustibility, the humanity is facing toward a common problem in energy crisis. Finding new energy sources is important to sustainable economic development and even human survival. Bio-ethanol, as an energy source that is renewable, affordable, and environmentally safe, will become a substitute for oil. Elevation of cellulase production and reduction of the cellulase production cost are the key factor for enhancing the market competitiveness of cellulosic bioethanol. In this paper, we discussed the development progress of bio-ethanol and cellulose industry to provide a basis for the future upgrading of bio-ethanol production industry and the development of gene engineering strain.
Keywords: bio-ethanol cellulose engineering strain
随着石化燃料由短缺变成枯竭，能源危机是人类面临的共同问题。1998年，Campbell和Laherrere对石油储备和未开发的石油进行评估后认为，天然油在2010年前的产量就开始下降，到2050年全球每年石油供应量将从目前的25亿桶下降到5亿桶[1]。随着石化燃料供应的减少，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。生物乙醇作为一种可再生的、经济上可承受的，并且对环境安全的能源物质将逐渐成为石油的替代品[2]。生物乙醇的生产经历了以1代淀粉原料生产乙醇和以木质纤维素为代表的非淀粉原料的2代生物乙醇工业。2代生物乙醇生产克服不与食品的供应之间存在竞争，但是纤维素酶产量低、不稳定、难以工业化导致2代生物乙醇的生产成本大大提高。本文从生物乙醇产业发展过程、木质纤维质物质生产生物乙醇的市场前景及纤维素降解酶的研究进展进行综述，为生物乙醇生产产业的提升、纤维素工程菌的研发提供基础。
生物乙醇产业发展过程
从上世纪80年代开始，人们就开始以谷物为原料来生产乙醇用作供氧燃料，这些被业内称为第1代燃料乙醇的原料。在一些国家，如美国、加拿大、巴西、中国等，乙醇已经被广泛地掺入到汽油中来代替纯汽油使用，其中乙醇的体积含量可达到10%。最近美国正在实施一项混合燃油计划E85，即汽车制造商生产一种可使用乙醇混合物E85（85% 的乙醇和15% 的汽油按体积比混合）的汽车[3]。巴西早在1929年就建立了一项利用乙醇作为发动机燃料的计划，并在接下来几年里安装了第一个使用乙醇作为燃料的发动机。1984年，巴西要求新生产的汽车能使用水化生物乙醇（96%的生物乙醇+4%的水）作为燃料[3]。混合燃料的使用不仅可以减少汽油的使用量，还可以降低温室效应气体以及有毒气体的释放。
但是随着世界人口的不断增长，以谷物等第1代淀粉原料生产乙醇就与食品的供应之间存在竞争，这些谷物为原料生产乙醇就不能满足全球的需求。中国在过去三十年中GDP的年平均增长量为10%，这使得中国成为世界上最大的燃料消费国之一，同时也成为世界上造成空气污染最严重的国家。由于大部分的能源由燃烧化石燃料提供，中国政府正努力解决诸如国内因迅速枯竭的石油和天然气资源而越来越依赖进口石油来满足国内一半的实际需求[4]，以及严重的环境污染等问题。为了改善现状，中国政府决定增加使用能源的种类，尤其提倡使用可再生的、排放更少温室气体的燃料，如乙醇这样的生物燃料和生物柴油。由于生物燃料从诸如玉米、木薯、大豆这样的农产品中提取而来，这对改善中国农村人口的经济状况有积极影响。除了向乙醇生产者发放津贴以鼓励乙醇的生产之外，中国政府近年来也强制要求中国十个省份必须销售浓度为10%的乙醇汽油，这些措施使得中国2008年的乙醇产量迅速达到14.6亿升且在2010年达到21.5亿升，一举成为继美国和巴西之后的世界第三乙醇生产大国。尽管中国政府之前要求到2020年国内乙醇的年消费量要达到100亿升，然而由于担心乙醇生产可能与食物生产行业形成竞争，且考虑到国内农村可用耕地数量有限，以及水资源供应短缺的问题，中国政府于2007年宣布暂停国内谷物乙醇的生产。
为了解决这个矛盾，以木质纤维素为代表的非淀粉原料成为生物乙醇生产的重要原料物质。木质纤维素，其结构复杂，有三种：纤维素35%～37%、半纤维(23-25%)和木质素(18-22%)组成。每年光合可产生大于1，500亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素[5]。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦秆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。
木质纤维质物质生产生物乙醇的市场前景
到2020年，全世界从木质纤维素物质生产生物乙醇的产量大约是165亿加仑（合计约625亿升），美国将占有63.9%的市场，欧洲和中国分别将占有10.4%和11.5%的市场[3]。目前，生物乙醇的产业，尤其是非淀粉类的生物乙醇产业主要在于政府的补贴和维持，其原因在于利用木质纤维生产生物乙醇的生产成本较高。第1代淀粉类原料与第2代非淀粉类原料发酵生产生物乙醇不同之处在于前面的预处理和酶解糖化过程。淀粉类原料很容易被酶接触到，就被淀粉酶和糖化酶酶解为葡萄糖(C6糖)，然后葡萄糖再被普通的酵母发酵生产出乙醇，这样，生产工艺环节少，流程短，成本就非常低。但是木质纤维素物质经过自然选择和漫长进化，木质素将半纤维素和纤维素紧密包裹在内部，形成紧密结构，被天然“设计”成可以抵御酶进攻的分子结构。因此与淀粉乙醇不同的是首先要有高温高压蒸汽或结合加酸碱等化学品的预处理技术将紧密结构打开，让酶能够接触到纤维素和半纤维素。纤维素和半纤维素酶解后发酵可以生产出乙醇[6]。纤维素酶解后可得到葡萄糖(C6糖)，半纤维素酶解后可得到木糖(C5糖)，淀粉类和纤维素都是由葡萄糖聚合成的长链结构，只是结合的方式不同而已，因此酶解过程需要的酶是不同的；而半纤维素是由C5糖聚合而成的长链结构，也需要特定的酶。纤维素及半纤维酶的成本更高，这也是导致木质纤维素乙醇成本比淀粉乙醇高的重要原因之一。在每加仑生物乙醇的生产中，利用木质纤维生产，纤维素酶的成本大约是15-20美分，而利用淀粉类生产，淀粉酶的费用仅仅只占到了2－4美分[7]。因此要想提高纤维素生产生物乙醇的市场的竞争力，提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的成本成为解决问题的关键因素。我国是纤维素酶的需求大国，由于纤维素酶的广泛应用，我国市场需求量将以每年25%～35%的速度上升，用纤维素酶产业化生产生物乙醇的关键技术将在未来几年内得到解决，那时我国纤维素酶年需求量将增加到25-40万吨，每年将为我国节省生产燃料乙醇用粮500-1，000万吨[8]。由于产酶菌种落后，产率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展，从而阻碍了以木质纤维素为原料的2代生物乙醇工业的发展。
木质纤维素及纤维素降解酶
木质纤维素，其结构复杂，有三种：纤维素(35%～37%)、半纤维(23%-25%)和木质素(18%-22%)组成[9]。纤维素属于可再生自然资源，是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植物干质量约1，500亿吨，其中纤维素占850亿吨[5]。
纤维素酶(cellulase)是指能够水解纤维素β-1，4-D-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶是一种具有很高活力的木聚糖酶，是一种复合酶，属生物催化剂[10]。纤维素酶主要是指三类关键酶:（1）外切型纤维素酶，系统命名为外切β-1，4-D-葡聚糖酶，又称纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91，也称Cl酶)。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每回依次从纤维素分子中切下一个纤维二糖分子，所以又称纤维二糖水解酶(简称CBH)。（2）内切型纤维素酶，系统命名为内切β-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也称Cx酶或CMCase)。这类酶是纤维素酶中最重要的酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。（3）纤维二糖酶，系统命名为β-葡萄糖苷酶(EC2.1.21，也称CB酶)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。当以上三种纤维素酶的关键酶的活性比例适当时，就能协同作用完成对纤维素的降解，但各个酶组分单独作用时效果极差。所以说纤维素酶降解纤维素时一个协同表达和作用的过程[11-12]。
不同来源的纤维素酶分子特征和催化活性都不尽相同。细菌产生的纤维素酶量少，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，而且不能分泌到细菌细胞外，常常聚集形成多酶复合体[13]。真菌能产生大量的纤维素酶，产生的酶组分，能分泌到菌体外，一般不聚集成多酶复合体，但可以相互发生强烈的协同作用。纤维素酶分子的大小因来源不同也有明显的差异，变化范围很广。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上决定了酶的多型性，表现为分子量的差别[14]。纤维素酶的酶活力一般都很低，因而酶生产成本高。据报道，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的大100倍，这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一[3]。
迄今为止，人们已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了多种纤维素酶基因，有一百多种基因可在大肠杆菌中表达，大多数克隆的纤维素酶基因能产生信号肽，从而使表达产物部分或全部转移至E.coli的细胞质间隙[15]。虽然克隆到大肠杆菌的基因，不需要载体的启动子就可表达，但表达水平很低，推测可能是其启动子不能完全被识别的缘故。但在大肠杆菌中表达纤维素酶基因存在两个主要问题:一是提取有很大困难，二是表达水平低、酶蛋白不能分泌，离工业化应用的目标还有一定的距离，所以在纤维素酶基因的表达方面人们将目光转向了真核表达系统[16]。
木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌[6]，世界纤维素酶市场中的纤维素酶20%是来自木霉属和曲霉属[17]。绿色木霉是一种在各种气候带的土壤中能够普遍存在的一种多细胞丝状真菌，能够分泌完全的纤维素酶系，其中产量较高并且稳定，是目前纤维素酶商业化生产的主要生产菌株[18]。对于绿色木霉的研究直到九十年代初仅有CBHⅠ基因克隆的报道，王建荣、张曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片段做探针，构建了绿色木霉基因文库，并克隆了CBHⅠ、CBHⅡ基因，并对其基因结构进行了研究[19]。
纤维素酶的合成一般受纤维素诱导及葡萄糖降解物的阻遏，多数菌株纤维素酶的合成既受纤维二糖、山梨糖等的诱导，又为葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，还受菌体生长速度的影响[6]。在绿色木霉中，纤维素酶属诱导型酶类，其多个酶组分的表达经过严密的调控。在绿色木霉中能产生分泌型的纤维素酶，当CBHⅡ基因缺失时，会影响纤维素酶系其他酶的表达，而缺失其他基因时，只单独影响自身的表达。另有研究表明CBHⅡ是纤维素酶系统中最先表达的酶，其表达产物进一步诱导其他纤维素酶基因的表达，但CBHⅡ基因的表达受纤维素降解产物葡萄糖的抑制[20]。
随着基因工程技术的发展，定点突变和基因重排技术在纤维素酶的生产工业中的应用越来越广泛。在里氏木霉 (T.reesei) 中，需要产生至少14种酶协同作用才能水解未经化学处理过的植物干物质。为了降低纤维素酶的复杂性，将里氏木霉的CBH1、嗜酸耐热菌的葡聚糖内切酶EI 以及曲霉(Aspergillus niger)的β- 葡萄糖苷酶以90∶9∶1(质量比)混合形成一个三元复合物，此三元复合物在120 小时内水解预处理过的纤维素的能力与李氏木霉中纤维素酶体的水解能力相当。为了提高此三元复合物水解纤维素的活力，利用定点突变的方法对葡聚糖内切酶EI的活性位点进行修饰，结果与突变前的三元复合物相比，其水解纤维素的活性提高了12%[21]。Zinnia R等在里氏木霉菌中应用同源重组技术将外切β－葡萄糖苷酶整合到egl3和xyn3基因启动子的下游，增强了纤维素酶的表达量4倍到7.5倍，这些重组菌株能有效的降解纤维素物质[22]。
生物乙醇及纤维素降解酶的未来发展趋势
随着石化燃料供应的减少，寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。生物乙醇作为一种可再生的、经济上可承受的，并且对环境安全的能源物质将逐渐成为石油的替代品[2]。由于产酶菌种落后，产率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展，从而阻碍了以木质纤维素为原料的2代生物乙醇工业的发展。因此要想提高纤维素生产生物乙醇的市场的竞争力，提高纤维素酶的产量，降低纤维素酶的成本成为解决问题的关键因素。目前纤维素酶工程菌株中不稳定、产酶量不高、难应用于大规模产业化大规模生产等三大难题。利用基因工程技术改造菌种，尤其是纤维素酶基因启动子的改造，在发酵过程中其酶形成过程不受主要代谢产物葡萄糖的抑制，促进其他纤维素酶基因的协同表达，大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力，将是工程菌柱构建的方向，构建不受葡萄糖抑制、稳定、高效的表达纤维素酶工程菌。可以解决本项目的实施将会大大提高纤维素酶的产量，降低木质纤维素生产生物乙醇时纤维素降解成本，从而促进木质纤维素生产生物乙醇产业的发展。
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生产纤维素酶的生物在自然界中广泛存在，其中可以分泌纤维素酶的微生物主要有霉菌和担子菌等真菌，也有细菌、放线菌和一些原生动物，并且在一些动物的体内也都含有丰富的纤维素酶，如:在牛胃、蜗牛胃液及木蠹蛾唾液中都发现了纤维素酶的存在。传统的生产纤维素酶的工艺主要有液体发酵和固体发酵2种方式。固体发酵法生产工艺是主要用玉米和稻草等植物秸秆作为原料，接种微生物以进行发酵工艺，具有投资少、工艺简单且产品价格低廉等优点。但固体发酵同时也有一些缺点，如:其劳动强度较大、大规模生产所需成本高、其生产效率低且容易受杂菌污染等。液体发酵法生产过程是以低于20目的标准粉碎玉米秸秆，然后灭菌处理，再进发酵罐发酵，接入纤维素酶菌种，在低于60℃发酵70h，随之从发酵罐底部通进净化无菌空气，气流搅拌物料，物料发酵完后需要经过压滤机压滤、超滤浓缩及喷雾干燥过程，从而得到纤维素酶产品。此法在某些方面弥补了固体发酵的缺点，但因其培养周期较长，设备要求较高和产生的废水不易处理等缺点而制约着纤维素酶的生产。目前在生产纤维素酶中应用固定化细胞与生物床等现代技术，这些方法融合了固体发酵与液体发酵的优点，相比更适于规模化生产纤维素酶，应得到不断研究与发展。
纤维素酶的生物学功能
纤维素酶可以消除饲料中的抗营养因素，提高饲料养分消化率。在单胃动物体中，有助于消化道环境的改善，增加酸度，激活胃蛋白酶;利于改善小肠绒毛完整性和营养物质的吸收强度。在反刍动物日粮中添加纤维素酶，能弥补动物体内微生物产生纤维素酶量的不足，同时增强与半纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等酶的协同作用，利于改善营养物质的吸收状况。另外，在治疗草食家畜的胃肠疾病时，纤维素酶也得到了应用。有相关研究表明:纤维素酶可以促使饲料中纤维素和半纤维素的分解，直接降低其致病因素，也可增加可溶性物质含量，促进有益微生物的活动。同时，纤维素酶产生菌可形成一些能调整胃肠道菌群并促进废物及有害物排出的物质。陈侠甫等认为，纤维素酶在牛的前胃迟缓、瘤胃膨胀和积食及马的急慢性消化不良和便秘等疾病方面都有较好的治疗效果，并且经多位研究者的治疗试验，其治愈率高达98.9%，表现出此酶制剂的疗效高、疗程短、无不良反应且经济方便。
纤维素酶在反刍动物生产中的应用
反刍动物日粮中添加适量的纤维素酶，可以提高饲料消化率和利用率、改善瘤胃的发酵功能、加强营养物质的吸收、增加动物体的日增质量，且可改善产奶量和奶品质。瘤胃微生物区系结构正常时，纤维素酶的添加能提高粗纤维和一些营养物质的酵解强度及消化吸收水平。若瘤胃发生病理变化，微生物区系失去平衡而进入腐解过程，此时高活性纤维素酶会迅速发挥作用，调整微生物区系结构，使区系的平衡关系与酵解、吸收及合成过程得到恢复。焦平林等(1996)在阉牛日粮中添加纤维素酶，每头牛每天添加纤维素酶量40g，进行60d饲喂，结果表明:加酶组的日增质量比对照组提高了19.6%，差异极显著。在用荷斯坦奶牛进行的试验中，试验组奶牛的纤维素酶以每天每头牛50g的量添加，结果表明:试验组奶牛在68d总产奶量与对照组相比提高了8.5%，差异显著。付连胜等(1998)在成年奶牛及育成牛的瘤胃功能状态正常时，饲喂纤维素酶5d，相比饲喂前，粪便干物质减少了30%，封闭式牛舍在1周后的氨含量降低了约70%，采食粗饲料量增加了8%～10%，尿中尿素降低58.9%，对怀孕奶牛于产前30d饲喂纤维素酶，在其分娩后，没有出现生理性消化不良症状，胎儿无畸形和弱胎且增质量1.5～3kg。赵长友等(1998)对纤维素酶在草食动物日粮中较好的应用效果进行了综述。尹清强和陈树兴(1998)在对绵羊的研究中，每天每只羊饲喂30g纤维素酶能显著提高其瘤胃液中的蛋白酶和羧甲基纤维素钠(CMC)酶的活力及乙酸、丙酸和丁酸的产量(P＞0.05)。金加明等(2007)使小麦秸秆经纤维素酶酶解后饲喂小尾寒羊，每只试验羊的平均日增质量148g，与对照组相比提高68.2%(P＜0.05);56.1元的盈利高出对照组32.7元，提高经济效益139.7%。
纤维素酶在单胃动物生产中的应用
在鸡和猪等单胃动物的日粮中，主要以玉米、饼粕和糠麸等植物性饲料进行配制，因而含有一定量的纤维素。单胃动物的肠道中，存在一些微生物可降解部分的纤维素，却不可以分泌能断裂β－1，4糖苷键的内源酶，故单胃动物对饲料中存在的纤维素不能够进行有效地利用。此外，动物体对营养物质的消化和吸收会因纤维素的交错、缠绕和黏附而受到阻碍，纤维素的这种性质也会对肠道微生物菌群的平衡产生影响。添加纤维素酶于单胃动物的日粮中可以起到营养和保健双重作用。秦江帆等(1996)以提高肉用仔鸡日粮中富含纤维素的麦麸的比例来进行试验，分别添加了0、0.05%和0.1%的纤维素酶制剂，结果与对照组相比，添加0.1%纤维素酶组在1～2、3～6和7～8周生长阶段的日增质量分别提高4.31%、4.54%和4.13%，耗料比分别下降1.56%、4.50%和4.3%。说明添加外源酶制剂可以在一定程度上补充不足的内源酶，并且可以消除一些抑制营养消化吸收的物质，大大促进仔鸡生长发育。徐奇友(1998)在蛋鸡的产蛋期间，在日粮中分别添加0.1%、0.15%和0.5%纤维素酶，结果产蛋率分别提高了0.53%、1.25%和2.88%，添加酶量为0.15%和0.5%组的破蛋率分别降低了34.49%和16.19%，蛋壳强度则相对提高了14.71%和8.41%。尹清强等(1993)研究了在AA肉鸡日粮中添加0.02%和0.05%纤维素酶的试验，56d后，2组AA肉鸡的体质量分别提高了3.10%和2.88%(P＜0.05)。前苏联学者在生长育肥猪日粮中添加0.04%的纤维素酶，结果使猪的平均日增质量提高了10.07%(P＜0.05)，而添加0.3%木霉纤维素酶于以大麦为主的生长猪日粮中，饲料养分消化利用率可以提高2.5%～3.5%(P＜0.05)。李德发等(2001)做了纤维素酶对生长猪的作用效果试验，结果表明，适量添加纤维素酶可以改善生长育肥猪的生长性能和品质。
纤维素酶的发展前景
关键词：纤维素酶；固定化；载体结合法；交联法
中图分类号：Q814.2 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-11-0046-1
0 前言
固定化酶（immobilized enzyme）又称固相酶，是将酶固定于水不溶性载体 ，即将酶锁闭于一定空间内，使其不溶于水溶液。固定化酶是21世纪发展起来的一项新技术，1916年Nelson和Griffin最先发现了酶的固定化现象后，科学家们就开始了固定化酶的研究工作。1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。固定化酶的制备方法主要有三种：载体结合法、包埋法和交联法。目前应用得比较多的是载体结合法与交联法。
固定化酶与游离酶相比，具有不可比拟的优点，主要表现在：酶与产物易于分开，可以回收再利用，在经济成本上较优于游离酶；固定化酶可以改善酶的操作性能和稳定性；另外固定化酶不混入产物，可以精简分离工序等[1]。近年来，国内外对纤维素酶的固定用以改善游离纤维素酶性质的研究比较多，本文对近期用交联法、载体结合法等方法对纤维素酶进行固定的研究作一综述。
1 国外对纤维素酶固定化的研究概况
国外对纤维素酶固定化的研究开展得比较早。1997年Ge Y.Burmaa B.等[2]就开始同时固定化了纤维素酶和葡萄糖异构酶，结果发现固定化酶仍然保存了50%的初始酶活力。随后，F Bissett,B Sternberg（1978）[3]以壳聚糖为载体固定了黑曲霉产的β-葡萄糖苷酶。结果表明固定化酶以游泳酶具有更高的热稳定性，固定化酶与游离酶的最适PH相差不大但是在偏酸的环境仍有较高酶活等优点。B.A.Sm.K Havkine（2004）等[4]研究了固定在硅质支持物上的淀粉酶和纤维素酶的性质和功能。Yoshimot M（2006）[5]等优化了微脂体交联固定的纤维素酶水解纤维素的一些条件，探讨了最佳固定化方法。Jones PO（2009）[6]等研究了离子交联纤维素酶的结合量以及固定化该纤维素酶后其水解的一些性质。Tébéka IR（2009）[7]等研究了游离纤维素酶以及固定化纤维素酶的水解活性。国外对纤维素酶固定化的研究主要在于研究固定化酶的酶促动力学、水解特性等。
2 国内纤维素酶固定化的最新进展
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作，随后许多科研院所也逐渐开展了对酶固定化的研究工作[8]。在固定化酶研究初期，人们主要集中于各种制备方法的研究，近年来，人们的注意力已开始转向固定化酶与固定化细胞在工业，农业，医学，等方面的应用。鲁爱华（2009）[9]等分别以冻干壳聚糖微球和湿壳聚糖微球为载体，戊二醛为交联剂进行纤维素酶的固定化研究，并对2种固定化酶的热稳定性、米氏常数、重复利用次数、pH值加以对比分析。确定酶固定化的适宜条件为：0.03g冻干壳聚糖微球与10 mL4 g/L戊二醛交联4h后，加入10mg酶固定2h，酶活力回收率为96.3%；0.1g湿壳聚糖微球与10mL2 g/L戊二醛交联2h后，加入6mg酶固定4h，酶活力回收率为62.4%。与游离酶相比，2种固定化酶的米氏常数均降低；具有很好的热稳定性。冻干载体更易与酶分子结合，酶活力回收率高于湿载体固定化酶。刘志良（2010）[10]等用硅胶作栽体，戊二醛作交联剂，制备了固定化的纤维素酶。同时对制备固定化纤维素酶的偶联剂浓度、pH、给酶量3个影响因素进行了研究，通过正交试验优化得出最佳的固定化条件：交联剂戊二醛浓度为1%，固定化pH值为5，固栽量为每克载体100mg纤维素酶。裴哲、朱启忠（2010）[11]等从香菇中提取纤维素酶后，先后研究了以海藻酸钠、明胶为载体固定化纤维素酶的方法。结果表明，3种固定化酶较游离酶有更好的耐热性与pH值稳定性，其中交联包埋法固定化酶在重复利用性、与底物的亲和程度、酶的固定率等方面均优于直接包埋法和包埋交联法，在重复使用6次后，仍保持72.2%的酶活力。而明胶的最佳浓度为3.0，戊二醛浓度为1.0。与游离酶相比，固定化酶最适反应 pH向酸性方向移动了0.4，最适反应温度提高了5℃，并且固定化酶具有良好的贮存稳定性。张孟麒（2010）[12]等采刚Placken-Burman试验设计和正交试验设计对影响固定化纤维素酶活的因素进行了筛选和优化。探讨了纤维素酶、壳聚糖、乙酸、乙醇、戊二醛等试剂对固定化效果的影响。结果表明：壳聚糖、乙酸、乙醇浓度、酶浓度分别为15L、2.0%、40%、100%时，以壳聚糖为载体制备固定化纤维素酶的活力最高。
随着对纤维素酶固定化方法研究的深入，新型载体应用于纤维素酶的固定化以后，相信在不久的将来一定能够在现有基础上提高纤维素酶固定化的效率，为有效解决利用纤维素废弃物提供高效的酶。
参考文献（略）
项目基金：乐山师范学院自然科学基金（Z0924）。
作者简介：胥成浩（1968-），男，乐山师范学院化学与生命科学学院副教授，研究方向：生物化学的教学与研究。
1.1葡萄糖内切酶
该酶作用于纤维素分子内的非结晶区，随机水解β-1，4-糖甘键，截短长链纤维素分子，产生许多带有非还原性末端的小分子纤维素，但不能单独作用于结晶的纤维素。同时它也能水解小分子的纤维寡糖。
1.2葡萄糖外切酶
这类酶作用于纤维素分子的末端，依次切下纤维素分子中的纤维二糖，可作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。
1.3β-葡萄糖苷酶
也称纤维二糖酶，是一种可将纤维二糖、纤维三糖和纤维六糖等水解为葡萄糖的非专一性酶；在水解过程中低聚糖对外切酶和内切酶的产物产生抑制作用，这种酶的存在可以显著降低抑制作用，提高水解效率。
2食品工业纤维素酶的来源
纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、动物体、微生物（细菌、放线菌、真菌、酵母）等都能产生纤维素酶。由于动物体和放线菌的纤维素酶产量极低，所以很少研究。细菌所产生的酶是胞内酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，提取纯化的难度大。而且产量也不高，主要是中性和碱性的葡萄糖内切酶。因其多数对结晶纤维素没有活性，所以主要用于棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中，在食品工业中应用也较少[4]。目前，报道较多的是真菌，其产生的纤维素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，其中木霉纤维素酶产量高、酶系全，故而被广泛应用，尤其是里氏木霉、绿色木霉的研究较多。
2.1产纤维素酶里氏木霉的研究进展
由于里氏木霉产纤维素酶量高、稳定性好、适应性强，便于生产和管理，因此具有突出的研究和利用价值。目前，在菌株选育上普遍采用人工诱变和基因工程改造两种方案获得高效分解纤维素的菌株。诱变的方法一般是传统的物理诱变(紫外线)和化学诱变(亚硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589为出发菌株，经紫外线诱变，获得两株突变菌株M2-1和M3-1。其滤纸酶活分别达到257U和281U。张素敏等利用紫外线诱变里氏木霉T306，得到突变菌株的CMCA活力达到64.2U/mL[5]。在化学诱变剂中，烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接反应，故更易诱发基因突变。DURANDH等用亚硝基胍诱变里氏木霉QM9414，得到一株稳定性较好的突变菌株CL847，FPA酶活最高达到5.2U/mL，较出发菌株提高了4倍[6]。也有紫外线与亚硝酸钠、亚硝基胍等化学试剂复合诱变的研究，取得了较好的效果。这些研究对里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育及其工业化应用具有显著意义。基因工程改造可以从不同产纤维素酶菌株中筛选出比活力高、酶学性质稳定的基因重组在一起并高效表达，具有定向性，是选育出高产纤维素酶菌株的有效途径。目前已成功在里氏木霉中克隆表达的基因有纤维二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。
2.2产纤维素酶绿色木霉的研究进展
绿色木霉酶活较大，是目前公认较好的纤维素酶生产菌。目前的研究主要集中于绿色木霉产纤维素酶生产工艺的研究。陈莉等采用固态发酵方法研究了不同条件对其产纤维素酶活的影响。得出绿色木霉固态产酶发酵的最优条件是培养温度30℃，培养时间5d，接种量5%，含水量250%。在实际发酵过程中，不同的酶组分达到最大酶活的时间也有不同，例如FPA酶活在发酵2d后达到最高值,Cx酶活在发酵3d后达到最高值。以蛋白胨为唯一氮源时，纤维素酶活力最高，以尿素为唯一氮源时，纤维素酶活力最低。绿色木霉分泌的酶系偏酸性,发酵液初始pH值为4.5时，FPA酶活和Cx酶活都出现最高值。因此在实际应用中也可以根据需要来调整不同酶组分的含量，以及合适的氮源，适宜的pH值等[8-9]。黄发等人对绿色木霉产β-葡聚糖酶的工艺条件研究也得出了类似的结果[10]。
3纤维素酶在食品工业的应用
3.1在果蔬加工中的应用
在果蔬的加工过程中,为了使得植物组织快速软化和膨润,常常采用加热蒸煮或酸碱处理等方法。这样一来就使得蔬菜、果实的香味和维生素等损失很大。通过使用纤维素酶来进行蔬菜的软化可以避免这一缺点。除此以外,通过采用纤维素酶对蔬菜和果实进行分解,可以使加工的果酱口感增加;还可以用纤维素酶来分解蘑菇,制造一种很好的调味料;在糖果品加工工艺中也可以采用纤维素酶来缩短砂糖进入果实当中的时间，以更快地达到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊栖菜汁浸提工艺条件,通过研究最适范围各个单因素发现，在复合酶酶解提取羊栖菜汁的最佳浸提方案中,添加纤维素酶与果胶酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。
3.2在大豆加工中的应用
纤维素酶用于对大豆的处理,可以促使其大豆快速脱皮,与此同时,由于纤维素酶可以破坏其细胞壁,从而使得包含在细胞中的油脂和蛋白质完全的分离开来,导致大豆和豆饼中提取优质的水溶性蛋白质和油脂的得率明显增加，不但降低了生产成本，而且还显著地缩短了生产时间,更是提高了生产产品的品质。
3.3在茶叶加工中的应用
随着茶饮料工业的快速发展，茶水饮料生产的方式渐渐地由最初饮料厂的全程生产方式向由原料厂商只是生产茶浓缩汁这一方式过度,这就使得我国的茶叶浓缩汁、速溶茶等生产发展快速。随着近现代生物技术的快速发展,外源的生物酶在茶叶提取、加工中得到充分的应用。酶法提取的原理为利用其纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等水解酶分解茶叶的细胞壁,使得细胞结构破坏,导致茶叶中的有效成分快速扩散与浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶叶提取生产的过程中，纤维素酶可以提升其可溶性糖类的含量以及水浸出物得率，并且还可以促进氨基酸、茶多酚、咖啡碱等物质的溶出，有利于释放出芳香性物质，有显著的增香效果[13]。
4纤维素酶在酿造、发酵工业中的应用
4.1在酱油、食醋酿造中的应用
酱油酿造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶类对原料进行相应的酶解，而在该过程中如果添加使用纤维素酶，就可以使大豆等原料的细胞膜软化、膨胀等细胞破坏作用更加明显，使得包藏在细胞中的碳水化合物、蛋白质等顺利释放，从而缩短酿造时间，并且可以显著提高产率及品质，使酱油中的还原糖和色度明显增加，风味得到明显改善[14]。在食醋酿造过程中，通过纤维素酶与糖化酶混合使用，可以显著提升原料利用率及出品率。郝建新等以绿原酸为评价指标，进行了添加纤维素酶发酵醋的工艺研究。结果发现，利用纤维素酶等酶后，得到的发酵醋色泽澄清，并具备醋特有的香气，口感也很柔和，而且具有比较好的体外抗氧化的效果[15]。
4.2在啤酒加工过程中的应用
把纤维素酶利用在啤酒工业的麦芽生产当中，可以增加麦粒等的溶解性，减少糖化液中R-葡萄糖的含量，明显提高过滤性能。张麟等对啤酒糟进行了研究，发现预处理过程中添加纤维素酶水解比只用机械处理得到的可溶性糖含量有明显提高[16]。
4.3在饮料中的应用
冯丹等用新鲜的豆渣为原材料，利用纤维素酶对原料进行酶解，可以获得其水溶性膳食纤维等提取液，添加辅料可混合调配成一类酸甜适口，体系均一，滋味纯正，并且具有一定保健功能的膳食纤维类饮料。且研究发现其具有较好的稳定性[17]。
4.4在酒精发酵中的应用
通过在原料中添加纤维素酶来酿酒，可以增加出酒量，节约粮食20%左右，而且酿出的酒酒味醇香，杂醇油含量低。尤其是白酒当中，添加纤维素酶以后，可以同时将淀粉和纤维素转化为可发酵性的糖，再经过酵母分解而全部转化为酒精，提高出酒率且酒的品质纯正。在实际生产中应用纤维素酶，不仅可以提高发酵产率，而且能够显著缩短发酵时间[1]。此外，利用纤维素酶水解木质素生产乙醇用于化工、能源等方面对于目前的全球资源短缺现状的缓解也具有重要意义。
5纤维素酶在纤维废渣回收利用方面的应用
利用其纤维素酶或微生物,把农副产品、城市废料中的纤维素进一步转化成为酒精、葡萄糖和单细胞蛋白质等产品,这对于开辟食品工业的原材料来源、提供新型能源和变废为宝等方面具有十分重要的价值和意义。例如纤维素酶应用于动物饲料的添加剂、纺织、造纸、医药保健、石油开采、新型能源、环保等领域都具有很大的潜力。
6展望
在食品加工工业中，用纤维素酶对农产品进行预处理相较于传统的加热蒸煮或酸碱处理有很多优点，如使植物组织膨化松软，减少农产品香味和营养物质的损失，改善口感，更利于消化，节约处理时间等。另外，纤维素酶也应用于发酵和酿造甚至动物饲料等工业中。纤维素酶目前已经广泛地应用于包括食品在内的各个不同领域,今后也必然将会在应用的深度与广度上进一步发展。虽然纤维素酶的应用还存在不少方面的问题，其主要是在生产菌种等的优化问题，以及应用的成本问题，想要解决这些问题，其主要的方式在于现代生物技术的进一步应用和酶工程的深入探索。另外，若纤维素酶生产菌的生产能力得到进一步提高,纤维素在食品工业及其他行业中的应用将更为广泛和深入。总之，纤维素酶是大有前途的新兴产业，其发展前景广阔。
关键词：纤维素酶；里氏木霉；液体发酵；形态学
中图分类号： Q5561 文献标识码：A
纤维素物质是地球上最丰富的有机物资源，全球每年产生的纤维素高达1 000亿吨，但这些资源大部分利用率很低，且污染环境.如能借助纤维素酶将纤维素降解并进一步转化为乙醇、细胞蛋白及气体燃料等物质，对于解决全球面临的能源危机、食品短缺及环境污染等问题具有重大的意义.此外，纤维素酶还可广泛应用于医药、饲料、果蔬加工、造纸、中草药制造、石油开采、工业洗涤剂、细胞生物工程等行业\[1\].
纤维素酶目前主要通过木霉以固体、液体深层发酵方式发酵生产.在固体发酵中，生长状况及产酶峰期可以通过固体曲的干湿度、菌丝生长及分布状况、分生孢子的形成及颜色变化等因素直观辨别\[2-3\]在液体深层发酵中一般通过测定酶活性来确定产酶高峰期，然而这种传统的酶活性测定方法不仅需要多种专用仪器设备和化学试剂，还要结合对比标准曲线和计算，不仅费事费力，而且检测成本相应增高\[4-5\]因此，研究液体深层发酵中的产酶菌株形态学变化，建立其形态学指标体系，对于快速掌握发酵产酶的高峰期和调控发酵液的成熟度具有重要意义.本文以里氏木酶HC415菌为研究材料，对该菌在液体深层发酵产酶时的菌丝体形态特征与纤维素酶活力间的相关性进行了研究，初步掌握了该菌液体发酵产纤维素酶时菌体形态学变化动态规律，现将
综上所述，里氏木霉液体发酵产纤维素酶时，菌体形态变化与发酵液中的酶活性高低有着密切的关联性，这种关联性可作为快速调控发酵液成熟度的重要指标，利用显微镜观察菌体形态作为直接快速判断该菌产酶能力的强弱具备可行性.HC415菌丝体在产酶高峰期变短、变粗，并在分枝顶部生出许多的膨大结节究竟是产酶结构、繁殖结构（分节孢子）或是休眠结构（厚垣孢子）尚有待进一步研究.
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