时间：2023-11-22 10:58:40
一、教材分析
1、在教材中的地位
本节是必修二第五章第一节的内容，通过前面各章的学习对于基因是什么，基因在哪里，基因是如何起作用的相关知识已经有了整体的认识。那么基因在代代相传中会不会变化？怎么变化？发生的变化会对生物的生存产生什么影响？本节从遗传物质变化的角度出发分析基因突变和基因重组对生物的影响，以及在生物进化过程中所起的作用，同时，也是学习第六章《从杂交育种到基因工程育种》和第七章《现代生物进化理论》的基础。
2、重、难点分析
重点：基因突变的实例；基因突变及基因重组的概念；基因突变的原因；基因突变特点及意义；基因重组的类型及意义。
难点：基因突变的概念；基因突变的结果形成原基因的等位基因；基因突变的特点；交叉互换。
3、教学目标
（1）知识目标。通过对镰刀型贫血症病因的分析认识基因突变的概念并分析基因突变的几种类型；不同器官发生基因突变的遗传情况；举例基因突变的原因和特点；识记基因突变的意义；举例说明基因重组的概念，类型；说出基因重组的意义。（2）能力目标。通过实例分析入手培养学生分析归纳总结能力；设置问题让学生分组讨论，培养学生合作探究能力。（3）情感态度与价值观。列举基因突变引起的遗传病实例让学生更加珍爱生命，远离不健康的生活方式。
4、教W方法
通过实例分析入手，设置问题情境引导学生探究，再归纳总结概念，从现象到概念，这种教学更符合学生的认知规律；通过联想和类比推理让学生得出基因突变的类型；基因突变的原因部分通过癌变的具体实例归纳哪些因素引起基因突变，让学生在兴趣中掌握了抽象的概念；通过讨论的形式引导学生掌握基因突变和基因重组的意义，最后通过比较法掌握基因突变和基因重组的区别。
5、教具准备
多媒体课件
6、课时安排：1课时
二、教学过程
导课：简单复习下变异的概念，举例：一美女单眼皮，国字脸，去了韩国一趟变成双眼皮瓜子脸，她的这种改变从生物学角度来说就属于变异，问，如果该美女结婚了，她的双眼皮瓜子脸能遗传吗？学生答：不能。教师追问：什么样的变异才能遗传给下一代呢？学生答：遗传物质改变引起的变异才能遗传给子代。教师和学生一起归纳变异的类型：可遗传变异，遗传物质改变引起的变异，有三种来源，基因突变、基因重组、染色体变异；不可遗传变异，由环境变化引起的，遗传物质没有改变，所以不能遗传给下一代。本节课学习可遗传变异的两大来源，基因突变和基因重组。
基因突变
1、基因突变的实例――镰刀型细胞贫血症
学生阅读课本的有关内容，注意以下几个问题： （1）镰刀型细胞贫血症的症状？（细胞呈镰刀状，容易破裂，使人患溶血性贫血，严重时会导致死亡。）（2）镰刀型细胞贫血症的直接病因？（血红蛋白结构异常）科学家为什么先从蛋白质入手？（蛋白质是生命活动的直接体现者）（3）异常血红蛋白与正常血红蛋白相比氨基酸序列有什么不同？（一个氨基酸被替换）（4）氨基酸被替换的根本原因是什么？
学生回答每一个问题后播放括号内的内容，然后再展示第四个问题，引导学生回顾基因表达过程让学生认识到蛋白质的氨基酸序列取决于DNA中的碱基序列，所以，血红蛋白氨基酸被替换应该是DNA中的碱基序列改变的结果。多媒体展示图片和学生一起通过图片分析镰刀型细胞贫血症的原因：
DNA中的一个碱基对被替换信使RNA碱基对改变蛋白质中氨基酸改变蛋白质改变性状改变
教师阐述：像这种氨基酸DNA中碱基对的改变引起基因结构的改变就是基因突变。碱基对改变的类型，除了替换外，还有增添和缺失。
问：这种改变能否遗传？能的话怎样遗传？（能，通过DNA复制后，经减数分裂形成生殖细胞遗传给后代，无性繁殖的生物还可以通过体细胞遗传。）
2、基因突变的诱因
学生阅读课本后，请一个同学回答引起基因突变的原因，不完整的教师补充，通过多媒体展示：物理因素、化学因素和生物因素
3、基因突变的特点
学生阅读课本后和学生一起归纳：普遍性、随机性、不定向性、低频率性、多害少利性。
4、基因突变的意义
教师问：基因突变能产生新的基因，新的基因所控制产生的新性状对生物的生存产生什么影响？突变是多害少利的，什么个体更容易在自然选择中生存下来？
（基因突变产生新的基因，进而出现新的性状，而这种性状对生物的生存大多数是有害的少数是有利的，只有那些适应环境的有利变异个体才能在自然选择中生存下来）
基因突变能产生新的基因，是生物变异的根本来源，为生物进化提供可选择的原材料。
基因重组
请学生阅读基因重组部分内容，并思考以下问题：
1、基因重组的概念？（生物体在有性生殖过程中，控制不同性状的基因发生重新组合的过程。）哪些生物能发生基因重组？（有性生殖的生物）有没有产生新的基因？（没有，原有基因发生重新组合形成新的基因型出现新的表现型。）
2、基因重组的类型有几种？（两种，四分体时期，四分体中的菲姐妹染色单
体发生交叉互换，引起染色单体上的非等位基因重新组合；减数第一次分裂后期非等位基因随着非同源染色体的自由组合发生重组。）
3、基因重组发生的时期？（减数分裂形成配子过程。）
比较项目
4、基因重组的意义？
（有性生殖的过程通过基因重组产生更多新的基因型出现更多表现型，是生物变异的重要来源，是形成生物多样性的重要原因，对生物进化具有十分重要的意义，也是生物进化原材料的重要来源之一。）
【关键词】基因突变 染色体变异
[Abstract] This essay discusses the differences in the chromosome formation the cause and the results between gene mutation and chromos omestructure variation
[Keywords]Gene mutationchromosomevariation
我们在学习生物变异一节时，学到了基因突变和染色体结构变异，很多学生在做具体题时二者总是混，分不清。现将二者的区别简单加以介绍。
基因突变和染色体结构变异均是可遗传的变异，在遗传中表现出子代性状与亲代性状不同，出现亲代、祖代从来没有过的新性状，且这种性状能在后代中重新出现，可见是遗传物质发生变化了。两者区别表现在：
1 染色体形态
1.1、基因突变是单个基因内部发生变化，从而引起该基因所控制的性状产生不同于亲代的变化。在光学显微镜下也看不到染色体形态的变化。
1.2、染色体结构变异是某个染色体在结构上发生变化，在光学显微镜下可以观察到染色体形态的改变。
2 产生的原因
2.1、基因突变是DNA复制过程中产生偶然差错，个别碱基缺失，增添或替换使基因中相关核苷酸的种类、数量、排列顺序发生改变，因而改变了遗传信息。例如，镰刀形细胞贫血症。
2.2、染色体结构变异是由于外界因素作用，染色体发生断裂和重新组合而造成染色体结构变化，改变遗传信息，我们课本提到了结构变异的四种情况（缺失、易位、倒位、重复）猫叫综合症是人体第五号染色体短辟上的缺失引起的疾病。
3结果不同
3.1、基因突变是不定向的，结果产生等位基因，如基因A可突变a，也可以突变为a1、a2、a3、 ……,a也可以突变成A。即同一性状在不同生物个体中发生突变后有不同的表现。例如，刮大风海岛上有翅昆虫可突变长翅和残翅昆虫。
3.2、染色体相同的结构变异后表现出的生物性状在不同生物个体均相同。如猫叫综合症，患儿都表现两眼距离较宽，反应迟钝，往往过早夭折，哭声似猫叫。
通过上述三点的比较介绍，我想大家对基因突变和染色体结构的变异的区别应该能够掌握了。
关键词：dhplc技术；基因突变；检测
1 dttplc技术原理
变性高效液相色谱(dhplc)是一种高通量、自动化的基因突变检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展应用，与sscp和dna直接测序等突变检测技术相比，dhplc具有灵敏性更高，特异性更强，廉价省时等优点。
dhplc技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链dna在部分失活条件下具有不同保留的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。所有基因组dna的单拷贝均可通过pcr反应大量扩增，杂合子个体的dna经扩增产生异源双链，由于错配位点的氢键被破坏，因此在异源双链上形成“鼓泡”，导致它与纯合子个体的dna扩增产物——完全匹配的同源双链的解链特征不同。在部分加热变性的条件下，异源双链dna分子更易于解链形成y形结构，与固定相的结合能力降低。当流动相中乙腈浓度梯度增大时，异源双链将先于同源双链被洗脱出来，带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰形。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段，从而提供有无突变的信息。
2 dhplc技术在突变基因诊断中的应用
基因突变是指基因组dna分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入，它是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。
随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。dhplc技术自最早被用于分析人y染色体单核苷酸多态性位点(snp)以进行人种进化的遗传性研究；此后还用于筛查致病基因突变位点、分析单核背酸多态性以及基因启动子cpg岛甲基化修饰改变等研究；因其灵敏性及准确度均较高，操作实现了半自动化，检测周期短、费用低，尤其适合于基因结构复杂而无突变热点或突变频率低于20％的单基因变异，以及多基因致病突变。
(1)散发性卵巢癌p53基因突变定位于17染色体的p53基因是目前研究得最广泛的抑癌基因，迄今发现的人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393个氨基酸就有280个位点存在突变，其直接的后果是导致氨基酸的改变，最终使p53蛋白失活，丧失抑癌作用。杜明和丰有吉，利用dhplc来检测50例散发性卵巢癌p53基因外显子5，8的突变，18例突变都可以使用dhplc的方法发现，没有假阳性和假阴性。说明dhplc可以用于临床筛查基因突变，并且对于异质性肿瘤而言，dhplc检测基因突变无疑是最可靠的。
(2)胃癌组织基因突变鲁狲、徐惠绵、任群等人利用dhplc对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测，并测序验证。在他们的研究中p53基因的突变率为21％(8/39)；其中肠型胃癌突变率40％(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33％(2/24)(p<0.01)；发现既往未见报道突变3例。这充分说明了dhplc是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法
(3)汉族人i型多囊肾致病基因突变张树忠等人，通过采用dhplc技术检测汉族人常染色体显性多囊肾病(ad－pkd)i型致病基因pkdl的突变：以来源于19个adpkd家系的67名成员血样标本的基因组dna为模板，通过长链pcr和巢式pcr联合扩增的方法扩增pkdl全编码区，然后采用dhplc方法进行初步筛查，将存在异常色谱图的扩增产物经核苷酸测序，确定突变的具体位点和类型，共检测出14个致病突变，包括10个错义突变、1个插入突变、1个缺失突变、2个无义突变。他们实验结果充分说明了dh－plc方法可以作为更为有效筛查汉族人adpkdpkdl突变位点的检测途径。
(4)乳腺癌brcal基因突变brcal基因为“乳腺癌1号基因”，位于17q21，有22个编码外显子。目前已经发现约40％～50％的遗传性乳腺癌和卵巢癌患者brcal基因发生突变。李丹等利用聚合酶链反应pcr扩增brcal基因，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，直接进行dh－plc分析，从124例乳腺癌患者中共发现9种突变，确定了9种乳腺癌患者可能发生的突变类型，为今后临床应用dh－plc对高危人群brcai基因进行早期基因检测提供了9个位点，所有dphlc检测显示峰型异常的样品经测序证明均存在突变或者shp，证明该技术阳性检测率为100％。且具有操作简单、快速、敏感、准确且经济等特点。
3 dhplc技术与其他技术在突变基因诊断中的联合应用
目前在核酸分析领域与hplc联用的检测手段有紫外(ultraviolet photometric detector，uv)、荧光(fluorescencedetector)、质谱(mass spectrometry，ms)等。其中紫外检测器(uv)凭借其良好的通用性成为应用最为广泛的检测器，但灵敏度不高的弱点使其使用受到一定的限制。在核酸分析和一些突变扫描方法中有时需要更高的灵敏度，这时具有更高灵敏度和选择性的荧光检测器成为首选。但是荧光检测器要求使用荧光标记物，且通常使用的染料如吖啶黄、溴化乙锭是有毒物质。scalano实验室开发出sybr green，染料不仅具有更好的灵敏度，而且使用更安全。激光诱导荧光是目前灵敏度最高的检测方法之一。hecker等采用荧光标记pcr引物、激光诱导荧光方式进行检测，证明dh－plc方法可以区别含量相差500倍的两个等位基因，这使多份样本的混合检测成为可能。同时荧光标记单链，使色谱图的解释变得更加容易。美国transgenomie公司在waveor核苷酸片段分析系统技术平台基础上，开发出一种后荧光检测技术。在所有分析条件不变的情况下，被检测的核酸片段经dhplc分离之后在混合室中与荧光试剂混合，然后进行检测，不仅可以提高灵敏度上百倍，而且不需要昂贵的荧光标记引物。近年来电喷雾离子化一质谱(eis－ms)作为一种重要的结构分析工具与ir－rp－hplc联用也已应用于核酸分析领域，该联用技术不仅可以确证被分离的单链dna的成分特性，还可以确证扩增的pcr产物的基因型。众所周知，在核酸的质谱分析中为了获得高置信度的分析结果，对分析物进行适当的脱盐和去除小分子量杂质是必不可少的，这也正是hplc－ms的魅力所在，但质谱的高成本使该项技术较难推广使用，
4 总结
……
EGFR基因：名声“响亮”
从组织学角度看，肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者又可再细分为肺腺癌、肺鳞癌、肺腺鳞癌等。超过85%的肺癌是非小细胞肺癌，超过50%的非小细胞肺癌是肺腺癌。目前，科学家普遍认为，部分肺腺癌的发生和发展与“驱动基因”突变有关。也就是说，原本正常的细胞，一旦其中的某些基因在某些关键位点发生突变，就会转变成为肿瘤细胞，最终导致肿瘤发生和发展。这类基因被人们形象地称为“驱动基因”。“驱动基因”数目众多，到目前为止，人们发现的“驱动基因”超过了100种。其中，最著名、最为大众熟悉的当属EGFR基因。
EGFR基因的中文名称叫作“表皮生长因子受体”基因，这个基因编码的蛋白质广泛分布于各类上皮细胞表面，具有调控细胞生长、增殖、分化等功能。EGFR基因的名声之所以那么“响亮”，一方面是因为50%以上的中国肺腺癌患者的肿瘤细胞存在EGFR基因突变；另一方面是因为存在EGFR基因突变的肺腺癌患者，除了常规的治疗手段（手术、化疗、放疗）外，还可以应用专门针对EGFR突变基因的“靶向药物”，且疗效显著。
靶向药物：并非所有肺癌或者都能用
传统的化疗药物进入人体内后，除了杀灭癌细胞外，还会不同程度地损伤人体正常细胞，“杀敌一千，自损八百”。靶向药物就像它的名字一样，能够直接找到并作用于突变的EGFR蛋白，就像一颗颗有GPS定位的导弹直达目标，对正常细胞的影响非常小。由于同一个基因上的突变位点不同，对应的靶向药物也有差异，好比一把钥匙开一把锁，不能有丝毫偏差，故现在科学家已研究出针对不同的突变基因的靶向药物。
由于大多数肺腺癌患者存在EGFR基因突变，且已有针对EGFR基因突变的靶向药物，故医生都会建议肺腺癌患者进一步检测肿瘤细胞中的EGFR基因，看是否存在关键位点的基因突变。如果存在基因突变，并且是对靶向药物敏感的基因突变，在肿瘤进展或复发时，除了常规治疗外，医生还会针对性地使用靶向药物进行治疗，以提高患者的生活质量，延长寿命。
EGFR基因突变：与肿瘤的关系“不简单”
EGFR基因和肺癌的关系，绝不能简单地理解为“EGFR基因突变导致肺癌”，也不是“患了肺癌，就一定有EGFR基因突变”。EGFR基因突变只能够解释部分肺腺癌患者肿瘤的发生和发展。复旦大学附属肿瘤医院胸外科十年大数据分析表明：70%左右的肺腺癌患者存在“驱动基因”突变；在不吸烟的女性肺腺癌患者中，更有近90%的患者存在“驱动基因”突变。除了EGFR基因之外，ALK基因、ROS基因、BRAF基因等也是十分有名的“驱动基因”，也有针对性的“靶向药物”。
部分肺腺癌、肺鳞癌及小细胞肺癌患者，与EGFR基因突变没有直接关系，谜底有待揭晓。另一方面，并不是每个被诊断为肺癌的患者都要使用或建议使用“靶向药物”治疗。只有经过基因检测，且肿瘤符合某些生物学特性的患者，才是“靶向物”治疗的合适人选。
EGFR基因检测：仅针对肺癌患者
根据“驱动基因”突变理论，“驱动基因”突变是后天发生的，且只发生在体细胞中，因此不会对下一代造成影响。只有发生在生殖细胞中的基因突变，才有一定概率遗传给下一代。目前针对“驱动基因”突变的检测，只在肿瘤细胞中进行，也只针对肺癌患者，并不对正常人的肺组织进行基因检测。
随着研究的深入，国外有研究人员发现，有极小比例的正常人群存在生殖细胞定位点的EGFR基因突变。根据国外的数据推算，这类人所占的比例不足万分之一，但这些从出生起就携带EGFR基因突变者，一生中患肺癌的概率接近1/3。
关键词：散发性帕金森病；LRRK2基因；基因测序
帕金森病（Parkinson's Disease， PD）是常见的、慢性致残性神经系统变性疾病，在亚洲人群中，其年发病率为1.5/100000～15/100000[1]。临床主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势反射障碍。研究证实，PD是遗传因素和环境因素共同作用的结果。目前已克隆出a-synuclein、UCHL1、LRRK2、NR4A2、park1、DJ-1、parkin等与帕金森病发病相关的基因。在所有已确定的PD基因中，Lrrk2基因是最有可能在典型晚期发病的PD中起作用的基因[2， 3]。我们对收集的中国粤西地区散发PD患者进行研究，筛查是否存在LRRK2基因G2019S突变。
1 对像与方法
1.1研究对象
71例散发帕金森病患者，均为广东医学院神经内科收集病例，诊断符合帕金森病诊断标准断[4]， 并排除非帕金森病的诊断。71例患者，男44例，女27例，年龄46～87岁，平均65.5±8.5岁。
1.2研究方法
所有患者均取晨起肘静脉血5-10ml （3.8%柠檬酸钠抗凝），常规碘化钾法从白细胞中提取基因组DNA，-20°C保存。
聚合酶链反应（ PCR）扩增LRRK2基因41号外显子序列，引物正义序列：5’-GCACAGAATTTTTGATGCTTG-3’，反义序列：5’-GAGGTCA GTGGTTATCCATCC-3’，引物由上海生工公司合成。PCR扩增采用12.5ul反应体系，其中包括10×Buffer1.0ul，dNTP（10 mmol /L）1.0ul，引物（20umol/L）0.3ul， 基因组DNA1.0ul，TaqDNA聚合酶（5u/μ1） 0.15ul，H2O 9.05μ1。PCR 反应条件：95℃，热变性5 min，（95℃，30s，退火62℃，35s，延伸72℃，40s）扩增32个循环后延伸72℃，10 min，终止反应。反应产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAG）电泳。100V电泳2 h以后用银染法染色，观察结果。
DNA测序，分别对每例样本进行双向测序，测序由上海生工公司完成。
2 结果
71例帕金森病患者的DNA模板，经PCR扩增得到331bp的产物（电泳结果见图1），测序结果经序列对比后未发现LRRK2基因41号外显子G2019S突变（测序结果见图2）。
3 讨论
本研究利用聚合酶链反应（ PCR）扩增71例帕金森病患者的DNA LRRK2基因41号外显子序列，并对其扩增得到的产物进行测序，结果未发现LRRK2基因41号外显子G2019S突变，提示G2019S突变可能不是中国散发帕金森病的突变位点。
Lrrk2基因位于染色体12q11.2- q13.1，全长7584个碱基， 其产物称为Lrrk2蛋白，也叫dardarin蛋白，是Paisan[5]等于2004年首先发现，由51个外显子构成，共有2527个氨基酸，富含亮氨酸重复序列。Lrrk2蛋白属于Roco （Ras of complex proteins （Roc） with a C-terminal of Roc domain）蛋白家族中的Ras/GTPase超家族，包括富含亮氨酸的重复单位区（leucine-rich repeat zone，Lrr）、复合蛋白激酶（ROC）、C末端Roc域（COR）、微管相关蛋白激酶激酶激酶（microtubuleassociated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）和C末端β螺旋形重复（WD40）五个连续的结构[6]。Lrrk2蛋白是一个具有多种功能的激酶，通过添加磷酸到其它蛋白上从而激活这些蛋白的活性。目前，在Lrrk2蛋白上至少发现了75个氨基酸置换，但发现有致病性的只有R1441C， R1441G、Y1699C、G2019S、I2020T 、R1628P和G2385R。体外研究发现，Lrrk2突变会解除激酶活性抑制，诱导神经元轴突和分支的顺行性退化，tau蛋白过度磷酸化，导致神经元细胞程序性死亡。而且，把Lrrk2突变体引入到成年大鼠脑中，也可以发现类似体外培养的情况：该突变体阻止多巴胺神经元生长及诱导产生包涵体[7， 8]。位于41号外显子的G2019S突变改变LRRK2蛋白的自身磷酸化，进一步增强底物磷酸化水平，从而导致 LRRK2的激酶活性增强产生疾病。Lrrk2突变还可以引起多种神经病理改变，在G2019S突变的大鼠模型中，表现出黑质多巴胺神经元的进行性变性[9]；没有Lewy小体的单纯的黑质神经元的丢失；α-突触白阳性的Lewy小体的黑质神经元的丢失[10]；与tau蛋白病变相关的神经纤维缠结的出现[11]；通过激活GSK3β，使tau蛋白错配及磷酸化，从而诱导神经元树突变性11。这些病理改变都可能促进PD的发生。在G2019S突变PD患者身上，可以见到线粒体功能及形态明显受损，但目前尚不清楚这些改变是否与G2019S突变后Lrrk2的活性改变有关[12]。
在北非阿拉伯人中，41%（20/49） 散发性PD病人携带G2019S突变，37%（10/27） 家族性PD病人携带G2019S突变，而在欧洲人群中，散发性PD病人携带G2019S突变为1.9%，家族性为2.9%[13]。而在北美高加索人群中，家族性和散发性分别约为3%～7%和1%～2%[3， 14， 15] 。然而，G2019S突变在亚洲人群中罕见。在印度学者的研究中，他们调查了印度150名散发性帕金森病病人和170名对照者，未发现有G2019S突变16。国内学者曹立在136名散发及家族性PD患者标本中均未发现G2019S突变[17]。以上结果说明G2019S突变在不同的种族和地域中有非常大的差异。需要注意的是，在携带有LRRK2 G2019S突变的帕金森病人中，该基因的外显率是随年龄变化的，即具有年龄依赖的特点：60岁时外显率为15%，70岁时外显率为21%，到了80岁外显率可以达到32%[18]。本实验研究的71例散发的帕金森病患者中均未发现G2019S突变，可能由于种族和地域差异该突变位点在中国帕金森病患者中少见甚至缺如，提示G2019S突变可能不是中国散发帕金森病的突变热点。由于本实验只涉及到散发帕金森病例，且样本量较少，实验结果具有局限性，我们正在收集更多样本及家族性帕金森病例样本，更近一步的研究工作正在进行中。
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[17]曹立， 唐北沙， 夏昆. 帕金森病与LRRK2基因G2019S突变相关性研究. 中华内科杂志， 2006，45：931-933.
【关键词】 基因 CD59 突变 中国仓鼠卵巢细胞 补体限制作用
［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a cell model expressing human mutant CD59 molecular， and study its biological activities. MethodsNucleotides within glycosylation motif were changed to a human mutant CD59 gene (from K41H44 to K41K42) by overlap extension PCR. The mutant CD59 gene was inserted into a eukaryoticexpressing vector pALTER to form a recombinant plasmid. CHO cells were cotransfected by the recombinant plasmid and pcDNA3 via lipofectamine method. Target protein expressed on the membrane of the transfected cell lines was detected by immunocytochemistry and Western blot. Fluorescence dye was used to study the complement restriction activity of the mutant CD59 before and after glycosylation．ResultsMutant CD59 was expressed on the surface of transfected CHO cells．The dye release rate of positive clone expressing mutant CD59 molecules was lower than that of the control group. However， the rate accelerated after glycosylation. ConclusionA stable transfected cell model expressing human mutant CD59 is successfully established， which might lay the basis for further study of its biologic functions.
［KEY WORDS］genes， CD59; mutation; CHO; complement restriction activity
CD59是一种以糖基磷脂酰肌醇锚于细胞膜表面的糖蛋白，相对分子质量约为20 000， 广泛分布于造血生成细胞和非造血生成细胞及多种组织细胞表面，并可以游离形式存在于尿液、唾液、泪液等多种体液中。CD59具有多种重要的免疫功能［1］，其中最主要的作用是作为补体的调节蛋白，以同源限制的方式抑制攻膜复合体(MAC)C5b9的形成，保护自身正常的组织细胞免受补体损伤。然而据报道，CD59可在糖尿病病人体内被糖基化失活，糖基化的CD59失去了 MAC限制功能 ，MAC插入内皮细胞导致了生长因子的释放，进而可引起血管增殖［2］，导致血管并发症的发生。
为了探讨人突变CD59的抗补体活性及其与糖尿病血管并发症之间的关系，我们构建了一种突变的CD59基因，并转入中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，以便进一步研究突变CD59的活性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与细胞株 pALTER和pcDNA3以及克隆有CD59全长cDNA序列的pALTER质粒（pALTERCD59），均由美国哈佛大学提供。CHO细胞购自中科院上海细胞所。
1.1.2 主要试剂及工具酶 RPMI 1640培养液，购自HyClone公司。G418 选择抗生素，购于Amresco公司。LipofectamineTM 2000为Invitrogen公司产品。 FITC标记的CD59单抗（mAb）为Immunotech公司产品。双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧 甲酯（BCECF/AM）为SigmaAldrich公司产品。彩色蛋白质Marker由美国哈佛大学提供 。EcoR Ⅰ酶购自宝生物大连有限公司。
1.1.3 引物设计及合成 共设计两对引物，第一对引物用来扩增含突变位点及其上游序列的DNA片断，正向引物(FM)为：5′AAGTGTTGGAAGAAGGAGCAGTGCAATT3′（划线处为突变位点）；反向引物（R2）为：5′ATTAACCCTCACTAAAGGGA3′。第二对引物用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片断，反向引物（RM）为：5′ATTGCACTGCTCCTTCTTCCAACACTTG3′；正向引物（F2）为：5′TAATACGACTCACTATAGGC3′。其中FM和RM 反向互补 。以上引物由上海生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒pALTERCD59的基础上，重新设计一对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物。通过重叠延伸PCR产生特异位点诱变［3］。将指导合成的CD59分子中的H44去掉，增加1个K42，产生突变CD59。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化，并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的 PCR产物用EcoR Ⅰ单酶切 ，并经T4 DNA连接酶插入到pALTER质粒的EcoR Ⅰ位点，构建重组真核表达质粒（命名为mCD59pALTER）。通过转化、筛选、酶切鉴定挑选出目的片段正向连接的重组质粒，并对筛选的克隆进行序列测定、分析（由上海生物工程公司协助完成）。
1.2.2 细胞转染及筛选 重组质粒mCD59pALTER对CHO细胞的转染，参照Lipofectamine 2000的说明书进行。以质粒突变CD59pALTER 与pcDNA3共转染CHO细胞，同时设不带突变CD59基因的空pALTER转染CHO细胞作为阴性对照。转染后24 h， 将细胞作1∶10稀释后传代，在含800 mg/L G418的RPMI 1640中培养约2周后，出现阳性克隆。挑取单个克隆，继续抗性筛选2周，其阳性克隆的后续培养始终在G418维持剂量（400 mg/L）下进行。经连续传代10次后，收集细胞，对表达产物进行鉴定。
1.2.3 克隆细胞株表达产物的鉴定 采用免疫化学染色方法：收集细胞，用PBS洗3次，涂片、乙醇固定后晾干。灭活内源性过氧化物酶后，依次与羊抗人CD59 多克隆抗体、HRP兔抗山羊IgG于37 ℃作用各45 min，最后以DAB底物显色后镜下观察。 收集细胞，经裂解处理后，离心收集上清进行Western blot 分析，将不同相对分子质量蛋白质分离并进行特定条带酶免疫染色，进一步确定CD59分子的表达。
1.2.4 荧光染料释放试验 用BCECF/AM荧光染料渗入法，测定突变CD59蛋白糖基化前后的抗补体活性。将细胞接种于96孔板内，每孔1×104个细胞。在接种突变CD59CHO的孔中，半数孔中加入核糖（终浓度为50 mmol/L）作为实验组，另一半孔不加核糖作为对照组。培养72 h后，加入氰基硼氢化钠以稳定加合物并维持细胞体积及膜电位不变。然后置于37 ℃孵育20 min，洗涤后每孔加入BCECF/AM（终浓度为2 mg/L），再于37 ℃孵育30 min使其渗入细胞内部。然后每孔加入自制的抗CHO细胞多克隆抗体（1∶1 000稀释）50 mL，置37 ℃水浴中30 min。洗涤后，加入不同浓度（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8）的新鲜人血清（含补体），每孔100 μL，于37 ℃作用15～20 min。吸出上清，加入到2 mL PBS液中，测定其荧光强度（FI）。最后于每孔中加入100 μL的细胞裂解液，以释放出细胞内部的BCECF/AM，并测定荧光强度（FI）。所用激发波长为500 nm，发射波长为530 nm。荧光释放率的计算公式为：染料释放率（%）=上清中染料释放的FI值/（上清中染料释放的FI值+细胞裂解后染料释放的FI值 ）×100% 。
2 结
果
2.1 重组质粒的鉴定
以EcoR Ⅰ对突变CD59CHO进行酶切，可获得1条496 bp的电泳带，与所插入的片段的大小相一致（图1）。测序结果表明，突变CD59pALTER质粒含有突变的CD59全长cDNA序列。
2.2 转染细胞株表达产物的鉴定
免疫化学染色结果显示，pALTERCHO不显色；而突变CD59CHO阳性克隆的表面显棕色。Western blot 分析结果表明， 突变CD59CHO的裂解产物中，可检出相对分子质量约为20 000的突变CD59蛋白，证实突变的CD59基因在转染的CHO 细胞中获得表达。
转贴于 2.3 突变CD59的活性检测
BCECF/AM荧光染料释放试验表明，突变CD59具有补体限制性，糖基化后其活性下降（图2）。
3 讨
论
血管内皮是一个复杂的内分泌器官，它对于动脉粥样硬化的发生起到“第一道防线”的生理防御作用。内皮细胞功能异常在糖尿病血管并发症中扮演了至关重要的角色［4］。许多资料表明，糖尿病病人血管内皮及肾脏中MAC的沉积增加［5］。MAC沉积的增加可以导致从MAC靶定的内膜释放生长因子如基底成纤维生长因子和血小板源性生长因子等［6］，而生长因子的释放可以刺激血管壁细胞增殖并可导致增殖性血管并发症的发生。人CD59作为补体调节分子，可以抑制MAC的形成，从而抑制由于MAC插入内皮细胞导致的生长因子释放而导致的血管增殖性并发症的发生。但糖尿病持续高糖血症可使CD59发生非酶糖化并损伤其功能。
本文采用重叠延伸PCR和基因重组技术构建了人CD59的一种突变体，使糖基化基序K41H44突变为K41K42， 44位组氨酸由一无关氨基酸取代，然后稳定转染CHO细胞，从而获得突变CD59表达细胞株。根据抗原抗体复合物可激活补体从而导致靶细胞损伤的原理，对突变CD59的补体限制活性进行了初步研究。实验结果表明，突变CD59的K41K42赖氨酸双体结构不影响突变CD59的抗补体活性，且对糖基化失活敏感，可能与糖基化位点增多有关。另外，由于细胞不能够耐受长时间的糖化，而短时间的糖化并不能够使突变CD59的抗补体活性完全丧失，因此，将来可以进一步提纯突变CD59蛋白，使其充分糖化后吸附至细胞上再做抗补体活性的检测。未来制备突变CD59单克隆抗体可以用于临床诊断，为糖尿病血管并发症诊断、预防方面提供理论依据。
参考文献
［1］WALSH L A， TONE M， THIRU S， et al. The CD59 antigenα multifunctional molecule［J］. Tissue Antigens， 1992，40 (5):213220. ［2］JUAN A， JUDITH H， RUDOLF F， et al. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes［J］ . Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97 (10): 54505455.
［3］萨姆布鲁克 J， 弗里奇 E F， 曼尼阿蒂斯 T(金冬雁译). 分子克隆实验指南［M］. 第3版. 北京：科学出版社， 2002:11091113， 13071308.
［4］李宏亮，余叶荣. 2型糖尿病患者血管内皮细胞功能异常及其机理研究［J］. 中华糖尿病杂志， 2004，12（2）：146148.
［5］ACCARDOPALUMBO A，TRIOLO G， COLONNAROMANO G， et al. Glucoseinduced loss of glycosylphosphatidylinositolanchored membrane regulators of complement activation (CD59， CD55) by in vitro cultured human umbilical vein endothelial cells［J］. Diabetologia， 2000，43(8):10391047.
摘要】 背景与目的 以人肺癌细胞株pc9及其耐药子系细胞pc9/ab2、pc9/ab11、pc9/bb4为模型，观察4株细胞对gefitinib的耐药差异及耐药机制。方法 体外培养细胞测定耐药指数，对4株细胞egfr 基因exon18-21进行测序并在mrna水平上的测定表达量差异。结果 pc9及其3株耐药子系细胞均存在耐药性差异。pc9及其3株耐药子系细胞均存在19外显子15 bp缺失突变并且耐药细胞株pc9/ab11外显子20存在ag的点突变。敏感细胞株pc9的egfr 基因在mrna水平上的表达量明显高于其他3株耐药株。结论 pc9、pc9/ab2、pc9/ab11和pc9/bb4肺癌细胞株对gefitinib的耐药性存
在非常显著的差异，4株肺癌细胞株egfr 基因突变和mrna表达水平的差异与其与gefitinib获得性耐药有关。 【关键词】 egfr 基因；耐药；gefitinib；肺肿瘤
“一天有这么多时间真是棒极了。我觉得我活了两辈子。”
像Ross一样的短睡眠者大有人在，他们每天醒得很早，一般4、5点的时候就起床了，开始新的一天，从不会感到头昏脑涨，更不需要借助咖啡提神。Margaret Thatcher说她一天只用4个小时来睡觉，而Mariah Carey却需要15个小时。
科学家发现，短睡者的的基因中一条叫做DEC2的基因上存在着一个突变，其他正常睡眠时间的成员基因中没有。正常来讲，睡眠时间短会对人体健康、生活品质等造成影响，会造成抑郁、肥胖，并且换上中风和糖尿病的风险会增加，“睡得好会避免许多疾病，包括痴呆。如果睡眠时间减少两个小时，认知系统会立即很明显地受到影响。”而那些拥有DEC2基因突变的人则完全没有这方面担忧，他们精力充沛、乐观，很希望将自己的生活填满：早起后网上购物，读读书，出门锻炼或者和其他时区的人对话。
Ross记得小时候总是和父亲一起消磨早上的时光，他也是一个睡眠时间很短的人。现在如果她偶尔睡过头，父亲会认为她是不是死了。
需要多长时间的睡眠是由基因决定的。独立睡眠顾问建议，达到高效睡眠最有戏的方法是调整早起的时间。研究表明，身体会在起床前一到一个半小时前醒来。
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一部分人执着追求生活中的创造力，认为不需要过多追求效率，不断填图有一种放松和顽皮的感觉，而儿童图画书上蜡笔纹的触感“摸起来很年轻”。