时间：2023-03-15 00:00:41
在一项生命科学的前沿技术上，中国科学家成了“第一个吃螃蟹的人”，不过这项“创举”没能获得认可，反而迎来了国际生物学界的巨大争议。
5月18日，美国国家科学院和美国国家医学院（下称“两院”）宣布，将发起一项重要倡议，为编辑人类基因组的研究制定指导性规范。
“两院”提议在今年秋季召开一次国际峰会，同时建立一个工作组，来研究涉及生殖细胞编辑的伦理、法律、社会和科学议题。
就在这项倡议之前，4月底，美国国立卫生研究院主任弗朗西斯・柯林斯发表声明，表态研究院不会资助任何人类胚胎基因编辑的研究。
让几家美国国家研究机构大动干戈的缘由，来自4月18日中国中山大学副教授黄军就团队的一项最新研究进展。
当天，黄军就带领的研究小组在学术期刊《蛋白质和细胞》上，报道了研究小组使用基因编辑技术改造人类胚胎的最新研究进展。
这被不少生物学界人士认为是逾越了基因研究的伦理和安全红线，在一些人的眼中，甚至和当年的克隆人一样，将引发“蝴蝶效应”，“打开人类灭亡的潘多拉魔盒”。
中国科学家做的这项研究，真的有如此巨大的能量？
论文“导火索”
实际上，黄军就研究小组使用的基因编辑技术――CRISPR/Cas9，并非中国团队独创，它主要是通过对生物体基因组的改变，来读取和改变遗传物质和编码信息。通俗一点的描述，就是把一小段基因剪切或替换掉。
与仍存在争议的转基因技术相比，基因编辑不涉及外源性基因，只是对生物体内源性基因的调控，所以更容易被人们接受。比如，在一些农作物的基因修复上，可以利用基因编辑技术，把一些遗传疾病出现的基因突变恢复正常，让农作物回到健康生长状态。
CRISPR/Cas9技术已经属于基因编辑的第三代技术，最近两年，这项技术也已被全球生物科学界大量深入研究和优化。不过，在黄军就小组的研究之前，还没有人公开把这项技术真正应用在人体胚胎上。这也是争议点所在。
事实上，未公开的研究也并非没有。在黄军就小组的研究之前，《麻省理工科技评论》报道了另一个还未来得及发表的研究项目：哈佛大学著名遗传学家乔治・丘奇的实验室中，博士后中国留学生杨璐菡正在对人类尚未成熟的胚胎进行基因编辑。
杨璐菡的研究主要针对乳腺癌的突变基因，希望能通过这一研究降低下一代女性的患病风险。但报道发表后，外界的舆论压力让她不得不停止了研究，也变得遥遥无期。
相比之下，黄军就研究小组看起来就“幸运”得多，他们的研究并没有遇到社会舆论以及伦理禁忌的压力，文章顺利发表在《蛋白质和细胞》上。最开始黄军就想把在《自然》和《科学》杂志上，但先后被拒绝。
《蛋白质与细胞》是新创不久的学术期刊，并不如《自然》和《科学》等期刊一样为人所熟知，不过，黄军就小组的研究文章发表后，质疑和批评声还是如洪水般汹涌而来。
这其中不乏一些生物学界和基因编辑领域的大师级人物。比如基因编辑技术的先驱弗奥多・乌诺夫以及CRISPR/Cas9技术的发明者之一詹妮弗・杜德娜就明确表态，应该禁止该技术应用于人类生殖细胞基因的改造。
伦理与监管
一些学者还将矛头指向刊登论文的《蛋白质和细胞》杂志，指责杂志的编辑没有对论文的发表进行同行评审，激进一点的批评，则认为杂志编辑极端不负责，这是在支持修改人类胚胎基因。
《蛋白质和细胞》期刊执行编辑张晓雪对于这些批评予以澄清，她说：“编辑部作出刊登这项研究的决定，不应该被看作是对类似尝试的一种认可或者鼓励。”
黄军就随后也对他们的研究作出进一步的说明，他认为自己团队的研究并没有跨越伦理红线，研究所使用的胚胎都是无法发育的废弃胚胎，而且研究的目的，也是为了找出这项技术的问题所在。
按照黄军就小组论文的描述，团队使用了86个胚胎细胞，48小时之后，只有28个胚胎拼接成功，而且还有胚胎出现了“脱靶”突变（影响到正常基因）。
在研究小组看来，这一研究结果向学界揭示了技术的不成熟，因此他们停止了实验，除非成功率接近100%。
但一些研究人员仍然担心，这篇论文会是个开始，更多的人会在对基因编辑技术的后果不明确的前提下，就启动更进一步的研究和实验，进而演变到制造变种人类的地步。
这也是所有担心的症结所在，技术本身的成熟只是时间问题，但应用的方向出现偏差，整个人类种族的未来就有可能陷入危机。
这些担心不无道理，不过，就像核技术等备受争议的技术一样，任何科学技术都有两面性，是否会被应用于对人类有害的领域，这已经明显超出科学家所能掌控的范畴。
《自然》杂志在随后发表的一篇文章中写道，改造人类胚胎基因组是一个复杂的问题。论文发与不发，都改变不了实验已经完成的事实。而任何关于人类胚胎的人为操作，总是会引起激烈争论，但争论的最终目的，应该是制定出明确的规范标准，让科研真正朝着有利于人类福祉的方向发展。
关键词 基因编辑 锌指核酸酶 转录激活因子样效应物核酸酶 CRISPR/Cas9核酸酶
中图分类号 Q-49 文献标志码 E
基因编辑是指对基因组进行定点修饰的一项新技术。利用该技术，可以精确地定位到基因组的某一位点上，在这位点上剪断靶标DN段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正达成了“编辑基因”。
1 研究背景
近年来，随着分子生物学的迅速发展，研究人员正通过定点突变的方法使目的基因完全失活来研究特定基因的功能，这是一种最直接有效的研究方法。随着高特异性及更具操作性的人工核酸酶的出现和技术体系的完善，基因编辑技术获得了飞速发展，并将靶向基因操作推向高潮，使得定点基因敲除、敲入变得更为简单且高效。与传统的以同源重组和胚胎干细胞（ES）技术为基础的基因打靶技术相比，基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，并应用到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本更低。
现代基因编辑技术的基本原理是相同的，即借助特异性DNA双链断裂（DSB）激活细胞的天然修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）两条途径。
2.1 非同源末端连接
非同源末端连接是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA修复重连的过程中会发生碱基随机地插入或丢失，造成移码突变，使基因失活，实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJC制会将其连入双链断裂DSB位点，从而实现定点的基因敲入。
2.2 同源重组修复
同源重组修复是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整地整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。若在一个基因两侧同时存在DSB及同源供体的情况下，可以进行原基因的替换。
目前主要有3种基因编辑技术，分别为人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术；转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术；RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术（CRISPR/Cas RGNs）。
ZFN技术是第一代基因编辑技术，是基于锌指蛋白发展起来的。1986年，Diakun等首先在真核生物转录因子的DNA结合区域发现了Cys2/His2锌指模块。1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN，可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因编辑中的应用。
ZFN由锌指蛋白（ZFP）和FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别DNA特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂。于是，细胞可以通过同源重组修复机制和非同源末端连接修复机制来修复DNA。HDR修复有可能会对靶位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，由此达到基因敲除的目的。
ZFN诱导的基因编辑技术可应用于很多物种及基因位点的编译，具有较好的发展潜力。但是目前有3个缺陷制约了该技术的推广：① 以现有的策略设计高亲和性的ZFN，需投入大量的工作和时间；② 在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性；③ 虽然三联体设计具有一定特异性，但仍存在不同程度的脱靶效应。
2009年，研究者在植物病原体黄单胞菌中发现一种转录激活子样因子效应物，是特异识别DNA序列的基础。TALEN识别模块一般由34个氨基酸组成，其中第12、13位氨基酸高度可变，被称为重复可变的双氨基酸残基（RVD）。RVD决定了对特异性核苷酸的识别，其与A、G、C、T有恒定的对应关系，如即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。随后，TALEN特异识别DNA序列的特性被用来取代ZFN技术中的锌指蛋白。它的可设计性更强，不受上下游序列的影响，具备比ZFN更广阔的应用潜力。
TALEN包含2个TALEN蛋白，每个TALEN都是由TALE array与FokⅠ融合而成。在进行基因编辑时，其中一个TALEN靶向正义链上的靶位点，另一个则靶向反义链上的靶位点。然后FokⅠ形成二聚体，在靶向序列中间的spacer处切割DNA，造成双链DNA断裂，随后细胞启动DNA损伤修复机制，FokⅠ针对不同的TALEN骨架，其最适宜的spacer长度不同，其长度范围一般为12～20 bp。实验结果表明，TALEN在靶向DNA时，第一个碱基为T时其结合效果更佳。
目前，TALEN已经成功应用于酵母、哺乳动物和植物的特异性位点来进行基因打靶，与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势，但仍然有些问题需要解决，例如脱靶效应、TALEN与基因组进行特异结合受邻近序列影响等。
继2015年4月，中山大学研究人员利用基因组编辑技术除去了人类胚胎中的一个突变基因后，5月，全球知名期刊《自然》（Nature）称，美国国家科学院（NAS）和国家医学院（NAM）宣布，将推出重大的举措为人类基因组编辑技术制定指导准则。
基因组编辑技术，是近年科学界的明星技术，它实现了在生物体基因组水平上进行精确地敲除、插入或置换，意味着人类可按意愿改写DNA，也因此引发巨大的伦理道德争议。
核心技术门槛的降低，往往意味着某个行业即将迎来爆发期，比如智能手机的风起云涌。
此前，由于技术壁垒与监管成本高昂，转基因育种几乎垄断在以孟山都公司为首的几个大公司手中；而基因组编辑技术应用于种子培育，不仅少了几分改写人类DNA的顾忌，而且这一新的育种技术降低了准入门槛，使一些小公司、校办企业也有了进入的机会。
不过，转基因作物始终面临着严厉监管，同样作为基因工程，基因组编辑育种技术的产物，是否也面临一样的命运？如果改变监管策略，又需要如何调整？ 是不是转基因育种？
上述一连串的发问，其实指向同一个问题，基因组编辑育种是否应被视作转基因育种？
被看好的基因组编辑技术，主要有核酸酶 （ZFNs）、TALE核酸酶（TALENs），以及CRISPR/Cas系统，原理都是在DNA靶位点产生双链断裂，之后进行末端连接或同源重组，以修复损伤的DNA。
其中，CRISPR/Cas系统是最新的技术，它不像另外两种技术那样靠蛋白来识别目标，而是靠核糖核酸（RNA）来识别，操作更简捷，应用范围更大。
美国一家小公司Calyxt有一个新突破，它利用TALEN技术使土豆耐冷藏，并可减少烹饪时产生的致癌物质。技术原理是，通过降低土豆中天门冬酰胺和单糖的含量，不让切开的土豆变黑和减少高温烹饪时产生的致癌物质丙烯酰胺。
TALEN技术由TALE蛋白DNA结合域和核酸酶两部分融合而成，这相当于一场观察员寻找定位、狙击手攻击的游戏，TALE蛋白DNA结合域负责靶序列的特异性识别，而核酸酶负责靶位点的切割。
麦当劳等快餐企业的薯条供应商辛普洛特的转基因土豆，也于2014年11月得到美国农业部批准，它同样可以减少土豆擦伤变黑，并在烹饪过程中降低丙烯酰胺的产生。
两种土豆的品质类似，但区别在于，辛普洛特土豆嵌入了野生土豆中的基因片段，并采用RNA干扰技术让负责编码特定酶的基因不再表达，Calyxt土豆则只是剔除了土豆本身的基因，没有插入任何外源基因。
检测无法发现Calyxt土豆与传统土豆的差别，因为，基因组编辑技术无需引入外源基因，直接可在作物自身基因组上进行操作，与自然突变或物理、化学诱变的机理一样，因此，分子检测无法区分基因组编辑获得的植物突变体与常规突变体。而转基因育种时外源基因的嵌入位置有随机性，需要大量的筛选来获取目标性状。
这就是基因组编辑育种不同于转基因育种的重要原因。
那么，前者可以替代转基因育种吗？
基因组编辑技术至少现在还不能完全替代传统转基因技术，比如，因为Bt基因来源自细菌，基因组编辑尚无法实现在作物自身基因组上产生Bt基因。
日本茨城大学农学院教授刀川（Masashi Tachikawa）介绍，一部分人认为基因组编辑育种应按非转基因植物对待，其比转基因更天然，环境风险较小；另一部分认为基因组编辑对基因组重新配置，同时技术门槛的降低会加大环境风险，因此需要更加严格。站在中间路线的人则认为应保持现状，然后再逐步减轻或加强，而操作精准度增加并不会降低风险。 “我受监管吗？”
美国农业部认定Calyxt土豆不在转基因法规监管内。2014年8月28日，美国农业部动植物卫生检验局回复Calyxt公司咨询称，该土豆有别于传统的转基因作物，最终产品不含有任何外源的遗传物质，农业部对于转基因作物的管理条例不再适用，因此不受相关条文（即《生物技术监管协同框架》）管理。
自2011年7月至2014年11月，美国农业部动植物卫生检验局网站上已有25封来信咨询，均涉及同一个问题：“我受监管吗？”
早在四年前美国就《新兴技术监管和监督原则》强调，监管要遵循科学，定量和定性考虑效益与成本，如果没发现重大的监督问题，考虑不予监管。
美国农业部海外农业局新技术与生产方式办公室副处长彼得里（Mark Petry）对《财经》记者表示，在美国，基因组编辑产品是遵循个案分析的原则、以科学为基础进行的。与此同时，一些转基因产品被等同于常规育种产品对待。
彼得里透露，近期许多业内科学家建议，监管机制应该保持一贯性， 如果在无法区分基因组编辑产品与常规育种产品的情况下，两种产品应该等同对待。
此外，如果Calyxt土豆要出口，仅仅拿到美国农业部的许可远不是终点，各个国家的监管都需要协调。
6月上旬，由美国、英国、阿根廷、中国多个国家和地区的政府官员、科学家、产业人士参加的新育种技术交流活动接连在菲律宾和中国举行，其目的即是协调各个国家和地区的基因组编辑育种技术监管。
美国政府已经将一些产品的安全评价材料在网络上公开，以便各国参考。
欧盟的做法则有些费解，欧盟于1998年批准Mon 810转基因玉米、1998年批准了两个康乃馨生物技术品种后，没再批准新的栽培申请。如今主要的生物技术公司退出了欧盟，先正达公司停止在欧洲的基因工程项目，孟山都从欧盟撤走所有栽培档案。如果将基因组编辑育种技术纳入转基因育种范畴，那么这一技术在欧盟将又一次陷入绝境。
欧洲食品安全局（EFSA）转基因生物（GMO）小组成员约内斯（Huw D Jones）在北京上述交流活动中透露，欧盟正在考虑这一问题，2015年夏季之前完成转基因生物体定义的法律审查，秋季将提交最终草案给成员国评审，希望在年底之前发表涵盖现有新育种技术的指南。他本人表示，如果产品中不再有重组DNA，且基因组编辑无法与自然突变区分的话，那么不应纳入已定义的转基因育种范畴。
阿根廷的做法接近美国。阿根廷国家农业生物技术咨询委员会执行主任、农畜渔业部生物技术主任莱马（Martin Lema）介绍，只要最终产品不含外源基因，则不纳入转基因产品的监管范畴。
在日本，申请基因组编辑育种技术品种须在种植以及用于食品和饲料之前咨询主管部门，并请其裁决最终产品是否纳入监管。 中国的政策选择
中国并非旁观者。以中国科学院遗传与发育研究所研究员高彩霞等人为代表，中国已经在基因组编辑的小麦育种上做了出色的工作。
白粉病是小麦的世界性病害，小麦中的致病基因在其A、B、D基因组上各有一个拷贝。高彩霞与中国科学院微生物研究所研究员邱金龙合作利用TALEN技术，在六倍体小麦中对该基因的3个拷贝同时进行了突变，获得对白粉病具有广谱抗性的小麦材料。该研究结果于去年7月发表在权威生物技术期刊《自然-生物技术》在线版。
需要注意的是，这种抗白粉病小麦很难通过杂交育种获得，因为杂交育种利用的是自然突变产生的植株，而六倍体小麦很难发生3个拷贝同时突变。同样，传统转基因技术也不容易实现，因为转基因技术具有插入的随机性，做不到在特定基因上的插入，而六倍体的筛选工作量是无穷大的。
高彩霞还利用基因组编辑技术研发了一种带有香味的水稻。不过，这些成果都还没有应用在商业生产中，因为农业部尚未有明确说法。
中国在农业生物技术政策制定上是有深痛教训的。作为中国转基因法规的主要起草人之一，中国农业科学院植物保护研究所生物安全研究中心主任彭于发认为，目前看中国转基因政策采取的防守策略并不成功，亟须改进。
国务院颁发的《农业转基因生物安全管理条例》（下称《转基因管理条例》）于2001年5月。当时国内在该领域的研发相对落后，于是中国采取了一个防守策略，即设置高门槛，让国外产品进来时，额外增加很多程序。
结果出乎意料，按照彭于发的讲法就是，“外面的没挡住，里面的没起来”。以大豆为例，中国没挡住进口，自己的转基因大豆也没发展起来。因为设置高门槛后，没有一个中国的企业和研究院所能达到这样的高标准。
此外，还在客观上造成“能试（验）不能用，许吃不许种”现象，因为最后不允许种，投资者没有获得效益，至今只有大北农集团等少数企业开始作为。
对于基因组编辑育种技术，彭于发建议，其一，要避免“转基因”字眼引来的公众舆论压力，建议采用“精准育种技术”或“先进育种技术”概念；其二，因为检测不到外源基因，大量的新产品不应作为转基因产品来管理；其三，中国需要一个简化的合理程序。
也有不太乐观的看法存在。部分业内人士就认为，这一育种技术恐怕不能逃脱作为转基因的监管。按照《转基因管理条例》第一章第三条，“农业转基因生物是指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的动植物、微生物及其产品”，基因组编辑技术既然是在作物基因组水平上的遗传修饰，那么则属于基因工程，符合上述定义。
1987年，一个科学研究小组发现，在一个细菌基因的一端有一个奇怪的重复序列，一个DNA序列紧跟着几乎完全相同但以相反方向构造的序列。这一现象当时并未引起太多人的注意。过了10年，破译微生物基因组的生物学家开始经常发现这类令人费解的DNA重复模式，因为这种重复模式出现在超过40%的细菌和90%的古生菌中。这种DNA的重复序列就是基因编辑器CRISPR。即便如此，研究人员也并不理解基因编辑器的作用。
到了2005年，有3个研究小组发现，基因编辑器可能与微生物的免疫作用有关。其中一个研究小组是马里兰州贝塞斯达市美国国家生物技术信息中心的尤金·库宁和其同事。他们发现，基因编辑器能够整合入侵的噬菌体（一种病毒）的少量基因，从而可以参考入侵者的基因来识别和攻击入侵者，就像疫苗一样发挥作用。
具体作用是，细菌和古生菌占据入侵的噬菌体的部分DNA，然后将其作为核糖核酸（RNA）分子（能阻止外来DNA的匹配）的一个模板保存起来，就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰（RNAi）的系统来摧毁核糖核酸一样。简单地说，基因编辑器能模仿入侵者的基因以干扰入侵者的基因编码，从而抗击入侵者。
2007年，总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司——丹尼斯克公司（后被美国杜邦公司收购）的鲁道夫·巴兰格等人在研究中证明，他们通过添加或删除与噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA，增强了嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力。也就是说，通过基因编辑器可以增强细菌防御噬菌体的能力。细菌借助基因编辑器而使自己具备一种有高度适应性的免疫系统，使得它们能击退来自某些噬菌体的多次进攻。
当然，基因编辑器更为现实的作用是能够为食品生产培育更强壮的菌株。因为乳品业通常依靠细菌（诸如嗜热链球菌）生产酸奶和乳酪，嗜热链球菌能将牛奶中的乳糖分解为有刺激性的乳酸。但是，噬菌体能攻击嗜热链球菌，从而让后者不能发挥作用，使得制造的酸奶或其他食物的质量或数量遭受严重损害。
到了2013年，研究人员对基因编辑器有了更多的了解，他们发现，基因编辑器似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。
新生命的诞生
利用基因编辑器，研究人员可以更为迅速地改变或删除细胞中的多个基因，从而可以治疗一些遗传性疾病，例如亨廷顿病，甚至可以治疗艾滋病等现在无法治愈的疾病。当然，这一技术还以用来纠正体外受精胚胎的基因缺陷，如此，将可以创造新的健康生命。
现在，中国研究人员利用基因编辑器走在了创造新生命的前列。南京医科大学生殖医学国家重点实验室、云南省灵长类生物医药研究重点实验室和南京大学的研究团队利用基因编辑器，首次在全球创造和孕育了两只靶向基因编辑猴。创造靶向基因编辑猴的目的是建立猴子疾病模型。由于人与猴子有较大的相似性，因此可以用猴子来模拟人类，试验药物和治疗遗传病，从而降低以人做试验的风险。
基因编辑器可以对目标基因进行插入、删除或重写，类似编辑人员对文字进行编辑、删改和插入一样，是一种对物种基因进行编辑加工的过程，由此不仅可以改变基因的功能，而且能创造新的生命。
研究人员先是给猴胚胎细胞注射定制的核糖核酸，然后把基因编辑器中的一种编辑工具DNA切割酶Cas9引导至期望的基因突变位点，修改了3个基因。这3个基因分别是，调节代谢的基因Ppar-γ、调节免疫功能的基因Rag1和调节干细胞和性别决定的基因。研究人员在180多个单细胞期猴胚胎中同时靶向编辑了这3个基因，然后对15个胚胎的基因组进行测序，结果发现其中有8个胚胎显示出两个靶基因同时突变的证据。这两个基因就是调节代谢的基因和调节免疫功能的基因。
此后，研究人员将这种经过遗传修饰的胚胎转移到代孕母猴体内，其中一只母猴分娩出了一对孪生猴。对这对孪生猴的基因组进行检测后发现，它们的DNA中确实存在两个突变的靶基因。也因此把这两只猴称为靶向基因编辑猴。
当然，现在这两只猴子还处于幼年期，尚无法验证是否经过编辑的靶基因会产生作用，即是否会在猴子的代谢和免疫功能方面出现变化，而检验这些功能需要等到3年后猴子成年时才能观察到。
另一方面，人和动物的一些生理功能和病理表现并非只是一两个基因就能决定的，所以，在未来评估这种靶向基因编辑猴时，还要评估和观察其他基因是否起作用，而且要检测是否靶向基因编辑猴的所有细胞中都有这种经过编辑加工过的基因，如此才能全面地评价这种猴子的价值。
但不管怎样，靶向基因编辑猴的诞生也提供了改变和修饰基因以治疗疾病的一个新的方向。
其实，基因编辑器的原理比较明确，就是找到目标基因并干扰这种基因的表达，或让这种基因处于沉默状态，不能表达。
在基因干扰的研究上，研究人员早就有类似的发现。1990年，一个研究小组给矮牵牛花转入一种催生红色素的基因，希望这种转基因矮牵牛花变成鲜红色。但是，事与愿违，矮牵牛花不仅没变成鲜红色，反而完全褪色，花瓣变成了白色。这是为什么呢？
1998年美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛揭开了其中的奥秘，原来是核糖核酸干扰造成的。核糖核酸过去被视为从DNA转录遗传信息的“二传手”，蛋白质是根据其转录的信息来生产的，所以它只是一个信使。但是，法尔和梅洛发现，核糖核酸在转录信息时，有时是忠实传递信息，但有时会打折扣，从而使特定基因开启、关闭、更活跃或更不活跃，最终影响到生物的体型、外表、颜色和发育等。正是由于产生了干扰，转入矮牵牛花的红色素基因沉默下来，不能表达，矮牵牛花就不会变成红色。为此，法尔和梅洛共同获得2006年的诺贝尔生理学或医学奖。
利用核糖核酸干扰可以让一些致病基因沉默，以治疗疾病，例如，核糖核酸干扰可治愈实验鼠的肝炎。但是，核糖核酸干扰是通过阻断信使核糖核酸（mRNA）来阻止蛋白质生成，这时DNA的信息已经转录到核糖核酸中了，这如同马已离厩，要进行特定的干扰，有时已经太晚。
但是，基因编辑器所进行的干扰则是在DNA的信息还未转录到核糖核酸之时，也就是说，是在马还未离厩时对目标马匹（目标基因）的干扰。
更有意义的是，基因编辑器也需要核糖核酸协同作用，因为它可以为编辑器中的切割酶Cas9导向（所以基因编辑器又称为CRISPR-Cas9系统），引导其在特异位点裂解完整基因组，这个特异位点就是目标基因的位点，从而修改、修复目标基因序列，或插入新的基因片段，以干扰目标基因。
[关键词] 基因靶向修饰技术；Cas9；CRISPR/Cas；基因组编辑；基因治疗
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（a）-0154-04
Review about CRISPR/Cas system as a new targeted genome editing technology
JIA Liangjie
College of Life Sciences， Shaanxi Normal University， Shaanxi Province， Xi′an 710119， China
[Abstract] CRISPR （clustered， regularly interspaced， short， palindromic repeats）/Cas （CRISPR-associated） systems are a unique prokaryotic defense against foreign genetic elements. It also be considered as a targeted genome editing tool in molecular biology research. Because of its simplicity， high success rate and high efficiency in genome targeting， Cas system became the best genome targeting tools compared with ZFNs （Zinc-finger nucleases） and TALENs （Transcription activator-like effector nucleases）. According to the recent researches， Cas system could be used as an efficient system for site-specific transcriptional repression or activation. Additionally， a specific Cas9 protein has been observed to target an RNA substrate， suggesting that Cas9 may have the same ability as RNAi technology to be programmed to target RNA as well. Overall， the targeted genome editing technology via CRISPR/Cas system has been Widely promoted and applied in many field such as the research on gene functions， the the disease model of gene knock-out animal construction and the gene therapy. So it will have significant impact on future advancements in genome engineering.
[Key words] Gene targeting； Cas9； CRISPR/Cas； Genome editing； Gene therapy
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）系统是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质免疫系统，通过序列特异的RNA介导，切割降解外源性DNA，这些外源性遗传物质包括噬菌体或者外源性质粒[1]。CRISPR/Cas系统可分为三种类型，其中类型Ⅱ CRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。在类型Ⅱ CRISPR/Cas系统中，CRISPR能够转录产生前体crRNA（Pre-CRISPR RNA，Pre-crRNA），Pre-crRNA经过Cas9-tracrRNA复合物加工后产生成熟的crRNA（CRISPR RNA），crRNA的5′端区域能够与靶位点互补配对，而其3′端能够与tracrRNA（trans-activating crRNA）及Cas9蛋白形成复合物，从而引导Cas9蛋白结合于靶位点进行特异性地切割。CRISPR/Cas系统与其他外源核酸防御系统（如限制修饰系统）最重要的区别在于：CRISPR/Cas系统具有记忆性，细菌会记忆首次入侵外源核酸的信息，在其再次入侵时，特异性的识别并切割这些外源核酸酶使其降解，保护自身遗传物质的完整准确[1]。特异的Cas蛋白会识别外源性的遗传物质中具有原型间隔序列毗邻区（protospacer adjacent motifs，PAM）的DN段，通过Cas蛋白将PAM5′端的DNA（即原型间隔序列）加工成短的DN段，插入到其CRISPR序列的重复序列之间，最终使得细菌通过spacer序列识别并且随后靶向这些外来原件进行切除[2]。
类型Ⅱ CRISPR/Cas系统组成最为简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA、RNase Ⅲ四种成分即可发挥作用[3]。在这一系统中，Cas9蛋白在crRNA的加工以及对外源DNA的特异性切割中都发挥着重要的作用[4]。因此本综述也主要介绍针对类型ⅡCRISPR/Cas改造而来的相关技术。
1 CRISPR/Cas系统可以作为一种位点特异性基因编辑平台
CRISPR/Cas系统作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点在于操作简单，这是因为其识别的特异性是有crRNA序列决定的。有报道称，可以通过人工合成crRNA序列使得Cas9系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA序列上，最终介导Cas9蛋白特异性的切割该杂交区域[5]。与crRNA互补的靶位点序列称为原型间隔序列，除了与crRNA存在互补序列外，在互补序列的毗邻区还必须存在原型间隔序列毗邻区（proto-spacer adjacent motif，PAM）。PAM序列对于Cas9系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义，其使得双链RNA复合体与靶序列精准的结合，并有效地避免了自身结合现象的发生。
在Cas9系统发挥识别剪切过程中，tracrRNA首先与crRNA形成crRNA：tracrRNA复合体，Cas9蛋白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，在crRNA的引导下识别并切割靶位点。为了进一步简化操作过程，研究人员依据crRNA：tracrRNA复合体的结构特征设计了sgRNA（single guide RNA），sgRNA具备crRNA：tracrRNA复合体的功能，能够被Cas9蛋白识别并引导Cas9蛋白结合于靶位点[5]。
上述Cas9所具有的这些优点使得其能够成为一种跨平台的基因编辑工具在多种实验模型中发挥价值。最新的研究结果显示，Cas9作为一种基因组编辑工具已经成功的应用在细菌、酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中（既包括传代细胞系和干细胞中）[5-7]{Cong，2013#427}{Cong，2013#427}{Mali，2013#409}{Mali，2013#409}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}{Cong，2013#425}。这说明了它是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编辑工具。Cas9-sgRNA在靶位点切割产生双链DNA断裂（Double strand break，DSB）后，细胞可以通过两种方式对DNA进行修复，非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）修复方式和同源重组方式（homology-directed repair，HDR）。非同源末端连接往往使得核酸链被剪切的区域发生基因突变，导致编码的基因会丧失功能[8-9]。而同源重组往往通过供体DNA与基因组DNA之间的同源重组造成靶位点的纠正或者靶向插入外源基因[8-9]。
由于sgRNA对靶序列识别的长度只有20个碱基，且Cas9蛋白对sgRNA 5′端序列与靶位点的错配不敏感，这使得Cas9-sgRNA技术的脱靶率比较高。为了提高该技术打靶的特异性，一种突变型的Cas9蛋白（Cas9 D10A）被构建出来[8-9]。这种突变型的Cas9核酸内切酶是将Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域之中的一个（RuvC-Ⅰ）经过点突变的从而失活，另一个切割结构域被保留，从而使得目标序列形成单链断裂（nicked DNA）[5]。这样需要有结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9 D10A识别并切割靶位点才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性[8-9]。
2 利用Cas9系统在转录水平对基因表达的调节
Cas9-sgRNA作为一种能够与靶位点特异性识别并切割的技术，其用途不仅限于对靶位点的靶向编辑。通过点突变使Cas9蛋白的两个核酸内切酶结构域活性全部丧失获得dCas9，但是dCas9仍保留了与靶位点特异性结合的能力，这样将dCas9-sgRNA作为与DNA特异性识别的平台，同样具有很大的应用价值[5，10]。dCas9-sgRNA结合与DNA上，阻断该位点上基因的转录，可以起到转录抑制的效果。如果在dCas9的C端融合转录抑制结构域KRAB（Krüppel associated box），获得的dCas9-KRAB-sgRNA具有更强的转录抑制效果，将可以替代脱靶效应明显的siRNA技术。如果在dCas9的C端融合转录激活结构域p65AD，则可获得能激活特定基因转录的转录因子[10]。通过以上这两个方面的改造可以使Cas9-sgRNA成为对基因表达的调控工具。由于原核表达系统中，需要依赖于诱导与阻遏调控机制，相反，真核生物中，调控的方式是散在的协同调控方法。所以当我们设计在原核生物中表达一个真核生物的基因或是在真核生物中表达一个原核生物的基因时，这就需要在基因序列前附加一个新的启动子和具有调控作用的小分子进行转录水平的调控，甚至需要对于特定的基因序列设计相应的增强子来对于目标基因的表达进行调控，而利用dCas9-激活或抑制系统就可以绕过这些繁琐的步骤[11-13]。
3 利用Cas9系统对目标RNA序列进行操纵
最近，相关研究证明了病原体Francisella novicida基因组中编码的Cas9核酸内切酶能够引起一个位点特异性的转录抑制作用[14]。该文章报道了通过tracrRNA和一种新型的小RNA（small CRISPR/Cas-associated RNA，scaRNA）所介导，F.novicida Cas9（FnCas9）能够与靶向的mRNA相结合，从而进一步发生反应的过程。随后，这种Cas9-scaRNA-tracrRNA-mRNA复合结构的各组分之间互作导致了mRNA稳定性衰减从而将靶序列的表达量降低。以此可以推测FnCas9或可能其他的Cas9系统将可以很容易的被介导靶向RNA。事实上，实验还为研究Cas9系统优先靶向RNA或DNA的机制方面提供了启发，也就是FnCas9系统作为Cas9系统的一个个例，具有较强的结构特异性和序列需求性。
FnCas9系统靶向特定的RNA序列原理做出第一种推测是， FnCas9系统自身结构的特殊性决定了功能。在目前已知的蛋白结构中没有一个是可以通过保守残基与靶向mRNA结合的[14]。相反，在FnCas9系统中存在一个精氨酸富集基元（arginine-rich motif，ARM）结构域，并被证明是在其结合mRNA的过程中发挥了重要的作用[12]。FnCas9系统可能在tracrRNA和mRNA中间形成了一个简单的脚手架结构，这个结构促使了靶向的核酸内切酶对目标区域RNA的降解[15]。另一种推测是介导RNA和靶向RNA之间的非同源性互作下进行识别并结合。实验证实，这个现象在病原体F. novicida中出现，tracrRNA上与mRNA反向互补的同源序列和非同源序列相互交错结合，从而形成tracrRNA-mRNA复合物。
这项新的技术一经提出，预示着FnCas9将会代替shRNA（short hairpin RNA）/siRNA等传统RNAi（small interfering RNA）技术成为一种新型的RNA干扰物而对于不同种类的细胞及动物模型定的基因的下游产物进行RNA干扰[16]。在目前的研究成果看来，并不能确定此系统能否稳定地在真核生物的细胞之中都能发挥降解RNA的作用[23]。当然，FnCas9系统也并不是唯一一个能够与mRNA结合产生干扰作用的Cas9系统一种存在于Pyrococcus furiosus 的CRISPR/Cas蛋白亚型（Ⅲ型）被证明可以靶向消化RNA底物[16]。研究发现，与先前提到的FnCas9相比，这一系统所能够识别并干扰的RNA序列更长，也就表明，这一系统与基于Cas9系统的FnCas9干扰物相比有更高的特异性，这一平台的发现将极大促进RNAi技术的进步。
4 展望及结语
到目前为止对CRISPR/Cas9技术的开发尚属初步。首先，虽然Cas9系统会被sgRNA引导从而识别出靶序列，但脱靶效应依然存在[11]。为了减少脱靶效应，研究人员得出了很多方法改变现状，如通过改变sgRNA的二级结构、改变sgRNA的长度、或是通过互补的切口酶预先制造双链DNA断裂，这都能有效地减少脱靶效应[11，17-19]。另外，PAM区域与靶片段的同源序列的长短也在近期被报道，在对于Neisseria meningitidis中的Cas9系统（NmCas9）的PAM序列的特异性分析的报道中我们就可以发现，NmCas9系统的PAM区域（5′-NNNNGATT-3′）与Streptococcus thermophilus中的Cas9系统的PAM区域（5′-NNAGAAW-3′）比Streptococcus pyogenes Cas9（5′-NGG-3′）对PAM区域配对的要求严格的多[5，8，20]。
从最开始认识到CRISPR作为细菌和古细菌的一种免疫系统，到之后通过观察到这种获得性的免疫能力的细菌或是古细菌也能够生存下来并能将免疫能力传递给下一代，认识到 CRISPR/Cas9是一种能够遗传的免疫系统，这完美地验证了拉马克的获得性遗传理论[21]。通过这种在原核生物中发现的遗传物质靶向操作系统，现在能够很快速地对遗传物质进行操作或修饰，无论是在细胞系中还是在模式动物的胚胎中[22]。CRISPR/Cas9系统在基因治疗方面能够发挥较大的作用。通过导入Cas9系统和相应的靶向致病基因的sgRNA载体，来对遗传缺陷进行纠正或删除，这种技术将在未来几十年之内将会逐步成为一种可靠地治疗手段。当然，与成熟的ZFN 和 TALEN等遗传物质靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9核酸内切酶系统具有得天独厚的优越性，其优越性体现在如构建简单方便快捷、安全性高、毒性小等方面。CRISPR/Cas9系统在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将会发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。
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早在1987 年，CRISPR序列由日本科学家在大肠杆菌中发现[1]，但由于这段序列的功能无法确定，因此该发现一直未引起人们的注意，随后，研究人员研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，随着人们对该结构的逐渐了解，2002 年，这种结构被正式定义为CRISPR。2005 年，研究人员发现CRISPR的间隔序列可以识别并结合特定的噬菌体DNA 序列，从而使得CRISPR序列在获得性免疫中发挥作用。2008 年，Marraffini 等[2]发现细菌CRISPR 系统能够阻止外源质粒的转移，并首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能，科学家们也由此揭开了研究CRISPR 系统作用机制的序幕。
1 CRISPR的结构与分类
CRISPR 作为一种特殊DNA 重复序列，主要由多段长度为25 50 bp 长度的高度保守重复序列和26 72 bp 长度的间隔序列串联而成。同一个CRISPR位点中的重复序列一般具有极高的保守性，5’端与3’端部分尤为保守，但在微生物种间甚至同一个基因组的不同CRISPR位点间却存在较大的差异。另外，不同的CRISPR位点，其包含的间隔序列的数量差别也很大，从几个到几百个不等。
CRISPR/Cas 系统大体上可以分为3大类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型在介导外源DNA 降解过程中需要多种Cas 蛋白来参与反应，形成的切割复合体结构复杂，Ⅱ型系统组分则较为简单，只需要一个Cas9 蛋白来切割DNA 双链。一个简易的Ⅱ型CRISPR/Cas 系统必定要含有gRNA 和Cas9，Cas9 蛋白具有改造crRNA 和破坏双链DNA 的双重功能，位于gRNA 5' 端的20 bp左右的碱基决定CRISPR/Cas9 系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的位点，主要负责决定CRISPR/Cas9 系统的特异性。目前以Ⅱ型CRISPR 系统为基础的CRISPR/Cas9 系统在基因组编辑中有较为广泛的应用。
2 CRISPR/Cas9的作用机理
CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的基本原理为，将tracrRNA： crRNA 设计为引导RNA（gRNA），gRNA 包含位于5’端靶DNA 的互补序列以及位于3’端tracrRNA： crRNA 的似序列，利用靶DNA 的互补序列来定位需要编辑的位点，利用该类似序列与Cas9进行结合。该技术仅设计引导RNA 即可实现对含有PAM 序列的任一靶DNA序列进行插入、敲除与定点突变等修饰。由于设计操作简单、通用性好及编辑效率高等优势，CRISPR/Cas9 的基因编辑技术已成为TALEN 与ZFN之后的新一代基因组编辑技术。
另外，CRISPR/Cas9 系统还可以实现同时对多个不同靶DNA 序列进行编辑。利用CRISPR 位点自身的特点，设计对应不同靶DNA 序列的间隔序列，插入到重复序列之间，经过转录加工后会形成多个可定位于不同靶DNA 序列的双引导RNA，或者串联不同的sgRNA均可实现对哺乳动物细胞基因组的多个不同基因同时进行编辑。
3 CRISPR技术的应用
CRISPR/Cas9 系统作为新兴的基因编辑技术，目前已逐步在人类细胞、斑马鱼、小鼠、酵母、果蝇、细菌及水稻等作物中进行研究并报道。
在作物新品种培育和改造时，传统的转基因技术培育和改造新品种一般采用利用外源基因随机整合的方式，转基因表达的可控性较差。而CRISPR/Cas9 技术则可以进行定点修饰，达到高效定向。Shan 等用该技术敲掉了小麦的一个基因，得到了耐白粉病的小麦新品种。该团队还利用CRISPR/Cas9 技术定点突变了小麦和水稻两种作物的MLO 和PDS 等5 个基因。
在哺乳动物的研究方面，研究人员采用该技术建立基因打靶小鼠，结果证实，采用该技术不仅可以通过非同源末端连接途径实现对多个靶基因的定点敲除，还可以通过同源重组途径对多个靶基因进行靶向修饰。这些成果为其在生物工程、基础医学、医药学科等多种领域中的应用中提供了有力的基础。
4 展望
CRISPR/Cas9 作为细菌最为简单的Ⅱ型获得性免疫系统，被成功改造为继TALEN 与ZFN 之后新一代基因组编辑技术，为基因组的定向改造调控与应用等带来突破性革命，且相对于TALEN 和ZFN，CRISPR/Cas9有其独特的优势：（1）构建和设计方法简单快捷，成本低廉，适用于任何分子生物实验室；（2）用于基因组的点突变编辑效率优于ZFN和TALEN；（3）可同时实现多个基因的打靶。可见，CRISPR/Cas9 在基础理论研究、农牧渔业和临床治疗等领域必将有越来越广阔的应用前景。当然，目前关于CRISPR/Cas9 系统还有许多亟待解决的问题，相信随着人们逐步深入和全面的研究，CRISPR/Cas9 技术将会展现出其无比强大的生命力。
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[关键词]基因编辑技术； CRISPR/CAS9； ZFNs； TALENs
基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术，可对特定DN段进行敲除、加入和替换等，从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。此过程模拟了基因的自然突变，修改并编辑了生物的基因组，使研究人员可以在极短时间内模拟自然界漫长时间的基因演变，甚至能够完成自然进化中无法完成的基因组改变。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，研制如改良水稻等粮食作物；在医疗领域，该技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机制和探究基因功能，以及改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。
锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因编辑技术。这3种技术皆是通过在特定的靶向序列处引入双链断裂缺口（doublestrand break，DSB），继而通过NHEJ途径（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途径这2种细胞内DNA修复机制完成修复。NHEJ途径（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口处有碱基的插入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途径在提供外源DNA模板的条件下使基因组DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加[1]。由此可见，这3种基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。
11ZFNs每个锌指核酸酶单体都是由锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）与非特异核酸酶结合的人工合成酶。此酶的N端部分是能识别含有特定DNA序列的锌指蛋白，C端部分则由非特异性切割结构域Fok I以及连接DNA结合结构域和内切酶的肽段组成[23]。ZFN的特异性取决于ZFP，因此筛选高质量的ZFP是获得高效、特异性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6个锌指组成，每个锌指识别基因组中连续的3个碱基。ZFP一旦与基因组中的特定序列结合，Fok I核酸内切酶便会形成二聚体发挥内切酶活性，产生DNA双链断裂的缺口，继而通过细胞内修复机制对断裂部位的基因进行修饰[811]（图1）。ZFN的基因打靶效率一般能够达到30%，可以做到针对特定序列设计ZFN来实现对靶基因的修饰。然而ZFN识别结构域存在的上下文依赖效应大大降低了ZFN设计和筛选效率。目前尚不能针对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN，也不能在每一个功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点。在ZFN的筛选和设计方面存在较大的技术困难之外，其制备价格也比较昂贵。此外，ZFN的脱靶切割也往往会导致细胞毒性。综上这些因素使得ZFN在基因治疗领域的应用有一定的局限性。
12TALENsTALEN是植物病原菌黄单胞杆菌Xanthomonas sp.产生的TALE蛋白的中央区域结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域组合而成的一类重组核酸酶。TALE蛋白的中央区域结构域是该蛋白识别特异DNA序列的结构域。它包含了155～195个蛋白单元模块，每个模块单元有34个氨基酸残基，其中除第12和13位氨基酸可变外，其他氨基酸都是保守的。因此，这第12和13位氨基酸被称作重复可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues，RVDs） 位点[12]，是靶向识别的关键。由于TALE存在多种变体，所以可以构建出靶向基因组中预设DNA靶位点的多种TALEN。相比ZFN技术，TALEN使用了TALE蛋白的中央区域结构域代替ZFP作为人工核酸酶的识别结构域，更好地解决了DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白中央区域结构域对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定：组氨酸天冬氨酸特异识别碱基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺异亮氨酸识别碱基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸识别碱基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺识别碱基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺赖氨酸识别碱基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺丝氨酸可以识别A，T，G，C 中的任一种NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（图2）。这种与DNA碱基一一对应的方式在设计上相对于ZFN要简单得多。然而，在实际构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程也比较繁杂，通常需要大量的测序工作。这使得该技术的使用成本较高，对于普通实验室的可操作性较低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效导入细胞方面也限制了它的应用。
13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统[15]，由成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR与Cas蛋白组成，能特异性识别外源病毒或质粒的核酸物质，并对其进行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通过转录生成一段非码RNA，即CRISPR前体
的靶标可设计为针对一个基因，也为针对多个基因，都能达到有效的特异性位点编辑的效果。CRISPR/Cas9系统已被公认为是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第3代“基因组定点编辑技术”。ZNFs和TALENs作用时均是采用蛋白质对DNA序列的识别，而CRISPR/Cas9对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程。该识别方式使得CRISPR/Cas9与前二者相比更为精准，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通过导入质粒进行表达，因此也省去了耗时耗力的蛋白质工程过程。同时，研究人员可以通过生物信息学分析，设计出针对绝大多数基因的特异性靶标识别crRNA。因此，与前2代技术相比，CRISPR/Cas9成本低、制作简便、快捷高效、脱靶率低的优点使其迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，逐渐成为当今分子生物学领域最炙手可热的技术之一。然而CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不完美之处：Cas9 蛋白对于目标序列的识别除了依靠crRNA序列的匹配之外，目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序（PAM），因此Cas9 蛋白对于设定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能会随机产生细胞毒性的问题。
14 NgAgoCRISPR是以RNA为向导寻找靶向序列，而NgAgo则是以DNA来担任向导。韩春雨等的工作显示，NgAgo可结合24个碱基的gDNA，比CRISPR结合19个碱基的gRNA要长5个碱基，因此理论上精确性要高1 024倍，脱靶率也较低。然而，不同于CRISPR/Cas9技术大量运用已获得了实践验证，NgAgo的作用效果还有待于今后工作的检验。
2基因编码技术的应用
21在基因治疗中的应用随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多疾病都与基因突变、缺失或表达异常有关，由此基因治疗技术顺势而生。基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因或有治疗作用的基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通过细胞内基因修饰来治疗疾病。近两三年来，基因编码技术作为该策略的新生力量开始活跃在基因治疗的舞台上，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩。
癌症治疗方面：2015年11月英国伦敦大奥蒙德街医院（Great Ormond Street Hospital）的医生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的疗法，成功地治愈了一名患有“无法治愈的”白血病的1岁女孩“莱拉”（Layla）。其治疗方案是利用TALEN蛋白对异体T细胞进行基因编辑，去除内源性TCR（提高肿瘤杀伤特异性）及CD52（避免药物alemtuzumab的干扰），并命名为antiCD19 CART细胞，再将这些经过设计的“人工培育的免疫细胞”输入患者体内去捕捉和杀伤肿瘤细胞。经过1个月的治疗，这名女孩目前摆脱了癌症，身体状况很不错，成为世界上首次用基因编辑治愈的白血病女孩[18]。此外，科学家们在过去的几十年中已经确定了许多肿瘤治疗中相关的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因组修饰类、基因抗药性基因。近2年，研究者们已经开始利用基因编码技术对上述基因开展了大规模的基因编辑修饰研究，预计今后几年内会出现多项癌症治疗方面的重大突破。
遗传性疾病治疗方面：2015年底《Nature》杂志发表的对2016年热点研究领域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美国加利福尼亚州里士满Sangamo生物科学公司将计划开展利用ZFN纠正导致血友病基因缺陷的人体试验，并对其研究成果表示非常期待。另外该公司还与马萨诸塞州剑桥市的Biogen公司合作开始了另一项试验，尝试通过该技术提高β地中海贫血患者体内一种血液球蛋白的功能[19]。已有研究证实人β珠蛋白（HBB）基因的突变可能导致地中海贫血症。我国中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，修改了人类胚胎HBB基因的DNA，为治疗地中海贫血症提供了可能。该研究中一共使用了86个胚胎，48 h后有71个胚胎存活，其中在54个接受了基因测试的胚胎中仅有28个胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遗传物质。该研究是史上第一例利用基因编辑技术改造人类胚胎细胞的案例。尽管该研究使用的胚胎均为无法发育成婴儿、不能正常出生的胚胎，该成果的伦理问题在西方仍引发巨大争议，由此《Nature》的记者和编辑们最终将黄军就选入了年度十大人物之列[20]。多种肌肉营养障碍症（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表达dystrophin蛋白的基因发生移码突变，导致不能形成有功能的抗肌萎缩蛋白dystrophin所引发的一种遗传性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技术成功修复了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南医学中心的Chengzu Long，杜克大学的Charles Gersbach，哈佛大学Amy Wagers 与MIT张锋合作研究组这3个独立的研究组又分别完成了小鼠成年体的基因修复。其中Chengzu Long研究组的研究方案为利用腺病毒将gRNA以及CRISPR/Cas9导入肌肉细胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能够产生较短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。
逆转录病毒相关传染病的治疗方面：HIV病毒的基因会整合到病人的基因组上。利用抗逆转录病毒药物治疗仅能抑制HIV病毒的复制但对整合在细胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用药物这些病毒余孽就会起死回生，开始产生艾滋病原体。因此只有清除整合在宿主靶细胞上的HIV病毒基因才能实现根治艾滋病的梦想。2013 年，朱焕章等设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并证实该ZFN能特异性靶向HIV感染及潜伏细胞系上的HIV1前病毒LTR，且介导了HIV1整合基因的高效切除，亩获得了显著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技术使带有HIV病毒的T细胞失去活性，同时病毒复制在受感染细胞中降低了90%。这一治疗方案预计在两三年后开展临床试验。
22在新方法学及动物模型制备上的应用当前，各类基因敲除（knockout）和基因嵌入/置换（knockin）基因工程动物及细胞系已经成为现代医学认识疾病发生发展规律、研究疾病预防和治疗的重要实验工具和手段。传统的基因工程动物制备工艺――基因打靶技术是基于胚胎干细胞的一种同源重组技术。利用该技术制备基因修饰动物周期较长且存在生殖系统传递失败的风险。新型的基因编码技术系统可在小鼠受精卵中直接进行基因组编辑，因而快速、高效、低成本、无物种限制地一步生成基因工程动物。复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室的研究人员通过CRISPR/Cas9技术进行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径[24]。Park 等[25]使用TALEN 技术将诱导的多能干细胞中含有F8 基因的140 kb染色体片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通过TALEN基因编辑工具将其之前倒置的染色体片段再重新恢复到正常。实验结果表明TALEN基因编辑工具既可以建立疾病模型，又可以介导疾病的再次纠正。军事医学科学院的研究人员利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将有丝分裂降解结构域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到进基因组表达框上游，以期周期性持续降解细胞内CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，从而获得CTCF蛋白特异性降解细胞系，为后续研究CTCF功能奠定基础[26]。
此外，随着现代生物技术的不断发展和完善，基因编辑技术已经变为科研人员的新宠，越来越多的科学家运用其与其他技术相结合进行各种学术研究。第三军医大学西南医院和重庆大学的研究人员通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复方法，用GFP标记HCC细胞中的内源多功能性因子Nanog，证明雄激素/雄激素受体轴可以通过直接结合其启动子，增加Nanog的表达，并促进HCC细胞的干性和肿瘤发生[27]，从而初步阐明了肝癌发生的性别差异的机制。CRISPR/Cas9技术的成熟使得利用多重sgRNA载体高效、高通量编辑细胞内基因成为可能，为新型功能遗传筛选创造了条件。IAA2（indole acetic acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员。由于没有该基因的失去功能型突变体，其功能和作用机制的研究受到了阻碍。研究人员在GoldenGate克隆技术的基础上，将每3个sgRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变，所得到的突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。
23其他应用前景目前，世界各地的实验室已将基因编辑技术应用于生物学研究的各个领域。
预防疟疾：利用CRISPR/Cas9对蚊子的基因进行改造，使其携带一种抗疟疾的基因，从而对疟原虫产生抑制，进而遏制疟疾的传播[29]。另一种改造为导入不孕基因，使疟蚊灭绝[30]。
器官移植：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。这为糖尿病人提供更为理想的临床异种胰岛移植供体。另外，有研究改造了猪肺基因以利于用于人体肺移植，以及去除了猪器官上的内源性逆转录病毒（PERV）以防止移植器官带来的病毒感染[31]。
生物制药：北京蛋白质组研究中心张普民教授及其研究团队利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行了基因编辑，在猪白蛋白的基因区域插入了人白蛋白的编码DNA，使猪只产生人白蛋白而不产生猪白蛋白[32]。
农业育种改良：利用CRISPR/Cas9技术几年内可实现至少50～100年才能完成的育种改良工作。圣保罗Recombinetics公司利用该技术培育出不会长角的牛，从而使牛无须经历被切去牛角的痛苦过程。目前该公司正致力于培育永远不需要被的猪。
灭绝物种复活：加州大学圣克鲁斯分校Ben Novak将灭绝的候鸽的博物馆标本DNA与现存鸽子进行序列比对，并尝试对现存鸽子进行基因改造，使这些鸽子变得更接近灭绝的候鸽。
3基因编码技术的争议与思考
基因编辑技术可谓当今生命科学界炙手可热的前沿科技。顾名思义，该技术能够对最基本的遗传单位――基因直接进行设计和修改，其意义和价值可想而知。这使得各大公司迅速加入到基因编辑的产业之中。2015年8月，比尔及梅林达・盖茨基金会和谷歌风投基金投资Editas医药公司1.2亿美元；2015年10月杜邦与Caribou生物科学公司达成了合作协议，使用CrisprCas9技术来改进农作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中国基因编辑技术产业已走在世界的前列：在CRISPR技术数上中国仅次于美国，位居世界第2；目前50多家中国研究机构已提交了基因编辑专利；劲嘉股份与黄军就团队合作开展CRISPR技术治疗地中海贫血在临床应用方面的研究。中泰证券的分析师认为未来5年仅地中海贫血基因治疗的国内潜在市场空间超过500亿元。与此同时，随着基因编码技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统相对前两代技术效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，构建周期缩短至原来的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脱靶率依据最新技术已降低至目前检测技术检测不到的水平。脱靶率、效率、便携性及成本的极大改善，使得该技术更平民化，技术门槛越来越低。它已成为许多车库生物学家/草根生物学家以及生物黑客的新宠。都柏林生物黑客和企业家Andreas Stürmer说，CRISPR是有史以来最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。
但任何事物都有其双面性，基因编辑技术产业虽然能够造福于人类，然而上面所述的巨大的经济利益驱动以及越来越低的技术门槛，再加上人类对自身健康改良的迫切心态极可能导致对该技术的滥用，进而对人类和地球环境形成威胁，甚至造成意想不到的生态灾难。在美国国家情报总监詹姆斯・克拉珀的威胁评估报告中，“基因编辑”已经被列入“大规模毁灭性武器和武器的扩散”威胁名单，与核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，关于该技术运用的争议从其诞生之日就已出现，并呈愈演愈烈之势。现有争议最集中之处为关于人类胚胎改造的伦理学争议。史上第一、二例基因编辑技术改造人类胚胎细胞的研究皆出现在中国。2015年4月，中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，为治疗地中海贫血症修改了人类胚胎基因组[33]。2016年4月29日广州医科大学范勇团队，宣布他们用基因编辑技术制造出一个能对艾滋病毒免疫的人类胚胎[34]。尽管这2例基因编辑研究都使用的是人类三核受精卵（不能正常发育的受精卵），但在国际上仍引起了广泛的关注和全球科学家激烈的讨论。讨论的焦点不在于文章的学术价值，而在于改造人类胚胎细胞的伦理问题。由于基因编译技术引发的伦理问题迫在眉睫，2015年12月1日，由美国国家科学院、美国国家医学院、中国科W院和英国皇家学会联合组织召集的人类基因组编辑国际峰会在华盛顿召开。会议重点了解各方对基因编辑技术的伦理问题的态度和想法。美国再生医学联盟主席兰菲尔（Edward Lanphier）等在《Nature》杂志上发表评论文章称，希望研究人员暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑，否则可能对后代产生无法预测的后果[35]。然而，人类胚胎改造的研究终究为大势所趋。2016年2月1日，英国政府批准了伦敦弗朗西斯・克里克研究所 Kathy Niakan研究员对人类胚胎进行编辑的请求。这项研究成为世界首例获国家监管机构批准的人类胚胎编辑研究。
综上所述，日渐成熟的基因编辑技术已经成为了强力的生物、医学工具，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面带了巨大的突破，可以快速构建实验新方法和动物模型，推动科研的发展，并在器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活和中药现代化等方面具有广阔的应用前景。其价值甚至引起了普通民众的广泛关注。人类畅想将来它不仅可去除遗传缺陷、治疗疾病，还可导入长寿、健康、强力的基因，甚至制造完美人类。当然，任何事物都是一把双刃剑，在乐观畅想基因编辑技术可使人类变得更加完美的同时，也不要忘记滥用技术可能带来的潜在风险和生态灾难。建立针对基因编辑技术安全有效的检测手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使这项技术更好地应用和造福人类。
4基因编辑在中药发展中的潜在前景
如何让传统中药跟上生命科学现代化的步伐，使传统中医药走出国门，让世界接受中草药，是当今中医药工作者面临的难题。长期以来，由于中医药与现代医学、生命科学之间缺乏有效沟通的桥梁，有逐渐被边缘化的趋势。中药基因组计划将现代生命科学的最新技术和研究成果应用于中药研究，有望彻底改变中药研究手段和方法的落后局面，架起传统中医药学与现代生命科学之间沟通的桥梁。中国中医科学院中药研究所陈士林团队在著名植物学杂志《Molecular Plant》发表丹参全基因组[36]，标志着作为常用中药丹参的遗传密码被破译，为揭示丹参主要药理活性成分丹参酮和丹参酚酸生物合成及其调控的分子机制，促进丹参优良品种选育提供了重要的遗传背景基础。该工作构建了世界上首个药用植物基因组框架图，标志着我国中药研究进入了基因组学时代。目前已有多个中草药如印度大麻、赤灵芝、牛耳草、铁皮石斛等完成了基因组测序。中草药基因组研究的飞速发展为基因编辑技术在中草药研究中的应用带来了极佳的时机和广阔的前景。今后研究者们可以以丹参研究为模板，借鉴国外的植物基因组研究计划的经验，对中草药在结构基因组学、功能基因组学和生物信息学等方向展开研究。在此基础上，利用基因编辑技术开展中药药效成分、药材的生长及抗性相关基因的研究和改造工作，结合先进的育种方法，筛选出既保持“道地血统”，又优质、高产、抗病的中药材优良品种。该工作既有利于实现中药标准化生产，使中药质量可控，又有利于解决当前中药材资源面临的“断粮”困境。
中药药材是现代药物研发最大的遗传信息资源之一。我国在该方面具有得天独厚的优势。《本草纲目》中记载了1 892种药用植物，1995年出版的《中华本草》收集了8 000多种药用植物，而且其中不乏很多名贵，稀缺的药材如人参，虫草等。另有统计表明，我国中草药已有12 000多种。基因编辑技术的成熟也为开发这个药物基因资源带来了良机。基因编辑技术在中药资源的引入和应用，将会为解决这一问题带来新的前景。通过基因编辑技术可以快速获得药材靶基因的突变或是导入异源基因，从而快速鉴定出该基因产物与药理活性成分的相关性和重要性，发掘出新的或更高效的药物相关基因，并可更清晰地阐明药理活性成分生物合成及其调控的分子机制。
尽管将基因编码技术引入中药研究能为传统中草药带来新发展和突破，但与当今各个领域广泛应用基因编码技术相比，其在中药研究中的应用还处于起步阶段，还有许多基础工作有待完善。比如这一技术的应用必须以完善的中药基因资源为基础，如果没有对中药特别是具有丰富药理药效学和临床应用价值的名贵中药的基因资源的研究与开发，基因技术体系的应用必然大打折扣。此外，也不能盲目的为了中药的基因而基因，浪费大量的人力物力资源，应有的放矢的将目标集中在既具有重要临床应用价值的名贵或濒临灭绝的中药基因资源的研究与应用上，为中药现代化搭建良好的基础技术平台，让现代基因技术更好的为传统中药的发展服务。
[致x]李连达院士对本文的选题、框架设计等给予了诸多宝贵意见。
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农业时代的开启
“遗传”，听起来是个人人都能理解的名词。中国人说“种瓜得瓜，种豆得豆”，英美人说“like father like son”。这些俗语里反映的生物代际之间的相似性，就是遗传。先人们大概早就发现，不管是动物还是植物，不管是生物的外形、行为，还是性格，这些性状都能在一代代的繁衍中顽强地延续和保留下来。
实际上，早在人类文明开始之前，人类就已经充分―尽管也许是下意识―观察到了遗传现象的存在，甚至已经开始利用遗传规律改善自己的生活了。
现代人类的祖先可以追本溯源到数百万年前的非洲大陆。在两百多万年的无尽岁月里，先祖们在非洲大陆上采集植物果实、捕获动物，过着靠天吃饭、随遇而安的日子。人类文明的曙光出现在距今十几二十万年前。那时，现代人的直系祖先―人属智人种―出现在非洲大陆，并且很快一批批地走出非洲，在全世界的各个大陆和主要岛屿上开枝散叶，也把采集和狩猎的固有天性带到了世界各地。在那个时候，还压根看不出我们这些身材矮小、面相平凡的先祖会在日后成为整个地球的主宰。
然而，就像突然拥有了某种未知的魔力一般，差不多从一万年前开始，在世界各地快乐采集和狩猎的智人先祖们，几乎在一眨眼间就改变了赖以生存的生活方式。这些变化开启了农业时代，也最终催生了今天建立在发电机、汽车、互联网和生物技术基础上的全新人类社会。而这一切变化的开端，就是祖先们对于遗传规律的利用。
在贾雷德・戴蒙德的名著《枪炮、病菌与钢铁》中对此有着生动详尽的讨论。就在人类先祖走出非洲的必经之路上，地中海东岸生长着繁茂的野生小麦，它们的种子富含蛋白质和淀粉。不难想象，当生活在中东新月沃地的人类先祖们在偶然间发现这种植物后，一定会如获至宝地将它们作为日常采集和储藏的对象。对于先祖们来说，这和他们数百万年来在非洲大陆的日常采集工作并无分别。
但是如果先祖们想要把这些野生小麦挖出来，为他们提供稳定的食物来源，就会遇到一些棘手的问题。野生小麦的麦穗会在成熟后自动从麦秆上脱落，将种子尽力播撒到周围的泥土里。这是这些禾本科植物赖以生存繁衍的性状之一，但这也使得人类先祖想要大规模收获小麦种子变得非常困难。后来，在某个不知名的具体年代，生活在中东地区的远古居民们无意间发现了一些遗传变异小麦。这些小麦的麦穗即便成熟以后，也不会自动脱落。
泛生子的概念
从理性高度思考遗传本质
很容易想象，如果这些变异小麦出现在野外，我们只有死路一条。因为它们完全无法通过脱落的麦穗散播自己的后代。但这些变异植株对于我们的先祖们来说却无比珍贵，因为这样的遗传突变小麦会大大方便他们在固定时间大批收割麦穗、储存麦粒！更要紧的是，先祖们一定也在无意间发现了遗传的秘密―种瓜得瓜，种豆得豆，因此这些仿佛是上天赐予般的神奇的小麦种子，也将会顽强地保留这种对人类先祖而言―而不是对小麦自身，极其有利的性状。所以我们可以想象，先祖们可能会将这些奇怪的植物小心移植到村庄周围，用心呵护，直到收获第一批成熟的种子。这些种子将成为下一年扩大种植的基础。就这样，伴随着一代代人类先祖们的细心发现、栽培和收获，符合人类需要的优良性状被保留了下来，一直保留到今天。这些无意间发现的遗传突变小麦，可能标志着人类农业社会的开端。
最早从理性高度思考遗传本质的，是同样生活在地中海边的古希腊人。在古希腊哲学家德谟克利特和希波克拉底看来，遗传现象必然有着现实的物质基础，不需要用虚无缥缈的神来解释。在他们的想象里，遗传的本质是一种叫作“泛生子”的微小颗粒。这种肉眼不可见的颗粒，在先辈的体内无处不在，忠实记录了先辈从形态到性格的各种性状，并且会在过程中进入后者体内。以泛生子颗粒承载的信息为蓝图，子代得以表现出对先辈们的忠实模仿。
必须承认，泛生子的概念本身，其实并没有解决任何实际问题。或者刻薄点说，这只是把人们习以为常的遗传现象用一个听起来晦涩难懂的名词概括了出来而已。但是这个从现象到概念绝非毫无用处。至少，借用这个概念，人们可以把许多看起来很不一样的现象联系起来。
例如，无性生殖―微小的细菌和酵母能够一分为二产生两个后代；有性生殖―雌雄家畜后会产生出一群嗷嗷待哺的小崽儿；甚至还包括果树的嫁接―为什么果树嫁接后的果实会带有接穗和砧木的共同特征，不就是因为泛生子颗粒能够从砧木毫无障碍地流动到接穗里面去，和接穗的泛生子合二为一嘛。
因此，这个生命力顽强的概念从古希腊时期一直流传到了近代。甚至在19世纪中期，在达尔文创立进化论，为地球生命和人类的起源找到科学解释的时候，他仍然借用泛生子的概念作为自然选择理论的遗传基础。
进化论遭到的批评
宗教人士的攻击与严肃的科学批评
在达尔文看来，一个生物个体的所有器官、组织乃至细胞，都碛凶约鹤ㄊ舻姆荷子颗粒。手的泛生子记录着每个动物的手掌大小、宽窄、掌纹乃至毛发的生长位置，眼睛的泛生子当然少不了记录眼睛的大小、虹膜的颜色等。在的过程中，来自父母双方的泛生子融合在一起，共同决定了后代们五花八门的遗传性状。
更要紧的是，泛生子携带的生命蓝图一旦出错，就会导致后代遗传性状的“突变”，而这些突变，就是达尔文进化论中自然选择和适者生存的物质基础。正是因为有突变，一代代生物个体才会具有微小但能够稳定遗传的差异，而这些遗传差异影响着生物个体在环境中生存和繁衍的能力，并最终导致适者生存。
达尔文的进化论在诞生后遭到了猛烈攻击，特别是在宗教界人士和虔诚的信徒们看来，达尔文的学说亵渎了人类万物之灵的神圣性，也把传说中按照自己的模样造人的上帝置于可有可无的尴尬地位。但很少有人知道的是，进化论同样遭遇了严肃的科学批评。热力学创始人之一、物理学家开尔文勋爵当时估算出地球的年龄至多不会超过一亿年，而这点时间远远不够积累出达尔文进化所需要的五花八门的遗传突变（当然，后来人们意识到地球的年龄远大于此）。
古生物学家们对此发出了诘难，按照进化论，地球上必然存在许许多多物种之间的中间形态，但是它们的化石又在哪里呢？有一个批评可能是最致命的，因为它声称发现了进化论和遗传融合理论的深刻矛盾，换句话说就是，达尔文辛辛苦苦为进化论找到的遗传基础，可能根本不支持进化论的声明！这一批评来自苏格兰工程师、爱丁堡大学教授亨利・弗莱明・詹金。他评论说，按照达尔文的进化论，生物的遗传物质需要经历漫长、微小的突变过程，才能产生足够显著的形状变化，最终造就地球上千万种五花八门的物种。
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冷暴力
作者：[法国]玛丽-弗朗斯・伊里戈扬
出版社：后浪丨北京联合出版公司
出版日期：2017年6月
定价：38.00元
本书首次提出了“精神虐待”这一概念，它广泛发生在婚姻、家庭和职场中，施虐者通过拒言语歪曲、讽刺、嘲笑、轻蔑、否定人格等常用手段来欺凌、控制受虐者，使这种关系持续下去，让受虐者无法逃脱。
日本新中产阶级
作者：[美国]傅高义
出版社：上海译文出版社
出版日期：2017年5月
定价：60.00元
傅高义在学术生涯之初被斥为“乡下人”后，意识到一个社会学家如果从未在另一种文化中生活过，何谈理解本国社会？1958年至1960年，他来到东京市郊展开田野研究，描写日本社会快速变迁之际的“新中产阶级”―工薪族和他们的家庭。此书是他的成名作。
外婆的道歉信
作者：[瑞典]弗雷德里克・巴克曼
出版社：天津人民出版社
出版日期：2017年5月
定价：42.00元
关键词：基因组编辑；CRISPR-Cas9；猪；基因功能；网络调控
中图分类号：R34；S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6510-07
最新的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）分类表将其描述为三大类型和多个亚型，结合生物化学与分子遗传学方法揭示了不同CRISPR-Cas（CRISPR associated protein）类型的特征[1]，其中II型系统Cas9比其他更为简便。基于CRISPR-Cas9系统的作用原理，研究人员模拟细菌的成熟crRNA和tracrRNA，在体外人工合成gRNA（guide RNA），同样可以达到特异地切割靶标DNA，从而将该系统简化成核酸酶Cas9和人工合成的sgRNA两个组分，在靶标位点导致所期望的插入、删除或替换，由此开创了新型基因编辑技术，这是该系统的“基因工程功能”。更进一步地，通过点突变得到缺乏核酸酶活性的Cas9突变体，命名为dCas9。突变的dCas9可在gRNA的引导下，实现与DNA结合，但不能切割DNA。而dCas9具有融合异源模块的结构域，利用dCas9这3点特性，将其与一系列具有功能的异源模块融合，实现不同研究目的：转录激活与抑制、探索未知基因及其调控元件的功能、全基因组扫描等，这是该系统的“基因调控功能”。不论是基因工程/基因调控，其工作过程是相同的：gRNA通过序列互补原则将核酸酶带到基因组特定位点，使其与靶标结合。不过，基因工程与基因调控是利用Cas9蛋白的不同形式，包括野生型Cas9与人工突变的dCas9蛋白，以实现各自目的[2，3]。该技术能够快速地构建遗传改造的动物，使得在过去要花费数月或数年的工作现在只需几周完成。CRISPR技术与PCR技术类似，正在给生物工程研究带来革命性的改变，从各个方面影响着生命科学的发展[4]。目前基因组编辑CRISPR-Cas中也主要是应用Cas9系统，下面简称“Cas9系统”。
2013年初以来，Cas9系统的快速创新及其拓展应用，使其成为可替代ZFN和TALEN的第三代基因组编辑工具。2013年Science杂志将Cas9系统选为年度十大突破之一（亚军）；2014年美国加州大学伯克利分校生物化学家Doudna博士和德国的Charpentier博士因此共同获得了美国硅谷“科技突破奖”与“阿尔珀特奖”；2015年被Science杂志评选为年度十大突破之首；2016年具有小诺贝尔奖之称的盖尔德纳国际奖授予了三位科学家：Doudna，Charpentier和麻省理工学院的张锋三位博士。几大公司看好Cas9系统的成果商业化前景。Editas Medicine、Intellia Therapeutics和CRISPR Therapeutics等公司已经收到数亿美元的投资。例如，2015年比尔・盖茨等大佬宣布为促进基因编辑技术的蓬勃发展，共投资1.2亿美元参与基因编辑公司 Editas Medicine的B轮融资，Cas9先驱之一张锋是该公司的联合创始人。Editas Medicine计划于2017年采用基因编辑疗法对先天性黑蒙症进行临床试验，这是一种罕见的视网膜疾病，基因突变可能导致眼睛中的感光细胞逐渐消失。据麻省理工W院Broad研究所网站最新报道，农业生物技术巨头杜邦（DuPont）公司宣布对Caribou Sciences公司进行投资，且将获得其专利在农作物使用的独家授权。而Caribou Sciences是Cas9技术首创之一Doudna博士实验室的附属公司。目前，杜邦公司正在温室中种植Cas9编辑的玉米、大豆、水稻和小麦，期望在5～10年内出售Cas9技术的产品。位于明尼苏达州圣保罗的动物生物科技公司Recombinetics正在开发同类动物，包括无须抑制牛角生长的牛和不需要被的猪。2016年6月底，美国国立卫生研究院（NIH）顾问委员会批准了一项申请：利用Cas9系统强化依赖于患者T细胞（一种免疫细胞）的癌症疗法。由于其易用性和通用性，Cas9已经被世界各地的实验室用来改写基因组和重塑细胞，其在医学和农业领域的潜在应用是无穷无尽的，它将开启该行业新一波的产品浪潮和利益追逐。根据瑞士洛桑附近的咨询机构IPStudies介绍，全球已有超过860项CRISPR专利，平均每天新增加一项专利。世界许多遗传学家和生化学家普遍认为，Cas9系统可对所有的生物进行改造，这是一项可改变生命未来的伟大技术，当然，该技术也面临许多伦理挑战。
1 CRISPR-Cas9系统的拓展性应用研究
最初的Cas9只能实现剪切的基因工程功能（CRISPR1.0版本）。每次只能执行一种功能的dCas9是CRISPR2.0。现在研究人员将突变dCas9蛋白与一系列具有功能的异源模块融合，成为能够执行多重功能的CRISPR3.0。这种平台能够执行复杂的程序，适用于研究基因网络机理和更深入探讨复杂性状/疾病[5]。
1.1 同时激活多基因表达/同时抑制多基因
Chavez等[2]设计了三方转录激活子（VP64-p65-Rta）融入dCas9，可探讨一连串基因回路对生物过程（比如组织发育或疾病发生）的影响，也可以精确指导干细胞分化，生成再生医学所需的移植器官。Konermann等[6]应用改造后的Cas9系统成功激活了十个基因，包括长非编码RNA（LncRNA）。这些基因转录效率得到了两倍以上的增长，该研究的意义在于，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因表达[7]。Cas9系统已被成功地用于同时干扰小鼠2个基因和敲除猴与蚕的两个基因[8，9]。多位点编辑将促进多方面研究，包括上位效应的检测和基因组中物理距离非常接近的多基因操作。Ma等[10]同时靶向基因家族的多成员（多至8个位点），突变率平均为85.4%。Zalatan等[11]应用架RNA（scaffold RNA，scRNA），成功在酵母中重新定向了一个复杂的多分支的代谢通路，其中一些基因被激活，另一些基因被抑制（CRISPRa/i）。多基因的组合控制可以帮助人们灵活操纵细胞中的通路，例如，改写细胞命运或者设计代谢通路。Cheng等[5] 报道其CRISPR 3.0版本是Casilio，该系统可结合多个蛋白模块，包括基因激活、基因抑制、染色体荧光标记、组蛋白乙酰转移酶等，以实现不同的目的。
1.2 运用Cas9实施表观遗传学编辑
Kearns等[12]报道dCas9-组蛋白脱甲基酶LSD1 在鼠胚胎干细胞中靶向转录因子Oct4的远端增强子，抑制Oct4转录并失去多能性。许多酶能以不同的机制催化DNA去甲基化，其中，TET（Ten-Eleven Translocation dioxygenase）双加氧酶家族有3个成员：TET1、TET2和TET3，催化的5-甲基胞嘧啶氧化，可启动DNA的去甲基化。Xu等[13]首先向传统sgRNAs中插入两个拷贝的噬菌体MS2 RNA元件，构建了修饰后的sgRNA2.0，这有利于Tet1催化结构域（TET-CD），与dCas9或MS2外壳蛋白融合，以靶向基因位点。结果证明，dCas9/sgRNA2.0指导的去甲基化系统能有效地将靶基因去甲基化，可显著上调靶基因的转录，包括RANKL、MAGEB2或MMP2，而且这结果与它们启动子中相邻的CpG岛的DNA去甲基化密切相关。类似的工作与结果也由Choudhury等[14]报道于模式抑癌基因BRCA1启动子。这些结果不仅可以帮助我们理解在特定背景中DNA甲基化如何调节基因表达的机制，而且也使我们能够控制基因表达与功能，并带来潜在的临床效益。表观遗传效应模块的汇总详见文献[15]。
1.3 运用Cas9开展高通量全基因组遗传学筛选
全基因组 CRISPR 筛选克服了传统遗传筛选的缺点，可应用于几乎任何细胞系和任何遗传背景下的筛选[16]。应用其进行遗传筛选的基础是蛋白Cas9修饰后的多种形式融合和sgRNA文库。构建Cas9高通量筛选的文库有两种：阵列文库和混合文库。（1）细胞系中开展遗传学筛选。Wong等[17]创建了Cas9与CombiGEM结合的平台技术，可展望，该平台有着广泛的应用前景，加速系统鉴定控制人类疾病表型的遗传组合，并转化到新药物组合的发现。（2）体内开展遗传学筛选。Ma等[18]将活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（AID）与dCas9融合成为dCas9-AIDx，在慢性粒细胞中靶标BCR-ABL，鉴定了赋予细胞伊马替尼抗性的已知突变和新突变。Zhu等[19]开发了配对的gRNAs（pgRNAs），产生大片段缺失，应用这种高通量方法确定了51条功能性的lncRNAs，并验证了其中的9个。该方法使科学家们能够快速识别哺乳动物非编码元件的功能。
1.4 光遗传学加CRISPR调控基因表达与靶DNA切割
东京大学和杜克大学基于光诱导的CRY2（色素）和CIB1（蛋白），开发出相似的光遗传学+CRISPR系统，其目的是利用光来开启和关闭基因表达，同时赋予时空控制和可逆性[20-22]。
1.5 通过荧光标记的dCas9对DNA实施标记
Deng等[23]w外构建“dCas9/荧光素”复合物作为探针，可视化基因组位点完全没有引起DNA变性，称为Cas9介导的荧光原位杂交（CASFISH）。dCas9/sgRNA能够在近着丝粒区、着丝粒、G富集端粒和编码基因等位点快速而有效地进行重复DNA元件标记，也适用于初生组织切片的检测。这种技术具有快速、有效、破坏性较少与成本低的特征，为基础研究和遗传学诊断增加了一种非常有潜力的工具。
1.6 CRISPR-Cas9系统同时实现基因工程和基因调控的双重功能
Kiani等[24]开发了Cas9系统一个新策略，能够同时实现基因组工程和基因调控的双重功能。其使用经过改造的gRNA和Cas9蛋白，在切割特定基因的同时调控其他基因的表达。这一技术大大增强了基因组编辑和基因调控的功能性，帮助我们进一步操纵细胞，以揭示重要生命过程背后的复杂机理，比如，癌症耐药性和干细胞分化，或者帮我们设计更高级的人工基因回路。更进一步地，双重功能Cas9可以促进基因工程菌株（例如大肠杆菌）大规模生产化合物和燃料。
1.7 多顺反子基因
Xie等[25]将tRNA与gRNA结合起来，开发合成了一个多顺反子基因，以提高Cas9系统的靶向能力和多重编辑效率，能够在水稻中高效实现多重基因组编辑和染色体片段删除（可达到100%）。Qi等[26]设计多个tRNA-gRNA单元，在玉米中的研究表明，该系统不仅增加靶向位点数目，也能更有效和准确地缺失染色体片段，这对基因功能的完全消除特别是lncRNAs的研究很重要。同时还表明，在一个表达盒中可容纳多达四个tRNA-gRNA单元，用来修饰同一基因家族中的不同成员或同一代谢途径中的不同调控基因。
1.8 Cas9系统应用于多能干细胞
诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可无限地自我更新，而不会丧失分化成所有细胞类型的能力，且绕过了免疫排斥的障碍。iPSCs在再生医学中具有良好的前景，是用于致病突变原位校正的一种理想细胞群。将CRISPR应用到iPSCs中为纠正遗传缺陷疾病开辟了一条新途径，因为iPSCs很难采用传统的基因打靶策略进行操作，尤其是蛋白质介导的基因组编辑方法[27-30]。
1.9 染色体大片段和lncRNA编辑
Shechner等[31]介绍了以CRISPR-Cas9为基础的基因组靶向技术展示：CRISPR-Display（CRISP-Disp），将gRNA-ncRNA融合，能将大片段非编码RNA带到特定DNA位点，同时不影响dCas9的功能。CRISP-Disp系统可容纳约4.8 kb的RNA结构域，这相当于天然lncRNA的长度。除了lncRNA以外，研究人员还对各种天然和人工非编码RNA进行了测试，表明gRNA可以偶联多个非编码RNA结构域，这些结构域可同时且独立起作用。CRISP-Disp可用来解决如下问题：一个lncRN段是如何调控基因表达的？是这个片段的转录本在起作用，还是它本身的序列在起作用？揭示lncRNA在表观遗传学修饰、染色质重塑或者转录调控中做出的贡献。该系统除了研究非编码RNA机理外，对合成生物学来说，CRISP-Disp的灵活性、模块化和多重化特性是很有吸引力的。用CRISP-Disp招募RNA-蛋白复合体到特定位点，可以设计出复杂的基因调控回路。Yoshimi等[32]开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP（Two-hit two-oligo with plasmid）），来完成相对较长的DN段，如GFP（Green fluorescent protein）序列的靶向基因敲入，提高基因编辑的效率。第一种方法是利用lsODNs作为靶向供体。第二种方法是共同注射两个gRNAs作为“剪刀”切割基因组DNA和供体质粒DNA中的靶位点，两个短ssODNs作为“浆糊”连接切割位点的末端。利用开发出的两种基因改造方法，该研究小组成功实现了高效、精确敲入GFP基因，导入了近200 kb的大片段基因组区域，这是采取传统方法不可能做到的。并用人源基因替代了大鼠基因，构建出了基因人源化的动物。这两种基因敲入方法将会提高遗传工程改造的效率。研究人员高度期待这些遗传工程生物将用于药物研发、转化和再生医学等广泛的研究领域。
1.10 研究蛋白质工程
Hess等[33]开发了一种称为重利用体细胞超突变的原位蛋白质工程新技术，命名为CRISPR-X。研究人员利用dCas9召集胞嘧啶氨酶（AID）变异体，其携带有经过MS2修饰的sgRNAs，能特异地诱变内源靶标，限制脱靶伤害。它能产生不同点突变的多样文库，同时靶向多个基因组位点，结果从中找到了引发Bortezomib耐药性的已知和新突变。还利用超活化AID变异体，同时诱变了转录起始位点上游和下游的位点。这些结果均表明 CRISPR-X是一种强大的工具，能帮助科学家们创建复杂的原始遗传突变文库，分析完善蛋白质工程。
2 CRISPR-Cas9系统在猪中的研究进展
Cas9系统出现之前，已经有文献报道了其他技术的基因组编辑猪[34]，现在利用Cas9系统的报道层出不穷。这里重点综述Cas9系统在猪研究中的进展，因为猪不仅提供肉食，同时其在生理学、免疫学和基因组学上与人高度相似，器官大小也比啮齿动物有优势。
2.1 功能基因研究
Su等[35]合成sgRNA时用猪U6启动子代替人U6启动子，获得更佳的打靶效率；Wang等[36]显微注射Cas9 mRNA和sgRNA至猪原核期胚胎，筛选出打靶效率最高的sgRNA；He等[37]将携带GFP和红色荧光蛋白（RFP）的Cas9质粒先后转染猪胎儿成纤维细胞，通过双重荧光筛选提高打靶成功效率；吴金青等[38]应用SSA（Single-strand annealing）报告载体，使Cas9系统对猪胎儿成纤维细胞的打靶效率提高5倍左右。八聚体结合转录因子4（OCT4）是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的重要转录因子之一。Kwon等[39]研究表明Cas9系统可针对孤雌胚胎实现基因OCT4的敲除和敲入。Lai等[40]构建了一个猪OCT4的报告系统，其内源性OCT4启动子可直接控制RFP，因此荧光能准确地显示内源性OCT4的激活，并获得了在内源性OCT4基因启动子下游具有tdTomato基因敲入的猪胎儿成纤维细胞（PFF）系。Cas9系统编辑的PFFs被用作体细胞核移植（SCNT）的供体细胞，在SCNT胎儿的囊胚和生殖嵴中检测到了强大的RFP表达，并制备了两头有生命力的基因编辑猪。
2.2 提高生产性能
肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）基因对肌肉生长发育具有重要调控作用。Crispo等[41]、Cyranoski[42]、Wang等[43]和张冬杰等[44]利用Cas9系统获得了MSTN基因的双等位基因敲除猪。湖北省农业科学院畜牧兽医研究所Bi等[45]应用Cas9系统制备了无选择标记的MSTN基因敲除克隆猪。首先，利用Cas9系统介导的同源重组敲除猪初生细胞中MSTN的一个等位基因。然后，用Cre重组酶来切除选择标记基因，有效率为82.7%。免疫印迹显示，克隆猪MSTN大约有50%的降低，同时肌原性基因在肌肉中的表达有所增加。组织学显示，肌纤维数量增加，但是肌纤维大小保持不变。超声波检测显示，最长肌大小增加，背部脂肪厚度降低。该研究提供了一种可靠的途径用于家畜良种生产，也提出了一种策略来减少潜在的生物学风险。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所的李奎教授领导研究团队，首次利用Cas9系统获得了位点特异性的基因敲入猪模型[46]，得到一个新的基因组“安全港”位点：pH11位点，通过Cas9系统分别在细胞、胚胎和动物体内的该位点插入了大于9 kb的基因片段，实现了稳定高效的基因表达。
分化簇 163（Cluster of differentiation 163，CD163）被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的受体基因，分化簇1D（CD1D）是一类抗原递呈因子。Whitworth等[47]利用Cas9系统分别敲除CD163和CD1D的基因编辑猪；经过蓝耳病毒株攻毒后CD163双等位基因敲除猪未表现出临床症状，具有良好的抗蓝耳病能力。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所利用Cas9系统进行抗PRRSV和抗猪传染性胃肠炎（PEDV）的CD163和CD13双基因编辑猪的制备，正在开展相关验证鉴定工作。这些研究在养猪业引起了高度关注。
2.3 研究人类疾病的动物模型
猪是人类医学研究极佳的动物模型。vWF（von Willebrand factor）的基因是引起人血管性血友病的主因。Hai等[48]应用Cas9系统靶向猪vWF外显子，目的基因插入/缺失突变效率达到 68.8%（11/16）；单等位基因突变和双等位基因突变的vWF抗原水平均极显著低于野生型个体（P
再如，去除所有主要淋巴细胞的猪是研究人X-染色体连锁的严重联合免疫缺陷（SCID）患者病毒感染和免疫受损发病机理的理想动物模型。破坏IL2RG的猪比啮齿动物敲除IL2RG模型更接近于SCID表型。Lei等[50]利用Cas9系统快速生成双基因RAG2/IL2RG敲除猪，成功建立了人诺如病毒（HuNoV）感染的免疫缺陷的猪模型，因为RAG2/IL2RG缺陷猪缺乏B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。Yu等[51]成功地通过Cas9系统在滇南小型猪产生人类DMD疾病动物模型。
2.4 医学生物反应器
猪除了作为人类疾病模型外，也可作为生产人类需要的产品反应器。例如，赖良学课题组利用精确Cas9系统对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，3头可以分泌人胰岛素的克隆猪，其中2头完全分泌人胰岛素，而不含猪胰岛素；另一头既分泌人胰岛素也分泌猪胰岛素。牛泌乳量大、乳汁活性蛋白的产量高，因此其乳腺是理想的生物反应器，Peng等[52]通过CRISPR技术建立了人血清白蛋白的生物生产器。人成纤维细胞生长因子2（hFGF2）是一种多功能生长因子，在促进组织生长发育、新血管形成和参与组织修复过程中起着重要的作用，但其在人体内的表达量较低。Jeong等[53]借助Cas9系统将该基因导入到牛成纤维细胞的β-casein基因内含子中，为获得表达hFGF2蛋白的基因编辑牛奠定了基础。谷氨酸棒杆菌是工程化应用传统方法（同源重组）批量生产氨基酸的重要生物机体。Cleto等[54]采用CRISPRi降低该菌的基因PGI和PCK的表达高达98%，降低基因PYK高达97%，从而大大增强了L-赖氨酸和L-谷氨酸产品滴度的比率。这种新谷氨酸代谢工程方法只需要3 d时间，表明CRISPRi可用于快速且有效地代谢途径改造，而不需要对基因缺失或突变。
2.5 异种器官移植
据不完全统计，全世界大概有200万人需要器官移植，而器官捐献的数量远远低于需求数量[55]。尤其是老龄化和慢性疾病的多发，更加导致供体器官严重不足。猪被认为是人体异种器官来源的首选动物，因为猪与其他哺乳动物比较，无论从器官大小、生理结构和基因组相似度都更接近于人，因此，上世纪90年代应用猪生产人类器官项目一度在全球受到追捧，但受阻于猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovi-ruses，PERVs）造成的重大医疗风险。哈佛大学利用Cas9系统对猪肾细胞系PK15中所有62个拷贝的PERV pol（多聚酶）基因敲除，使内源性病毒传递给人的风险降低了1 000倍以上[56]。该研究扫除了猪器官用于人体移植的安全障碍，为全世界亟需器官移植的上百万病人带来希望，也重新燃起了大家对异种器官移植的信心。
免疫排斥反应是猪器官移植另一障碍。α-1，3-半乳糖基转移酶（GGTA1）基因与异种器官移植后的超急性免疫排斥反应显著相关，Sato等[57]在猪胎儿成纤维细胞中通过Cas9系统获得了GGTA1双等位基因敲除的细胞系。Li等[58]针对3个与免疫排斥相关的基因GGTA1、胞苷单磷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）和异红细胞糖苷酯合成酶（iGb3S）基因，共转染靶向这2个或3个基因的CRISPR/Cas9-PX330构质粒，最终获得了敲除单个基因及同时敲除2个或3个基因的胎儿或仔猪。利用类似的方法，Estrada等[59]对猪肝脏细胞分别敲除GGTA1、GGTA1/CMAH和GGTA1/CMAH/β4GalNT2（β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2）基因。
3 CRISPR-Cas9系统的前景
CRISPR-Cas9系统在如此短的时间内极大地推动了生物学的各个方面研究，例如基因功能解析、基因治疗、人类疾病动物模型、生物生产反应器和农业动植物优质遗传育种。该技术生成的产品，定向改变但不含外源基因/片段，在验证其安全性的基础上，这种经过“基因组编辑”的产品更容易被消费者接受。理论上它不会带来健康或环境方面的风险，但是否应该受到转基因相关法律的约束，美国和欧盟的态度不一致。作为新兴的基因组编辑技术，有必要进一步完善其特异性、脱靶效应和输送方法，以及如何更好地激活细胞自身的同源重组，并探索新型基因组编辑技术及其应用，例如，新CRISPR-Cpfl系统[60]、新型NgAgo系统[61]；无序列限制的DNA编辑新工具[62]、纳米颗粒技术[63]等等。
r业动植物改良从来都是一个漫长而繁琐的过程，而如今，科学家因为有了CRISPR技术能够快速而轻松地实现。近两年，许多实验室将这种工具应用在动植物和微生物中，以期获得更高产、更适应环境和更优质的品种。有理由相信，CRISPR-Cas9系统将更好的服务于人类，包括动植物育种。
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想要剔除遗传性疾病，有二个途径。一个途径是正常产前检查，包括在孕期对致病性突变进行筛查，然后让父母选择是否引产。另一种途径是对试管授精胚胎进行筛查，称胚胎植入前遗传学诊断（英文简称PDG），即对将植入母亲体内的试管授精胚胎进行筛查，只有那些不会产生疾病的胚胎才能最终被植入母亲的子宫中。迄今为止，PDG已经能够被用于筛查数千种严重的基因性遗传病。
但是，当一个试管授精胚胎被检查出同时具有两种或两种以上疾病风险时，PDG显得没什么实际作用了。如PDG并不能有效地剔除致病性突变的风险，例如心脏病、糖尿病、阿尔兹海默症或者精神分裂症等。而基因编辑则可以通过修正他们的基因来杜绝后代产生这种疾病的可能性。英国伦敦弗朗西斯克里克学院的罗宾认为这是另一种更符合伦理学的胚胎选择方式。
用CRISPR基因编辑技术剔除几十个致病性突变听起来没什么，但实际上意义非常重大，它能让人们拥有更长的寿命、更健康甚至更快乐的人生。不过，迄今为止这样的技术并不存在，我们对于那些致病性基因突变的了解也不够多，因此想要随心所欲地根除它们还不太现实。这就意味着当我们想要减小疾病发生率的同时，也不可避免的会涉及到种系基因编辑这个问题。 一些控制肤色、发色的基因已经被科学家掌握，从理论上说。通过基因改造进行美容是可以实现的。
另一个更加有争议的问题：能否通过给孩子添加他们父母缺乏的基因使孩子得到强壮的身体？许多控制肤色、发色、瞳色的突变已经被人们所掌握了，所以从理论上来说，这些美容性质的调整是可以实现的。但对于一些其他的特质，例如智力，则是由数百种不同的基因突变所控制的，而每一项突变都只产生很细微的作用。这就表明即使基因编辑技术足够安全，我们离能控制孩子的智力还有很长的一段路要走。
即使这样，前面的路并不明朗。最严重的问题经过基因编辑的胚胎通常会发育成拥有不同细胞的个体：有的细胞含有预期的基因改变，而有的细胞却没有，这种情况被称为镶嵌现象。这是一个前文提及的研究团队在第一次人类胚胎基因编辑试验中发现的。
这一研究领域的专家认为现在进行通过基因编辑对儿童胚胎基因进行改造的试验仍为时尚早，一些人甚至倡导禁止基因编辑这一技术开展。
真正出台禁令不太可能。好几个英国研究组织和基金会已经宣称他们将会支持人类胚胎的研究。其后，一群由干细胞研究者和生物伦理学家组成的国际组织也就此问题召开了一次研讨会议。会议的结论是，我们不但应该允许种系基因编辑技术的进行，更应该扩大研究，包括进行胚胎发育研究以及女性流产原因的研究等。