高效液相色谱法测定海洋水体与沉积物中光合色素

摘 要 建立了海洋水体与沉积物中30种光合色素的反相高效液相色谱检测方法。海水滤膜和沉积物分别采用95%甲醇和95%丙酮超声萃取。萃取液混合一定比例的超纯水后，采用Eclipse XDB C8反相柱进行分离，以乙腈（A）、甲醇（B）和四丁基羟胺甲醇（C）混合液为流动相进行洗脱，检测波长为430， 440和450 nm，柱温为50 ℃。色谱分离梯度为：0 min， 100% C；22 min，25% A， 45% B和30% C；28～38 min，70% A， 20% B和10% C；38.1～40 min，100% C。对23种已知浓度色素的线性关系、检出限和加标回收率进行分析。结果表明，相关系数范围为0.9972～0.9998，检出限范围为0.0305～0.7740 ng，加标回收率范围为88.6%～103.3%。

关键词 光合色素； 高效液相色谱； 海水； 沉积物； 海洋微藻

1 引 言

长期以来，海洋微藻分类主要以形态特征为依据，依靠专业人员采用显微镜检测。但这种分析方法具有专业性要求高，费时费力等缺点；同时许多微型浮游植物缺少明显的分类学形态特征,或存在无法固定保存及固定后易变形等问题,容易造成漏检和误检\。光合色素是藻类重要的生物标记物，不同种类的浮游藻类具有不同的色素组成和特征色素比值，以此为基础的化学分类方法成为浮游藻类分类学的重要组成部分\。光合色素种类多达几百种，建立精确的光合色素定性与定量检测方法是实现海洋微藻化学分类方法的关键，其中高效液相色谱方法（HPLC）是目前最成功的检测方法\。光合色素的HPLC分析在20世纪80年代获得了快速发展，实现了叶绿素准确定量分析（不受降解产物影响）\。随着HPLC自动化程度的提高，大量现场样品的光合色素分析成为可能。

1991年, Wright等\采用C18柱实现了40种类胡萝卜素和12 种叶绿素及其衍生物的分离。但该方法对一些重要的特征色素,如单乙烯基叶绿素（Chlorophyll a/b）和二乙烯基叶绿素（DV Chlorophyll a/b）, 以及叶绿素c2（Chlorophyll c2） 和c1（Chlorophyll c1）不能进行分离。Zapata等\采用甲醇、乙腈、丙酮和吡啶的醋酸溶液为流动相,实现了包括叶绿素c类、Chlorophyll a和DV Chlorophyll a等色素的分离，但Chlorophyll b 和DV Chlorophyll b不能分离。van Heukelem等\仅采用甲醇和水为流动相,并使用四丁基羟胺（TBA）作为修饰剂，改善流动相极性，Chlorophyll a/b和DV Chlorophyll a/b的分离效果良好，但叶绿素c类及胡萝卜素分离效果欠佳\。本研究采用C8色谱柱，以甲醇、乙腈和水为流动相，以TBA为修饰剂，建立了藻类光合色素分离新方法，对叶绿素c类、Chlorophyll a和DV Chlorophyll a等色素的分离效果良好。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱系统主要由Agilent1200系列组成，包括以下组件：G1311四元梯度泵，G1311自动进样器，G1321A荧光检测器，G1315C二极管阵列检测器，Eclipse XDB C8反相柱（150 mm×4.6 mm，3.5 m，Aglient Technologies公司）。整套HPLC系统由Agilent ChemStation进行管理。针筒滤器（上海安谱公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；四丁基羟胺（TBA，JT Baker公司）。实验用水均为经Millipore超纯水系统生产的超纯水。色素标准品（丹麦DHI公司），包括混合色素（含30种组分，未定量）和23种已知浓度的单标色素。

2.2 实验步骤

2.2.1 样品采集 于2011年2月在珠江口海域（E113°37′0.0″, N22°6′0.0″）和海南省陵水新村湾（E109°57′44.0″, N18°24′35.0″）采集水样，于弱光下过滤到47 mm Whatman GF/F 玻璃纤维滤膜上，滤膜于20 ℃下冷冻保存，待分析。

2.2.2 色素提取 滤膜和沉积物色素提取参考文献\的方法。将冷冻的滤膜剪碎，置于聚乙烯塑料离心管中，用3 mL 95%（V/V）甲醇提取色素。沉积物于

L。采用二极管阵列检测器（DAD）和荧光检测器（FLD）并列检测。流动相包括3种洗脱液：（A）乙腈，（B）甲醇和（C）四丁基羟胺

表1 HPLC 梯度洗脱程序

Table 1 Gradient elution program of HPLC

时间Time

（min）（A）乙腈Acetonitrile（%）（B）甲醇Methanol（%）

（C）TBA甲醇溶液TBAmethanol （%）00010022.025453028.0

70201038.070201038.10010040.000100 TBA： Tetrabutylammonium hydroxide.

醋酸甲醇混合液。洗脱液C配制方法：配制28 mmol/L TBA溶液（以醋酸调至pH 6.50），将TBA溶液与甲醇按体积比3∶7混合，过滤并超声脱气，可稳定保存1星期。色谱梯度洗脱程序见表1。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

3.1.1 流动相的选择与梯度优化 藻类光合色素种类较多，可分为3类：叶绿素（Chiorophylls）、类胡萝卜素（Carotenoids）和藻胆蛋白（Phycobilinrotein）。叶绿素包括叶绿素a， b， c和d等。其中，叶绿素a， b和d含有叶绿醇侧链，使其极性较弱，在反相色谱柱中具有较长的保留时间；叶绿素c类（c1， c2， c3）不含叶绿醇侧链，故极性较强，保留时间较短。类胡萝卜素包括胡萝卜素（Carotenes）和叶黄素（Xanthophylls）。胡萝卜素具有较强的亲脂性，但叶黄素类极性中等。叶黄素类成分复杂，色谱保留时间介于叶绿素a， b和叶绿素c类之间。藻胆蛋白仅存在于蓝藻、红藻、隐藻和某些原绿球藻中，与叶绿素和类胡萝卜素等性质差异较大，本实验不予研究。

叶绿素c类化合物极性较强，保留时间较短，部分组分（如Chlorophyll c2， Chlorophyll c1和Mg2,4二乙烯基脱镁卟啉a5单甲酯（MgDVP）等）色谱分离比较困难，但该类化合物含有COOH基团，可以考虑在流动相中添加四丁基铵离子作为离子对试剂进行分离。四丁基铵离子作为流动相修饰剂被广泛应用于液相色谱复杂组分的分离\。研究结果表明，叶绿素c类化合物保留时间与TBA浓度成正相关，但极性较弱的叶绿素a/b和类胡萝卜素组分（无COOH基团）保留时间与TBA浓度相关性不强。随着流动相TBA浓度增大，叶绿素c类化合物保留时间增加，但可以通过增大流动相中有机溶剂的比例（A， B洗脱液），控制其保留时间在10 min以内。色谱分离首先考虑Chlorophyll c2， MgDVP和Chlorophyll c1的分离，同时兼顾弱极性组分的洗脱，所以在初始阶段采用100% TBA甲醇溶液作为流动相，在0～22 min内，流动相中乙腈和甲醇的比例分别线性增加至25%和45%，TBA甲醇溶液降为30%。在此阶段，流动相中甲醇的比例和增加速度均超过乙腈，否则容易造成叶黄素组分，如19′丁酰氧岩藻黄素（19′Butfucoxanthin）/岩藻黄素（Fucoxanthin）、辣椒红素（Capsanthin）/硅甲藻黄素（Diadinoxanthin）、玉米黄素（Zeaxanthin）/叶黄素（Lutein）等色谱峰的合并。在22～28 min时，流动相中乙腈比例迅速增大至70%，甲醇和TBA甲醇溶液比例分别降至20%和10%，随后保持到38 min，以保证非极性组分的快速洗脱，同时能够改善α胡萝卜素（αCarotene）和β胡萝卜素（βCarotene）的分离效果。

3.1.2 色谱柱与柱温的选择 本研究对3种类型色谱柱的分离效果进行了比较，包括Protein and peptide C18 （250 mm×4.6 mm，5.0 m）, 尤其是对出峰时间相近的叶黄素类组分的分离，填料粒径较小的Eclipse C8色谱柱对该类色素组分的分离效果最佳。柱温对色素的出峰时间影响显著，柱温低于40 ℃时，各化合物出峰时间明显延长，导致样品分析时间明显增长。增加甲醇或乙腈比例，可缩短各组分的保留时间，但极易造成叶黄素类组分分离度变差。柱温过高则不利于保护色谱柱。本研究柱温选择为50 ℃，以保证色素组分具有良好的分离度，同时， 样品的分析时间控制在40 min内， 色素的色谱图如图1所示。

图1 光合色素HPLC分析图

Fig．1 Chromatogram of photosynthetic pigments

蓝线： 430 nm； 红线： 440 nm； 绿线： 450 nm， 峰序号同表2。Blue line: 430 nm, red line: 440 nm, green line: 450 nm, peak numbers are same as in Table 2．

3.2 进样量与加水比例的确定

水体和沉积物中的光合色素含量一般较低，而对提取液进行浓缩则增加了色素测定的难度，同时可能导致某些易降解色素的分解和转化。目前，水体和沉积物色素提取液多采用直接进样（非浓缩），HPLC进样量主要在100～900 L。由于滤膜和沉积物中色素提取分别采用了95%甲醇和95%丙酮，提取液进样之前需要混合适量水，以改善峰形。本研究分别采用水与提取液的比例为10∶90， 20∶80， 25∶75， 30∶70， 35∶65和40∶60（V/V）的混合液进行HPLC分析。结果表明，水与甲醇提取液的比例大于25∶75（V/V）时，光合色素（主要是出峰时间较早的极性组分）峰形较好，否则具有较大的前拖尾，而水与丙酮提取液的比例则需提高到35∶65（V/V）以上。

3.3 检测波长的确定

采用二极管阵列检测器扫描得到各物质在紫外可见光区的最大吸收波长。结果表明，藻类光合色素的最大吸收波长主要集中在可见光区（430～450 nm），但不同色素的最大吸收波长不尽相同（数据未给出）。为了能同时测定这些物质，采用3个波长检测，分别为430， 440和450 nm，其中Pheophorbide a， Pheophythin a和Chlorophyll a在430 nm具有较高的灵敏度，所以这3种物质的检测波长均可采用430 nm，但其它色素的灵敏度相对偏低（图1）。所以其它色素可以采用440或450 nm进行检测。光合色素的荧光检测对叶绿素c类和叶绿素a类化合物具有一定的灵敏度，但不能检测类胡萝卜素类组分，所以荧光检测主要应用于样品中色素的鉴别，不应用于定量分析。本研究采用荧光检测的激发波长和发射波长分别为440和650 nm\。

3.4 检出限与线性范围

在已确定的色谱条件下，进样量为100 g/L）关系进行线性回归（表2）。通过逐步降低标准溶液浓度，以信噪比S/N＝3作为基准，获得23种光合色素的检出限（表2）。由于标准品昂贵，本研究仅对GF/F滤膜进行了2个浓表2 光合色素的线性回归方程、检出限与回收率

Table 2 Regression equations，detection limits and recovery of photosynthetic pigments determined by HPLC

色谱峰

编号Peak

number化合物名称Name线性方Linear regressionequation相关系数CorrelationCoefficient

（R2）线性范围Linear range