聚己内酯电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞增殖及分化的影响

【摘要】 目的：观察聚己内酯（PCL）电纺纤维支架材料对骨髓基质细胞(BMSCs)增殖及分化特点的影响，评价其作为骨组织工程的支架材料的应用前景. 方法: 将兔BMSCs与PCL电纺纤维支架材料在培养板内共培养. 采用形态学观察、MTT法及ALP检测等方法检测BMSCs在PCL电纺纤维表面的粘附、增殖和分化能力. 结果: 体外培养的BMSCs能在PCL电纺纤维表面正常粘附和增殖，并且表达较高的碱性磷酸酶活性. 结论: PCL电纺纤维适合作为支架材料应用于BMSCs为种子细胞的组织构建.

【关键词】 电纺纤维;聚己内酯;骨髓基质细胞

0引言

理想的组织工程支架材料要求其不但能够作为种子细胞体内扩增和增殖的支架，而且应当能够成为生长因子、生物活性物质和基因的生物载体，发挥细胞功能调节的作用［1］. 目前已有近百种聚合物成功的通过这一技术获取了超细纤维并被陆续应用于膜技术、增强材料、纺织品、光学传感器、医药释放体系以及组织工程支架材料制备等诸多领域 ［2］. 本研究旨在通过聚己内酯（polycaprolactone, PCL）电纺纤维支架材料对兔骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）生长、增殖和功能分化作用的研究，初步探讨PCL电纺纤维作为组织工程支架材料的应用前景.

1材料和方法

1．1材料聚己内酯（PCL，美国Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化学试剂公司）；氯仿（西安化学试剂公司）；BGG40/2高压直流电源(北京机电研究所，0?30KV)；JSM?6700F型扫描电镜(日本JEOL公司)；BX60型荧光显微镜(日本 Olympus公司)；酶联免疫检测仪（美国Bio?Tek公司）；1.5 mo龄新西兰幼兔1只，雄性，体质量1.5 kg (第四军医大学实验动物中心)；DMEM培养液（美国Gibco BRL公司）；胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂）；MTT（美国Sigma公司）；Pholloidin?FITC（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶(alkaline Phosphatase，ALP)检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）.

1.2方法

1.2.1PCL电纺纤维支架的制备以氯仿/DMF（体积比2∶1）的混合溶液为溶剂，配制浓度为80 g/L的PCL电纺丝溶液. 将电纺丝溶液加入一个安装有8号不锈钢注射针头的自制玻璃加样管. 针头即喷丝口与BGG40/2高压直流电源的正极相连，针头下方安装一个接地的铜板，上覆铝箔作为纤维的接收屏与高压直流电源的负极相连. 在外加电压10 kV，接收距离12 cm，电纺丝溶液流量为3 mL/h的条件下进行静电纺丝. 收集接收屏表面获得的纵横交错的无纺纤维毡，置于干燥器中干燥保存.

1.2.2兔BMSCs的原代培养与接种取新西兰幼兔四肢长骨，纵行剖开，DMEM培养液冲洗骨髓腔，静置后取上清进行培养BMSCs. 24 h后换液，去除未贴壁的血细胞. 每3 d换液1次，2.5 g/L胰酶常规消化传代，倒置显微镜下观察. 取第二代生长良好的BMSCs，胰酶消化传代. 实验分组为PCL电纺纤维实验组和细胞培养板对照组两组. 将传代培养的第二代BMSCs以4×104/cm2浓度接种于各组，每孔加入500 μL接种细胞液，置入细胞培养箱4 h，再加入500 μL培养液，50 mL/L CO2, 饱和湿度、37℃继续培养.

1.2.3肌动蛋白actin直接免疫荧光染色培养8 h后取出PCL电纺纤维试件，PBS冲洗3遍. 37 mL/L甲醛的PBS溶液固定5 min, PBS洗涤2遍. 丙酮脱水，1 mL/L TritonX?100渗透5 min. 10 mg/L Pholloidin?FITC 37℃孵育染色40 min，抗荧光淬灭液封片. 于365 nm荧光显微镜下观察记录.

1.2.4扫描电镜观察于培养3 d后取出PCL电纺纤维试件，PBS冲洗3遍，25 mL/L戊二醛固定24 h. 乙腈梯度脱水，10 g/L锇酸处理1 h，临界点干燥，离子溅射仪喷金. 导电胶固定，以冷场发射扫描电子显微镜观察，电子加速率为5 kV.

1.2.5MTT检测于培养1，3，5，7 d后向实验各组分别加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化. 500 g离心10 min，每管重新加入DMEM培养液200 μL，接种至96孔培养板. 每组4孔，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h. 在酶联免疫检测仪上测各孔A490 nm值，每组3个试件.

1.2.6ALP活性检测培养的第3，7, 14日后，向实验各组分别加入2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，然后加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM终止消化. 将每个样本的细胞悬液加入离心管，500 g离心10 min. 每管加入200 μL细胞裂解液，充分吹打混合. 转移至96孔培养板，加入0.1 mL/L Triton X?100 50 μL，4℃过夜. 采用ALP检测试剂盒，每孔加入ALP反应底物100 μL，37℃孵育30 min. 0.2 mol/L NaOH 50 μL终止反应，在酶联免疫检测仪上测各孔A410 nm值，每组3个试件.

统计学处理：数据以x±s表示，采用统计学软件SPSS 10.0进行方差分析.

2结果

2.1形态学观察接种8 h后BMSCs在PCL电纺纤维材料表面的actin直接免疫荧光染色, BMSCs细胞以梭形和长方形为主，边缘有弧度，胞质丰满、伪足伸展充分. 细胞胞质内含大量束状排列的微丝结构，向两端伸展，排列有序. 核周围染色加深，呈圆形或卵圆形的细胞核(图1). 扫描电镜下示BMSCs伸展更加充分，生长连接成片. BMSCs下可见PCL电纺纤维呈相互交联的多孔网状无纺结构，纤维交错相叠、光滑均一、结构疏松、孔隙结构密集，纤维直径在153～612 nm之间(图2).

2.2MTT检测经方差分析，PCL电纺纤维实验组与对照组的A490 nm值均随共培养时间的增加而增大(表1)，7 d>5 d>3 d>1 d，各检测时间点之间有显著性差异(P<0.05)；而在1，3，5,7 d各检测时间点，两组吸光度之间无显著差异(P>0.05).表1聚己内酯电纺纤维支架对骨髓基质细胞增殖的影响(略)

2.3ALP活性检测经方差分析，PCL电纺纤维实验组与对照组的吸光度A值均随共培养时间的增加而增大(表2)，14 d>7 d>3 d，各检测时间点之间有显著性差异(P<0.05)；而在3，7,14 d各检测时间点,两组吸光度之间无显著差异(P>0.05).表2聚己内酯电纺纤维支架对骨髓基质细胞ALP活性的影响(略)

3讨论

种子细胞与支架材料是组织工程研究的两个核心问题. 骨髓来源的BMSCs具有多向转化的潜能，通过生长因子的诱导，可以分化为成骨细胞，在骨组织的修复、改建以及愈合过程中发挥重要的作用，是目前最为合适的骨组织工程种子细胞［3］. PCL是由ε?己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族聚酯，具有良好的热稳定性、生物降解性、力学性能、药物通过性以及生物相容性. 其降解产物对人体无毒，目前也广泛的应用于骨折固定材料、手术缝线、医用敷料、药物控释和组织工程支架材料等领域［4-5］. 利用静电纺丝技术制备组织工程支架材料的优势在于：能够制备出比表面积大、孔径小、孔隙率高、纤维均一性好，直径与细胞外基质内胶原纤维相近的连续超细纤维（50～500 nm），从而最大程度的模仿细胞外基质天然结构；制备方法简单快捷，支架材料可以是单一的聚合物，也可以是多种聚合物的复合体，并可以在支架中引人无机粒子(如羟基磷灰石等)、生长因子甚至活细胞等; 通过选择适当的材料和加工参数，能够调控支架材料的孔隙率、厚度、三维结构、降解率和力学性能；利用同轴电纺技术还能够将生物活性分子加入到聚合物支架中，实现有效释放［5-7］.

实验中所制备的PCL电纺纤维大体外观光滑均一，纤维直径为153～612 nm，为纳米级多孔无纺纤维. 其相互交错的多孔结构与天然细胞外基质的胶原纤维结构近似，有利于细胞的粘附、铺展和增殖. 细胞内肌动蛋白actin 的结构在维持细胞形状及附着方面起着非常重要的作用，actin染色通常用来研究细胞在材料表面的移动、伸展及形态. Actin直接免疫荧光染色结果显示BMSCs能够在PCL电纺纤维表面形成早期附着. 扫描电镜观察进一步表明生长在PCL电纺纤维材料表面的BMSCs不但可以早期贴附与材料表面，并且能够在短时间内形成良好的铺展形态. MTT比色法试验能够检测细胞存活和生长. 我们的结果表明BMSCs能够在PCL电纺纤维表面正常的存活和增殖，并且同对照组一样具有较旺盛的增殖能力，生物相容性良好. ALP是成骨细胞分化和功能成熟的早期标志，在成骨细胞趋向成熟的转化限制点扮演重要角色. 测定成骨细胞内ALP活性的变化可以了解成骨细胞的分化成熟程度以及细胞成骨矿化的能力. 我们的结果表明随着时间的增加PCL电纺纤维表面的BMSCs同对照组一样，持续的保持着成熟分化功能，表达出完善的成骨活性.

【参考文献】

［1］Rohner U, Hutmacher DW, See Y, et al. Individually CAD?CAM technique designed, bioresorbable 3?dimensional polycaprolactone framework for experimental reconstruction of craniofacial defects in the pig［J］. Mund Kiefer Gesiclitschir, 2002, 6(3): 162-167.

［2］Li D, Xia YN. Electrospinning of nanofibers: reinventing the wheel?［J］. Adv Mater, 2004, 16(14): 1170-1252.

［3］Burg KJ, Porter S, Kellam JF. Biomaterial developments for bone tissue engineering ［J］. Biomaterials, 2000, 21(23): 2347-2359.

［4］Aerturas MR, Molpeceres J, Guzmam M, et al. Development of a new cyclosporine formation based on poly(caprolactone) microspheres［J］.J Microencapsul,2002,19(19):61-72.

［5］李冀, 张育敏, 王志强. 骨组织工程支架材料合成技术的进展［J］. 中华创伤骨科杂志,2006,8(8):773-776.

［6］何创龙, 黄争鸣, 张彦中, 等. 静电纺丝法制备组织工程纳/微米纤维支架［J］.自然科学进展, 2005,15(10):1175-1182.

［7］Reneker DH, Chum I. Nanometre diameter fibers of polymer produced by electrospinning［J］. Nanotechnology, 1996,7(3):216-223.