细胞生物学研究范文
时间：2023-12-04 17:27:31
细胞生物学研究篇1
[关键词]细胞生物学 双语教学 教学改革
[中图分类号]G624.8 [文献标识码]A [文章编号]1009-5349（2014）11-0205-02
随着全球经济一体化的迅猛发展，为了适应新形势的需要及掌握国际最新科研动态，教育部在2001―2007年先后提出了在高校开展双语教学的要求，并特别强调生物技术等专业要率先施行。双语教学是我国教育改革的一项全新尝试，是推动我国高等教育国际化的重要举措，是培养具有国际意识及国际竞争力生物学专业人才的战略选择。目前，国内许多高校已开展双语教学工作。本文在总结以往细胞生物学双语教学的实践体会基础上，对高校开展细胞生物学双语教学的必要性、面临的问题及有效解决对策等方面做以讨论。
一、细胞生物学双语教学的必要性
在全球科技领域竞争日趋白热化的形势下，如何在竞争中处于绝对优势，这取决于掌握先进科学技术的水平，这也是国家富强、民族兴旺的根本支撑。在生命科学领域中，细胞生物学是发展最为快速的一门前沿学科，它是人们研究生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键切入点。同时它又是一门重要的基础学科，是生物工程、生命科学、农学、医学等相关专业的一门必修基础课程。而其中的克隆技术、细胞工程、基因表达等技术的发展迅速，使得本门课程教学内容要求不断丰富、不断更新。因此，细胞生物学的教学不仅要求学生掌握基本理论和知识，又要求学生关注最新发展动态与科技发展前沿接轨。可见，采用细胞生物学的双语教学势在必行。同时，加强双语教学研究、提高双语教学质量，是我国推行双语教学改革的迫切需要。
二、细胞生物学双语教学存在问题
现今，我国高校开展的细胞生物学双语教学工作尚处于起步阶段，在教学中仍存在一些不可忽视的问题和困难，主要表现为以下几方面：
（一）师资力量
双语教学对师资素质要求很高，不但要求精通专业内容，还要求具备较高的英语水平。现今我国达到这两种要求师资的并不多，一些教师外语的运用能力不错，但他们专业素质不佳。而一些教师精通专业知识，但外语讲解课程方面却存在困难。因此，双语教学师资匮乏是各高校亟待解决的问题。
（二）学生水平
双语教学的效果受学生整体水平的限制。首先，学生信心不足，认为细胞生物学的内容难度较大，用英文授课接受起来会更加困难;其次，学生掌握的专业词汇不够，还需要一定良好的英语基础。结果造成学生整体英语水平的参差不齐，给教学过程增加了一定的难度。
（三）教材
在双语教学中教材的选择，直接影响学生的学习效果。然而，目前国内可供选择的细胞生物学的外文版教材非常有限，教材主要分三种：一是国外原版教材，二是原版引进后“再加工” 的双语教材，三是在具体教学实践上由教师编写出版的双语教材。英文原版教材与自编英文教材比较，在文字表达上更为严谨，更能反映出学科领域的前沿，有利于培养学生英语表达的语感，逐渐体会和学习细胞生物学科独特的用语习惯。但在选用原版教材进行双语教学时，很可能因为知识结构体系不同而造成脱节。
（四）教学方法
双语教学的教学过程中衔接性很重要，而细胞生物学双语教学也是以其知识的内在联系为顺序，并不是以英文单词、语法的难易程度为顺序，这样便造成不同阶段教学的英文语言衔接效果不佳，同时增加了教学的难度。而由于各学校间师资力量、生源水平等各方面的差异。因此，各高校应根据实际情况，选择合理有效的教学方法。
三、双语教学改革对策
针对上述双语教学过程中普遍存在的一些问题，提出了相应的教学改革对策及建议。
（一）增强师资力量
关于双语教学师资匮乏的问题， 我们可通过挑选专业精深、英语能力强的复合型人才来解决。选择双语教学的教师时，把教学经验和专业知识放在第一位，因为只有充分掌握了本专业的知识体系和重难点，具有丰富的教学经验，才可能把握好双语教学中中英文使用的尺度，保证学生能掌握专业基础。在此基础上再选拔具有较高英语水平的教师，提高师资水平将是一个循序渐进且必不可少的积累过程。
（二）原版教材为主，国内教材为辅
双语教学的有效开展，必须以国外先进的原版教材为基础。但是原版教材价格较高，给学生带来一定经济压力。
因此，目前还只能保证教师备课使用原版教材，学生主要还是使用影印教材，再辅以适量的中文材料或文献的阅读。大多数院校选用的教材是翟中和等人编写的《细胞生物学》中文教材，以Gerald Karp编写的“Cell and Molecular Biology―Concepts and Experiments”为英文教材。总之，在具体教学过程中尽可能的多选择几本原版教材做以参考比对，从中选择适合自己院校和专业的内容，为提高双语教学效果奠定了坚实基础。
（三）双语教学的目标、手段及方法
1.教学目标
明确教学目标是教学体系建构的关键，也是设置课程、选择内容、教学实践等依据和标准。而双语教学具有不仅提高大学生英语水平，还要完成学科教学任务的双重目标。经过实践分析，提出了双语教学以“知识目标为主，语言目标为辅”的拟定目标，保证学生融会贯通地掌握现代细胞生物学的基础知识和基本技能，建立完整的细胞生物学的知识脉络和体系。而语言目标则着重在读和写两方面：一方面让学生掌握一定量专业词汇，熟悉专业英语思维;另一方面，培养他们阅读文献和自主获取、跟踪该领域的发展动态的能力。
2.教学手段
细胞生物学双语教学是以多媒体课件为主，同时结合传统的黑板书写进行授课。多媒体技术能够激发学生学习的兴趣，更有助于学生理解授课内容。另外，利用丰富的网络资源，帮助学生课前预习和课后复习。为了帮助学生课前预习和课后复习，提前将教学大纲、教案、课件挂上网，同时挂网的材料还有教学录像、大量的图片、动画、阅读材料及参考文献、习题和试卷，并对这些教学资源进行定期更新。
3.教学方法
在高校的教学过程中，教学方法的好坏是实现教学目标、完成教学任务的关键。过去的老式教学方法仍占主导，但这已经与飞速发展的经济、科技和社会形势不相匹配，更是影响了人才培养质量的提高。我们可以采取以下教学原则来改进教学方法，达到预期的教学效果。
（1）循序渐进原则。在双语教学的开始阶段，不应该采用整版的英语授课模式，这会使学生产生畏惧的心理。首先，适当减少英语应用比例，授课形式可以采取中英文相结合，以中文教材为主;随着教学实践的进行，学生对于英文逐渐适应，可依据情况增加课件中英文的比例，讲解时也可逐渐增加专业术语的英语表述。[7]让学生由少到多、由简单到复杂地接触并接受双语教学。
（2）做好预习及复习。学生进行课前预习，课前教师把英文课件提供给学生，让他们熟悉专业词汇及专业背景知识，这样能够降低学生课堂上的学习压力。课后应布置适量的作业，不仅有助于学生准确地掌握专业知识，并且能够提高他们的英文阅读和表达能力。
（3）建立考核机制。考核是促进学生学习的一种手段，是了解学生知识掌握程度的重要途径，从中可以发现教学方式及教学模式中存在的问题，并及时解决“教”与“学”中的问题。针对双语教学的课程，考核平时成绩的比重应适度增加，如课堂讨论表现、作业的完成情况等。另外，期末考试可以增加一些英文试题，并鼓励学生用英语答卷，而不过分强调语法的准确性。
双语教学是我国高等教育适应国际形势发展的需要，培养社会高素质复合型人才的有效途径，也是把我国高校素质教育向前推进的一个新举措。虽然现阶段还存在一定的问题和困难，但随着国家对教育事业的不断关注，随着教学经验的逐步积累、师资队伍的不断建设、学生英语水平的不断提高，双语教学必将实现由量变到质变的跨跃。
【参考文献】
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细胞生物学研究篇2
研究性学习 细胞生物学 实践教学
教学模式不是固定不变的公式。任何教师组织研究性学习都不能机械地套用它；同时，任何学生都没有一成不变的学习方式。细胞生物学作为一门理论性与实践性较强的学科，其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域。面向21世纪，为了跻身世界先进行列，为了完成我国高等教育“培养具有创新精神和实践能力的专门人才”的光荣任务，深化高等教育改革势在必行。深化高等教育改革的关键在于探索以培养学生创新能力为重点的新型教学模式。为了能在有限的课时内，让学生在理论与实验技能方面有一个全面的提升，笔者将研究性学习模式引入细胞生物学实践教学。
一、中国高校实践教学的困境
过去很长一段时间，实践教学由于受到主、客观因素的束缚，从总体上说不很令人满意。主要表现在门类众多、内容单一、重复严重、学时不够、方式呆板、考核不力等诸多方面。
1.课时减少，内容滞后。实践教学课时减少，是近几年新教学计划的特点之一。课时的减少与加强实验课、扩充实验内容的普遍趋势形成尖锐的矛盾。由于学科的高速发展，使得实践教学满足不了与理论接轨，往往实验内容滞后于理论发展，存在着很多缺陷。而随着教学形势和任务的改变，这些弊端显得更加突出，影响了该学科教学质量的提高。
2.教学方法单一陈旧。不少教师观念保守，满足于完成既定教学任务，只教书，不育人。集中表现在因循知识的“注入”而不重视思维的启迪；固守教师在课堂上信息的单向传递，而不重视学生的主动参与；局限于基本教材的知识面而不重视引导学生涉猎更广泛的知识领域。“让学生成为学习的主体”、“让学生学会学习”还未能得到落实。因而，我国大学生的独立性、批判性、创造性、应用性等能力与国外大学生相比显得较差。
3.考核方法片面。一般是根据学生的实验报告来直接打分，但是这样做的弊端是教师的主观性较大，同时对学生实际的实验操作掌握水平很难有一个正确的评价，较难客观的反映实践教学的效果。
二、研究性学习模式引入细胞生物学实践教学
1.统筹课程安排，改进实验方案。不开设验证性的实验，只开综合性、系统性强的实验，将学术研究比较成熟的研究结果改造成符合实验教学要求和特点的综合性实验。系统教授完理论课程后，利用集中的几周时间进行实验教学，使理论课和实验课有一个有效的衔接，使学生能够系统掌握细胞生物学的基本实验技能。
2.自编实验教材，重新设置内容。在实验教学过程中，根据精选的教学内容，编写了《生物学实验教程》实验指导书；在教学过程中，以自编教材为主，并参考其他辅助教材。教师只讲解基本的操作方法和技术，既不是严格的实验顺序，也不是标准的操作程序，学生可根据自己的实验方案参考使用。
为学生创设实际情境，以便提出高质量问题，并以“课题研究”作为载体，激励学生寻找问题的答案。这些问题应该是：
（1）新的，即呈现的是不熟悉的情境；（2）在学生的能力范畴之内，即在先前学会的知识和技能的范围之内时。学生自主组队，根据提出的问题，选用合适的实验方法，解决问题。
3.全面开放实验室，以科研带动教学。实验室开放是实验教学方式、手段的革新，我们要树立教学与科研相结合的思想，“以科研促教学，以教学带科研”，在教学中研究，在研究中教学。实验室的开放包含两个方面：实验设备资源的开放和教学方式的开放。实验设备资源的开放，即学生可以合理选择、使用适合的实验仪器设备，完成实验项目。教学方式的开放，也就是教与学的开放。主要表现在学生对实验内容、实验方法等的选择，实验运行的环节，完成实验的形式，以及指导教师指导方法的开放，强调学生的主体地位。
4.利用网络，实时指导。由于现代教学手段的广泛应用，基于校园网的Black Board网络平台已经成为传统教室的延伸。教师和学生可以通过网络随时进行交流和答疑。充分利用计算机辅助教学实验软件和多媒体教学课件。网络的充分利用可以实现教师与学生之间的实时互动，大大提高实验教学的效率。这种教学方式不受时间和空间的限制，充分利用了师生的空闲时间。
5.建立合理的考核机制。实践教学的效果不应该由原有单一的考试或实验报告成绩老考核。我们的教学目标直接指向学生多方面的发展变化，因此评价的指标也应该以学生多方面的发展变化为依据。以现代的教学质量观来指导学生学习效果的评价，必须以是否有利于学生的进步与发展作为考核指标。如可由实验态度（10%）、基本理论（15%）、操作技能（50%）、实验结果（25%）综合评定产生。实验考核以学生实际操作技能和分析解决问题的能力为主。
三、结束语
总之，在当前高校课程实践教学中，改革的目的是改变传统教学中的一些不合理的教学方法和手段，提高教学质量，激发学生的创新思维，促进学生学习的自觉性和主动性，使培养的学生更能适应现代社会发展对生物类专业专门人才的需求。
细胞生物学实验是一门重要的实验课程，把握好理论课程和实验课程的有效衔接，才能真正提高实验教学的质量和效果。在本科生中开设细胞生物学实验这样的综合性实验课的改革是一个系统工程，除了在教学实践中不断改进教学方法外，我们教师自身也要为人师表，不断提高自己，以科研工作充分带动教学，应在教学过程中对应学生自身的特点，根据自己的学科特点和学生未来发展的不同要求对他们进行因材施教，培养更多高素质的人才。
参考文献：
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细胞生物学研究篇3
[关键词] CIK细胞;扩增;杀伤活性
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2007）12（c）-019-03
The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells
WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru
(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)
[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P
[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外经过多种细胞因子作用后培养获得的一群异质细胞。它同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，被认为是增殖速度最快，杀瘤活性最强，杀瘤谱最广的效应细胞。过继性免疫治疗是治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法，用于过继性免疫治疗的免疫活性细胞必须具有较强的扩增力和杀伤性。本实验通过对CIK细胞的体外培养及其生物学特性的研究，以寻求用于过继免疫治疗的高效免疫活性细胞。
1 材料与方法
1.1实验材料
人外周血样品取自内蒙古自治区中心血站12例健康成人自愿者的静脉血50 ml。男6名，女6名，年龄20～50岁。人肺腺癌细胞株A-549购自南京凯基生物科技发展公司。
1.2主要试剂和仪器
RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；特级无支原体无热源胎牛血清(美国TBD公司)；人淋巴细胞分离液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技术发展中心，天津)；二巯基乙醇(美国TBD公司)；台盼蓝（美国Sigma公司）；二甲亚砜（美国Sigma公司）；青霉素，链霉素（华北制药有限公司）；胰蛋白酶（南京凯基生物科技发展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等购自北京化学试剂公司；MTT试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）；重组人白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美国Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（异硫氰酸荧光素）、CD4-PE（藻红阮荧光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG荧光抗体（美国eBioscienc公司）；流式细胞仪(美国BD公司)；550酶标仪（美国Biorad公司）。
1.3实验方法
1.3.1 PBMC的分离(密度梯度离心法)及LAK、CIK细胞的诱导将人外周抗凝血用淋巴细胞分离，吸取白膜层细胞即PBMC，PBS洗涤3遍，加入含10%无热源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巯基乙醇、0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素培养基），调整细胞浓度，接种于25 cm2培养瓶中，1.0×107个/（10 ml・瓶)，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内静置2 h，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。取非黏附细胞分成2组。LAK组:加入500 U/ml IL-2，每3天换液1次并补加500 U/ml IL-2。CIK组:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d换液1次，并补加IL-2及CD3mAb。
1.3.2LAK、CIK细胞表型的检测在培养1，4，7，10，13，16，19，22 d取培养的细胞，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，取100 μl悬液加入流式专用试管中，加入FITC、PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，对照为IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗涤3遍，洗去多余的抗体。并用同型无关阴性抗体做对照，在流式细胞仪（美国BD公司）上检测分析，至少分析1.0×105个细胞。
1.3.3 LAK、CIK细胞杀伤活性的检测取对数生长期的肺癌细胞A-549作为靶细胞，用RPMI1640培养基稀释成1.0×105个/（100 μl・孔），接种细胞于96孔培养板中，然后取出培养两组效应细胞，把效应细胞加入靶细胞孔中混合，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔，放置培养箱中培养24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)测仪于570 nm处测OD值，按下面公式计算各组LAK的杀伤活性。
1.4统计学处理
数据采用SPSS12.0统计软件包处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多个均数间使用单因素方差分析，两样本均数的比较用t检验，P
2 结果
2.1 CIK细胞的增殖情况
实验表明PBMC在细胞因子作用下均能增殖，镜下可见细胞饱满透亮、聚集成团，呈集落样生长。与LAK比较，在前期无明显差异，至19、22 d时扩增能力显著高于LAK细胞的扩增倍数(P
表1不同培养天数LAK、CIK细胞的增殖情况(x±s，倍)
2.2 CIK细胞的表型分析
用流式细胞仪分析细胞表型，结果显示CIK细胞培养后，其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P
与培养前比较，*P
2.3 CIK细胞的杀瘤活性
CIK细胞在培养至第13天即有较高的杀瘤活性，为61.17%，显著高于LAK细胞的41.02%(P
与单纯的LAK对照组比较，*P
3 讨论
近年来恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，随着细胞免疫学和分子生物学的发展，细胞免疫治疗成为除化疗、放疗之外的又一重要辅助治疗手段，副作用轻微，安全性较好[3]。过继免疫治疗(ALT)是恶性肿瘤生物治疗的一个重要手段，是通过直接向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫活性细胞，在体内发挥抗肿瘤作用，以此来达到治疗肿瘤的目的。淋巴因子诱导的杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的杀伤细胞，具有广谱杀伤肿瘤的细胞活性，其较早用于临床肿瘤免疫治疗并取得了一定疗效。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)是一种非MHC限制性的高效溶解肿瘤的细胞毒性T细胞，其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志CD3，也有NK细胞表面标志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。CIK 细胞是一类非主要组织相容性复合物(MHC)和非T细胞受体(TCR)限制性的免疫活性细胞，在培养过程中，一些非活性细胞在多种细胞因子的共同刺激下，激活为有细胞毒作用的CIK 细胞。这些活性细胞发挥抗肿瘤作用的机制很可能是通过黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互结合后，能够分泌大量的BLT 酯酶的细胞质颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解[6]；同时，CIK细胞自身还能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些细胞因子，提高细胞毒作用。是目前最新、杀伤肿瘤效果最佳的生物免疫治疗方法。Lanier于1986年首次发现这种异质细胞群(主要是CD3+CD56+细胞)，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%[7]。经过多年的实践，科学家们找到了体外大量扩增CIK细胞的方法，即应用细胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3单抗共同培养产生CIK。我们在实验中采取此方法，在分离外周血单个核细胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3单抗、IL-1β与IL-2，培养22 d，每3天换液和补加细胞因子，培养13 d时即有25%左右的细胞是CD3+CD56+细胞，具有典型的CIK细胞形态和生物学性状。CIK具增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、毒副作用小等优点，目前自体及异体外周血CIK细胞已被用于一些实体瘤和恶性血液病的治疗，并取得了较好的疗效。我们的实验结果表明，与LAK 细胞相比，CIK细胞具有更强的增殖能力，培养至22 d时体系中总的细胞数可增加100多倍。用流式细胞仪分析细胞表型， 结果显示CIK细胞培养后， 其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P
综上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3单抗、IL-1β和IL-2等多种细胞因子成功从健康人非贴壁PBMCs中诱导出大量的具有典型形态和免疫表型的CIK细胞，且具有较高的杀伤活性，为下一步临床治疗肿瘤奠定了基础。
[参考文献]
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(收稿日期：2007-11-05)
细胞生物学研究篇4
关键词：人类胚胎；胚胎干细胞；生物伦理学
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是指来源于着床前囊胚内细胞团或早期胚胎原始生殖细胞的一大类未分化的全能干细胞，具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能。人类胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hES细胞）在临床移植医学、细胞治疗、组织工程、生物学基础等研究领域具有重要的科学意义和巨大的应用前景，对于有效地治疗人类多种疾病，维护和促进人类健康具有巨大的潜在价值。但由于hES细胞的来源同胚胎道德地位、克隆人等一系列敏感问题有着密切联系，因此带来了法律问题，也引起了人们对人类胚胎和胎儿组织是否尊重的“世纪伦理之争”.
1 干细胞的来源、分类及功能
干细胞是指在生命的生长和发育过程中起“主干”作用的原始细胞（progenitor cells），它们具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。尤其是人类胚胎干细胞（embryonic stem cells），它可以分化成人体全部200多种细胞类型，进而构建人的心、肝、肾、神经等多种组织和器官，最终发育成一个完整的个体，是一种全能干细胞。根据来源的不同，干细胞分为成体干细胞和胚胎干细胞两种。成体干细胞指人体内为修复或替代体内损伤或正常死亡的细胞而产生的干细胞，其分化能力有限。目前，人类胚胎干细胞的来源主要有五种途径：①用选择性流产的人类胚胎组织产生；②用不孕症治疗后的剩余胚胎组织产生；③用以研究为目的的捐献配子人工受精创造的胚胎产生；④应用嵌合体胚胎产生；⑤应用体细胞核移植技术产生。2007年，美国Wake Forest大学的研究者在《自然》（Nature）上报告说：从羊水中可以分离出多能干细胞。这种方式介于“成体干细胞”和“胚胎干细胞”之间，为获取干细胞提供了新的思路。用不同来源的hES细胞研究干细胞，引发的伦理问题不同，得出的结论也不同[1]。
按照干细胞的分化阶段，人们将干细胞分成三大类：即全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞可以分化为组成整个人体的216种所有的细胞类型，它可产生一个完整的胚胎。多能干细胞可向多种细胞类型分化，但不能制造完全发育所需要的所有组织。专能干细胞是在干细胞发育的后期出现的，细胞也变得越来越专门化，例如神经干细胞、造血干细胞等。
显而易见干细胞的治疗则是它们的主要功能。科学家们指出干细胞治疗是一种具有潜在革命性的治疗疾病和损伤的、在医学领域应用广泛的新方法。它的目标是通过干细胞移植提供健康的新细胞修复身体受损的或病患的部分。例如是通过干细胞移植治疗白血病，神经干细胞移植治疗帕金森病、阿耳茨海默病、糖尿病、心脏病、多样硬化症、烧伤和脊髓损伤等疾病的新疗法意义重大。
2 干细胞研究所面临的主要伦理问题
胚胎干细胞研究中的伦理问题主要涉及人类胚胎的地位、胚胎干细胞来源、治疗性克隆和生殖性克隆等方面。具体问题有：人类胚胎的道德地位是什么；赞同或反对“生殖性克隆”的伦理论证是什么；为何“治疗性克隆”能得到伦理学的辩护。在讨论中还涉及到对“人的生命”和“人格”等概念的理解。在西方国家，有不少人坚持胚胎就是生命，特别是一些基督教徒和神职人员以及反对堕胎的人员，他们认为这是亵渎神灵、侮辱生命的尊严，并且认为克隆人的胚胎迟早导致克隆人的出现，故而表示强烈抵制和反对。女权运动者也从妇女、尤其是贫穷妇女的健康保健出发，对干细胞研究提出异议。并且过去几年中，有些西方国家曾立法禁止或部分限制而起步艰难，这些因素成为干细胞研究伦理纷争的焦点所在。
1999年，人类基因组组织（HUGO）伦理委员会发表了关于克隆的声明。从20世纪90年代末以来，我国学界一直在高度关注胚胎干细胞研究中的伦理问题，对上述伦理问题的研究与国际社会近乎同步，发表了不少高质量的学术论文，举办了若干次高级别的研讨班，相关的研究成果被写入了生命伦理学教材。这些已有的研究成果有助于认识胚胎干细胞研究的伦理本质，为国家制定相关伦理准则提供决策参考，也为媒体和公众的广泛参与讨论提供了概念基础。不少专家学者也在积极推动和参与把理论成果转化为审查项目中的行动指南，2003年2月，国家人类基因组南方研究中心课题组提出了《人类胚胎干细胞研究的伦理准则（建议稿）》[2]。
为规范干细胞研究中潜在的诸多伦理问题，科技部和卫生部于2003年12月出台了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》规定：“用于研究的人胚胎干细胞只能通过下列方式获得：①体外受精时多余的配子或囊胚；②自然或自愿选择流产的胎儿细胞；③体细胞核移植技术所获得的囊胚和单性分裂囊胚；④自愿捐献的生殖细胞。”这些胚胎干细胞来源方式需经受伦理上的严格考证。我国hES细胞研究应用这种来源应做如下限制：捐献者自主决定是否继续存贮或捐献给另外的不孕夫妇；不许有预先设计地获得胚胎；不能买卖胚胎及胎儿组织；应以最少量的胚胎用于最重要的研究；研究者不得在治疗不孕症时有目的增加植入胚胎的数量和增加配子等。
3 我国对人类胚胎干细胞研究的基本立场
鉴于干细胞研究的巨大社会和经济利益，同时也涉及到人类生命雏形以及“克隆人”的重大伦理问题，国家人类基因组南方研究中心伦理、法律和社会问题研究部伦理委员会认为：为了“医为仁术”这个崇高的事业，应该支持我国科学家积极开展人类胚胎干细胞，使我国人类胚胎干细胞研究健康有序地发展，为21世纪科学的发展作出我们的贡献。该中心的伦理指导大纲中指出：人类胚胎干细胞研究应遵循的伦理原则包括：行善和救人、尊重和自主、无伤和有利、知情同意、谨慎和保密等原则。对胚胎干细胞研究的伦理规范中：①是反对“克隆人”。人类胚胎干细胞研究中涉及到体细胞核转移技术（SCNT），因此坚决反对滥用SCNT用于复制人类为目的任何研究；②支持治疗性克隆的研究，例如通过干细胞研究究得到的组织、器官，可用于临床移植手术等；③谨慎对待胚胎实验。
虽然科学是把双刃剑，但我们不能低估人类理性的强大力量。应就胚胎干细胞研究中的伦理问题，加强科学家、伦理学家、政策制定者和法学家之间的对话交流，开展对媒体从业者和公众的相关教育培训，世界各国在科学和伦理学的争论中扬利抑弊，通过立法手段使hES细胞研究走向健康的研究轨道，使生命科学更好地造福于人类。
参考文献：
[1]王延光.人类胚胎干细胞的来源与伦理思考[J].医学与哲学，2002，23（2）：7-10.
细胞生物学研究篇5
[关键词] 丹参酚酸B；后处理；组织工程；心脏瓣膜；形态学；生物力学
[中图分类号] R318.08 [文献标识码] A [文章编号]1673-9701（2011）22-13- 02
Effect of Salviaolic Acid B Postconditioning on Morphology and Biomechanics in Decellularized Porcine Aortic Valve
TAO Rancen GUO Guangwei
Department of Cardiothorocic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
[Abstract] Objective To observe the effect of salviaolic acid B postconditioning on morphology and biomechanics of decellularized pocine aortic valve，providing theoretical support for tissue engineering. Methods Porcine aortic valve leaflets were theated by two different proticols. Control group1 involved treatment with Triton-x100，sodium deoxycholate，DNase and RNase. And group 2 were treated by Triton-x100，sodium deoxycholate，DNase and RNase， then using salviaolic acid B post-processing. Eath samples were observered by microscopy and scanning electron microscope； Biomechanics characteristics measured by biomechanics properties-maximum deflection，elongation rate and max tensile stress. Statistical analysis was performed to compare the thickness. Results There was no significant difference in tissue thickness was found between two methods，Tx-sal method can protect the heart valve three-dimensional structure，biomechanics properties-maximum deflection ， max load and elongation rate were increased significantly in the group with salviaolic acid B. Conclusion Salviaolic acid B post-processing can effectively protect the collagen and elastic fibers and improve the biomechanical properties of decellularized pocine aortic valve.
[Key words] Salviaolic acid B； Postconditioning；Tissue engineering；Heart valves； Morphology；Biomechanics
理想的组织工程异种生物瓣膜支架应彻底去除细胞成分、最大限度地保存弹性纤维和胶原纤维，才能最大程度地减低免疫原性，较好地保留细胞黏附所需的三维微环境，进而更好地避免在瓣膜置换术后瓣膜的钙化和腐败，提高瓣膜耐久性[1-2]。目前，国内外所采用的酶或/和去垢剂脱细胞猪心脏瓣膜仍存在血栓形成、力学和免疫反应等方面的问题。因此本研究通过建立传统的曲拉通法脱细胞模型、应用丹参酚酸B后处理的方法，比较两组瓣膜形态学及生物力学性能的差别，探讨其在组织工程心脏瓣膜（TEHV）的应用前景。
1 材料与方法
1.1 实验材料
猪心购自太原屠宰场，选取6～7月龄的猪宰杀后取出心脏，PBS液冲洗后，放入无菌袋中立即运回实验室，在处死1h内取主动脉瓣膜。
1.2 药品、试剂和仪器
丹参酚酸B（四川广汉市本草植化有限公司）、脱氧胆酸钠、Triton-x100、EDTA、核糖核酸酶（RNaseⅠ）和脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）购自美国Sigma公司；水浴恒温震荡仪，Olympus双目显微镜，扫描电子显微镜（H-8000），HD-10型厚度仪（中国郑州），拉力试验机（Instron Company，SE08-292，USA）。
1.3 实验分组及试验方法
按随机数字法，将120片瓣叶随机分为三组：曲拉通组、曲拉通-丹参酚酸B组和正常组（新鲜猪主动脉瓣叶）。每组40片，曲拉通-丹参酚酸B作为实验组，曲拉通和正常组作为对照。
①曲拉通（Triton-x100，Tx）组[3]：消毒处理好的瓣叶，PBS液反复冲洗后置入含0.25%的脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate）、0.25%Triton-x100、0.02%的DNA酶、RNA酶和EDTA溶液恒温37℃持续震荡48h，用PBS液洗涤至清澈，后在4℃Hanks液中保存。②曲拉通-丹参酚酸B（Triton-x100 +salvianolic-acid B，Tx-sal）组：消毒处理好的瓣叶，PBS液反复冲洗后置入含0.25%的脱氧胆酸钠、0.25%Triton-x100、0.02%的DNA酶、RNA酶和EDTA溶液恒温37℃持续震荡48h，后置于0.5%的丹参酚酸B溶液中4℃恒温震荡48h，用PBS液洗涤至清澈，后在4℃Hanks液中保存。
1.4 观察指标
1.4.1 光学显微镜和电子显微镜观察 取各组瓣叶，常规4%甲醛固定，石蜡包埋，切片，从各组取5张石蜡切片， 二甲苯脱蜡，HE染色、Masson染色，光学显微镜下观察。分别观察脱细胞程度、两组对胶原纤维的影响。两组各取5片瓣叶，用3%戊二醛预固定，用1%的四氧化锇再固定，乙醇梯度脱水，离子溅射喷金，扫描电镜观察。
1.4.2 组织厚度 每组各取10片瓣叶，分别应用 HD-10型厚度仪测量瓣膜组织厚度。
1.4.3 生物力学特性 用拉力试验机（Instron Company，SE08-292，USA）将瓣叶沿瓣膜长轴进行拉伸实验，标距为20mm，以10 mm/ min速度牵拉瓣叶至断裂，计算拉伸强度、最大变形量、断裂伸长比。
1.5 统计学处理
所有数据以均数±标准差（χ±s）表示，应用SPSS16.0统计软件。组间差异性判断应用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 标本观察结果
新鲜组瓣叶呈淡红色，基本保持正常形态结构。经曲拉通脱细胞处理后瓣叶呈白色半透明，实验组经丹参酚酸B处理后瓣叶为乳白色。三组瓣叶均柔软，富有弹性。
2.2 光镜观察结果
HE染色显示，正常组可见大量间质细胞和蓝染的内皮细胞核，瓣膜结构紧密，Tx组和Tx-sal组脱细胞较完全，内皮细胞无残留，见封三图1、2、3。Masson染色显示，正常组胶原纤维排列整齐、无断裂现象。Tx组胶原纤维结构改变明显，纤维走向模糊，排列松散，波浪状结构消失；Tx-sal组胶原纤维三维网状结构完整存在，波浪状规则排列，纤维走向自然清晰，见封三图4、5、6。
2.3 电镜观察结果
扫描电镜显示两组去细胞瓣膜内皮细胞、间质细胞清除彻底，无残留。Tx组可见瓣膜支架结构明显改变，胶原纤维轻度断裂，形成深浅不一的沟。相比之下，Tx-sal组瓣膜三维网状结构规则、清晰，超微结构改变不明显。
2.4 组织厚度
组织厚度Tx组与加Tx-sal组分别为（0.73±0.03）mm和（0.75±0.05）mm，差异无统计学意义（P＞0.05 ）。
2.5 生物力学性能测定
Tx-sal组心脏瓣膜的抗拉强度、最大变形量、断裂伸长比明显高于Tx组（P＜0.05）。见表1。
表1 各组生物力学性能测定结果（χ±s， n=10）
组别 抗拉强度（MPa） 最大变形量（mm） 断裂伸长比（λ）
正常组 2.32±0.34 7.89±0.24 1.66±0.33
Tx组 2.21±0.37 8.15±0.77 1.25±0.18
3 讨论
近年来，随着组织工程学科的发展，组织工程心脏瓣膜（TEHV）能更好地解决人工瓣膜置换术后诸多的并发症，已成为目前瓣膜领域研究的热点[4，5]。理想的去细胞方法要求完全去除瓣膜细胞，降低免疫原性，又能保留天然瓣膜的胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分，保持足够的机械强度以满足心脏瓣膜的功能需求[6，7]。Bodnar[8]用Triton-x100和脱氧胆酸钠去细胞法处理瓣膜较为理想，细胞去除彻底，血液相容性好，是两种良好的组织工程瓣膜支架的制作方法。但是两者都存在钙化和衰败以及黏附较为困难的问题。有研究表明[9]，机械应力变化是直接引起异种生物瓣膜腐败的重要因素之一，且承受应力大的部位也最容易发生钙化，长期的机械应力不仅导致瓣膜胶原纤维机械性损毁，还可使瓣膜变形产生间隙，大量的离子和血浆进入组织间隙聚集引起血栓发生，导致瓣膜衰败。因此，研究如何提高支架机械性能、减低移植物免疫原性、减少瓣叶钙化，具有重要临床意义。
丹参酚酸B（Salviaolic acid B）是丹参提取物的重要组成成分，为一种缩酚酸多羟基化合物，由一分子咖啡酸与三分子丹参素缩合而成，分子式C36H30O16。大量研究表明，salB能捕捉超氧阴离子；清除氧自由基；减低内皮细胞间黏附因子（ICAM-1）的表达，减少白细胞浸润；还可避免细胞内的钙超载，降低钙化[10]。本研究结果显示，经丹参酚酸B改性处理脱细胞猪心脏瓣膜的弹性纤维、胶原纤维等细胞外基质的三维网状结构明显优于传统的曲拉通法，此外，拉力力学检测结果表明，实验组脱细胞猪心脏瓣膜抗拉强度、最大变形量、断裂伸长比明显高于对照组，显示了优良机械性能，提高瓣膜抗疲劳性，有助于延长置换术后瓣膜的使用寿命。
综上所述，经丹参酚酸B后处理的心脏瓣膜内皮细胞去除彻底，胶原纤维保存完整，机械性能较为稳定，是制备组织工程心脏瓣膜支架的优良方法，并显示可观的临床应用前景。
[参考文献]
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细胞生物学研究篇6
【关键词】 细胞生物学；研究型实验教学；创新能力
【中图分类号】G642.5 【文献标识码】B 【文章编号】2095-3089（2013）4-00-01
1.引言
在深化高等教育改革中，培养学生综合素质和提高学生创新能力是一个根本性的指导思想。在高等学校培养创新人才的系统中，实验教学是一个重要环节。如何突破传统的实验教学模式，开展创新实验教学，使实验教学活动更具有直观性、实践性和创新性，发挥其在学生素质教育和培养学生创新能力方面的重要作用是一个十分值得积极探索的课题。[1]
2.传统教学模式改革的必要性
实验课教学的目的，一方面在于使学生加强理解有关的理论知识，让学生掌握实际操作技能，另一方面在于提高学生分析问题、解决问题的能力以及提高学生的综合素质和创新能力。然而，传统的实验教学还没有成为一个独立的系统，仅仅还是课本知识的验证，而且采取的方式基本上还是演示式、“填鸭式”教学模式，完全忽视了学生才是教学的主体；此外在传统实验教学中，实验教学内容的选择、实验材料的准备到实验试剂的配制都是由教师包办代替，学生成了机械的操作者，只是对实验指导书的重复[2]。这种教学模式不能充分提高学生的学习兴趣，很难培养出适应时代需求的创新人才。因此，要培养具有创新意识和创新能力的高素质人才，就必须更新教学观念，打破墨守成规的教学模式，从传统的以教师为中心的知识传授型过渡到知识传授与探索相结合，实现以学生为主体，以调动学生自主学习，激发学生求知欲和创造性为主要目标的教学方式的转变。
3.研究型实验教学模式的探索
3.1研究型实验教学模式
研究型实验教学注重实验教学中的研究性，故又称研究性实验教学，研究型实验教学不仅仅是搞几个设计性、研究性实验，而是体现在课程体系的研究、实验课程的规划、课程内容的编排和实验过程的改革等每个层面，要求授课教师通过对实验教学的研究，对实验课程内容、实验教学方法、实践性活动等进行研究性的科学设计，从而引导学生的研究性实验学习，激活学生对实验的学习和探究动机，培养学生的实验兴趣，从而增强学生对研究性实验学习的自觉性和积极性，达到培养学生独立研究的能力，提高学生的创新能力和综合素质[3]。
总之，研究型实验教学是以“研究”为主线，通过增强实验教学中的研究性，而重塑实验教学中的能力要求，尤其是“创新”能力的要求，并为深化实验教学体系与教学模式的改革而探路。[4]
3.2研究型实验教学模式在细胞生物学实验中的具体实践
为适应当前社会需求，培养具有创新能力的生物人才，近几年我院对细胞生物学实验课进行了研究型实验教学模式的探索，将“研究性”融入到实验的各个层面：
（1）对实验内容进行问题式的情景化处理，将“研究”引用到实验的每个层面
比如在“细胞膜通透性”这个实验中，让学生自己思考，这个实验的最佳材料是什么，为什么选用这种材料；在“Feulgen反应显示DNA”这个实验中，让学生自己思考这个实验中我们通过什么步骤来消除实验误差。
（2）强调实验方法的改进和创新，树立敢于质疑、敢于挑战的科学精神
例如“植物细胞骨架的光学显微镜观察”实验中，TritonX-100的浓度和处理时间是相当关键的，它直接影响到细胞骨架的清晰度。我们就要求学生改变TritonX-100的浓度和作用时间，在不同条件下完成制片实验，然后比较制片效果，并确定最佳制片条件。通过这个实验的学习，告诉学生不能迷信实验讲义和文献资料的实验方法，但可以参考这些方法进行预实验，确定最佳方法后，再在最佳实验条件下开展研究。
（3）严格用科学方法处理实验数据，培养诚信的人格品质
在每一次实验中都严格要求学生必须真实地记录实验结果，不能对原始数据做任何修改或人为的加工，对于显微镜观察的样本，要客观地加以描述，并选择最具代表性的图像或照片作为实验结果。对于测量获得的数据，尽可能重复一次，求得平均值，如果样本达到一定数量，则可以采用统计学方法对数据进行处理。
（4）尝试以论文形式书写实验报告，全程体验科学研究过程
特别是对于自主设计实验，要求学生自己查阅文献，设计实验，导师确认后，自己安排操作，最后按科研论文的书写方式提交实验报告，并说明实验的创新性[5]。
此外我们还让学生加入到授课老师的科研课题中来，把学生完全置身于科学研究的氛围，使学生的基本技能更加牢固，应用理论知识分析解决问题的能力更强，创新能力、协调能力都得到了训练和培养。
3.3研究型实验教学实践的效果
通过研究型实验的教学实践，我院在学生创新能力培养中取得了一定的成绩。学生的各方面能力明显提高，主要表现在以下几个方面[6]：
（1）资料查阅及知识运用能力
学生在研究型实验教学实践活动中，特别是自主设计性实验中，通过查阅学校图书馆数据库中提供的信息，获取相关的研究文献、研究成果以及实验方法，对相关资料进行归纳整理。
（2）实验研究的能力及分析能力
在整个实验教学实践活动过程中要求学生以严谨的科学态度进行各实验工作，同时充分发挥观察力、想象力，对实验中出现得各种现象、数据进行分析与评价，对实验结果进行整理、分析与归类。
（3）科研论文的撰写能力
学生实验完成后按科研论文的书写方式提交小论文，在论文中学生须认真分析实验数据和结果，说明实验的创新点，通过这种锻炼，学生撰写论文的能力明显提高。
（4）提高了学生的创新意识
在研究性实验教学模式探索过程中，我们除了让学生完成教师规定的基本实验后，还鼓励学生参与到教师的科研课题中来，学生也可以根据兴趣自拟题目，撰写申请书进行申请，写出创新点，让学生体验研究的全过程，提高了学生的创新意识。
（5）提高了学生的团队精神
我们在实验教学实践活动中一般都是分组进行，共同协作完成同一个实验，由此使学生在实验中不仅学到基本知识，而且也增加了学生的团队精神和协作能力，为他们进入社会打下了一定的基础。
4.结语
实验教学改革是实验教学工作的灵魂，如何发挥实验教学的作用，更好地为培养高素质人才服务，是一个非常重要的课题。研究型实验教学还有许多方面需要创新和改革，只有通过坚持不懈的努力和深入细致的工作，才能使研究型实验教学改革真正达到对学生综合素质和创新能力的提高。
参考文献
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细胞生物学研究篇7
【关键词】 异体移植
摘 要：［目的］研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。［方法］切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12 cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在50％Triton X100和50％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12 cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5 μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10 cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。［结果］去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8 cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10 cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8 cm移植组明显高于10 cm移植组(P
关键词：去细胞神经； 异体移植； 再生
Abstract：［Objective］The purpose of this paper is to demonstrate whether the nerve length could affect the quality of acellular nerve and investigate the properly repairable distance of nerve defects with acellular nerve allografts. ［Method］Fresh sciatic nerves were obtained from adult dogs and pided into 12 cm long segments. The nerve segments were decellularized via an improved chemical decelluarization treatment as following: Nerve segments were rinsed with cold sterile Ringer's solution and submergedin 5% Triton100 solution 12h ，and then soaked the nerve segments into 5% sodium deoxycholate for 12h. The treated nerve segments were washed in distilled water for 3h. This procedures were repeated once again. In vitro， the degrees of decellularization ， demyelination and integrity of nerve fiber tubal of chemically extracted acellular nerves were observed with microscope and assessed by a score system. In vivo，the sciatic nerve of dogs on the right was exposed.In 8 cm grafted group (n=6)，a 7 cm segment of sciatic nerve was removed from the midthigh level. In 10 cm grafted group (n=6) ， a 9 cm segment of sciatic nerve was removed at the same level. The gaps were bridged with acellular nerve allografts by 8 cm and 10 cm long segments respectively. The followup period was 12 month postoperatively. Motor functional recovery of the right hind following allografting was examined by neurobehavioral， electrophysiological， histological and immunohistochemical assessment. ［Result］There was no difference on the degrees of decellularization， demyelination and integrity of nerve fiber tubal among every fraction of the acellular nerve from the two ends to the central portion. In 8 cm grafted group ， all survival dogs(n=5) were held upright with the affected hindlimb extended so that the body's weight was supported by the distal metatarsus and toes. In 10 cm grafted group， animals were failed to held upright with the affected hindlimb. Electrophysiological studies showed that elctromyographic activity was observed in both groups.After 12 month the conduction velocity was 321+51 m/s in 8 cm grafted animals and 183+6.0m/s in 10 cm grafted group. In normal animals， the conduction velocity was 1066+164 m/s. The conduction velocity in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P
Key words: Acellular nerve; Allograft; Regeneration
创伤、理化因素及肿瘤等原因可导致周围神经的损伤，造成长距离的神经缺损。为恢复肢体的神经支配通常需要应用移植物桥接神经缺损。该类移植物的功能是引导神经纤维通过缺损区并长入支配的器官和组织。由于新鲜异体神经移植的免疫学反应，在临床实践中自体神经移植一直被认为是“金标准手术”。但是由于切取自体神经带来的诸多并发症及供区所限，自体神经替代物修复神经缺损成为研究的重点。人工合成的替代物主要是由具有良好生物相容性和生物可降解材料制备，如PLA(polylacticacid)［1，2］，PLGA［poly(lacticcoglycolic)］［3］等。合成材料虽然可避免切取自体神经的并发症及异体神经的免疫反应，但在内部结构上不具备天然神经细胞外基质的三维空间结构，而这种结构对引导神经轴突的生长至关重要。异体神经的MHC(major histocompatibility complex)主要存在于神经的雪旺细胞和髓鞘成份中，近期研究显示经化学处理的去细胞异体神经可有效降低移植后的免疫反应并促进神经轴突向远端生长［4，5］，从而修复周围神经的节段性缺损。因此，化学去细胞异体神经已成为一种具有应用前景的自体神经替代物，并对其神经移植物的保存方法进行了研究［6］。然而，在实验研究中，对下述两个问题尚未进行深入研究：(1)较长节段神经的化学去细胞处理是否会造成神经断端与神经中段质量的差异；(2)在大型动物神经缺损修复中有效的长度范围为多少。上述问题的研究对制备较长的去细胞神经移植物和选择修复神经缺损的长度具有重要意义。
1 材料与方法
11 仪器及试剂
Medtronic Keypoint肌电图仪(丹麦)，恒温振荡器(回旋式，上海)，Triton X100(Sigma，美国)，脱氧胆酸钠(Sigma，美国) 。
12 犬化学去细胞神经的制备
已行钴―铬―钼人工假体体内植入实验并准备取材的实验犬6条，体重在24～26 kg，用速眠新100 mg肌注后全麻安乐死，取双侧全长的坐骨神经干，每条坐骨神经长约12 cm。将切取的全长犬坐骨神经标记远近端后，按下述顺序进行化学处理：(1)蒸馏水浸浴12 h；(2)50％Triton X100消化12 h;(3)蒸馏水浸浴3h；(4)50％脱氧胆酸钠消化12 h；(5)重复前述步骤；(6)蒸馏水浸浴3 h；(7)萃取神经在4℃、 pH 72无菌磷酸盐缓冲液(PBS)暂时保存；(8)将处理好的去细胞神经组织和Hank’s液一起用双层无毒塑料袋进行分装，在250 KGy的γ射线下进行辐照灭菌，放置在4℃冰箱中备用。
13 去细胞神经的组织学评价
去细胞处理后的神经组织，将每一神经段按等比例分为6小段，每小段长为20 mm，石蜡包埋，做5 μm厚横向和纵向组织学切片，进行HE染色观察去细胞程度及纤维管道结构完整性、Fast blue染色观察髓鞘成分。按照表1的标准进行去细胞神经的质量评价。每段随机取3张切片进行观察，取其均值单项计分。
14 去细胞异体神经移植试验
健康杂种犬12只，雌雄不分，体重243～266 kg，随机分成2组，8 cm移植组和10 cm移植组，每组 6只。用25％戊巴比妥钠(10 mg／kg体重)静脉注射进行麻醉。在无菌条件下右股后切口显露坐骨神经干。在坐骨神经干中段分别锐性切除7、9 cm长的神经节段，自然回缩造成8、10 cm长的神经缺损。分别用8、10 cm长的化学去细胞同种异体神经进行移植桥接神经缺损，用8-0无创尼龙线行神经外膜缝合，环形缝合6针。术后分笼饲养，观察期12个月。
15 体内移植实验观察
151 一般观察 观察移植后切口愈合及肢体功能恢复。
152 神经电生理观察 用丹麦产Medtronic Keypoint便携式肌电图仪进行运动和感觉诱发电位的检测。随机选取左侧非手术侧肢体5例作为正常值对照。在全麻下手术切开显露待测神经。
在进行运动诱发电位检查时，将刺激电极放置在移植段神经近侧2 cm的正常神经上，记录电极放置在小腿三头肌上，通过给予相同剂量的方波刺激比较两组实验动物在运动诱发电位波幅和时限上的区别。左侧肢体电极放置在相应位置，刺激参数为：10～20 mA，01 ms，10 Hz。
在进行感觉诱发电位观察时，刺激电极放置在踝关节部的胫神经上，记录电极放置在移植段近侧的正常神经上。刺激参数为50～100 mA，02 ms，19 Hz。
运动神经传导速度检查时，在移植侧，近端刺激电极位于移植段近端吻合口近侧2 cm处，远端记录电极位于移植段远端吻合口远侧2 cm处，两实验组距离分别为12、14 cm。在对照侧，两点位于与右侧相应部位的坐骨神经干上，间距10 cm。刺激参数为10～20 mA，02 ms，10 Hz，肌电图仪自动记录并计算运动传导速度。
153 再生神经的组织学观察 在过量麻醉药物的作用下处死实验犬并即刻观察取材。对实验组全部动物的移植段神经的近侧吻接口、移植段中央、远侧吻接口、移植段远侧神经和神经支配区域的靶肌肉进行神经再生的组织学观察。
1531 HE染色 将切取的移植神经及两端各1 cm正常神经取出后浸于4％多聚甲醛水溶液中固定24 h，经脱水处理后分段用石蜡进行包埋，连续组织学切片，切片厚度为5 μm，苏木素-伊红染色后观察组织结构形态，再生神经纤维和细胞浸润情况。
1532 S-100免疫组化染色 标本为石蜡包埋，切片厚度5 μm。Ⅰ抗为兔抗S-100蛋白抗体，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG抗体。用于观察再生神经中的许旺细胞的分布情况，特别是移植段神经中许旺细胞的分布。
1533 美蓝复红染色 在移植段中央和移植段远侧的神经中各取2 mm×1 mm×1 mm大小的组织块用05％戊二醛固定24 h，树脂包埋后用于半薄切片美蓝复红染色，切片厚度2 μm，染色后观察有髓神经纤维。
1534 透射电镜观察 将经05％戊二醛固定后树脂包埋的神经组织行超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。在SEM透射电镜下观察再生神经的超微结构。
1535 靶肌肉运动终板染色 在胫神经进入小腿三头肌肌腹部位切取3 mm厚的肌肉块，在含1％氯化钙的 10％福尔马林水溶液中固定24 h，取出后放置在蔗糖-凝胶溶液中，行冰冻切片，切片厚度为30 μm。用胆碱酯酶法进行运动终板染色，观察靶肌肉中再生的运动终板的形态。每张切片随意选3个视野计数运动终板数量，取其平均数。
16 统计学分析
用SPSS 115统计分析软件进行数据处理，组间对比用成对资料的t检验，P
2 结 果
21 去细胞神经各段间组织学观察结果
神经全长从近端到远端去细胞完全，评分均为0分；在结构观察中，除第2段为0分外，其余5段均为1分，存在轻度的结构破坏：观察髓鞘染色强度，神经全长均为1分，仍残留少部分髓鞘成分。综合评分第1段为2分，第2段1分，第3段到第6段均为2分，神经全长各段经去细胞处理后综合评分相似（见表1）。 表1 化学去细胞神经评分标准
22 移植动物一般情况和功能观察
8 cm组有1犬在移植后3个月并发肺部感染死亡。10 cm组有1犬在4个半月腹泻死亡。其余动物均存活至观察期满。 在8 cm组实验犬在移植术后3个月时均有不同程度运动功能的恢复，至6个月时恢复了较好的行走功能，但是外观上仍有轻微的跛行，12个月时在行走过程中踝关节可以完全直立和有较好的背屈。10 cm组在6个月时也有不同程度的下肢功能恢复，但是进展较慢，移植后12个月踝关节仍不能直立或爪背着地。
23 神经电生理观察
在移植段近侧的正常神经上给予电刺激时，8 cm组和10 cm组均在小腿三头肌上记录到诱发的运动神经传导电位。如表2所示移植术后12个月记录到的运动诱发电位时限和波幅的区别，8 cm组的波幅高于10 cm组(t=3286，P
24 再生神经组织学观察
大体上观察，8 cm组在局部切开检查时，移植段神经与周围组织有轻微的短缩，可见移植段神经有良好的连续性，无明显变细变硬。神经与周围组织有少量的粘连，再血管化良好。近侧和远侧吻接口无神经瘤形成。神经支配区的肌肉组织有轻度萎缩。10 cm组在切开检查时，可见移植段神经的远侧段明显变细变硬，但是仍然保持连续性，神经与周围组织有粘连，神经支配区肌肉萎缩明显。 表2 去细胞异体神经移植术后12个月肌电图结果光镜下，在两组移植段神经内均有S-100表达阳性的雪旺细胞，沿神经纤维方向呈带状排列(图1)，8 cm组的数量多于10 cm组。移植段以远的神经内亦可见到雪旺细胞增殖成带，神经横切面显示有再生的神经纤维，8 cm组优于10 cm组，在10 cm组可见较多神经束呈脱髓鞘改变。
运动终板染色显示在神经支配区的小腿三头肌中可以见到重新形成的运动终板结构，两组实验犬在运动终板数量上有较明显的差别，8 cm组再生的运动终板数量多于10 cm组，终板的形态也优于10 cm组(图2)。每个高倍视野下的运动终板的数量在8 cm组明显多于10 cm组，有显著统计学差异(P10 cm组。但是两组终板和正常的终板结构相比不管是在终板的数量还是在终板的纵横径上均有差别(P
电镜下8 cm组移植段神经内可见由雪旺细胞形成的髓鞘和有髓神经纤维，同时可见大量的无髓神经纤维呈束状分布(图3)；10 cm组移植段神经内也有少量有髓神经纤维形成。表3 去细胞异体神经移植术后小腿三头肌运动终板测量
3 讨 论
在异体神经移植的研究中，虽然经冻融处理、放射处理和化学处理后的异体神经均具有促进神经再生的功能，但由于冻融处理及放射处理的神经细胞碎片仍残存在神经的基底板层管内，妨碍神经轴突向远端的延伸，因此修复神经缺损的距离一般较短。而化学处理后的异体神经在降低免疫原性的同时，保留了神经纤维管道的结构完整性，其内部细胞碎片已被清除，去除了轴突生长的障碍，因此可用于修复较长距离的神经缺损。但在化学去细胞处理过程中，当为修复较长距离的神经缺损而处理较长神经段时，神经的两端与中央部位是否存在质量差异，对修复神经缺损有较大的影响。化学浸提液是从神经的两端还是透过神经外膜对神经进行去细胞处理存在争议。实验中从去细胞程度、髓鞘提取的程度及神经纤维管道的完整程度进行评价。结果显示在长12 cm的神经段中，经化学去细胞处理后，神经的中央部分与两端的各段间在上述三个方面的综合评价中无差异，说明对同等粗细的神经其长度并不影响其神经移植物的质量，由此可以推断化学浸提液并非从神经的两端而是从神经的外膜开始进行去细胞处理。故在用相同的浸提液及处理程序进行去细胞处理时，神经的长度对神经移植物质量无影响。
虽然在理论上可以应用化学去细胞的方法处理任意长度的神经，但在实验及临床应用中移植长度仍然影响肢体功能康复的结果。在早期的研究中应用化学去细胞异体神经较满意修复了犬5 cm长的坐骨神经缺损［7］。在应用相同方法处理的犬的化学去细胞异体神经移植实验中，对犬的8、10 cm 长的坐骨神经缺损用化学去细胞同种异体神经进行移植修复。结果发现在8 cm长的坐骨神经缺损修复组，无论是肢体功能的大体观察还是电生理的观察，均恢复较好。运动神经的波幅已达正常神经的50％，神经传导速度达到正常神经的30％；而在10 cm长的神经移植组，功能恢复较差，肌电图波幅及运动神经传导速度均未达到正常神经的20％。再生神经的组织学观察显示8 cm长的去细胞神经移植组在雪旺细胞、有髓神经纤维的分布及运动终板的数量和形态方面均明显优于10 cm移植组。
在8、10 cm神经移植组，其移植物本身的质量无差异，但最终结果具有明显的差异。产生这种差异的原因不在移植物本身，而与神经缺损的距离有关。Haase等［8］用去细胞异体神经桥接大鼠腓神经缺损，研究显示去细胞异体神经可以修复2 cm的周围神经缺损，当缺损>4 cm时未出现功能恢复，并认为生长因子可能有助于修复较长的神经缺损。但在随后的实验中应用血管内皮生长因子与去细胞异体神经复合后移植修复神经缺损，仅表现出促进近端吻合口轴突的生长，并未显出促使神经轴突延长的作用［9］。出现这种现象的原因可能是生长因子虽有促神经再生的作用，但在修复区内未能呈现生理环境下的浓度梯度变化，故轴突的生长方向受到干扰。在周围神经损伤后，靶器官通过神经远端释放不同的生物因子，发挥化学趋化作用，促使神经轴突向远端生长。生物因子的浓度呈现明显的梯度改变趋势，随距离的增加，生物因子的浓度发生明显的变化，从而影响神经的再生速度及肢体功能康复。因此，在使用生长因子促使神经向远端生长时应考虑其作用环节及浓度梯度变化。
本研究证实神经的长度并不影响化学去细胞神经制备的质量，在应用去细胞异体神经修复周围神经缺损中，8 cm或许是目前单独使用化学去细胞异体神经移植取得较好结果的最大范围。为修复更大范围的神经缺损，应探讨神经远端的生物因子表达分布规律，利用化学趋化原理促进神经的快速生长。
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细胞生物学研究篇8
2013年5月26日，这项研究成果被发表在国际学术期刊《自然·细胞生物学》上。一时之间“细胞逆转，即将实现‘返老还童’”的说法充斥着各大媒体。
细胞“逆转”的历程
有一天，每个人都将成为自身健康的“庇佑者”，不论是因为衰老、创伤或者疾病，只要是造成组织的缺损和伤害，都可以取自身的体细胞作为“种子”，让其重新“逆转”成多能干细胞，并进一步分化为心脏、神经、胰岛、肝脏、肾脏等多种类型细胞，甚至组织器官……这听起来真像是一部科幻电影里的场景，不过从2012年诺贝尔生理或医学奖揭晓的那一刻起，人们就开始触摸到了打开这个原本只存在于幻想中的世界大门的钥匙。而科学家为之奋斗的时间更是长达半个多世纪。
2012年8月17日，京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心主任山中伸弥、英国发育生物学家约翰·戈登因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖。
所谓细胞核重编程即将成年体细胞重新诱导回早期干细胞状态，以用于形成各种类型的细胞，应用于临床医学。
一直以来，人体干细胞都被认为是单向地从不成熟细胞发展为专门的成熟细胞，生长过程不可逆转。然而，戈登和山中伸弥教授发现，成熟的、专门的细胞可以重新编程，成为未成熟的细胞，并进而发育成人体的所有组织。
而早在20世纪60年代，约翰·戈登等人便首先证明末端分化细胞的特化过程是可逆转的。在一项经典实验中，他将蝌蚪肠道的成熟特化细胞的细胞核替换掉青蛙卵细胞的细胞核，从而使卵细胞发育为性成熟的成体青蛙。尽管这一研究开展于50年前，但这些早期的核移植和克隆实验还是引起了报刊上关于克隆人可能性的猜测。
自体细胞核移植实验建立以来，领域内众多科学家相信在卵细胞和胚胎干细胞中含有某些能“赋予”末端分化体细胞核全能性或者多能性的因子，并做了诸多尝试，但一直未能成功。直到2006年，山中伸弥等人在对24个胚胎干细胞高表达的候选基因进行筛选后，最终确定了Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4四个因子起关键作用。而这个“简单处方”可以使成熟的体细胞重编程为多能干细胞，这一开创性研究成果发表于国际知名期刊《细胞》上，引起了全世界的轰动。不到6年的时间，这一研究成果几乎包揽了拉斯克基础医学奖、沃尔夫医学奖等所有医学界大奖。
在业界专家看来，这项研究首先具有重要的生物学意义，即对细胞实现人工主动调控和干预，实现细胞水平的生命再造，对研究发育本身提供了新的思路，同时避免了异体移植产生的免疫排斥反应，是人类真正进入生命再造时代的开始；其次，具有重要的医学意义：每个人身上约有千万亿个体细胞，如血液细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞等，这项技术意味着生产人自体干细胞有了无穷尽的原料细胞，为干细胞抗衰老保健和疾病治疗带来了新的希望。
“这项成果颠覆了人们对发育分化的传统观念，颠覆了人们对干细胞分化为体细胞这一过程不可逆的固有观念，为获取多能性干细胞增添了一个新的途径，为干细胞与再生医学、疾病发生发展机制研究和药物研发打开了一扇新的窗户。”“十二五”国家“863”计划“干细胞治疗临床转化研究”主题项目首席科学家、军事医学科学院全军干细胞与再生医学重点实验室主任裴雪涛教授对于该获奖项目曾给出这样的评价。
“所谓细胞核重编程，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗来讲，就是在细胞层面实现了‘返老还童’。”中科院动物所赵同标研究员在接受采访的时候说，“一直以来，生物医学界普遍认为高等动物从受精卵发育到神经细胞、肌肉细胞、肝脏细胞等特化细胞，是一个不可逆的过程，末端分化的成体细胞绝对不会反过来逆分化变成干细胞，但英国科学家约翰·戈登和日本科学家山中伸弥的工作从根本上颠覆了这一传统观点。”
科研争夺的高地
自2006年日本科学家山中伸弥等人建立诱导多能干细胞技术以来，干细胞多能性研究一直是国际干细胞研究的热点和难点，全世界该领域的实验室就像在赛跑一样，一系列重大成果相继诞生。
2007年，日本科学家运用相同的“简单处方”成功实现人表皮成纤维细胞的重编程。同年，全球共有4个研究小组报道了人诱导多能干细胞体系的建立。美国和日本科学家相继通过诱导多能干细胞培育出嵌合体小鼠，证实诱导多能干细胞的多能性。此后，诱导多能干细胞的研究成为生物医学研究领域前沿中的前沿，多个实验室着眼于诱导多能干细胞技术的更新，先后创建了腺病毒载体技术、蛋白转染技术、小RNA技术等一系列非整合重编程技术，期望解决传统依靠病毒转染建立诱导多能干细胞的安全性问题。
同样，我国在细胞核重编程及再生医学应用领域也取得了令人瞩目的成就。在体细胞克隆领域，我国相继成功获得第一头克隆牛、猪、猴等大动物，并在国际上率先成功获得人类体细胞克隆胚胎。在诱导多能干细胞领域，中科院动物所研究员周琪和北京生命科学研究所高绍荣两支研究团队，于2009年分别利用iPS细胞克隆出小鼠，从而在世界上首次证明诱导多能干细胞的全能性。
据统计，2011年，中国在诱导多能干细胞领域发表的论文数量位居世界第三，而在干细胞领域的总数量已经超过日本，跃居世界第二。
而早在2010年，裴端卿团队就发现，细胞“逆转”过程是由间充质细胞状态转变到上皮细胞状态来驱动的。在进一步的研究中，裴端卿、郑辉团队通过优化转化因子导入的顺序，发现在间充质细胞状态转变到上皮细胞状态前还存在一个上皮细胞状态向间充质细胞状态转换过程，并证明这样的多次转换有利于提高重编程效率。
“这一发现与中国传统阴阳太极理念较一致。我们进一步推论，间充质细胞状态与上皮细胞状态之间的多次相互转换机理具有较高的普遍性，在其他系统或研究中也存在。”裴端卿说。
诱导多能干细胞及其产生的功能细胞移植被认为是治疗遗传病、器官损伤以及帕金森等退行性疾病的重要手段。诱导多能干细胞过程可以将人体内的普通细胞“逆转”回到早期胚胎发育状态，从而重新获得可分化成为体内绝大多数种类细胞的能力。
据了解，按照新细胞生物学机制，其可像正常胚胎干细胞一样转换成各种不同类型的细胞，如神经细胞、肝细胞和心脏细胞等。由于这些重组细胞产自患者的核遗传物质，因此不用考虑患者的移植排斥反应。“以干细胞治疗为核心的再生医学，将成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径，从而成为新医学革命的核心。”科技部《干细胞研究国家重大科学研究计划“十二五”专项规划》对干细胞治疗的地位作了上述评估。
技术用于临床为时尚早
据介绍，2011年年初，中国科学院已将“干细胞与再生医学研究”作为战略性先导科技专项。该专项首席科学家、中科院动物所研究员周琪表示，希望通过发现干细胞生物学的基本规律，揭示干细胞在组织器官发生和形成及再生中的本质作用，建立具有自主知识产权的新技术，实现干细胞修复组织和治疗疾病的总体目标。
然而，干细胞产业尽管市场前景广阔，但国内干细胞技术的科研成果转换目前还存在一定障碍。国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝表示：“干细胞再生医学产品研究开发代表着新方向，但是目前只有干细胞库技术服务产生了经济效益，其他干细胞产品还不能走入市场。干细胞药物上市审批存在障碍，导致科研成果难以转化、VC/PE不敢投资、企业不愿投入科研资金。”
裴雪涛认为，之所以将细胞核重编程技术视为再生医学发展的基础，是因为它为多能干细胞的获得提供了新的途径。此前，实验室研究的干细胞主要来源为胚胎干细胞和成体干细胞，前者虽具有多向分化潜能，但因伦理、技术、资源、免疫、致瘤等问题使其研究和应用受到限制；而后者虽然较易获得，但其分化效率、组织整合等并不理想。综合而言，诱导多能干细胞则集合了两者的优点，淡化了两者的缺点：来源为成熟细胞，获得相对广泛、数量充足；通过细胞核重编程，可使其获得多向分化潜能；来源于患者自体，因此免除了伦理和免疫排斥等问题的困扰。
裴雪涛坦言，诱导多能干细胞也有其不可回避的问题。它不仅要面对与其他干细胞研究相同的挑战，例如，如何分离获得各种组织特异性干细胞，如何保证高效的定向分化，如何确保整个分化过程安全、有效、可控，以及后续必须要解决的临床前研究、安全性评估、质量控制等。此外，还要解决其在诱导过程中可能出现的一系列问题，包括在重编程过程中，因基因转入而带来的安全风险；如何提高分化效率，确保在体外大量繁殖，以适应未来临床需要；一旦拿到重编程细胞，如何界定其与生理性细胞发育的区别等。
很多专家也提出，诱导多能干细胞的应用面临的最大的挑战就是它可能潜在的致瘤性。来自美国加州大学戴维斯分校的研究人员发现的证据表明，如今被认为大有希望用于一系列疾病治疗之中的诱导多能干细胞，非常类似于产生癌症的细胞类型。“科学家和临床医生必须对任何临床应用保持审慎。将诱导多能干细胞用于临床治疗，还需开展更多研究。”
因此，也许未来的某一天，人体更换器官可以像换汽车零件一样简单。但专家们这些看法也清楚地表明了，将细胞核移植和诱导多能干细胞等技术应用于人类我们还需要耐心等待一段时间。