3D支架在造血干细胞体外扩增中的应用

【摘 要】造血干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，能够发育为血液系统和免疫系统。3D支架能模拟体内骨髓微环境，现就3D支架在造血干细胞体外培养体系中的研究进展予以综述。

【关键词】造血干细胞；体外扩增；3D支架

【Abstract】Hematopoietic stem cells （HSCs） have both self-renewal and differentiation potential and could be differentiated into blood and immune systems. 3 d scaffolds can simulate the bone marrow microenvironment in vivo， therefore， here is to make a review on the 3D scaffold Advances in the Expansion of Hematopoietic Stem Cells in vitro.

【Key words】Hematopoietic stem cells； Ex vivo expansion； 3D scaffold

造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，也可以说它是一切血细胞的原始细胞。造血干细胞移植技术已得到全世界的认可，并成为根治白血病等疾病的主要手段，为人类战胜疾病带来新的希望。造血干细胞体外扩增具有重要的临床和高端科研意义，造血干细胞体外扩增培养可以保证有足够多的细胞数量供于患者造血干细胞移植，同时也是一项极具挑战的技术。

1 造血干细胞

造血干细胞的来源主要包括骨髓、外周血和脐带血。骨髓中造血干细胞含量高，但从骨髓中获取造血干细胞需要通过骨髓穿刺技术，对供者的伤害较大。经过 G-CSF 动员后的外周血造血干细胞比例增加，成为现在临床上造血干细胞移植最重要的来源[1]。脐带血造血干细胞含量丰富，且异体排斥反应小，免疫原性低，再生能力强，但其总体体积小，仅适用体重较轻的儿童患者，很难满足对于成人造血干细胞移植的需要[2]。因此，科学家在体外有效扩增造血干细胞方面做了很大努力。

造血干细胞具有2个重要的特征：高度的自我更新或自我复制能力，是一种多能干细胞[3]。造血干细胞移植可治疗恶性血液病，部分恶性肿瘤，部分遗传性疾病等75种致死性疾病[4]。

2 3D支架在造血干细胞体外扩增中的应用

研究表明3D培养对于提高干细胞的体外扩增倍数，延长体外培养时间和维持的自我更新能力有显著效果。3D支架培养能很好的模拟造血干细胞微环境的三维组织结构。细胞在支架上的生长、移植和内生长率直接依赖于支架的多孔结构、孔隙率、孔的直径和孔的形状。目前，三维培养支架材料有天然材料和合成材料两大类。

2.1 天然材料支架

天然支架材料主要有胶原蛋白、透明质酸类等ECM成分。ECM成分在细胞的粘附、存活、增殖、分化及干性维持中发挥着重要的作用。天然的ECM主要是从组织脱细胞提取或者培养细胞合成分泌获得。

胶原蛋白支架： Isabelle Leisten等[5]以8份体积的酸性胶原和1份体积的10×DMEM培养基混合后，以2M NaOH中和溶液；再分别加入1份体积的间充质干细胞培养基或含间充质干细胞的培养基，所得悬浮液转移至24孔板内，在37℃条件下孵育1h，获得无细胞或含间充质干细胞的胶原凝胶，造血干细胞单一培养、骨髓间充质干细胞或脐血间充质干细胞共培养。在细胞培养过程中，除了使用传统的液体培养体系，还采用了2种3D龛模型对比，龛I为造血干细胞悬浮于胶原凝胶上方；龛II为造血干细胞迁移至胶原酶I消化处理的胶原凝胶内。龛I条件下细胞增殖，且含造血干细胞（CD34+/CD38-）、老化髓细胞（CD38+、CD13+、CAE+）和NK细胞（CD56+）等多种细胞，龛II条件下造血干细胞有较高水平的原始CD34+/CD38-表型和髓系分化（CD13+、CAE+），类似于骨髓龛的骨内膜部位，而脐血间充质干细胞共培养体系不适于造血干细胞扩增。所以说，胶原蛋白和骨髓间充质干细胞的基质支持体系可有效成功地扩增造血干细胞，为研究造血作用的机制如增殖、分化、凋亡和间质改变提供了良好的模型，也可以作为血液疾病的药物筛选平台。

透明质酸水凝胶支架： 透明质酸水凝胶由透明质酸和ADH交联物长链和EDCI组成，制备方法为：透明质酸和ADH交联物溶解于去离子水中，PH调至4.6，加入碳二亚胺试剂（EDCI）水溶液，轻轻搅动2h形成凝胶；以0.1N NaCl盐析2天形成透明质酸水凝胶，再分别置于25%乙醇溶液和去离子水内放置2天去除未反应的ADH和EDCI；制备的凝胶于冻干器内冻干，冻干品于-20℃保存，使用前加热灭菌处理。透明质酸水凝胶支架可在不添加额外细胞因子的条件下培养和扩增造血干细胞，体外扩增28天的克隆形成率为传统培养法的280倍。以Pronectin F Plus？R包被和非包被的透明质酸水凝胶支架对造血干细胞扩增无明显差别[6]。

纤维蛋白支架： Ferreira MS等[7]在无菌条件下，混凝血酶、人凝血蛋白原自制悬浮液（由纤维蛋白原、CaCl2、GBSH5缓冲液组成），于37℃条件下聚合反应20min，得到所需的3D纤维蛋白支架。该支架孔径2-50μm，纤维直径0.3μm，支架直径6500μm，高2000μm，细胞生长体积为67mm3。支架无菌处理后置于96孔板中，接种脐血间充质干细胞和造血干细胞的重悬液。与3D PLGA meshes、3D InsertTM-PCL和3D OptiMaixTM-collagen 三种支架相比，新制备的3D纤维蛋白支架培养体系细胞增殖最高，培养14天的总有核细胞扩增了5×108倍，培养7天的CD34+细胞扩增了3×107倍；分裂细胞原始免疫表型更高；形态学、迁移和黏附性能更优；骨髓、脾脏和血液长期移植的NSG小鼠体内实验中也表现出最强的移植和多向分化能力。因此，该支架为脐血扩增和移植临床应用的最佳选择。

细胞制备的无细胞支架： MS-5细胞以去离子水孵育2～3min使细胞贴壁状态松弛，0.02M NH4OH室温孵育1～2min促进细胞裂解。基质干燥过夜，储存于PBS液中，4℃保存，得到所需生物支架[8]，成功用于脐血造血干细胞的扩增。

藻酸盐支架：袁燕等[9]将脐血单核细胞重悬于1.1%藻酸盐或1.1%藻酸盐-0.1%明胶溶液，混匀后通过27-g针头逐滴加入100mM氯化钙溶液中，旋转6～10min使形成的固态微球硬化成型；然后转移至培养皿中即为三维静止培养体系。该体系能在降低生长因子用量的同时有效地提高脐血造血干细胞的扩增效率和CD34+ 比例。

2.2 合成支架

近年来，多种合成可降解聚合物如聚乙二醇（PEG）、聚二甲硅氧烷（PDMS）、聚己酸内酯（PCL）和聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）等在组织工程领域被广泛应用，它们有良好的生物相容性、机械性能可控以及便于加工等优点。

PEG支架： Raic A等[10]通过盐析技术制备PEGDA水凝胶，NaCl晶体为致孔剂。333mg PEG-DA溶解在1mL饱和NaCl溶液中，加入终浓度为20μMRGDSK-PEG-丙烯酸盐，黑暗条件下130rpm旋转30mim；200mg PEGDA前驱溶液和800mg 40～100μm大小的NaCl晶体混合转移至一个48孔板的孔中，加入APS、TEMED，迅速混合得到聚合胶状物；切成2mm大小的胶块，再以去离子水溶解致孔物NaCl；当用于细胞培养时，胶块置于乙醇内，在-20℃条件下放置2天，随后冻干；冻干胶紫外灭菌处理后加入细胞悬液和培养基。制备的3D支架与间充质细胞、成骨细胞样细胞作为骨髓微环境成分共培养，比传统2D培养更能保持造血干/祖细胞的多能性。

PEG/PCL支架： Jung YJ等[11]也以盐析原理制备了PEG/PCL水凝胶支架，但没有选择APS和TEMED作为引发剂，而是用AIBN于70℃、12h条件下促进自由基交联反应；该支架可维持造血干细胞的自我更新和造血系统重塑能力，造血干细胞在PEG/PCL为6/14的水凝胶支架条件下生长状态最好。

2.3 复合型材料支架

在实际细胞培养应用中，多采用几种生物材料复合应用，以弥补单一成分的不足，增强多方优点，更好的模拟ECM结构，满足不同的需要。

纤连蛋白包被的PCL支架： PCL支架以50μg/ml的纤连蛋白在4℃包被24h，培养的脐血造血干细胞总细胞数目和CD34+细胞数分别增加了58倍和40倍，而2D培养仅为38倍和2.66倍[12]。

胶原蛋白1包被的PDMS支架：生物相容性材料PDMS被设计成含200μm直径微孔，旋转包被胶原蛋白1，以模拟骨髓微环境。将纯化的CD133+细胞接种于微孔中，并添加细胞因子TPO、FL、SCF体外培养，同时，为了对比，另取细胞接种于24孔板中体外培养，其它条件相同，其3D支架培养的细胞比2D培养有更高的扩增倍数和较低的分化率[13]。

3 3D支架应用过程中需要考虑的问题

不同培养体系培养的细胞最佳临床应用可能存在差异。例如，胶原-磷酸钙粘合支架培养的脐血造血干细胞矿化作用更多，有更多的成骨表达，有希望用于骨科和颅面整形术[14]。以盐析方法制备的PCL支架包被鼠尾胶原蛋白I，在存在角质细胞和成纤维细胞的条件下培养的脐血造血干细胞倾向于T细胞分化和原始淋巴结形成，有希望用于先天性造血和免疫功能失调的患者[15]。

与传统的2D细胞培养法相比，采用3D支架体系培养方法可以更有效的扩增造血干细胞。但是若要收集细胞则需要更多的步骤处理，如胰酶消化，这可能会损伤及减少细胞数目。Madlambayan等[16]设计了一个静态生物加工模式，包含两个用磁性装置分开透气的培养袋，用以除去不需要的细胞。用该方法培养的总细胞数、CD34+、CFU和LTC-IC细胞扩增倍数分别达到了24.6±3.6、30.8±7.2、31.3±5.8和32.6 ±7.5倍。

4 小结与展望

随着细胞因子、蛋白和小分子药物激动剂的鉴定及3D培养技术的迅速发展，造血干细胞的体外扩增技术已经趋近成熟。体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。目前，干细胞研究蓬勃发展，再生医学科学方兴未艾，组织工程学研究和应用也已凸显出广阔的应用前景和巨大的市场空间。在造血干细胞治疗和干细胞组织工程领域，模拟体内微环境进行造血干细胞体外扩增可以保证造血干细胞状态稳定，增殖量大，是该领域走向产业化的必然趋势。

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