高效液相色谱法同时测定元胡止痛片中欧前胡素\延胡索乙素与异欧前胡素的含量

[摘要] 目的:建立元胡止痛片中欧前胡素、延胡索乙素与异欧前胡素的HPLC含量测定方法。方法:采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.5)(61∶39);检测波长:280 nm;流速:1.0 ml/min。结果:欧前胡素在0.047 4～0.284 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9);延胡索乙素在0.020 5～0.123 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 8),异欧前胡素在0.075 0～0.450 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=1.000 0),平均回收率分别为98.6%、97.5%、96.8%。结论:本方法简便、准确、重现性好,可用于元胡止痛片的质量控制。

[关键词] 高效液相法;元胡止痛片;欧前胡素;延胡索乙素;异欧前胡素;含量测定

[中图分类号] R927.2[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)01(a)-058-03

Content determination of Imperatorin, Tetrahydropalmatine and Isoimperatorin in Yuanhu Zhitong Tablets by HPLC

WANG Yunlong1*, CHEN Xiaohui1, XU Shiwei2, SHAO Limei2, LI Yanxue2

(1.School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2.Jixi Institute for Drug Control, Jixi 158100, China)

[Abstract] Objective: To establish a method for the content determination of imperatorin, tetrahydropalmatine and isoimperatorin in Yuanhu Zhitong Tablets by HPLC. Methods: The Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm) column was used. The mobile phases consisted of methanol and phosphatic liquor Solution(triethylamine ajusted to pH=6.5) (61∶39), the flow rate was 1.0 ml/min and the detection wavelength was at 280 nm. Results: The linear ranges of imperatorin was at 0.047 4-0.284 4 μg (r=0.999 9), the linear ranges of tetrahydropalmatine was at 0.020 5-0.123 0 μg (r=0.999 8), the linear ranges of isoimperatorin was at 0.075 0-0.450 0 μg (r=1.000 0), the average recoveries were 98.6%, 97.5% and 96.8%, respectively. Conclusion: The method is fast, reliable, accurate and can be used in the quality control of Yuanhu Zhitong Tablets.

[Key words] HPLC; Yuanhu Zhitong Tablets; Imperatorin; Tetrahydropalmatine; Isoimperatorin; Content determination

元胡止痛片为《中国药典》2005年版一部品种,由延胡索(醋制)与白芷两味中药组成,具有理气、活血、止痛的功效。欧前胡素、延胡索乙素、异欧前胡素均是元胡止痛片中的有效成分。目前,现版药典[1]仅对其中的延胡索乙素进行了质量控制,文献报道[2-4]的大多是对其一种或两种成分进行含量测定,同时测定元胡止痛片中欧前胡素、延胡索乙素、异欧前胡素的含量的方法未见报道。本文采用高效液相色谱法同时测定元胡止痛片中欧前胡素、延胡索乙素与异欧前胡素的含量,方法简便、快速、专属性强、分离度高,可作为元胡止痛片的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HP1100高效液相色谱仪(四元泵、紫外检测器、自动进样器、柱温箱、HP Chemstation色谱工作站);Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱;AG285电子分析天平。

1.2 试药

延胡索对照品、欧前胡素对照品和异欧前胡素对照品均由中国药品生物制品检定所提供;水为双重蒸馏水,甲醇为色谱纯;元胡止痛片由四川蜀中制药有限公司提供。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.5)(61∶39);检测波长:280 nm;流速:1.0 ml/min。柱温:35℃;进样量:10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取欧前胡素、延胡索乙素和异欧前胡素4.74、2.05、7.50 mg,置100 ml量瓶中,加甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度,摇匀,作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取元胡止痛片20片,除去糖衣,精密称定,研细,取约10片重,精密称定,置100 ml锥形瓶中,精密加入加浓氨试液-甲醇溶液(1∶20)50 ml,称定重量,冷浸1 h,加热回流1 h,放冷,称定重量,用浓氨试液-甲醇溶液(1∶20)补足减失的重量,摇匀,经0.45 μm的微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品溶液。

2.4 系统适用性试验

分别取欧前胡素、延胡索乙素和异欧前胡素混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶液,按上述色谱条件进行试验,考察系统适用性。HPLC色谱图见图1。

(A.对照品;B.供试品;C.空白;1:欧前胡素;2:延胡索乙素;3:异欧前胡素)

Fig.1 HPLC chromatography

(A.Reference substance; B.Sample; C.Black; 1:Imperatorin; 2:Tetrahydropalmatine; 3:Isoimperatorin)

2.5 线性关系考察

分别精密量取“2.2”项下欧前胡素、延胡索乙素和异欧前胡素混合对照品溶液3、5、7、9、11、13 μl,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定色谱峰面积,以对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,计算回归方程,结果表明欧前胡素在0.047 4～0.284 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=3×106X+1.22×104(r=0.999 9);延胡索乙素在0.020 5～0.123 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=4×106X+1.46×104(r=0.999 8);异欧前胡素在0.075 0～0.450 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=2×106X-1.48×104(r=1.000 0)。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2”项下对照品溶液10 μl,重复进样5次,按上述色谱条件测定色谱峰面积,欧前胡素的RSD=1.5%,延胡索乙素的RSD=0.3%,异欧前胡素的RSD=1.8%,结果表明本法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液,分别于放置0、2、4、6、8 h后,注入液相色谱仪,测定色谱峰面积,欧前胡素的RSD=0.4%,延胡索乙素的RSD=1.3%,异欧前胡素的RSD=0.8%,结果表明供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

取同一批样品,按“2.3”项下方法制备5份供试品溶液,在上述色谱条件下分别测定色谱峰面积,欧前胡素的RSD=1.6%,延胡索乙素的RSD=1.9%,异欧前胡素的RSD=2.1%,结果表明本法重复性良好。

2.9 回收率试验

取已知含量的样品5份,每份20片,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别精密量取5 ml置5个25 ml量瓶中,分别精密加入上述混合对照品溶液5 ml,在上述色谱条件下测定,进样量20 μl,计算回收率,欧前胡素的平均回收率为98.6%,RSD=0.7%;延胡索乙素的平均回收率为97.5%,RSD=0.2%;异欧前胡素的平均回收率为96.8%,RSD=1.1%,结果见表1。

表 1 回收率试验结果(n=5)

Tab.1 Results ofrecovery test (n=5)

2.10 样品测定

取5批样品,照“2.3”项下方法制备供试品溶液,精密量取供试品溶液10 μl注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积按外标法计算相应元胡止痛片中欧前胡素、延胡索乙素和异欧前胡素的含量,结果见表2。

表 2 样品含量测定结果(%,n=5)

Tab.2 Content determination results of samples (%, n=5)

4 讨论

4.1 提取方法选择

本研究比较了超声提取法与回流提取法对欧前胡素与异欧前胡素提出率的影响[5-6],回流提取法延胡索乙素含量高于超声提取法延胡索乙素含量,欧前胡素与异欧前胡素含量无明显差异,故采用回流提取法。

4.2色谱条件的选择

对流动相甲醇与水的比例进行了考察,结果表明当甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.5)(80∶20)、甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.5)(70∶30)时,延胡索乙素、欧前胡素与异欧前胡素与其他组分分离效果不好,甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.5)(50∶50)洗脱时间较长,甲醇-0.1%磷酸溶液(三乙胺调pH值至6.5)(61∶39)延胡索乙素、欧前胡素与异欧前胡素与其他组分分离效果良好,保留时间适宜,故选择作为流动相,柱温分别考察了25℃、30℃、35℃,结果表明35℃时柱压较小,分离效果好。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2005:363.

[2]陈洪宝,李彩荣,杨庆胜,等.高效液相色谱法测定元胡止痛片中延胡索乙素的含量[J].时珍国医国药,2006,(9):1701-1702.

[3]孙巍,窦志英,高璎.HPLC法同时测定元胡止痛片中3种有效成分的含量[J].天津中医药,2006,23(5):426-428.

[4]王洪志,李惠芬,周静,等.HPLC法测定元胡止痛片中欧前胡素和异欧前胡素[J].中草药,2007,38(7):1018-1019.

[5]周岐勋,李健和,徐幸民.高效液相色谱法测定盐酸甲氯芬酯分散片含量及有关物质[J].中国当代医药,2009,16(4):73-76.

[6]关强,王云龙,杜遵义.高效液相色谱法测定延胡索药材中延胡索乙素的含量[J].中国当代医药,2009,16(4):78-79.

(收稿日期:2009-08-18)