高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒DNA及其变异

摘 要 构建了新型纳米金比色芯片，利用Taq DNA连接酶的连接特异性，将其与乙型肝炎病毒DNA（HBVDNA）靶序列完全互补杂交的捕获探针（固定在芯片上）和纳米金修饰的探针连接成一条链，从而将纳米金颗粒固定到芯片点阵上，再通过银染反应放大, 形成裸眼可见的显色信息。通过点阵的位置及灰度，即可判断HBVDNA靶序列的单碱基突变，并得出相对定量信息。本实验对不同浓度的HBVDNA靶序列进行了检测。结果显示： 此技术对单碱基突变有很强的特异性识别能力，并且具有较高的灵敏度（约10 pmol/L），在10～100 pmol/L浓度范围内表现出较好的线性关系。该技术检测时间短（＜1 h）、操作简单、不需要特殊的检测设备，具有很好的临床应用前景。

关键词 乙型肝炎病毒； 纳米金； 基因芯片； Taq DNA 连接酶

1 引 言

我国是乙型肝炎高发区，流行病学调查表明\，我国至少有8亿人感染过乙型肝炎，乙肝表面抗原的携带率曾高达9.75%。在乙肝的治疗方案中，通过抗HBV药物抑制HBV复制是最重要和有效的方法之一，因此HBVDNA的定量检测和耐药性变异检测在HBV病理研究与临床诊断中具有重要意义\。HBVDNA检测的传统方法有直接测序、S基因序列测定、ELISA基因型分型法和PCRRFLP基因型分型法等\。近年来，基因芯片技术开始应用于疾病的诊断，它具有灵敏度高、结果准确和操作迅速简便等优势。但由于采用示踪探针标记技术（酶、放射性同位素、荧光、化学发光等）比较昂贵，而且都有较高的仪器设备要求，限制了基因芯片在临床检测中的应用\。

以纳米金进行示踪标记，结合纳米金银染增强技术，在基因芯片上可实现目标DNA的检测\。李玮等\基于纳米金探针开发了可视化乙肝病毒基因芯片。但是，这些方法只能检测DNA的浓度，而且对于杂交和清洗条件都有较高要求。本研究引入Taq DNA连接酶作为单碱基突变的识别工具，只需一步杂交和连接反应，将纳米金颗粒捕获固定在芯片点阵上，再经过银染放大显色即可判定结果，不仅可以检测HBVDNA的浓度，而且可以识别HBVDNA的单碱基突变。本方法操作简单，不需要特殊的检测设备，而且通过修改探针的设计即可用于其它DNA的检测，具有很好的应用前景。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Prosys5510A芯片点样仪（美国Cartesian Technology公司）；V670紫外可见分光光度计（美国Jasco公司）；BX51显微镜和Qimage Retiga 2000R数码相机（日本Olympus公司）；JEM2100透射电子显微镜（TEM，日本电子公司）；Centrifuge 5804R高速离心机（德国Eppendorf公司）；DY501电泳仪（上海万达科技品格服务部）；Gel DocTM XR＋凝胶成像仪（美国BioRad公司）。

纳米金溶液、基因芯片由本实验室自行制备；氯金酸（Acros Organics公司）；0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）；1.0 mol/L NaCl；0.2×SSC洗液（含0.1% SDS）；银染液（将1%明胶溶液、5.7%氢醌溶液、25.5%柠檬酸23.5%柠檬酸三钠的混合液、20% AgNO3溶液顺序以120:60:20:3的比例迅速混匀，配好即用）；NaNO3洗液；目标DNA和探针由上海生物工程技术有限公司合成（表1）。DNA连接酶（Taq DNA Ligase）及其反应缓冲液由美国BioLab公司提供。其它试剂为分析纯， 实验用水为超纯水（美国Millipore公司MilliQ系统制备）。