高效液相色谱法测定氯霉素泡腾片中氯霉素含量

[摘要] 目的 建立氯霉素泡腾片中氯霉素含量测定的高效液相色谱方法。 方法 采用高效液相色谱法，其中色谱柱为Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.01mol/L庚烷磺酸钠缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8 g，用0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解并稀释至1000 mL，再加三乙胺5 mL，混匀，用磷酸调pH值至2.5）-乙腈为70∶30；柱温为室温；检测波长为274 nm。 结果 氯霉素在20.7～72.6 μg/mL范围内线性关系良好，平均回收率为100.10%，RSD值为0.93%。 结论 本法操作简便，专属性好，精密度高，可作为氯霉素泡腾片的含量测定方法。

[关键词] 氯霉素；高效液相色谱法；含量测定

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）07（a）-0093-03

氯霉素泡腾片为《中国人民医疗机构制剂规范》中收载的外用制剂，属于抗生素类药物，临床上主要用于阴道炎及宫颈糜烂。本品现行质量标准为《中国人民医疗机构制剂规范》[1]，该标准规定本品每片含氯霉素（C11H12Cl2N2O5）应为标示量的85.0%～115.0%，含量测定采用紫外分光光度法。《中国药典》2010年版颁布后，氯霉素原料药的含量测定方法采用高效液相色谱法，为提高氯霉素泡腾片的质量标准，有效控制产品质量，本研究参考《中国药典》2010年版及文献方法[2-4]，拟建立高效液相色谱法测定氯霉素泡腾片中氯霉素的含量。研究结果表明本方法操作简便，专属性好，精密度高，可作为氯霉素泡腾片的含量测定方法。

1 仪器与试药

Agilent1100高效液相色谱仪；BT25S电子天平（赛多利斯）；UNICO-2102C型紫外分光光度计（上海UNICO仪器有限公司）；PHS-3E型pH计（上海雷磁）。

甲醇、乙腈为色谱纯（上海星可高纯溶剂有限公司）；庚烷磺酸钠为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；三乙胺、磷酸二氢钾为分析纯（北京化工厂）。氯霉素（中国食品药品检定研究院，批号：130555-201203）；氯霉素二醇物（中国药品生物制品检定所，批号：130436-200704）；对硝基苯甲醛（中国药品生物制品检定所，批号：130562-200902）；氯霉素泡腾片（总医院第一附属医院自制，批号130903、130904、130905）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.01 mol/L庚烷磺酸钠缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8 g，用0.01 mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解并稀释至1000 mL，再加三乙胺5 mL，混匀，用磷酸调pH值至2.5）-乙腈（70∶30）；柱温：室温；检测波长：274 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 氯霉素二醇物对照品溶液的制备 精密称定氯霉素二醇物对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为氯霉素二醇物对照品溶液。

2.2.2 对硝基苯甲醛对照品溶液的制备 精密称定对硝基苯甲醛对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对硝基苯甲醛对照品溶液。

2.2.3 氯霉素对照品溶液的制备 精密称定氯霉素对照品12.5 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为氯霉素对照品溶液。

2.2.4系统适用性溶液的制备 分别精密量取氯霉素二醇物对照品，对硝基苯甲醛对照品及氯霉素对照品的母液各1 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀既得。

2.2.5 阴性溶液的制备 按处方比例称取混合辅料550 mg，加50%甲醇适量，搅拌溶解，转移至25 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，精密量取续滤液1 mL置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为阴性溶液。

2.2.6 样品溶液的制备 取本品适量（约相当于氯霉素2.5 mg），置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液体作为样品溶液。

2.3 系统适应性试验

精密量取氯霉素二醇物对照品溶液、对硝基苯甲醛对照品溶液、氯霉素对照品溶液、系统适用性溶液、辅料溶液及样品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定，在此色谱条件下辅料无干扰，氯霉素二醇物、对硝基苯甲醛和氯霉素分离度均大于2.0，系统适用性良好。见图1。

2.4 线性关系考察

精密称取氯霉素对照品10.39 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性储备液；分别精密量取1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为线性供试液。分别精密量取上述供试液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度C（μg/mL）为横坐标，以峰面积A为纵坐标进行线性回归，计算回归方程为A=16.35C+8.987（r = 0.9995，n = 6）。结果表明，氯霉素在20.7～72.6 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取“2.2.3”项下的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测定峰面积平均值为851.28，RSD为0.03%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一批号（批号：130903）样品，分别按照“2.2.6”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，重复测定6份样品，结果样品含量测定RSD是0.41%（n = 6），重复性较好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.3”项下的对照品溶液，分别放置0、8、12、24、48 h后，按“2.1”项下色谱条件测定，结果室温下氯霉素泡腾片主峰面积48 h内基本不变，RSD值为0.15%，满足测定要求。

2.8 回收率试验

分别精密称取对照品适量（相当于氯霉素40、50、60 mg），置100 mL的量瓶中，按处方比例加入辅料，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1 mL溶液，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，分别制得浓度为80%、100%、120%的供试品溶液。取供试品溶液按“2.1”项下色谱条件测定各水平的回收率。结果平均回收率为100.10%，RSD值为0.93%，符合含量测定要求。见表1。

2.9 样品含量测定

取3批样品（批号：130903、130904、130905）按照“2.2.6”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果氯霉素的含量均值分别为101.40%、101.54%、100.67%，符合规定。见表2。

3 讨论

原含量测定标准采用紫外分光光度法，氯霉素二醇物在检测波长处有较强吸收，干扰氯霉素的含量测定；按照《中国药典》2010年版中氯霉素的含量测定方法检测，杂质对硝基苯甲醛的出峰时间较晚，因此选择提高有机相的比例来获得良好的检测效率，同时氯霉素色谱峰与杂质峰良好分离[5-6]。

由于氯霉素泡腾片含有崩解剂等药用辅料，考虑辅料对氯霉素含量测定的干扰，参考《中国药典》2010年版二部氯霉素原料药的检测波长（277 nm），本试验分别制备氯霉素溶液和空白辅料溶液在190～500 nm扫描紫外吸收光谱，结果氯霉素在274 nm处有最大吸收，空白辅料在231 nm处有最大吸收，而在274 nm处基本没有吸收，所以本法选择274 nm作为检测波长。

本文参考氯霉素片质量标准[7]1029-1030和文献方法[8-10]，对流动相进行优选，确定适合的流动相并依据《药品质量分析方法验证指导原则》[7]附录194-195对本方法进行验证，结果表明本方法操作简便，专属性好，精密度高，可作为氯霉素泡腾片的含量测定方法。

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（收稿日期：2014-03-31 本文编辑：卫 轲）