血液的化学元素范文

血液的化学元素篇1

【关键词】 巨细胞病毒; 新生儿; 微量元素

[Abstract] Objective: To explore the relativity between the contents of traces element and the HCMV infection in newborns. Methods: Determined by PCR and ELISA， 80 samples with CMVIgM positive serumn and FQCMVDNA positive in serum and urine were recruited as subject group and 102 samples with those of negative were enrolled as control group. The contents of traces element in the all the samples were determined by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry(ICPAES) method. Result: The content of serum Zn、Fe、Mg、Ca in subject group was distinctly lower than that in control group(P

[Key words] human cytomegalovirus; the newborn; trace element

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)流行广泛，是危害人体健康最严重的病毒之一，血清IgG阳性波动率50%～100%[1]，可引起先天性及围产期感染，胎儿早期宫内感染可引起出生缺陷，病死率10%～30%[2]。新生儿先天性HCMV感染的发病率为0.15%～2.0%[3]，可造成新生儿的先天性小头畸形、视网膜脉络炎、智力障碍等。研究人员发现在病毒感染期间，许多微量元素下降，血清和病毒靶器官组织的微量元素均有显著变化，尤其发现血清中的显著变化优先于靶器官组织受累的初期阶段。同时，微量元素的改变与疾病并发症的发生密切相关[4]。本研究旨在探讨新生儿巨细胞病毒感染与血液中微量元素含量的相关性，为临床提供一项新的辅助诊治依据。

1 临床资料

1.1 一般资料

(1) HCMV感染阳性组为2007年2月至2008年10月我院新生儿病房收治的HCMV感染的足月新生儿80例(其中男46例，女34例;日龄1～12 d，平均5 d;体质量2 230～3 340 g，平均2 722 g)，均血清CMVIgM抗体阳性、血清及尿液FQCMVDNA>1.0×103拷贝·ml-1。对照组足月新生儿102例(其中男57例，女45例;日龄1～18 d，平均7 d;体质量2 255～3 370 g，平均2 783 g)，均血清CMVIgM抗体阴性、血清及尿液FQCMVDNA

(2) HCMV感染组中出现病理性黄疸71例，占88.8%;ALT升高48例，占60%;体温增高(>38 ℃)33例，占41.3%;贫血38例，占47.5%;肝大61例，占76.3%;皮疹22例，占27.5%。

1.2 试验条件

(1) 德国欧蒙医学实验诊断有限公司(EUROIMMON)提供TORCH检测试剂盒测定血清CMVIgM抗体。

(2) 美国BioRad伯乐iclycler全自动PCR分析仪。血液：EDTA2K抗凝血1.5 ml;尿液：取2～3次尿液放入经处理容器中，离心后取1 ml标本。分别提取DNA，中山安达基因股份有限公司提供试剂进行荧光定量PCR扩增，PCR仪做结果分析。>1.0×103拷贝·ml-1为阳性。

(3) 法国JY公司ULTIMA2型电感耦合等离子体原子发射光谱仪。高频发生器频率40.68 MHz，测定高频输出功率1.0 kW，反射功率

(4) 感染组和对照组的患儿均于清晨空腹4 h以上，股静脉抽取血标本，送检;清晨留取尿液标本，1 h内送检。

1.3 统计学处理

采用SPSS 14.0统计学软件作两独立样本t检验，P

1.4 结果

HCMV感染组与新生儿对照组比较，血清Zn、Fe、Mg、Ca均均减低(P

2 讨 论

本研究显示，新生儿HCMV感染时伴有低锌、低铁、低镁、低钙、高铜、高铅的微量元素失衡表现，血清锌水平明显低于新生儿对照组(P

铜也是人体的重要物质，铜和血浆铜蓝蛋白具有酶和氧化活性，能增强机体的防御能力。新生儿HCMV感染时，血清铜的含量较对照组明显增高(P

缺铁可直接损伤淋巴细胞的生成，使外周血内T细胞数目减少，中性白细胞杀菌能力减低，细胞清除率降低。引起铁的损失同时也造成了镁的吸收障碍。钙在机体生理活动的调节上具有重要的作用。新生儿HCMV感染时，钙元素含量显著低于对照组(P

微量元素的变化与病毒感染性疾病发病机制、疾病转归之间的关系正成为研究的热点之一[9]。研究发现，发生HCMV感染会导致血液微量元素的失衡;同时，微量元素的变化也导致了HCMV感染的进一步发展以及并发症的发生，对疾病的治疗和预后有一定的影响。重视微量元素异常与病毒感染的关系研究，对患儿病毒性疾病的防治将具有重要的意义。

参考文献

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血液的化学元素篇2

【摘要】 目的 观察束缚应激后小鼠全血中铁、锌、钙和镁含量的变化，研究束缚应激对全血4种元素的影响和规律。方法 建立小鼠束缚应激模型，原子吸收分光光度法测定小鼠全血中铁、锌、钙和镁的含量。结果 对照组小鼠全血铁、锌、钙、镁含量分别为（39120±1601），（590±056），（5944±1071），（4512±338）μg/ml；实验组小鼠全血铁、锌、钙、镁含量分别为（35123±3522），（505±070），（5968±740），（4399±431）μg/ml。与对照组比较，接受应激的小鼠全血中铁、锌含量显著降低（P＜005），钙含量略有升高，镁含量降低，但差异均无统计学意义（P＞005）。结论 束缚应激可使小鼠全血铁、锌含量显著降低；微量元素铁、锌与束缚应激反应之间存在一定的联系。

【关键词】 应激

应激是机体对各种外界应激原作用的反应，适度的应激是机体保护机制的一部分，有益于健康。但过度的应激往往成为疾病的诱因〔1〕。研究证实，应激能够影响动物和人体的免疫功能〔2，3〕。机体免疫系统功能的紊乱又是感染性疾病、肿瘤等发生或恶化的直接原因〔4，5〕。实验研究表明，应激可引起机体细胞因子、蛋白、酶等的变化〔6，7〕，而有关应激与元素之间关系的研究较少。铁、锌、钙和镁是人体中的必需元素，在人体生理生化过程中起着重要作用。因此，研究应激与元素之间的关系有重要意义。原子吸收光谱法具有灵敏度高、选择性好、精密度高、分析速度快等优点。本文采用原子吸收光谱法测定了束缚应激后小鼠全血中铁、锌、钙和镁4种元素的含量，旨在探讨束缚应激对全血中元素的影响。

1 材料与方法

11 动物与分组 选用32只健康C57BL/6纯系小鼠，体重20～25g，雌雄兼用，随机分为对照组和束缚组，每组16只。

12 应激模型的制备 应激模型的制备按文献［8］进行。将小鼠装入带有通气孔的可以限制其各个方向的束缚器中，室温下维持12h。正常对照组小鼠留置原饲养笼中正常饲养。实验期间2组小鼠均禁食禁水。

13 标本采集 解除束缚后恢复2h，摘除眼球采血，肝素抗凝。

14 全血元素含量测定

141 样品处理 取肝素抗凝血05ml用去离子水稀释定容，测定铁、钙、镁稀释100倍，锌稀释30倍。

142 标准溶液的配制 铁、钙、锌的工作液（100μg/ml）及镁的工作液（50μg/ml）分别由1mg/ml的铁、镁、钙、锌储备液稀释而成。用工作液稀释成不同浓度的标准溶液。标准溶液系列：铁标准溶液为10，20，30，40，60μg/ml；钙标准溶液为01，02，04，08，12μg/ml；锌标准溶液为005，01，02，03，04μg/ml；镁标准溶液为005，01，02，03，04μg/ml。

143 元素测定 用AA370MC原子吸收分光光度计测定样品中4种元素的含量，优化后的仪器工作条件为空气流量：7L/min；乙炔流量：17L/min；灯电流：铁和锌为6mA，钙和镁为4mA；狭缝宽度：铁为02mm，锌、钙和镁为07mm；波长：铁为2483nm，锌为2139nm，钙为4227nm，镁为2852nm。对标准溶液进行测定，绘制标准曲线，各元素线性关系良好。各元素回归方程为铁：C=1383A-04848；锌：C=5815A-002241；钙：C=1613A+001452；镁：C=1038A-002035。相关系数铁：09942；锌：09979；钙：09994；镁：09996。

15 统计分析 应用SPSS 100 统计软件进行分析，测得数据经SPSSexplore去除奇异值后得到有效数据（即分组时各组均为16只，去奇异值后有的少于16只）采用独立样本t检验分析2组差异，检验水平为P＜005。

2 结果

21 小鼠全血铁含量测定 应激后16只小鼠全血中铁含量为(35123±3522)μg/ml，与对照组〔15只小鼠结果为(39120±1601)μg/ml〕比较，显著降低，差异有统计学意义(P＜005)。

22 小鼠全血锌含量测定 应激后16只小鼠全血中锌含量为(505±070)μg/ml，与对照组〔15只小鼠结果为(590±056)μg/ml〕比较，显著降低，差异有统计学意义(P＜005)。

23 小鼠全血钙含量测定 应激后16只小鼠全血中钙含量为(5968±740)μg/ml，与对照组〔16只小鼠结果为(5944±107)μg/ml〕比较，钙含量略微升高，差异无统计学意义(P＞005)。

24 小鼠全血镁含量测定 应激后小鼠15只全血中镁含量(4399±431)μg/ml，与对照组〔15只小鼠结果为(4512±388)μg/ml〕比较，镁含量降低，差异无统计学意义(P＞005)。

25 实验组元素间相关分析 采用Pearson进行相关分析。元素间相关性分析结果表明，相关性Fe-Zn，Fe-Ca，Fe-Mg，Zn-Ca，Zn-Mg，Ca-Mg的r值分别为0877，0135，0770，0073，0493，0388；P值分别为0000，0617，0001，0788，0062，0153。

3 讨论

钙、镁都参与水盐代谢，对维持内环境的稳定有重要作用。应激可能通过影响这些元素的代谢，重新维持内环境的平衡〔9〕，这可能是本文中引起钙镁变化的原因。铁主要用于合成血红蛋白，构成各种金属酶的必需成分或活化某些金属酶和它的辅助因子，在机体运送氧和细胞内电子传递中发挥极其重要的作用。在应激条件下，肌肉处于紧张的运动，代谢率增加，耗氧量随之增加〔10〕，而运载氧及氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)的生成均需要大量铁的参与，这可能是血中铁水平下降的原因。锌是多种酶的组成成分，在激素的产生、储存和分泌中起着重要作用。有研究表明，锌有应激保护作用。其应激保护机制可能与其参与构成机体抗氧化防御系统有关。锌可能通过提高机体抗氧化能力来实现其应激保护作用〔11〕。有研究表明，应激会引起体内锌的损耗〔12〕。应激小鼠血中锌下降可能是因为应激机体对锌的需求量增加，血中锌转移到发挥其生理作用的靶器官。对4种元素进行相关性分析，发现铁与镁、铁与锌有显著的相关性，可能应激对铁与镁及对铁与锌的影响机制相同。综上分析，微量元素铁、锌在应激中有着重要作用，其具体机制有待进一步探讨。

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血液的化学元素篇3

1 幽门螺杆菌（HP）

HP是公认的慢性活动性胃炎的致病菌，是消化性溃疡重要的致病因子，并与胃癌及胃粘膜相关的恶性淋巴瘤密切相关。通过PCR检测及细菌培养发现ROU同样有大量HP的存在，其形态学、生化特性、免疫特性与胃粘膜HP相似[2]。又通过72例ROU患者口中不同牙位，龈上、龈下菌斑进行HP-PCR检测，其中轻型43例，疱疹样23例，重型6例，HP阳性率分别为53.49%、56.52%和83.23%。结果表明HP阳性率随着溃疡程度的加重而增高，HP与ROU有着密切不可分的联系。故抗HP治疗是治疗ROU的一种有效方法。

2 EB病毒（EBV）

PCR法对13例ROU口腔损害检测中，有5例检测出EBV-DNA。为检测EBV是否同时存在于外周血中，从PCR阳性患者中取2例外周血淋巴细胞及3例浆细胞中检测到EBV-DNA，提示淋巴细胞可能EBV潜伏感染的贮留地。EBV-DNA，EB核抗原，EBV/C3d受体出现在部分基底及基底周围细胞血管内及固有层淋巴细胞核中，提示溃疡前期的上皮细胞可能通过感染EBV的淋巴细胞而受到感染[3]。

3 免疫因素[4]

此项研究对唾液中6个指标，血中细胞免疫的8个指标，体液免疫的7个指标，微量元素的5个指标，应用非条件回归分析法，进行综合研究分析。明确提出ROU众多复杂致病因素中，EXRFE、T8、血液LGA、Cu是致病的危险因素，而b淋巴细胞、血清Zn、唾液C3和体液中LYZ则是重要的保护因素。ESRFE每增加一个等级，溃疡发病危险性增加14倍，T8每增加一个等级，溃疡危险性增加3倍。

这2个高危免疫指标的出现，使免疫活性细胞亚群不平衡及免疫活性细胞功能缺陷，导致机体免疫调节紊乱而致口腔溃疡。

4 微量元素

血液中的微量元素Zn和Fe呈现保护效应，而Cu为危险因素，Cu/Zn比值表现明显的危险效应，提示缺Zn，高Cu是口腔溃疡发病的重要因素，同时为ROU的治疗找到了依据[4]。

5 血液流变学

检测血液流变学指标，结果发现血浆粘度、全血高切还原粘度、红细胞刚性指标及红细胞聚集指数和ROU有密切关系。血液流变学的这些指标改变引起全血血浆粘度升高，血流速度减慢，有利于t淋巴细胞的浸润和免疫活性物质如粘附分子、免疫球蛋白及细胞因子的浸出，使它们能够介导与口腔黏膜发生特异性的免疫反应，引起一系列自身免疫反应，最终导致口腔溃疡的发生[5]。

6 细胞遗传学

应用现代细胞遗传技术，文献报道60名ROU患者中40名有家族遗传史。对外周血淋巴细胞的SCE、微核发生率、染色体畸变进行研究，与正常对照组相比，均有极显著性差异。因此ROU患者可能先天即有DNA修复缺陷和固有的不稳定染色体结构，这与疾病的发生存在一定的因果关系[4]。

7 雌孕激素受体

应用ABC法对10例健康女性黄体期口腔黏膜作ER和PR的检测，结果7例雌激素受体阳性，8例孕激素受体阳性，证明了口腔黏膜亦是性激素的靶器官之一，正常的性激素受体数量及功能状态是口腔黏膜促使正常生理功能的重要保证，倘若性激素受体数量和功能状态发生改变，或者性激素的分泌出现异常，均可导致口腔黏膜发生病理变化。此项研究有助于阐明性激素受体改变相关的口腔黏膜病的发病机理，进而通过调节性激素受体及其性激素水平达到治疗目的[6]。

ROU为人群中的常见病、多发病，治疗后复发率较高。因此，ROU的诱发因素至关重要，通过对幽门螺杆菌、EBV、微量元素、雌孕激素受体的检测，对免疫学、血液流变学、遗传学等研究，发现了与致病相关的因素，从而为临床诊治提供了依据。因此，应用抗HP、抗病毒、抗免疫，调节性激素和血液流变学，加适量微量元素，注意遗传因素，将是治疗ROU的最佳方案。

参 考 文 献

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[3]李欣.复发性口腔溃疡与eb病毒的关系[J].口腔医学分册，2007，34（4）：248.

[4]郭锡久，陈永朝，苏德水.复发性口腔溃疡与免疫、微量元素的研究[J].临床口腔医学杂志，2008，24（1）:129.

[5]孙鹏，朱力军，张建强.复发性口腔溃疡与血液流变学的研究[J].现代口腔医学杂志，2008，22（3）：260.

血液的化学元素篇4

自从1628年英国医师、生理学家哈维提出“血液循环”的科学新概念以来，人类对于人体防病保健有了新的认识。心脏节律性的搏动，推动血液在心血管系统中按一定方向循环往复地流动，这就是血液循环。不过当时并不完全了解血液是如何由动脉流向静脉的。1661年意大利医师、生物学家马尔皮基在显微镜下发现了动静脉之间的毛细血管，从而完全证实了哈维的正确推断。人类血液循环，是封闭式的，由体循环和肺循环两条途径构成双循环。血液循环的主要功能是完成体内氧气和养分等物质的输送。血液中的红细胞是呼吸载体，输送新鲜的氧气和养分，排出代谢废物二氧化碳；白细胞能消灭病原体，清除过敏源，抵御细菌和病毒对人体的侵害；而血小板有凝血、止血作用，三者各司其职，使人体拥有健康和免疫力。血液循环一旦停止，机体各器官组织将因失去正常的物质转运而发生新陈代谢的障碍。同时体内一些重要器官的结构和功能将受到损害，尤其是对缺氧敏感的大脑皮层，只要大脑中血液循环停止3分钟，人就会丧失意识，血液循环停止4―5分钟，半数以上的人将发生永久性的脑损害，停止10分钟，会毁掉绝大部分甚至全部智力。

血液受到污染，失去应有的清洁度，就会变得黏稠，流动不畅。然后，血液出于本能，就会设法恢复流动顺畅状态。那么，所有杂质都会聚集到身体某处，机体功能随之下降，进而引发各种疾病。如胆固醇中和了中性脂肪，积聚在血管内侧，沉淀下来，血管就会变得狭窄，失去柔韧弹性，处于脆弱易裂状态，从而导致动脉硬化，易诱发脑中风和冠心病。在血管的分界处的毛细血管一旦被堵，便会引起脑血栓和心肌梗塞。过多的尿酸若聚集在脚趾上还会诱发痛风。所以，血液清洁不单指血液顺畅流动，还包含血液中各种成分发挥正常作用。

血液清洁可保持人体各部分器官功能正常，并有较高的免疫力。血液能准确反映身体的一些潜在病症，血液清洁稍不正常，所有器官都会患病，像心情不佳、睡眠不好、身心疲惫、精力分散、头晕、恶心等。那么，如何鉴别血液是否清洁？血液黏稠就是警示信号之一。生活中有许多察验，比如进食速度比常人快；极少吃蔬菜，尤其是黄绿色蔬菜；不喜欢吃水果、酸奶；常吃方便面或快餐；经常吃油炸食物；鱼吃得少，肉吃得多；经常吃甜食；喝水少；晚8点钟以后吃饭次数过多；常在饭店赴宴；几乎每天都饮酒；一天吸烟10支以上。这些不良习惯，极容易使血液受到污染。

欲使血液保持清洁，进行适当运动和平衡心理状态除外，调剂饮食是非常重要的。既要平衡膳食结构，还要让某些特殊的营养成分被充分吸收。如：维生素C是一种具有代表性的食物成分，能消除血液中的活性氧，防治败血症；维生素E有助于扩张血管，防止血液凝固，使血液流动畅通，有抗氧化作用；叶酸能防治贫血；p-胡萝卜素能去除活性氧并抑制癌细胞的产生，有益于提高机体免疫力；维生素B2和泛酸等有促进脂肪代谢和降低胆固醇等作用；胆碱能清除肝脏多余脂肪，排除毒素；牛磺酸可促进胆固醇分解；食物纤维能帮助排出胆固醇，降低胆固醇含量，预防动脉硬化；钙能预防高血压、动脉硬化、骨质疏松和糖尿病；镁是预防心肌梗塞和脑血栓必不可少的矿物质元素；钾能排除过多盐分，控制血压的升高；亚铅是促进血液新陈代谢的微量营养元素；铬与胰岛素合作，促进糖代谢，稳定血糖浓度；硒能帮助分解过氧化脂质，延缓衰老；辣椒素有更强的抗氧化作用，能预防动脉硬化；叶绿素能保护血管弹性。花色苷是浆果类果实里含的紫色素，能够软化血管，改善血液循环。

有些食品对于保持血液清洁，远比服药剂、保健品、洗脏器优越得多。比如：

大蒜：含蒜辣素，能减少肝脏合成胆固醇，降低胆固醇和甘油三酯的浓度，增加有益的高密度脂蛋白，控制冠心病的发生。大蒜的提取物能增强心脏的收缩力，扩张末梢血管，还可阻止血小板凝聚，稀释血液，促进血液循环，避免血栓形成，防治高血压和脑中风。

洋葱：含前列腺素A，能较强地扩张血管，促进高钠盐等物质的排泄，降低血压和预防血栓形成。含生理活性物质二烯丙基二硫化物及硫氨基酸等成分，是天然的血液稀释剂和清洁剂，可以预防血管硬化，防止血脂代谢紊乱，长期稳定血压，维护血管弹性。

香菇：含16种氨基酸，其中7种为人体所必需的氨基酸、多种不饱和脂肪酸、多种维生素及降血脂物质等。含纤维素能促进胃肠蠕动，减少肠道对胆固醇的吸收。含有香菇嘌呤等核酸物质，能促进胆固醇分解排泄，维护血液清洁。

黄瓜：含大量纤维素，能促进肠道排出食物废渣，减少胆固醇的吸收；含丙醇二酸可抑制糖类转变成脂肪；含丰富的钾，能加速血液的新陈代谢，排出体内多余盐分，使血液清洁。

红薯：含大量胶原和黏多糖物质，能保持血管弹性，预防心血管系统的脂质沉积及动脉粥样硬化，促使皮下脂肪减少，避免出现过度肥胖，有效地血液清洁。

茄子：含多种维生素，紫茄中的维生素成分高于其他蔬菜。其中维生素P能增强细胞黏着性，能改善毛细血管弹性，防止毛细血管变脆及微血管出血，降低胆固醇含量。

花生：含植物脂肪为不饱和脂肪酸和甾醇，能吸收胆汁内的胆固醇；含丰富的维生素E，可使血小板沉积在血管壁的数量降低，加强毛细血管收缩机能，改善凝血因子缺陷。

山楂：含三萜类、生物类黄酮和丰富的维生素C，有扩张血管壁、降低胆固醇和甘油三酯以及降低血压等作用。还含有山楂酸、柠檬酸，能降血脂并控制血液污垢产生。

玉米油：从玉米胚芽中提炼出来的玉米油，含植物脂肪52％，为不饱和脂肪酸成分，可促进类固醇和胆酸的排泄，阻止胆固醇的合成吸收以及在动脉壁沉积，促进血液清洁。

血液的化学元素篇5

    【关键词】  丙戊酸;蛋氨酸;谷氨酸脱羧酶;精神分裂症

    Valproate renew GAD expression which had been inhibited by methionine in mouse primary cortical cultures

    【Abstract】  Objective  To study valproate and methionine(Met) regulate glutamic acid decarboxylase (GAD) expression in mouse primary cortical cultures nouron,investigate the mechanism of the VPA’s function in the treatment of schizophrenia.Methods  Adopting primary cortical cultures technique cultures neuron,collecte cells,lysis cells,use colorimetric method to measure GAD  activities;analyse  GAD activities of the vacancy group(serum-free DMEM),the Met group(cultures were incubated with Met at a final concentration of  2 mM in serum-free DMEM for 3days,after that change it with serum-free DMEM),and the VPA group(cultures were incubated with VPA at a final concentration of  2 mM in DMEM after that incubated with Met at a final concentration of  2 mM in serum-free DMEM for 3days).Results  In the Met group the average activities of GAD is obviously lower than the other two group,the difference has statistical meaning. In the VPA group the average activities of GAD is approach to vacancy group,the difference hasn’t statistical meaning.Conclusion  The methionine inhibits the cortical neuron express GAD,decreases GABA  synthesize. The VPA promotes the cortical neuron expression GAD,and renews GAD expression which had been inhibited by Met in mouse primary cortical cultures.

    【Key words】  valproate;methionine;glutamic acid decarboxylase(GAD);schizophrenia

    增加蛋氨酸(Methionine,Met)的摄入量,会造成近百分之七十的精神分裂症(schizophrenia,SZ)患者症状恶化[1]。有学者认为的大量摄入Met引起大鼠体内活性甲基供给体S-腺苷同型半胱氨酸(SAM)增加,SAM使谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase.GAD)等基因启动区甲基化修饰,引起GAD等基因表达降低[2]。在美国医生普遍使用丙戊酸(valproic acid,VPA)辅助治疗SZ。2001年Christopher[3]发现VPA能抑制组蛋白去乙酰基酶(Histone DeaCETylase,HDACs)的活性,从而诱导基因表达。笔者通过原代培养技术培养大鼠皮质神经元,并在培养液中先后加入Met、VPA,然后用Berthelot[4] 反应测定不同组别的皮质神经元裂解液的GAD相对酶活性。如果Met 能抑制GAD基因表达,将使皮质神经元中GAD的相对酶活性降低,而如果VPA能诱导GAD基因表达,将使GAD恢复到正常水平。

    1  材料与方法

    1.1  试剂  多聚左旋赖氨酸,N2添加剂(100×的成分: 牛胰岛素500μg/ml,人转铁蛋白10000μg/ml,黄体酮0.63μg/ml,硒0.52μg/ml,腐胺 1611μg/ml,Gibco),基础培养液(DMEM、碳酸氢钠、青霉素、链霉素),胎牛血清,兔抗GABA 血清(1∶600),羊抗兔IgG (1∶40),免疫组织化学试剂盒,Met、Gly 标准品,苯甲基磺酰氟(PMSF),非变性条件下裂解细胞的裂解液(pH 7.0的20mM Tris,150mM NaCl,1% Triton X-100,焦酸钠,β-甘油磷酸,EDTA,Na3VO4,等),GABA (纯度99.9 %),5′-磷酸吡哆醛(PLP),L-谷氨酸钠 (L-MSG),次氯酸钠,Folin-酚试剂,牛血清白蛋白,巯基乙醇,重蒸酚,无水乙醇等。

    1.2  动物  孕期16~18天清洁级SD大鼠,由郑州大学动物中心提供。

    1.3  方法

    1.3.1  大鼠皮质神经元分组培养  大鼠皮质神经元的体外培养参照陈丽敏[5] 完全培养液组的培养方法。以5×105/孔的数量接种大鼠皮质神经元于多聚左旋赖氨酸处理过的24孔培养板。以新配制的完全培养液(基础培养液+N2添加剂+10%胎牛血清)培养细胞,3天后换以无血清培养液(基础培养液+N2添加剂)分组继续培养。实验分三组,每组8个孔:空白组,无血清培养液;Met组,无血清培养液含终浓度为2mM的MET,培养3天后换以无血清培养液;VPA组,无血清培养液含终浓度为2mM的Met,培养3天后换以终浓度为0.5mM的VPA的无血清培养液。将细胞放置于温度37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。分组培养6天后将细胞用于各类实验。

    1.3.2  GABA能神经元的免疫细胞化学(PAP法)鉴定  培养细胞用4%多聚甲醛固定,0.2% Triton X-100和0.03% H2O2/甲醇溶液于室温下处理30min,羊血清蛋白(1∶50)37℃ 1h,经兔抗GABA血清(1∶600)4℃孵育72h,再经羊抗兔IgG(1∶40)37℃ 1h,兔抗PAP复合物(1∶40)37℃ 1h,用DAB 4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)呈色35min,贴片、脱水、透明及封片。上述每步骤间均用PBS充分洗涤,光镜下观察。

    1.3.3  谷氨酸脱羧酶活性的测定  (1)粗酶提取液的制备:去除培养液,用PBS、生理盐水(含最终浓度为1mM的PMSF)洗一遍细胞。每孔加入100μl非变性条件下裂解细胞的裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。裂解液接触细胞2s后,细胞就会被裂解。于4000r/min 下离心5min,得到的上清液即为粗酶液。裂解细胞的所有步骤都在冰上进行。采用Lowry 法测定蛋白质浓度后,用磷酸盐缓冲液稀释到3g蛋白/L。冰箱短时间保存备用。(2)采用比色法测定粗酶提取液谷氨酸脱羧酶的活性:取0.2ml 50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 6.8),其中含5mmol/L L-MSG及0.2mmol/L 的PLP,加入0.1ml 待测粗酶提取液和0.1ml 蒸馏水(对照组加入0.1ml 2mM的Met,实验组加入0.1ml 2mM的Gly),于37℃水浴中保温30min;迅速置于冰浴中止反应,加入0.2ml 0.2mmol/L pH 9.0 的硼酸缓冲液,1ml 6%的重蒸酚溶液,0.4ml次氯酸钠溶液,充分振荡;沸水浴10min 后,冰浴20min不断振荡,直至有蓝绿色化合物出现,然后加入2ml 60%的乙醇于645nm 下比色。以已知浓度的GABA 作对照。在上述测定条件下,以每分钟生成1μmol 的GABA 所需的酶量为一个酶活单位(U)。每组测定同时做3次重复,求平均值。

    1.3.4  统计学方法  全部数据以(x±s)表示,采用SPSS10.0 统计软件,平均数比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有显着性。

    2  结果

    2.1  培养细胞的观察  于种植完全培养液3天后,于倒置显微镜下观察可见大部分细胞贴壁,神经元约占据培养板面积的2/3 左右,胞体以呈椭圆形和三角形者占多数,部分细胞胞体为多角形,多数神经元长出2个以上的突起,并与邻近神经元的胞体或突起形成接触,90% 以上胶质细胞死亡浮起,表明大鼠皮质神经元的体外培养成功;分组继续培养6天后各组神经元胞体继续增大,突起长度及数量继续增加,基本铺满培养板,胶质细胞极少,表明在加入Met和VPA分组后大鼠皮质神经元生长正常。随机取20个视野(200×,0.44mm2/视野),计数每个视野中胞体折光性好、长出突起、生长状态良好的细胞,比较各组的存活细胞数。结果列于表1,表明不同组别细胞存活数没有差别(P>0.05),说明Met在2mM的浓度范围内、VPA在0.5mM的浓度范围内均不影响神经元的生长。

血液的化学元素篇6

参附注射液是红参与附子的提取物，其有效成分是人参皂甙和乌头类生物碱，是中医必备急救药物。据现代医学研究具有以下作用：（1)强心、扩冠、扩张外周血管、改善心功能；(2)调节免疫功能和中枢神经功能，保护血管内皮细胞，抗炎和提高对缺氧的耐受性；(3)直接灭活黄嘌呤氧化酶，清除氧自由基，抑制脂质氧化反应；(4)改善血液流变性，促进微循环；（5）刺激肠平滑肌运动，改善肠麻痹．多用于心力衰竭、休克等病症，最近逐步应用到外科领域，现将参附注射液在外科实验研究情况作一简要总结。

1对缺血再灌注损伤的保护作用

刘先义等[1]通过失血性休克模型观察参附注射液对家兔肝、肾、肺、肠组织中SOD、MDA、TNF含量及血浆酸性磷酸酶(ACP),镁浓度和小肠组织损伤程度的影响，发现再灌注90分钟后参附注射液治疗组肝、肾、肺、肠组织中的MDA和TNF水平降低，SOD水平增高，血中ACP,Mg2+'浓度下降，电镜观察肠粘膜上皮损伤明显减轻，首先验证参附注射液对兔缺血再灌注多脏器细胞的损伤有保护作用。

1.1肠粘膜组织：肠粘膜是肠道乃至整个机体代谢最活跃的部位，且因其血管为夹状结构及逆流交换机制，使肠粘膜最易受缺血、再灌注等病理因素的影响，肠粘膜结构和功能的保护己成为防治休克后MODS的重要研究领域。

夏中元等[2]通过失血性休克复苏期模型观察参附注射液对乙状结肠粘膜pH(pHi),肠道氧摄取率（O2ER）、门静脉血肌酸磷酸激酶（CPK）、肠粘膜丙二醛（MDA）含量的影响，发现参附注射液对复苏后肠pHi有升高作用，对血CPK影响不明显；能降低复苏后肠粘膜MDA含量及增加肠O2ER；能提高复苏后平均动脉压（MAP),心输出量(CO）。随后夏中元等[3,4]通过兔失血性休克模型观察参附注射液对肠粘膜损伤的保护作用机制，发现复苏1小时及3小时参附组肠pHi明显高于单纯复苏组，复苏3小时时肠粘膜NO,MDA及Ca2+含量低于单纯复苏组，说明参附注射液对失血性休克复苏期间肠粘膜损伤有保护作用，其机制可能为增加肠粘膜灌注及氧合、抑制NO的产生及抗炎效应、清除氧自由基及减轻钙超载。

刘先义等[5]证实参附注射液能减轻肠缺血一再灌注后血压下降的程度并维持再灌注阶段的血压，减轻肠粘膜屏障损伤程度，降低血及肠组织中TNF-a的浓度，说明其保护肠粘膜的机制可能与阻断TNF-a合成与释放，减轻TNF-α介导的一系列生物效应有关。

胡刚等[6.7]采用钳闭大鼠肠系膜上动脉缺血再灌注模型研究参附注射液对缺血再灌注大鼠肠粘膜内核转录因子一kB(NF-IcB）、细胞间粘附分子一I(ICAM-1）、肿瘤坏死因子、（TIYF-a),诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响，发现参附注射液能明显减轻缺血再灌注导致的小肠组织的病理损害，能抑制缺血再灌注后肠组织NF-kB的活化，能抑制缺血再灌注后肠组织ICAM-1、iNOS表达，能抑制血浆和肠组织中TNF-a的含量，对肠粘膜有保护作用。

刘欣等[8］

观察参附注射液对大鼠缺血再灌注小肠细胞Bax,Bcl-2及c-myc蛋白表达的影响及它们与肠细胞凋亡的内在联系时发现：缺血再灌注组Bax值明显高于对照组，参附组Bax值明显低于缺血再灌注组，且低于对照组：缺血再灌注组Bcl-20D值高于对照组，且参附组Bcl-20D值高于对照组，但缺血组与参附组比较无显著差异：缺血再灌注组c-mycOD值明显高于对照组，且明显高于参附组：缺血再灌注组细胞凋亡指数明显高于对照组和参附组，而参附组高于对照组。说明参附注射液增加小肠Bcl-2蛋白的表达，降低Bax及c-myc蛋白表达，抑制小肠细胞凋亡，保护缺血再灌注小肠。

孟庆涛[9]等通过大鼠肠缺血再灌注模型研究参附注射液对肠粘膜上皮细胞凋亡的影响，发现参附注射液能减轻肠粘膜病理损伤程度和细胞凋亡数，能减少肠组织caspse-3的表达，增加肠组织Bcl-2的表达，通过减轻细胞凋亡，减少肠粘膜缺血再灌注损伤。

刘小南等[10]观察移植胰腺再灌注5天时小肠通透性和吸收功能，监测血清TNF-a,NO及SOD,取受体空肠粘膜组织检测小肠粘膜湿重、微绒毛高度及宽度、MDA含量及MPO活性，取肠系膜静脉血、肠系膜淋巴结、肝及脾组织进行细菌培养，观察细菌易位情况，发现SF组血清TNF-a含量、MDA含量、MPO活性、淀粉酶、小肠通透性、细菌易位率和小肠粘膜损伤程度均低于IR组；血清NO和SOD含量、小肠吸收功能均高于IR组。这说明参附注射液预处理可保护大鼠胰腺移植受体小肠粘膜屏障，降低细菌易位率；机制可能与降低胰酶活性，减少TNF-a生成、减轻PMNs粘附与聚集、增加NO和SOD含量有关。

SF通过以下机制保护肠粘膜损伤：（1)改变复苏期间肠粘膜灌注及氧＊：(2)提高氧摄取和利用这可能与SF中人参皂贰能提高红细胞2.3一二酸甘油酸浓度并促进氧向组织释放有关。(3)抑制脂质，过氧化反应，清除氧自由基。研究表现SF可直接灭活黄嘿吟氧化酶，减少氧自由基的形成：(4)保护生物膜完整性，CPK活性的增高是反映生物膜损伤的敏感指标。(5)强心升血压扩张外周血管，增加内脏灌注。该效应可能与其抑制心肌细胞膜上Na-K-ATP酶，去＊乌药硷的p效应及去申猪毛菜硷的作用相关；(6)调节细胞内钙稳态：SF中对NO含量的影响及其有效成份人参皂普的钙通道阻滞作用是SF抑制肠粘膜细胞内钙超载的重要机制，而SF对NO含量的影响可能是其另一机制；(7)抗炎作用；SF降低肠粘膜NO含量可减弱NO介导的炎性介质瀑布样联锁反应，而另一方面SF能促进PG12释放，抑制TXA2各成，同时增强抗炎作用。

1.2肺组织：急性呼吸窘迫综合症(ARDS)是多器官功能障碍综合征(MODS)最先出现和最常见的临床表现之一；其发病机制复杂，临床救治困难，是目前最热门的研究领域之一。参附注射液对肺损伤的保护作用研究主要集中于以下几个方面：

罗巍等[11]通过内毒素性休克模型，对平均动脉压(MAP)及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量及吞噬细胞(PAM)变化进行观测，发现参附组MAP虽然苏降，但2小时后开始上升，至6小时基本恢复正常，降低BALF中细胞总数和PAM，证实参附注射液对休克肺组织的损伤有保护作用；刘先义等（1）随后进一步证实参附注射液能降低肺组织内SOD,MDA,TNF水平，说明其机制可能与抗氧化损伤及减轻炎症反应有关。

刘欣等[12]研究重症急性胰腺炎时参附注射液对肺组织内核转录因子-kB(NF-kB）、细胞间粘附分子一I(ICAM-1)和白细胞介素一6(IL-6)的影响，发现参附注射液能减轻胰腺组织和肺组织细胞坏死、炎症细胞浸润、微血管充血及血栓形成的程度；并能降低肺组织的NF-kB、IL-6的表达，对SAP时肺损伤有保护作用。

罗自强等[13]采用无血清成年大鼠肺组织培养的方法观察参附注射液对肺组织表面活性物质合成的影响，发现其能以剂量依赖方式促进肺组织护［3H］胆碱的掺入。并提高肺组织总磷脂(TPL）、磷脂酞胆碱（PC）的含量及PC/TPL比值，该效应可被蛋白激酶C抑制剂H7和钙调蛋白抑制剂W7阻断，说明参附注射液可以促进PS的合成，其效应有赖于PKC及钙调蛋白的介导。

1.3肾组织：戴晓明等[14]观察参附注射液对鼠肾缺血再灌注模型超氧化物歧化酶及组织形态的影响，发现参附注射液能减轻肾外髓水肿，增高SOD活性，提示其机制可能与保护SOD活性，降低脂质过氧化反应有关。杨树龙等[15]研究参附注射液对肾缺血再灌注后血清和肾组织中超氧化物歧化酶(SOD),脂质过氧化产物丙二醛(MDA),肾组织中NO及Na2+水平、WBC滞留数、肾小管计分及肾组织的超微结构的影响，发现参附注射液明显降低肾缺血再灌注血和肾组织中MDA含量及肾组织中WBC滞留数、肾小管计分和Na2+浓度：明显升高血和肾组织中SOD活性及肾组织中NO含量；减轻肾组织学损伤，但对肾组织Ca2+作用不明显。其机制可能是通过激活和保护内源性氧自由基清除剂DSOD活性、直接灭活氧自由基、增加NO含量、抑制WBC勃附和Na2+内流，发挥预防急性缺血再灌注肾损伤的作用。

1.4肝组织：朱卫华等[16]在原位肝移植离断门静脉之前经尾静脉一次性注射参附注射液1Oml/kg,移植肝脏再灌注3、6、24小时取血检测AST,ALT,LDH,HA,SOD,MDA、TNF-a,IL-1、ETI和NO水平；取肝脏组织制成石蜡标本，用于HE染色光学显微镜观察和末端脱氧核昔酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡，发现参附注射液能降低血ALT,AST,LDH,HA,MDA、TNF-a,IL-1、ET-1水平及肝脏细胞凋亡指数，升高SOD和NO水平，减轻肝脏组织学损害程度，对移植肝脏缺血再灌注损伤有保护作用，可能机制有抑制枯否细胞激活和氧自由基产生，改善微循环，减少细胞凋亡。

1.5胰组织：刘小南等[17]对在移植前1天及术前30分经静脉分别注射参附注射液l0ml/kg于移植胰腺观察移植效果发现再灌注后参附注射液能提高1个月存活率，各式检点血糖、血淀粉酶、进食量、排尿量和饮水量均低于I-R组，并能减低移植胰的损伤程度，对大鼠胰腺移植具有保护作用。

1.6神经组织：万敬枝等[18]用改良的Longa's法制作大脑中动脉脑缺血再灌注模型，观察参附注射液对脑组织NO,MDA含量和SOD活性的影响，发现参附注射液可提高SOD活性，降低NO,MDA含量，对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。张国梅等[19]观察参附注射液对吗啡依赖人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH胞内Ca2+浓度的影响，发现参附注射液中、高剂量组神经细胞内Ca2+浓度显著升高，抑制纳洛酮催促引起的细胞内Ca2+的降低，说明参附注射液可能通过调节细胞内Ca2+浓度发挥其戒毒作用。

2.抗休克作用

2.1微循环：

陈东辉等[20]采用内毒素攻击大小鼠制造内毒素性休克模型，观察参附注射液对其休克死亡情况的影响，发现能减少死亡率，同时对D-半乳搪胺、放线菌素D和去肾上腺敏化鼠的内毒素性休克同样具有保护作用。

杨进国等[21]用盲肠结扎穿孔法复制感染性休克模型，观察参附注射液对术后6小时和18小时心脏的影响，发现SF组血压下降较慢，心肌组织病理损害明显减轻，心肌组织NF-kB及ICAM-1阳性表达明显降低，血桨中TNF-a含量明显降低，说明参附注射液对心肌损伤有明显保护作用，其机制可能与免疫调节作用，使促炎／抗炎因子达到平衡，防止过度炎性反应和免疫抑制有关。

王正荣等[22]观察参附注射液对大鼠肠系膜微循环的影响发现参附注射液能明显改善肾上腺素所致肠系膜微循环障碍，扩张微动脉、增加毛细血管网开放数、增进微动脉血流速度和缩短微循环恢复至正常的时间。

李兴平等[23]发现身附注射液能显著扩张小鼠耳廓微动脉管径，增加小鼠耳廓微循环毛细血管网点开放数，高剂量10ml/kg能促进正常小鼠微动脉血流速度；同时对肾上腺素组和内毒素组小鼠同样有上述作用，并有一定的量效关系，且能改善内毒素攻击小鼠的体温。

杨芳炬等[24]观察发现参附注射液均使各种状态下的小鼠耳廓微动脉直径扩大，毛细血管交义网点数及血流速度增加；其中对肾上腺素、内毒素所致外周循环障碍作用尤为显著：其作用较参麦注射液明显，与地塞米松作用相似；对内毒素攻击所致小鼠体表温度降低有明

显对抗作用，与李兴平实验结论一致。

2.2血流动力学：夏中元等[25]通过失血性休克模型研究参附注射液（SF)和生脉（SM)对家兔休克复苏使血流动力学影响，发现参附注射液和生脉注射液能显著升高MAP，增加CO.显著降低SVR；休克复苏1小时，SM升高MAP及增加CO作用较SF强，而复苏1小时及2小时，SF降低SVR作用较SM显著，两药对HR及CVP无明显影响；提示休克复苏初期应用SM更能维持血流动力学稳定，而SF舒张血管作用强有利于改善组织灌注。

总之，参附注射液通过其”多靶点”效应，能改善缺血再灌注介导的多器官功能不全和休克，其具体机制可能有以下几个方面：（1）改善心脏功能，升高血压；（2）改善微循环，降低血流变性；（3）抗氧化损伤，抑制黄嚓吟氧化酶，减少自由基生成，增加SOD;〔4）减轻炎症介质释放，促进促炎／抗炎因子平衡；（5）促进氧释放和利用，调节细胞内2,3-DPG；（6）阻滞钙通道，防止细胞内钙超载，调节钙稳态：（7）刺激肠蠕动，改善肠麻痹，减少肠细菌移位：（8）免疫与中枢神经调节作用．随着对参附注射液药理作用的深刻理解，必将扩大其临床应用范围，促进中药的开发与利用．

参考文献

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血液的化学元素篇7

【关键词】 间充质干细胞 人脐血 分化 神经元

间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSC) 是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞， 最先发现于骨髓， 随后在脐血和其他组织中也发现了MSC。研究报道MSC在体外诱导条件下不仅可分化为成骨细胞、 成软骨细胞、 脂肪细胞和成肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞［1］， 而且还能跨胚层横向分化为神经细胞［2］。我们在分离培养人脐血MSC的过程中发现部分脐血MSC在体外培养多次传代的过程中未经诱导表现为类似神经元的形态， 因此采用RTPCR和免疫细胞化学的方法对脐血MSC能否表达神经元特异性抗原标记进行检测。

1 材料和方法

1.1 材料 淋巴细胞分离液（1.077 g/mL）购自中科院天津血液病研究所; DMEMLG培养基购自Sigma公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 青/链霉素、 谷氨酰胺、 2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA购自Gibico公司; 鼠抗人CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC、 HLADRPE单克隆抗体(mAb)及同型对照购自Coulter公司; 鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（neuronspecific enolase， NSE）和神经丝蛋白（neurofilament， NF）mAb工作液， EliVisionTM Plus试剂盒购自北京中杉生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增引物 根据GenBank上登录的NSE、 NF基因序列设计， 由上海生工生物工程有限公司合成。NSE引物为: 5′gaagaaaaggcctgcaactg3′， 5′ccaggtcagcaatgaatgtg3′; NF引物为: 5′atcggtaaaggtgcacttgg3′， 5′tctacctccccattgacagc3′。扩增片段长度分别为157 bp和168 bp。

1.2.2 脐血标本的收集 脐血来源于南京军区福州总医院妇产科出生的健康足月顺产新生儿。产妇产前检查均正常， 脐血的收集均已征得产妇同意。无菌条件下采集脐血: 待胎儿娩出后， 在距离胎儿5～7 cm的脐带处进行双接扎， 剪断脐带， 穿刺脐静脉后抽取脐血， 每份30～80 mL， 抽取后注入100 mL， 经无菌处理， 加入333.4 nkat/mL肝素抗凝的生理盐水瓶中， 充分混匀。脐血采集后4 h内进行单个核细胞的分离。

1.2.3 脐血单个核细胞的分离 采用密度梯度离心法: 脐血30～80 mL用无菌的DHank’s液等体积稀释。取数个50 mL的无菌带盖离心管， 先加入1.077 g/mL的淋巴细胞分离液25 mL， 无菌滴管吸取稀释后的脐血25 mL， 离液面约1 cm处缓慢加入， 形成一明显的界面。2 000 r/min离心20 min， 小心吸取中间的白膜层。加入5倍体积的PBS缓冲液， 1 000 r/min离心10 min， 洗涤3次， 弃上清。所得单个核细胞用于细胞培养。

1.2.4 脐血分离细胞的培养和传代 参照骨髓MSC的培养方法［3］从脐血中分离出的单个核细胞以1.0×109/L的密度接种于含体积分数200 mL/L胎牛血清、 2 mmol/L谷氨酰胺、 1667 nkat/mL青/链霉素的DMEMLG培养液中， 置于37℃、 50 mL/L

CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。5～7 d后首次换液， 悬浮的细胞被去除， 可见瓶底有少量的贴壁细胞。换上新鲜的培养液继续培养。开始每隔5～7 d换液1次， 待细胞克隆出现、 扩大后根据培养液颜色的变化每3～5 d换液1次。待细胞克隆不再扩大生长时即开始传代， 加入2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA消化液， 37℃孵育6～8 min， 200 mL/L 的胎牛血清终止消化， 按1∶3的比例接种至新的培养瓶中继续培养。

1.2.5 脐血分离细胞的表面抗原检测 采用流式细胞术（FCM）检测: 选择P3代细胞， 抗体分别为CD29FITC、 CD44FITC、 CD105FITC、 CD34FITC、 CD106FITC和HLADRPE。FCM检测后， 应用SystemⅡSoftware Version 3.0获取、 分析检测结果。

1.2.6 脐血分离细胞向神经元样细胞分化的检测 (1)RTPCR检测: P2和P10代细胞接种于6孔板， 培养达到80%以上融合后， 参照TRIzol RNA抽提试剂盒说明书抽提细胞总RNA， 按照Promega RTPCR试剂盒说明书合成细胞总cDNA（βactin作为内参照）。NSE、 NF基因片段的PCR扩增采用50 μL反应体系: 10×PCR缓冲液5 μL， dNTP 4 μL， 模板DNA（cDNA）5 μL， 上游引物（20 μmol/L）1 μL， 下游引物（20 μmol/L）1 μL， DNA聚合酶1 μL， ddH2O 33 μL。离心混匀， 94℃预变性5 min后， 按下列参数: 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 共30个循环。最后一个循环结束后72℃延伸5 min。(2)免疫细胞化学检测: 分别取P2代和P10代脐血分离细胞， 以5×106/L的密度接种于放置有消毒盖玻片的6孔板内， 每孔加入2 mL新鲜培养液， 制备细胞爬片。细胞贴壁后， 吸出培养液， 小心加入PBS轻轻冲洗2次后， 再加入40 g/L多聚甲醛室温固定15～20 min。PBS轻洗2次， 然后参照EliVisionTM Plus试剂盒说明书进行免疫细胞化学染色。

2 结果

2.1 脐血分离细胞的培养和传代 原代培养的细胞刚接种时呈圆形， 48～72 h后开始有极少量细胞贴壁， 5～7 d后出现较多的贴壁细胞， 部分为成纤维细胞状的长梭形细胞和少量纺锤状细胞（图1A）。1～2 周后可见1～3个细胞克隆出现， 细胞排列成束状、 漩涡状或放射状（图1B）。2～3周左右细胞克隆不再向周围扩大， 按1∶3的比例传代后细胞扩增明显加快， 7～10 d达到90%以上融合， 为均匀一致的成纤维细胞状细胞。P2～P7代细胞增殖速度最快， 1∶3传代后3～5 d即达到90%以上融合， P8代细胞增殖速度开始变慢， P10代以后细胞增殖能力明显下降。相差显微镜下观察， P2代细胞表现为均匀一致的成纤维细胞样的形态， P3代开始偶见个别细胞表现为类似神经元的形态， 随着传代次数增加这种细胞的数量有增多的趋势。

图1 人脐血分离细胞的形态（×400）（略）

A: 培养7 d的分离细胞; B: 克隆化生长的分离细胞.

2.2 脐血分离细胞表面抗原的FCM检测 检测结果显示脐血分离细胞强表达CD29、 CD44、 CD105， 阳性细胞百分数分别为97.8%、 99.5%、 98.3%; 不表达CD34、 HLADR、 CD106， 阳性细胞百分数分别为0.09%、 0.82%、 0.12%（图2）。

2.3 脐血MSC向神经元样细胞分化的检测

2.3.1 RTPCR检测结果 P10代脐血MSC的RTPCR检测结果为: PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后， 在分子量100～200 bp之间出现预期的NSE、 NF的特异PCR扩增条带。P2代脐血MSC的RTPCR检测结果无NSE、 NF的PCR扩增条带。提示P10代脐血MSC有NSE、 NF mRNA表达， 而P2代脐血MSC无NSE、 NF mRNA表达（图3）。

图2 人脐血分离细胞的FCM检测（略）

图3 人脐血MSC向神经元样细胞分化的RTPCR分析（略）

1: 神经丝蛋白(P10); 2: 神经元特异性烯醇化酶(P10); 3: DNA marker (DL 2 000); 4: 神经丝蛋白(P2); 5: 神经元特异性烯醇化酶(P2).

2.3.2 免疫细胞化学检测结果 P2代细胞呈现均一的、 典型的成纤维细胞样的形态， 不表达NSE、 NF， 细胞胞质为均匀的蓝色。而P10代细胞中， 部分细胞表现为神经元样细胞的形态， 部分细胞为扁平、 宽大的形态， 均有不同程度的NSE、 NF抗原表达， 神经元样细胞胞质染成较浓的棕褐色， 而扁平、 宽大的细胞则染成浅棕色（图4）。

图4 人脐血MSC的免疫细胞化学检测 (×200)（略）

A: P10 MSC， 神经元特异性烯醇化酶 (+); B: P2 MSC， 神经元特异性烯醇化酶 (-); C: P10 MSC， 神经丝蛋白(+); D: P2 MSC， 神经丝蛋白(-).3 讨论

研究报道MSC在体外诱导条件下可分化为神经细胞， 诱导后MSC表现为神经细胞的形态， 并表达多种神经细胞的特异性抗原标记。而且有学者发现MSC可诱导分化为特殊类型的神经细胞， 如5HT敏感神经元［4］、 多巴胺能神经元［5］等。MSC的这种特性为其用于神经系统疾病的细胞替代治疗提供了可能， 但是对于MSC在体外诱导条件下分化为神经细胞的观点目前还存在争议。有学者认为MSC经化学诱导法诱导出现的神经元样细胞形态改变是细胞毒性损害、 胞质收缩、 细胞骨架改变的结果， 而不是真正的神经细胞［6］; 也有文献报道骨髓MSC在诱导前就已经能表达神经细胞标志物， 诱导后表达明显增加［7］。

目前虽然对MSC的研究较多， 但还没有公认的可用来鉴定MSC的专一的、 特异性的抗原标志。主要根据细胞形态、 免疫表型、 多向分化潜能进行鉴定。MSC表达的主要抗原标志有: （1）黏附分子， CD58、 CD44等。（1）整合素家族成员， CD29、 CD51等。（3）其它分子， CD90、 CD105等。不表达造血细胞的表面抗原标志CD34、 CD45等， 不表达组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLADR抗原等， 也不表达内皮细胞表面抗原标志CD31、 CD106等［8］。本研究从足月新生儿脐血中分离培养出的MSC为均匀一致的成纤维细胞样的形态， FCM检测强表达CD44、 CD29、 CD105， 不表达CD34、 HLADR、 CD106， 符合MSCs的抗原标志特征， 提示我们分离的细胞为MSC。

在培养过程中我们观察到脐血MSC在P8代以后增殖速度不断减慢， 而且在多次传代后少数细胞呈现类似神经元的形态， 提示MSC具有终末分化为神经元的可能。P2代细胞表现为均一的成纤维细胞样的形态， RTPCR 检测无神经元特异性抗原NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测无NSE、 NF蛋白表达， 说明这个时期的MSC中不存在神经元; 而P10代细胞则呈现不同的细胞形态， 部分细胞的形态类似于神经元， RTPCR检测有NSE、 NF的mRNA表达， 免疫细胞化学检测也表明该类细胞能表达NSE和NF蛋白， 证明此时MSC中包含有神经元样细胞。本实验没有应用外源性诱导剂， 可以排除诱导剂对细胞形态的影响; P10代MSC不仅形态上与神经元相似， 还有神经元特异性抗原标记NSE、 NF的mRNA和蛋白表达， 进一步证实MSC有终末向神经元分化的可能。目前中胚层起源的MSC横向分化为神经细胞的确切机制尚不清楚， 基因芯片技术证实骨髓MSC不仅含有成骨细胞、 成软骨细胞、 成肌细胞等中胚层细胞的标志物基因， 还含有神经细胞的某些标志物基因， 一旦基因组中某些基因被细胞外微环境中的细胞因子所激活， 则可能向某些特定细胞分化［9］。本研究中MSC在体外培养和传代的过程中能表达NSE、 NF， 可能存在某种因素促使NSE、 NF基因激活。

然而我们的研究结果只能说明人脐血MSC有终末向神经元分化的可能性， 是否能分化为真正的神经元还需要进一步的实验如其他神经元特异性抗原标志的检测、 电镜检查和电生理学研究， 尤其是从功能上证实这些细胞能完成某种神经活动， 如形成突触联系、 建立神经反射等。这些研究对于人脐血MSC用于神经系统疾病的细胞治疗将具有重要的理论和实用价值。

参考文献

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［2］ Choong PF， Mok PL， Cheong SK， et al. Generating neuronlike cells from BMderived mesenchymal stromal cells in vitro［J］. Cytotherapy， 2007， 9(2): 170-183.

［3］ 王 超， 徐 蕴， 宋文刚， 等. 大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立及其表型分析［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23（5）: 466-468.

［4］ Li TY， Shu C， Wong CH， et al. Plasticity of rat bone marrowderived 5hydroxytryptaminesensitive neurons: dedifferentiation and redifferentiation［J］. Cell Biol Int， 2004， 28(11): 801-807.

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［7］ 袁 源， 杨树源， 韩忠朝， 等. 人脐带间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究［J］. 中华神经医学杂志， 2006， 5（3）: 230-236.

［8］ Gang EJ， Hong SH， Jeong JA， et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2004， 321(1): 102-108.

血液的化学元素篇8

关键词：血液循环系统　计算机仿真　功率键合图法

0 引　言

功率键合图法是一种系统动力学建模方法，它以图形方法来表示、描述系统动态结构，是对流体系统进行动态数字仿真时有效的建模工具。通过已有的研究工作表明，功率键合图方法可以较好地应用于生物流体系统仿真，特别是人体循环系统的建模和数字仿真[10]。

我们在以前的工作当中，建立了一个简化的血液循环系统模型[10]，验证了功率键合图法的可行性和有效性。键合图建模方法的优点是直观形象，便于获得状态空间方程，有利于数值化计算，避免了电模拟方法中推导状态方程困难的弱点 。本文对血液循环系统进行了较细致和全面的划分，建立了一个包括动脉系统、静脉系统、心脏（左、右心室和心房）以及冠脉循环、外周循环的多分支血液循环系统仿真模型。

应用功率键合图方法对血液循环系统进行建模和仿真的基本规则是，(1)把血液循环系统的结构及各主要动态影响因素以图示模型形式，即功率键合图加以表示，(2)从功率键合图出发，建立系统的动态数学模型——状态空间方程，(3)在数字计算机上对状态方程进行求解。

1 多分支血液循环系统模型的建立

1.1 系统描述

血液循环系统模型如图1所示[4]。在心血管循环系统中，血液在心脏“泵”的作用下所进行的循环流动，可以看作是一种功率流的流动、传输、分配和转换的过程。血液在左右心室有节律地收缩作用下，被泵向人体的各个部分，其中包括：体循环区（血液由左心室经主动脉、大动脉、外周循环区和腔静脉，回到右心房），肺循环区（血液由右心室流经肺动脉和肺静脉到左心房。），腹部内循环，颈部和头部循环，以及冠脉循环等。在心房和心室、心室和主动脉之间存在着防止血液倒流的膜瓣，如二尖瓣、三尖瓣、主动脉瓣等。

图1　血液循环系统模型

1.2 功率键合图模型

应用功率键合图建模方法的第一步是将原系统表达为功率键合图的图示模型。功率键合图由功率键、结点和作用元等主要元素构成，多分支血液循环系统的功率键合图如图2所示。

Rnv

Chv

Rhh

Cha

Rna

图2　多分支血液循环系统功率键合图模型(此图有省略)

参考图2，绘制多分支血液循环系统功率键合图的步骤可简述如下：

(1)根据对多分支循环系统各个功率流程分支的分析，依次确定各0结点和1结点。

0结点表示集总的流容容腔，如心室腔、主动脉弹性腔，在0结点处血液压力为等值，而该结点输入的血流量等于输出的血流量。1结点表示集总的流阻管路或流感管路，如大动脉血管，在1结点处血流量为等值，而该结点的压力降等于上流压力值减去下流压力值。在图2 的循环系统模型中共有15个0结点和21个1结点。

(2)画上各结点周围的功率键，并标注功率流向。

功率键是带有箭头和因果线表示功率的线段。本模型中构成功率的两个变量是血压和血流。箭头表示系统作用元中的功率流向，即循环血液的流动方向。

(3)在功率键的一端标注上相应的C、R、L作用元。

为了能够全面、细致地刻画系统特性，本模型中应用了三种作用元：流容、流阻和流感。

流容反映血管的顺应性，画在0结点上，用C来表示，简称C元。例如，图2 中的Cta、Car、Cvn、Cpa、Cpv是分别表示与图1相对应部分的胸主动脉、大动脉、腔静脉、肺动脉和肺静脉顺应性的流容。

流感反映血流的惯性特性，画在1结点上，用L来表示，简称L元。如图2中的Lta、Lar、Lvn、Lpa、Lpv、Lco是分别表示相对应的胸主动脉、大动脉、腔静脉、肺动脉、肺静脉及冠状动脉血流惯性的流感。

流阻反映血流粘滞阻力的特性，简称R元，画在1结点上。例如图2中Rta、Rar、Rvn、Rpa、Rpv和Rco是分别表示胸主动脉、大动脉、腔静脉、肺动脉、肺静脉及冠状动脉血流粘滞阻力的阻性作用元。

(4)在各功率键上标注因果线，以便于建立系统的数学模型。

功率键上的因果线表示各作用元上流量与压力两变量之间的因果关系，确定了自变量和因变量，便于建立系统的状态方程。对于C元，其功率键上两个变量间，自变量是流量，因变量是压力；对于L元和R元，其功率键上两个变量间压力是自变量，流量是因变量。

经过以上步骤，就完成了循环系统的功率键合图模型。可以看出，键合图模型就是通过结点、功率键和作用元这些元素对心血管循环系统直观而形象的描述和反映。在将循环系统翻译成键合图模型后，就可以方便、有条不紊地推导系统数学模型。

2 系统数学模型

功率键合图建模方法的第二步是推导系统的数学模型。在推导系统动态过程的数学模型——状态方程时，首先要确定状态变量。应用键合图方法建模的方便之处就在于对状态变量的确定有一定之规，可遵循固定的法则。

由于系统的状态方程是一阶微分方程组，在其变量间有导数关系，而在键合图中，只有流容C和流感L作用元中的两个变量间才有导数或积分关系，所以应当从C元和L元各自的变量间取一个变量作为状态变量。

对于C元，自变量为流量，因变量为压力，其关系为：

(1)

对于L元，自变量为压力，因变量为流量，其关系为：

(2)

对于R元，流量和压力之间的关系有：

(3)

根据规则，取C元功率键上的压力变量p和L元功率键上的流量变量Q为状态变量，状态变量的一阶导数即为状态方程。

因此，对于0结点，由(1)式两边取导数可得：

(4)

其中， 是第i个0结点处的压力， 为输入血流量， 为输出血流量， 是第i个0结点处的流容。

对于1结点，由(2)式和(3)式可得：

(5)

其中， 是第i个1结点处的血流量， 为上流压力， 为下流压力， 和 分别是第i个1结点处的流阻和流感。

对每个0节点和1结点都建立类似(4)和(5)的关系式，则可以得到系统的数学模型。本模型的数学模型是36阶的状态空间方程，即模型由36个一阶微分方程组成。下面列出了主动脉循环部分的状态方程：

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

其中，Cta、Caa、Car分别是胸主动脉、腹主动脉、外周动脉的流容；Lta、Laa、Lar、Lvn分别是胸主动脉、腹主动脉、外周动脉和腔静脉的流感；Rta、Raa、Rsa、Rpc和Rsv是分别表示胸主动脉、腹主动脉、外周动脉、外周循环和腔静脉的流阻。ptao、paao、psar和Qtao、Qaao、Qsar分别是动脉循环中的胸主动脉、腹主动脉、外周动脉部分的压力和流量。

血液循环是由心脏的舒张－收缩动作推动的，本文采用了心室时变流容 来表示这种舒张－收缩动作， 是时间的周期函数。

对于循环系统中的膜瓣作用，可以作为模型的约束条件加入到系统数学模型当中：当血液正向流动时，膜瓣阻力为一较小的数值；当血液反向流动时，膜瓣阻力为无穷大，即阻止血液倒流。

本模型中的流容、流阻和流感参数参照文献[4]。

3 计算机仿真

本文采用4阶定步长Runge－Kutta法来求解模型的状态方程，设定仿真步长为0.0001s，在奔腾586 PC机上进行数字仿真。

当加入边界约束条件，设置各状态变量初始参数之后，状态变量便以状态方程为基础被同步地展开。在每一步，血液循环系统各部分的压力和流量值根据状态方程被分别计算出来。待仿真数据变化稳定后，由系统输出方程可以得到每个心动周期内系统各部分的血压p、血流量Q、血液容量V以及心输出量CO和射血分数EF等各项生理参数数值，从而可以对多项生理特性进行计算机仿真。本文进行了正常生理条件下和高血压、血管刚性的病理条件下的生理特性仿真。

3.1 正常生理状态仿真

设定各状态变量的初始参数为正常值[4，5]，对系统模型进行计算，即可得到正常生理条件下，血液循环系统血流动力学参数的仿真数据。

图3给出了在正常状态时，三个心动周期（每个心动周期为0.8秒）内的左心室压力和主动脉血的仿真波形压的仿真波形。从压力仿真波形图中可以看出，心室压力和主动脉压力在每个心动周期内的压力脉动是十分显著的。图4是肺动脉血压和肺静脉血压的仿真波形。肺动脉压的压力脉动也较为显著，而在肺静脉中，血液的压力脉动就不很明显。

图3 左心室和主动脉的压力变化仿真

140

01.6

t/s

(a)左心室血液容量的周期变化

140

01.6

t/s

(b)右心室血液容量的周期变化

图4 肺动脉和肺静脉的压力变化仿真

在表1中给出了血液循环系统主要血流动力学变量在正常状态时条件下的仿真数值。由生理学规律可知 ，左心室收缩压范围一般在17~18 kPa，主动脉压力范围在12~17 kPa，肺动脉压在2 kPa左右。因此，仿真所得波形和数据与实际的生理规律是相符的。

表1中还给出了评定心脏功能的两个有用的指标：心输出量CO和射血分数EF，仿真所得到的数据为：心输出量5256 ml/min，射血分数61%，都符合实际的生理规律 。

表1 血液循环系统主要血流动力学变量计算机仿真数值

仿真实验

项目

左心室压

峰值

LVPP

(kPa)

主动脉压

AP

(kPa)

左心室舒

张末容积

LVEDV

(ml)

右心房压

RAP

(kPa)

肺动脉压

PAP

(kPa)

右心室舒

张末容积

RVEDV

(ml)

冠脉血流

量

CF

(ml/min)

心输出量

CO

(ml/min)

射血分数

EF

（%）

正常

17.96

16.82

123

0.6

2.13

130

228

5256

61

高血压

21.28

18.63

126

0.6

2.26

130

230

4989

54

血管刚性

19.29

17.10

124

0.6

2.13

130

229

5010