妊娠晚期抗病毒免疫阻断治疗新生儿血清研究论文

【关键词】宫内感染InfluenceonserumhepatitisBvirustranscriptsinnewbornsbyHBIGimmunoblockingtherapyduringthelaterstageofpregnancy【Abstract】AIM:ToinvestigatethesignificanceofviraltranscriptsinearlystagediagnosisofHBVverticaltransmission,andtoobservetheinfluenceofHBIGimmunoblockingtherapyonserumHBVRNAinnewbornsfromHBVcarriermothers.METHODS:FortysixHBsAgpositivepregnantwomenweretreatedwithantiHBVimmunotherapy(HBIG200IU/4weeksandLimidazolewasappliedasliniment10mg/week)since26weekpregnancy.Theother23weretakenascontrolswithoutanyantiHBVtherapy.Viralnucleicacidswereextractedfromseraofmothersbeforetherapyandfromseraofnewborns.HBVDNAandRNAs,includingthefulllengthandtruncatedRNAmolecules,wereamplifiedrespectivelythroughPCRandRTPCRtargetedtotheHBVXproteinencodingregion.RESULTS:SerumHBVDNAinnewbornswasonlyfoundwhentheirmothershadnotbeentreated.CirculatingviralRNAwasdetectedinmorethanhalfofthenewbornsirrespectiveoftreatmentofmothers.However,inthenewbornsoftreatedmothers,serumRNAwasuniformlyofthetruncatedtype.CONCLUSION:ApplicationofserumHBVRNAisgreatlyhelpfultothediagnosisofearlystageinfectionofnewbornsfromHBVcarriermothers.TruncatedRNAistranscribedfromHBVtemplatesinthenewbornsratherthanbeingtransmittedfrommothertochild,immunoblockingtherapydoesnotinterferewithintrauterineinfection.However,itmayinterferewiththemanifestionofahighreplicativeinfection.【Keywords】hepatitisBvirus;transcript;verticaltransmission;intrauterineinfection;immunotherapy【摘要】目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）转录体在早期诊断HBV母婴传播中的意义，并观察母亲抗乙型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）免疫阻断治疗对新生儿血清HBV转录体的影响．方法：治疗组46例HBV表面抗原（HBsAg）阳性孕妇自孕26wk开始行抗HBV免疫治疗（HBIGim,200IU/4wk;同时使用左旋咪唑涂布剂10mg/wk）；另23例HBsAg）阳性孕妇做为对照组未给予任何抗病毒治疗.从孕妇治疗前血清及其新生儿血清中提取核酸，经PCR及RTPCR扩增HBVDNA，全长型RNA（fRNA）和顿挫型RNA（trRNA），琼脂糖凝胶电泳显示产物，Southern杂交进一步验证扩增产物.结果：HBVDNA阳性仅存在于未接受免疫治疗的母亲所生新生儿中；超过半数的新生儿血清中可检测到病毒转录体RNA，并与其母亲是否接受免疫阻断治疗无关.但是，治疗组母亲所生新生儿中仅可检测到顿挫型病毒转录体trRNA.结论：血清HBV转录体可早期诊断新生儿HBV感染的状态；新生儿血清中trRNA的转录模板可能为新生儿体内的病毒DNA;HBIG免疫阻断治疗不能阻断HBV宫内感染，但可以阻止高复制性感染的发生.【关键词】乙型肝炎病毒；转录体；母婴传播；宫内感染；免疫疗法0引言母婴传播是形成慢性HBV感染的重要原因.据估计我国的慢性HBV感染约有30%~50%是通过母婴传播发生的.对于未接受治疗的母亲来讲单独HBsAg阳性母亲的婴儿，约40%在半岁内出现HBsAg阳性的所谓“突破性感染”［1-3］.而HBsAg和HBeAg双阳性母亲的婴儿HBsAg阳性率高达90%以上［4］.这些婴儿多数转变为慢性HBV感染形成新的传染源，并成为发生肝细胞癌（HCC）的高危人群.由于大部分受感染的新生儿延迟出现诊断性的指标HBsAg和HBVDNA,再加上部分病毒抗原和抗体可以通过胎盘屏障进入胎儿体内，使得新生儿感染的早期诊断显得极为复杂和困难［1,5］.有研究表明，新生儿延迟出现的“突破性感染”发生在已有的隐匿型感染的基础上［1,6-7］.我们的研究表明，结合病毒转录体的检测可以更精确地诊断和区分复制期和非复制期（既隐匿型感染）等不同的感染阶段［8-11］.并且，我们前期的研究也显示，在慢性HBV感染母亲所生的新生儿中，HBV转录体是一个较早出现的病毒标志物［12］.本研究拟应用我们建立的血清HBVRNA检测方法，进一步分析血清病毒转录体在早期诊断新生儿感染状态中的意义，以及免疫治疗对它的影响.1材料和方法1.1材料1.1.1病例选择69例HBsAg阳性孕妇分为治疗组46例及未治疗组23例.69例孕妇孕期均无先兆流产史无急性或慢性肝炎病史症状及体征无肝功能受损情况.孕妇年龄孕产次胎龄均无明显差异.69例孕妇分娩新生儿69(男36，女33)例.1.1.2试剂高纯度核酸提取试剂盒、核糖体RNA(rRNA)、单管RT/PCR试剂盒、地高辛探针标记及原位杂交试剂盒均购自Roche公司(Mannheim,德国)，原位杂交试剂盒、DNase和RNase灭活的吸头购自Biolabs，HybondN尼龙膜购自Amersham，TaqDNA聚合酶、100bpDNAMarker及DNaseI均为Gibcol产品，DNase和RNase灭活的试管和离心管购自Eppendof公司.其他常用试剂和药品均为分析纯或电泳级.1.1.3引物和质粒PCR引物由上海生工合成.用于阳性对照的质粒为40A和41A［13］，均由德国癌症研究中心病毒与宿主相互关系分部制备.1.2方法1.2.169例HBsAg阳性孕妇治疗方法孕26wk开始，按来诊次序分为治疗组46例，孕26wk始孕妇臀大肌注射已型肝炎病毒免疫球蛋白（HBIG）（上海生物制品研究所生产批号为20000712)200IU/4wk，同时使用左旋咪唑涂布剂(福建省凯华药业有限公司生产批号为20000307500mg/支)5mL涂布于上下肢体内侧皮肤易吸收处2次/wk，3mo一疗程.未治疗组23例根据患者或其亲属的意见未给予上述任何主动或被动免疫防治措施，孕妇所生的新生儿的乙肝疫苗接种均按第0,1,6月进行.1.2.2血清分离和核酸提取孕妇26wk肘静脉采血2mL，新生儿分娩后24h内采股静脉血2mL.按照我们建立的方法［10］，于30min内应用低温离心（4000r/min，20min，4℃）分离血清.核酸的提取采用高纯度病毒核酸提取试剂盒，按照说明书操作，仅将其中的poly(A)RNA替换为rRNA作为载体RNA，以免与后面使用的oligod(T)引物结合而干扰HBV3′端的结构分析.200μL血清标本提取后可得到50μL的核酸提取物.1.2.3目的核酸扩增按我们建立的方法［10］，针对HBV基因X区血清核酸的PCR，RTPCR所用上游引物包括txs（1445）：5′GGACCGTGTGCACTTCGCTT3′，txs1（1454）：5′GCACTTCGCTTCACCTCTGC3′，txs2（1464）：5′TCACCTCTGCACGTCGCATG3′；下游引物包括：txas（1574）：5′CCTCAAGGTCGGTCGTTGAC3′，xas1（1668）：5′AATTTATGCCTACAGCCTCC3′，txas5（1683a）：5′(T)15GCTGG3′.扩增病毒DNA采用50μL反应体系，TagDNA聚合酶5U，引物为txs/txas，循环条件：93℃100s，90℃40s，58℃50s，70℃40s，35个循环，72℃15min.trRNA的RTPCR系统在逆转录后采用半巢式PCR，引物txas5分别与txs和txs2配对.trRNA扩增用的锚定oligod(T)引物与fRNA的末端1803~1806位置的结构也有一定的亲和力，故也同时检测fRNA［10］.20g/L琼脂糖凝胶电泳后观察结果.1.2.4地高辛标记探针的制备和原位杂交按我们建立的方法采用PCR法合成2种地高辛标记探针，用于区分fRNA和trR[1][2][3]NA［10］.在这些PCR反应中，Dig11dUTP部分取代了dTTP作为Taq多聚酶的底物.各种核苷的使用浓度为：200μmol/LdATP,dGTP,dCTP;180μmol/LdTTP和20μmol/LDIG11dUTP.地高辛标记探针的合成严格按照产品说明书进行（Roche,Cat.No.1093088）.作为分析血清RNA的PCR扩增产物，DIG11dU/dT的最佳比例为1∶10.地高辛标记探针的显影，采用一种碱性磷酸酶链接的抗地高辛抗体，当碱性磷酸酶与底物BCIP结合后，其产物可进一步与NBT反应，在膜上产生持久的蓝色或棕色的沉淀.2结果2.1母亲和新生儿血清中HBVDNA，fRNA(全长型)trRNA(顿挫型)的检测图1所示为4对治疗组母亲新生儿血清中相应的PCR和RTPCR扩增结果［10］.第1和第2对的母亲DNA，fRNA，trRNA和HBeAg阳性，第3对的母亲仅DNA和trRNA阳性，第4对的母亲仅trRNA阳性.而所有4名新生儿仅显示trRNA阳性.2.2治疗组与非治疗组母亲和新生儿血清病毒RNA和DNA检测结果表1总结了治疗组与非治疗组母亲和新生儿血清中HBVDNA，fRNA和trRNA检测结果.HBVDNA和fRNA等病毒复制的指标仅存在于非治疗组新生儿，而trRNA在治疗组与非治疗组新生儿中普遍存在.未治疗组新生儿HBVDNA和fRNA阳性率明显高于治疗组新生儿（P<0.01），而两组新生儿血清trRNA阳性率无显著性差异（P>0.05）.图中所示119bpPCR扩增产物为HBVXDNA，360bp和235bp分别为fRNA和trRNA扩增产物.m1n1到m4n4表示4对母亲/新生儿.cDNAf和cDNAtr：包含fcDNA和trcDNA的阳性对照质粒；符号“-”表示阴性对照；M：100bpDNA标志物.图14对母亲/新生儿血清中HBV核酸检测的代表性结果（略）表1HBsAg阳性母亲及其新生儿血清中HBV核酸的检测结果（略）2.3HBIG免疫阻断治疗对trRNA和fRNA的影响表2对比了仅仅trRNA阳性和fRNA与trRNA共同阳性新生儿的例数.未治疗23位母亲所生23名新生儿中，12名表现为仅trRNA阳性，而治疗组46位母亲所生新生儿全部表现为仅trRNA阳性（表2）.结果提示，单独trRNA阳性新生儿的出现与免疫治疗无关，免疫治疗导致新生儿fRNA消失，相应地trRNA单独阳性的例数增加.在HBsAg和HBeAg共同阳性母亲所生的新生儿中，免疫治疗导致新生儿单独trRNA阳性例数相对增加的作用表现得更加明显（表2）.未治疗母亲所生新生儿中，fRNA和trRNA共同阳性者占7/11，而在治疗组中则为0/14.3讨论本研究立足于应用血清HBVRNA和DNA区分新生儿的不同感染类型.既往研究表明，fRNA是一个病毒复制的标志物，而trRNA单独阳性提示无复制阶段的病毒基因表达［8,9,14］.先前基于肝组织和血清的研究提示，trRNA的来源与染色体整合的和游离的病毒DNA均有一定关系［14-15］.而新生儿的感染处于病毒感染的早期阶段，此时染色体整合的病毒DNA不占主导地位.因此更支持游离的病毒DNA为trRNA的转录模板.表2顿挫型RNA在全长型RNA阴性(tr)和阳性(ftr)母亲/新生儿血清中的表达（略）不难理解，新生儿的HBV感染是由于暴露于受感染母亲体内的病毒所导致的宫内感染.但是，这种感染不一定伴随高复制阶段.这可能是由于前基因组RNA缺乏反转录起始位点，原因可能为转录和转录体成熟的相关因素与肝脏的发育程度有关［16］.接受免疫阻断治疗的母亲所生新生儿普遍缺乏fRNA和病毒DNA(以及HBeAg)，但trRNA阳性较为普遍.这一方面反映了免疫阻断治疗可以有效预防新生儿的高复制性的感染.另一方面，治疗组与非治疗组新生儿trRNA阳性率无明显差异，提示病毒感染本身并没有被有效预防.如果新生儿血清trRNA是宫内感染的产物，我们推测病毒感染和表达的模式可能有两种：一种导致病毒的高复制，而另一种则检测不到病毒的复制.前者对免疫治疗敏感，而后者不敏感.但是，后者有可能会转变为高复制状态，这有助于解释部分新生儿在出生后1岁以内甚至更晚出现的“突破性感染”［1,3,17］.虽然本研究明确地显示了血清HBVtrRNA在新生儿HBV感染血清学诊断中的潜在意义，但在推广至临床应用之前，有必要进行包括动态追踪观察在内更大规模的研究.【参考文献】［1］WangZ,ZhangJ,YangH,etal.QuantitativeanalysisofHBVDNAlevelandHBeAgtiterinhepatitisBsurfaceantigenpositivemothersandtheirbabies:HBeAgpassagethroughtheplacentaandtherateofdecayinbabies［J］.JMedVirol,2003,71(3):360-366.［2］ZhuQ,YuG,YuH,etal.ArandomizedcontroltrialoninterruptionofHBVtransmissioninuterus［J］.ChinMedJ(Engl)，2003,116(5):685-687.［3］DentingerCM,McMahonBJ,ButlerJC,etal.PersistenceofantibodytohepatitisBandprotectionfromdiseaseamongAlaskanativesimmunizedatbirth［J］.PediatrInfectDisJ,2005,24:786-792.［4］朱启熔,吕晴,愈蕙,等.宫内感染HBV婴儿接种乙肝疫苗失败的机制和预后研究［J］.中华儿科杂志，1997,35(7):349-351.［5］WangJS,ChenH,ZhuQR.TransformationofhepatitisBserologicmarkersinbabiesborntohepatitisBsurfaceantigenpositivemothers［J］.WorldJGastroenterol,2005,11(23):3582-3585.［6］WheeleySM,BoxallEH,TarlowMJ,etal.HepatitisBvaccineinthepreventionofperinatallytransmittedhepatitisBvirusinfection:finalreportonaWestMidlandspilotstudy［J］.JMedVirol,1990,30(2):113-116.［7］NguiSL,OConnellS,EglinRP,etal.LowdetectionrateandmaternalprovenanceofhepatitisBvirusSgenemutantsincasesoffailedpostnatalimmunoprophylaxisinEnglandandWales［J］.JInfectDis,1997,176(5):1360-1365.［8］BreitkreutzR,ZhangW,LeeM,etal.HepatitisBvirusnucleicacidscirculatingintheblood:distinctpatternsinHBscarrierswithhepatocellularcarcinoma［J］.AnnNYAcadSci,2001,945:195-206.［9］SuQ,WangSF,ChangTE,etal.CirculatinghepatitisBvirusnucleicacidsinchronicinfection:Representationofdifferentlypolyadenylatedviraltranscriptsduringprogressiontononreplicativestages［J］.ClinCancerRes,2001,7(7):2005-2015.［10］ZhangW,HackerHJ,MildenbergerM,etal.2004.DetectionofHBVRNAinserumofpatients(Invitedpaper)［J］.MethodsMolMed,2004,95:29-40.［11］吴涛，张伟，苏勤，等.中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测［J］.第四军医大学学报，2004,25（7）:587-589.［12］崔云，张伟，苏勤，等.乙型肝炎病毒转录体血清学检测及其在母婴垂直传播中的意义［J］.第四军医大学学报，2005,26（12）:1089-1092.［13］HilgerC,VelhagenI,ZentgrafH,etal.DiversityofhepatitisBvirusXgenerelatedtranscriptsinhepatocellularcarcinoma:AnovelpolyadenylationsiteonviralDNA［J］.JVirol,1991,65(8):4284-4291.［14］KairatA,BeerheideW,ZhouG,etal.TruncatedhepatitisBvirusRNAinhumanhepatocellularcarcinoma:Itsrepresentationinpatientswithadvancingage［J］.Intervirology，1999,42(4):228-237.［15］Zhang[1][2][3]W,HackerHJ,TokusM,etal.PatternsofcirculatinghepatitisBvirusserumnucleicacidsduringlamivudinetherapy［J］.JMedVirol，2003,71(1):24-30.［16］ZhaoR,DuncanSA.Embryonicdevelopmentoftheliver［J］.Hepatology,2005,41(5):956-967.［17］YuenMF,LimWL,ChanAO,etal.18yearfollowupstudyofaprospectiverandomizedtrialofhepatitisBvaccinationswithoutboosterdosesinchildren［J］.ClinGastroenterolHepatol,2004，2(10):941-945