细胞受控组装人工喉软骨支架及性能表征

摘要：目的 应用组织工程和生物制造工程原理，采用增材制造技术，探索一种制造喉关节软骨支架的新途径。方法 利用明胶和海藻酸钠作为材料，通过CCA-II细胞受控组装机制备喉软骨支架，然后对所制备支架进行性能的表征。结果 制取出了粘度合适、降解率合适、高孔隙率和含水量的三维支架，类似喉软骨外基质成分。结论 增材制造技术与组织工程技术和生物制造技术的结合为未来修复喉功能提供一种潜在的手段。

关键词：人工喉软骨；增材制造；细胞受控组装；生物3D打印

1喉软骨支架制备方案

所谓组织工程就是运用工程科学和生命科学的原理和方法，从根本上认识正常和病理的组织结构--功能关系，研究和开发一套具有生物相容性、组织相容性和生物活性的组织器官[1-3]，用以替代或修复已损伤的人体组织和器官，或进一步改进受损组织器官的生理功能。具体做法是：首先制备具有良好生物相容性和良好机械性能的生物材料支架，然后将种子细胞与生物材料支架混合培养，植入受损部位，待细胞生长、增殖、分化形成与原来组织器官具有相同形态，并且具有和原来组织器官相一致的生理功能的具有生物活性的组织器官替代物，同时生物材料支架也按照细胞生长、增殖、分化相匹配的速率降解，从而达到组织器官损伤修复和恢复其生理功能的目的[4-7]。

通过组织工程和生物3D打印技术原理，本文研究过程主要为以下内容：喉软骨支架的生物材料的选择和喉软骨支架的制取。其中主要为降解率合适、孔隙率高、含水率高且生物相容性好的喉软骨支架。支架组装过程如图1所示，支架制取实验在CCA-II细胞受控组装机中完成。

2喉软骨组织工程支架材料的选取

2.1喉的组成成分 成人的软骨，根据软骨组织内所含纤维的成分不同，可分为三种类型，即透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。而喉的软骨属于透明软骨，是一种自身没有血管，没有神经，没有淋巴组织的特殊结构。在透明软骨中软骨细胞仅占软骨组织体积的1～5%。软骨细胞的营养都是由软骨基质来提供的。软骨细胞是一群比较特殊的细胞同时自身能够合成和维持软骨基质的底层结构[8]。因此，如何选取合适的支架材料对整个喉软骨的作用至关重要。

2.2材料的选取 根据喉软骨组织的组成成分以及其结构特点，理想的喉软骨组织工程支架应该具备以下特征：①良好的生物相容性，对细胞和机体无毒害；②良好的生物降解特性，可完全被机体降解吸收或排出体外；③良好的机械特性，具备一定的力学强度和可塑性，结构长时间保持稳定，具有较高的孔隙率；④良好的表面相容性，利于细胞在材料表面黏附与生长[9]。目前可作为喉软骨组织工程支架的材料具体可分为三类，分别为天然高分子材料、人工合成高分子材料以及复合材料。天然高分子材料如胶原、壳聚糖等均取自天然动植物体，其都是软骨细胞外基质成分或类似基质构成物，所以此类材料能够很好的与生物体相容，有良好的仿生性和组织亲和性，并能够促进细胞的增殖，且大多来源丰富，价格低，但也有质地相对较软，机械强度不足的缺点。而合成材料则是在天然材料的基础上发展起来的，虽然在机械强度上能够满足需求，但其亲水性差、细胞吸附力弱则是其与天然高分子材料相比不足之处。而复合材料的出现则改变了上述两种材料的不完美，它即具备了天然材料组织相容性和亲和性好的优点，又提高了材料的机械强度，使得喉软骨组织工程支架的材料变得更具可行性。

根据复合材料的这些优点，本文采取制备明胶与海藻酸钠复合材料的方法来喉软骨组织工程支架，其中明胶是胶原的部分变性衍生物，在35℃以下时形成热可逆性凝胶，具有高含水率及温敏性[10]。海藻酸盐可在Ca2+、Ba2+等二价阳离子的作用下发生溶胶凝胶相转变，具有良好的机械强度和成形性。将二者相结合，得到含水率高、易于成形的明胶海藻酸钠复合材料（GSA），在化学成分、柔软性、对亲水性营养和代谢物扩散性等方面都与ECMs相似[10]，可用作基质材料。其次，该材料模仿天然软骨的蛋白多糖水凝胶基质（含水85%～90%），可以作为喉软骨的修复或替代材料。最后，该材料是由亲水性聚合物经水溶胀形成的，软骨细胞可渗透入其中进行生长。将该材料制成多孔状，软骨细胞还可由微孔进入多孔水凝胶内部生长[11，12]。

3支架的制取实验

本实验在CCA-II细胞受控组装机中完成。首先把经Mimics处理过的STL格式三维模型导入计算机中，再用Aurora软件对该模型分层，得到CLI文件。将得到的CLI文件导入Cark软件中，准备Cark控制软件来完成对组装机进行控制。设定系统组装参数如表1所示，实验前设定组装机温度在10℃，预冷30min。具体过程如下：①首先分别称量浓度为20%的明胶溶液以及浓度为4%的海藻酸钠溶液；②将称量好的明胶与海藻酸钠加入0.9%生理盐水中制作成相应浓度的共混液，并在65℃水浴锅中加热30min，边加热加用玻璃棒搅拌；③将海藻酸钠溶液用CJJ78-1磁力加热搅拌器在65℃恒温下搅拌1～2h，至海藻酸钠形成透明均匀胶状体；④把制作好的海藻酸钠溶液与明胶溶液按1：1混合，放入1000r/min离心机中离心10min，以去除溶液混合中产生的气泡；⑤装入细胞组装机中打印。

支架制作完成后，滴加6%CaCl2交联，大约交联10min左右交联完成，用PBS清洗两次，得到成形支架，见图2。

4 支架的性能表征

根据组织工程支架用于制取喉软骨基质的要求，支架需要满足高含水量、有一定降解速率、高孔隙率以及膨胀率在一定范围内等要求，为此对支架的降解率、孔隙率、含水量以及膨胀率进行表征。

支架的的降解率是组织工程支架重要的参数，本文利用测定支架的失重率来测量支架的降解率[13]，具体的过程是：首先将打印好的12个支架两两分成一组，取各组平均质量，记为m1，加入PBS缓冲液中，保证支架完全浸泡在溶液中，放入37℃恒温培养箱中；每周定期更换PBS溶液，分别于第1，2，3，4，5，6w取一组样品，用去离子水冲洗多次，称重，取两个样品的平均质量记为m2，按照下列公式来计算支架的降解率：

β = （m1-m2）/m1×100%

支架孔隙率采用排液法测定[14]，选择所用的液体为乙醇，因其能够很好地浸泡支架而不使支架溶解、膨胀或收缩。过程为：首先将支架真空干燥8h，称重，记为m1；然后将干燥后的支架放入具有一定量乙醇的容器中，反复抽真空至支架不再有气泡溢出，将浸泡在乙醇中的支架连同容器一起称重，记为m2；最后将内部还含有乙醇的支架从容器中取出，把不含支架的乙醇同容器称重，记为m3。计算孔隙率的公式如下：

η =v1/（v2+v3）=（m2-m3-m1）/（m2-m3）×100%

其中，v1表示支架中孔隙所占有的体积；v2表示支架中材料的体积；v3表示样品的总体积。

支架的含水量即支架内水分的含量，具体测定过程为：首先将制备好的支架样品浸泡在PBS缓冲液中，放入37℃恒温培养箱中24h，取出滤纸吸取表面多余水分，称量支架质量，记为m1；然后对支架进行真空干燥8h，称取干燥后支架质量，记为m2，支架的含水量用以下公式计算[15]：

=（m2-m1）/m2×100%

最后，对支架的膨胀率进行了测量，具体过程为：首先将支架放入PBS中，然后放入37℃恒温培养箱中24h；24h后称取支架体积与质量，分别为V1与m1；再将支架放入低温冰箱中冷冻12h，冻干后得到固体凝胶支架，称重，记为m2。利用公式计算支架膨胀率：

Vpbs =（m2-m1）/ρpbs

θ =Vpbs/V1×100%

5结果

由图3所示，支架的降解率在2w内降解率在14%左右，而且其降解率是呈直线上升，到第6w时支架重量下降到一半以上。根据组织工程支架对材料降解性的要求，需要支架能够在2w内保持其结构及形状的稳定，以便支架能够在体外进行培养，本文所研究明胶-海藻酸钠支架在2w内只下降14%，能够为软骨细胞的黏附、生长及增殖提供充足的时间和空间，而且材料到第6w降解到其自身50%左右，其时间与软骨细胞的增殖及分泌外基质的速率相匹配，满足组织工程支架对喉软骨修复所要求的降解率。不仅如此，当支架植入生物体内时，由于体内含大量对材料有酶性催化作用的物质，会导致材料在体内产生水解及氧化，而明胶在体内水解后肽键断裂，变成低分子多肽，低分子多肽仍能促进细胞增殖及增加细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白[16]。因此，明胶-海藻酸钠支架的降解率及降解产物的无毒性能满足喉软骨的体外增殖与分化。

支架的孔隙率及含水量是对于细胞在支架内部传输营养物质和代谢产物的排出中起着重要作用，由表2看出，支架的孔隙率及含水量均达到80%以上，有利于促进细胞代谢及加速营养物质的传输，特别是支架模拟天然软骨的蛋白多糖水凝胶基质含水量在85～90%之间，为软骨细胞提供类似细胞外基质环境，能够为细胞的生长与增殖起到比较好的保护和促进作用。表2中还对支架膨胀率进行了测定，由于材料含水量比较高，因此，支架的膨胀率相对较大，但由于材料本身是含水的，本文测定的膨胀率是相对于干燥支架材料而言，实际的膨胀率远远小于这个数值，能够满足组织工程支架对维持支架结构稳定的要求。

6结论

本文从组织工程学出发，利用当今比较流行的增材制造技术，结合实验室现有的CCA-II细胞受控组装机，试图找到一个新的修复喉关节，尤其是喉软骨缺损的方法，本文通过细胞受控组装系统，对不同明胶浓度的实验，研究出了比较适合制作支架的明胶与海藻酸钠浓度，实现了细胞支架的打印，说明了明胶-海藻酸钠支架有高孔隙率与含水量以及比较合适的生物降解性，是作为喉软骨基质的很好的材料，尤其作为多孔支架，有利于细胞粘附及生长。本文的研究为后面需要做相关支架植入动物体内提供较好的参考，为整个喉支架的制作及动物实验做了很好的铺垫。虽然本文初步证实了明胶与海藻酸钠混合材料作为喉软骨支架的可行性，但与实际喉软骨有一定的差距，因此，在不断研究出新材料的基础上，选择怎样的交联方法以及制备工艺将会是今后的研究方向。

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