兔骨髓间充质干细胞在HA/CS支架中的增殖活性

[摘要]目的：研究骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在羟基磷灰石（ha）/壳聚糖（cs）复合支架材料中的生长和增殖情况，探讨复合材料与细胞的相容性。方法：穿刺法抽取新西兰大耳白兔骨髓3ml，通过密度梯度离心法获取MSCs，体外贴壁培养，倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。将第2代细胞以高密度接种到支架材料中体外三维培养，观察其细胞相容性。结果：经密度梯度离心结合贴壁筛选得到纯化的间充质干细胞， 细胞能够连续传至9代以上，第2、5代细胞增殖能力最强。细胞进行体外三维培养时，可在HA/CS复合支架材料上良好的附着、生长和增殖。结论：兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养， HA/CS复合支架与MSCs具有良好的细胞相容性。

[关键词]骨髓间充质干细胞；体外培养；HA/CS支架

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）03-0213-04

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有多向分化潜能的干细胞，其在特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌键细胞等多种细胞分化，是一种重要的组织工程种子细胞[1]。但骨髓中MSC的含量极低，仅占单个核细胞的0.001%～0.01%[2]。在体外培养条件下对其进行分离、纯化和扩增是MSCs研究和应用的前提条件。本实验采用贴壁筛选的方法从骨髓中分离MSCs并对其纯化，对其在整个生命周期的形态、传代、增殖状态进行研究，探讨体外分离培养MSCs的生长规律，为大规模地获得生物学性状良好的骨髓MSC应用于骨和软骨损伤的临床应用奠定基础。同时研究三维培养条件下，羟基磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）复合支架材料对骨髓间充质细胞粘附、生长、增殖等功能的影响，寻找适宜的干细胞载体，作为移植修复组织缺损的供体材料。

1 材料和方法

1.1 实验材料：新西兰纯种大耳白兔一只，2月龄，体重2.0～2.5kg， HA支架从四川大学生物材料中心购买，CS粉由上海其胜生物公司购买， 人淋巴细胞分离液，PBS（中山金桥公司），肝素，DMEM低糖培养液（Gibco），小牛血清（中国军事科学院），胰蛋白酶（Sigma）， EDTA（Sigma）， 超净工作台（苏州净化仪器公司），CO2孵育箱（美国NAPCO），倒置显微镜（尼康）。

1.2 MSC的取材、培养

1.2.1 取材：用麻醉剂速眠新注射液肌肉注射动物（0.3ml/kg），将兔麻醉后，侧卧手术台上，于后股骨下段处剪毛备皮，体积分数0.01活力碘消毒，铺无菌洞巾， 12号骨髓穿刺针接10ml注射器，穿刺进入骨髓腔，含稀释（500U/L）的肝素钠湿润针管后，抽取骨髓液约2～4.0ml，注入无菌离心管中。

1.2.2 将抽取的骨髓等体积加入人淋巴细胞分离液离心10min，分3层，去掉上清，再次PBS漂洗混匀离心，去掉上清除去脂肪等，取中间灰白色絮状层 （此层为所要的细胞层）。按5×l05cells/ml的密度接种接于25cm2培养瓶中。培养液为含10%胎牛血清（FBS）、L-DMEN培养基。在5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中进行培养。第2天换半液，第4、7天换全液，换液时将原来的培养液直接吸出，用培养液洗涤2次以去除悬浮细胞，加入新的培养体系继续培养。每3～4天换液一次并观察其生长状态。待贴壁细胞的密度达到80%～90%时，进行传代培养。

1.2.3 传代：细胞生长达到近融合状态后，吸除培养液，少量PBS洗涤一次，加入1ml的消化液（含0.02% EDTA及0.25%胰蛋白酶），放入细胞培养箱内5min后，低倍镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，加入适量的含血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以5×103/cm2细胞密度接种于新的培养瓶内，继续在相同的条件下培养。隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后又可达到近融合状态。

1.2.4 生长曲线：分别取第2、5、8代的MSC，用胰蛋白酶消化后加入L-DMEM 完全培养液，调整细胞密度至2.0×104/L，接种于3个24孔培养板中，培养板上作相应标记，每孔细胞悬液1.0ml 。每天每板取3孔消化，形成细胞悬液，混匀，对细胞计数并计算均值，连续9天。然后以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3 MSCs一生物材料复合物的形成与体外培养

1.3.1 支架材料的准备：采用冻干法制备双层HA/CS复合支架，称取CS 0.3g溶于0.2mol/L的醋酸10ml配成浓度为3%（w/v） 壳聚糖溶液，同是加入分子量1000聚乙二醇1g，放入温水中以溶解腊状聚乙二醇，离心去除气泡。将4×1mm HA放入4×4mm的模具中，取配好的壳聚糖溶液，倒入模具中，注意让壳聚糖溶液停留在HA支架上1min，放入冰箱-20℃冷冻10h，在冷冻抽干机中冻干24h，制成羟基磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）支架，将冻干的羟基磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）支架放入0.1mol/LNaOH中，中和支架内的醋酸溶液，反复PBS液冲洗，至PH值中性。

将HA/CS复合生物材料置75%酒精浸泡2h后，紫外线消毒1/2h，PBS缓冲液冲洗数次，无血清的DMEM培养液浸泡24h过夜，吸干培养液，准备接种。

1.3.2 细胞悬液的准备：选择一瓶第2代近融合的细胞，消化后，收集细胞悬液，离心，计数，一般回植的细胞浓度要求达到1.0×106个/ml。

1.3.3 接种：将支架材料中的培养液完全吸干，支架材料回缩，取离心后的细胞悬液0.5m1，用微量加样器或滴管将其加到支架材料上，使细胞悬液均匀地浸于生物支架材料上，移至6孔板中，细胞一材料复合物于37℃，5%CO2，100%饱和湿度的条件下培养4～5h后加入相应的培养液继续培养。（高浓度悬液，4～6h后开始贴壁，加培养液防止细胞营养不够而死亡）。

1.3.4 体外观察与培养：培养物隔日换液，以倒置显微镜观察MSCs的基质分泌及其与HA/CS的粘附情况。

2 结果

2.1 原代细胞培养：原代细胞多呈圆形或椭圆形，第1次换液后可见大部分呈梭性的贴壁细胞，细胞形态变长；以后拉长的细胞增多，逐渐以梭形细胞为主，部分呈三角形；第 7天时可观察到数十个细胞聚集生长组成的集落（见图1）；集落逐渐增多，集落中细胞数量亦增多，细胞为成纤维样细胞；10～12天后集落相互融合，形成致密贴壁层，细胞呈草束状排列（见图2）。

2.2传代细胞：随传代次数增加，MSC的增殖能力开始减弱，细胞向多角形发展，生长速度降低；8代以后细胞胞体增大，生长速度明显减慢，细胞形态变为扁平，呈现老化现象（见图3）。其中第2、5代细胞增殖能力最强，第8代细胞与第2、5代细胞比较增殖能力明显减弱。

2.3 生长曲线：3代细胞生长曲线都呈S形，传代后的1～2天细胞进入生长滞缓期，细胞增殖数量不多，主要为MSCs的贴壁生长阶段，培养细胞的有丝分裂活动不太活跃；从第3日开始细胞增殖加速，相差显微镜下可以观察到贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，第3～7日这些细胞克隆进一步扩大，许多细胞克隆彼此相连，细胞显示呈对数增长，为对数增长期；7～8天后增殖速度逐渐减慢进入平台期，细胞数目基本不再增多（见图4）。

2.4 高密度细胞悬液刚注入HA/CS复合支架材料时，在其边缘仅能看到少量圆形未贴壁的悬浮细胞，5天后可见其边缘细胞数量增多，且部分细胞形态变为梭形，小部分细胞仍呈圆形；随着培养时间的延长，支架上的细胞数量逐渐增加，但明显慢于二维培养的细胞增殖速度，增殖细胞聚集呈簇状。14天后观察可见大量细胞从支架材料中爬行出来，呈网状排列，在支架材料的周围可见大量梭形细胞生长状态良好（见图5、6），表明间充质干细胞能在支架材料上良好地附着、生长和增殖。

3 讨论

骨髓间充质干细胞是骨髓中一些未充分分化的类中胚层细胞，与骨、软骨、脂肪等组织具有起源上的相关性，在一定条件下，有很强向这些组织分化的潜能[3]，因此间充质干细胞在组织工程、细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。间充质干细胞可来源于骨髓、脂肪、肌肉和滑膜等组织，其中，骨髓间充质干细胞可从骨髓穿刺获取，操作容易，损伤少，是目前研究得最多，也是最有可能应用于临床的间充质干细胞。骨髓间充质干细胞能在多种三维支架上粘附、生长、增殖和分化，并复合三维支架材料移植修复组织缺损[4-5]。

可生物降解和组织相容性的三维支架材料是组织工程学研究的重要内容之一。人工合成支架（如PLA、PGA），尽管被证明支持细胞粘附、增殖、分化等优点，但也存在缺乏识别信号，亲水性性差，对细胞吸附能力弱，生物降解慢，引起纤维变性和免疫反应。天然材料最突出优点是无抗原性，生物相容性好，具有细胞识别信号，有利于细胞粘附、增殖和分化，与细胞外基质结构相似，但也存在许多缺点，如机械强度不足、降解速度快以及大规模生产的限制等。

目前，国外和国内软骨组织工程支架的研究趋向于多种材料复合支架。通过调整支架材料的比例，使得复合支架更适于软骨细胞的粘附、增殖、分化和维持表型。本研究中应用的壳聚糖具有良好的生物降解性和生物相容性，是海洋无脊椎动物外壳上的甲壳素脱乙酞基后的产物，来源广泛，取材料方便，其化学结构为（1，4）-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，其降解产物在体内不积聚，无毒，无刺激，无免疫原性，无热原性、无致畸和致突变效应[6]，广泛用于生物医用领域。而羟基磷灰石则可提高支架的力学强度，从而克服天然支架材料普遍存在力学强度不够的问题。实验中让壳聚糖溶液停留在HA支架上1min，放入冰箱-20℃冷冻10h，在冷冻抽干机中冻干24h，制成羟基磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）支架，将冻干的羟基磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）支架放入0.1mol/LNaOH中，中和支架内的醋酸溶液，反复PBS液冲洗，至PH值中性，可制成适宜于细胞载体的复合材料支架。再将细胞置于复合支架内三维培养14天，结果发现，细胞能在支架材料上良好的附着、生长和增殖。这表明骨髓间充质干细胞与HA/CS复合支架有良好的细胞相容性，可作为骨髓间充质干细胞的良好载体。

[参考文献]

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[收稿日期]2011-02-23 [修回日期]2014-01-10