时间：2023-02-27 21:48:24
关键词基因治疗;治疗方式;发展前景
中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01
美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。
1基因治疗的方式
1.1体内基因治疗
体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。
1.2反义疗法
反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。
1.3通过核酶的基因治疗
20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。
1.4自杀基因疗法
自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。
2基因治疗存在的问题
2.1基因治疗的社会和伦理问题
基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。
2.2基因治疗的技术问题
目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。
3展望
以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。整理
4参考文献
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理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明［1-5］，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。本文即对该类载体的研究进展做一简介。
1HIV-1基因组的基本结构［6］
HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述。
2构建HIV-1载体系统的基本原理［7］
HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种［1］。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
3HIV-1载体系统的改进
近年来，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力［8］、筛选抗病毒药物［9］、评价Env糖蛋白的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用［10］等。而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果［1～3］，主要包括以下几方面的改进。
3.1包膜蛋白
最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等［1］设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。
3.2包装成分
包装成分的构建应在不影响重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍。Naldini等［1，2］在构建包装质粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等［3］将包装包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素［11，12］，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。
3.3载体质粒
载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明［7］，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等［1～3］在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。对于载体上需含有多少顺式作用序列为最佳，目前尚不完全靖楚。
4HIV-1载体介导基因转移的体内外实验
迄今，Trono课题组构建的HIV-1载体系统已在体外转导过人子宫颈癌细胞(HeLa)、鼠成纤维细胞(208F)、原代培养的人巨噬细胞、人呼吸道上皮细胞等，结果表明［1-5］，HIV-1载体无论对分裂细胞还是非分裂细胞均能转导，但对非分裂细胞的转导效率与细胞所停止的周期有关。HIV-1载体对G0期细胞的转导效率不如对静止于G1/S或G2期的效率高，停止于G0期的时间越长，这种差别越大。这可能是由于某些G0期细胞内脱氧核苷酸浓度低、影响了反转录步骤，造成报告基因未表达所致的表观现象。实际上，HIV-1载体有的已进入到G0期的靶细胞内，建立了转录中间体。一旦这类细胞进入细胞周期，载体所携带的基因就会表达。
在动物体内实验中，Naldini等［1］将HIV载体注射成年大鼠脑组织，30天后取脑组织，未观察到病理变化，免疫组化显示报告基因能够在终末分化的神经元中表达，证明HIV载体对体内基因转移是有效的。此后，他们将重组病毒在转导前用dNTP和多胺处理，以增加病毒内逆转录反应，可使对大鼠神经元的转录数率提高2倍，报告基因可表达3个月以上［2］。Miyoshi等［4］将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的HIV载体注射大鼠眼球，GFP能在感光细胞和视网膜色素细胞中表达，如果以视紫质启动子控制GFP，则可在感光细胞异地高表达。
对于HIV-1载体进入非分裂细胞后的表达是否全部由整合形式产生，目前尚有不同意见。Naldini等［2］将包装质粒中的整合酶基因突变，如此而产生的HIV载体不能在非分裂细胞中表达，因此认为HIV载体的表达全部由整合形式产生；而Goldman等［5］却在转导细胞中测到了HIV载体前病毒的非整合形式，认为不能排除两种形式同时存在的可能。
在用HIV-1载体已经进行的所有体内外实验中［1～5］，未出现过有复制力的HIV，说明其安全性是有保证的。
5HIV载体的基因治疗中的应用前景
5.1获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗［7，13］
目前对于AIDS的基因治疗方案，基本上是以逆转录病毒载体介导的方式，将抗病毒基因体外导入CD4+T淋巴细胞或CD34+的造血祖细胞，再回输体内。常用的抗病毒基因包括自杀基因、反义RNA、核酶、RNA诱饵的相应DNA序列以及调节蛋白或结构蛋白的突变体基因等。由于这些治疗基因不能到达巨噬细胞和多能干细胞，困此难以重建免疫；此外，体外操作费用昂贵，不适于大规模应用。
HIV-1载体的研究为AIDS的基因治疗带来了新的希望，它可能具有以下优势：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的载体颗粒可以将抗病毒基因直接运抵CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，适于直接的体内治疗，而包被了VSV包膜的载体颗粒又能感染多能干细胞，有利于免疫重建；第二，患者体内的野生型HIV-1可将携带抗病毒基因的载体拯救出来，使载体扩增并扩散到周围更多的细胞中发挥抗病毒作用；第三，如果将抗病毒基因置于HIV-1本身的长末端重复序列(LTR)控制之下转导细胞，则只有当HIV-1感染该细胞时，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才会表达，使基因表达具有了靶向性。
5.2神经系统疾病的基因治疗［1，2，14］
Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性脑病，由编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一种退行性脑病，由于产生多巴的神经元退化，导致大脑纹状体内多巴胺水平降低，临床上给患者注射左旋多巴可改善症状，但长期注射及药物的副作用令患者难以承受。较为理想的方式是在脑内持续表达酪氨酸羟化酶(TH)，使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴；Alzheimer氏病也是一种多因素引起的退行性脑病，造成大脑皮质和海马回神经元萎缩，通常采用神经营养因子防止神经元退化。由于HIV-1载体能够体内转导神经元并建立长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基因治疗非常具有吸引力。可以设想，分别将编码HPRT、TH或神经营养因子的基因通过HIV-1载体介导，体内注射至神经元，有可能对上述疾病产生良好效果。
5.3血液系统疾病的基因治疗［15］
造血干细胞一直被认为是对血液系统恶性肿瘤或其它疾病(如地中海贫血、镰刀性红细胞贫血、血友病等)进行基因治疗的理想靶细胞，但由于缺乏使目的基因在造血干细胞稳定表达的方法，这方面的研究进展不明显。尽管小鼠逆转录病毒载体能够转导经细胞因子刺激后进入细胞周期的造血干细胞，但经此处理的干细胞性质可能会发生改变。HIV载体则可通过直接转导静止的干细胞避免这类问题。将多药耐药(MDR)基因导入造血干细胞，可使其耐受大剂量化疗，可能成为治疗白血病和其它恶性肿瘤的有效途径；将正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分别导入造血干细胞，有望对地中海贫血、镰刀性红细胞贫血和血友病产生疗效。
5.4其它
囊性纤维化(CF)是由于缺损囊性纤维性穿膜传导调节蛋白(CFTR)而引起的一种人类遗传病，其特点是粘液腺功能不足，粘液中含有异常糖蛋白，因而粘液的粘度不正常而影响呼吸道上皮和消化道上皮，引起慢性感染，直至死亡［16］。针对CF的基因治疗研究已进行了多年，试用过各种载体，效果不甚理想。最近，Goldman等［5］用HIV-1载体进行了尝试，动物实验表明，导入CFTR基因后CF缺陷可被纠正。但他们同时也发现，HIV-1载体转导增殖中的呼吸道上皮细胞效果较好，而对完全分化的上皮细胞则效率很低。目前尚不完全清楚转导受限的机制，有待进一步研究。
色素性视网膜炎是一种遗传性的进行性视网膜退变，症状包括视野进行性减小、夜盲、视网膜色素沉着等。研究发现，将视杆细胞cGMP磷酸二酯酶γ亚单位基因导入感光细胞有可能纠正视网膜退变，但导入时机以及导入多少感光细胞才能保持视觉功能尚不清楚。由于成熟的视网膜细胞绝大部分为终末分化细胞，因此HIV-1载体为视网膜病变的研究与治疗带来了希望［4］。
6存在问题
尽管HIV-1载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像目前常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞［17，18］均不理想。据报道，Vpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂［19，20］，也是建立包装细胞的主要障碍之一。如果确如前文所述，包装质粒中的vpr基因并非必需、去除后不影响载体的转导能力，则建立稳定的包装细胞是大有希望的。
在保证HIV-1载体的安全性上，迄今已做了种种努力，要产生有复制力的HIV，必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。即使如此，一旦用于人体试验，仍然不能打消人们对感染有复制力的HIV-1的顾虑。更为谨慎的做法是，以非人类的慢病毒为基础构建载体，如猴免疫缺损病毒(SIV)、猪和牛免疫缺损病毒(FIV和BIV)、马传染性贫血病病毒等，而目前这些工作尚属空白。
(本文承蒙侯云德院士审阅，特此致谢)
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基因治疗(GeneTherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，而达到治疗目的。1991年美国实施了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，科学家W.FrenchAnderson等将含有正常ADA（AdenosineDeaminase，腺苷脱氨酶）基因的逆转录病毒转入一个4岁患有ADA-SCID（SevereCombinedImmunodeficiency，严重复合免疫缺陷综合征）的女孩的白细胞内，并用白细胞介素Ⅱ(IL-2)刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入到此患儿体内。大约1－2月治疗一次。8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，两年后基本恢复正常，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗并获得类似的效果[1-2]。
这是基因治疗史上的里程碑，迅速引起了全球基因治疗的研究热潮。然而，基因治疗的发展并不是一帆风顺的。1999年，美国一名年仅18岁的青年JesseGelsinger因患鸟氨酸转氨甲酰酶不足症（一种遗传性疾病）在美国宾夕法尼亚大学人类基因治疗中心接受基因治疗时不幸死亡，这一事件震惊了当时的科技界。基因治疗一度跌入低谷，各国对基因治疗临床试验的资助大幅减少[3]。基因治疗在争议中不断地前进，最近几年已取得不俗进展，重新成为各国研究的热点。RNAi（RNAinterference,RNA干扰）是基因治疗的又一亮点，其在神经性、遗传性、病毒性等疾病中的治疗研究已经展开[4]。2009年，针对X-连锁型肾上腺脑白质营养不良症(X-linkedAdrenoleukodystrophy，X-ALD)的基因治疗初见成效，并被《Science》评为年度十大科学发现之一[5]。正如《Science》评论指出：在饱受科学界质疑以及制药业遗忘多年后，近几年基因治疗在应对严重遗传性疾病方面取得了重大突破，再次优雅的回归[6-7]。在我国，基因治疗也有一定发展。1991年，复旦大学薛京伦教授研究小组进行了国内首例基因治疗临床试验。
2003年，人类首例商业化基因治疗产品“重组Ad-p53腺病毒注射液”在深圳诞生。目前，我国已在在遗传病、肿瘤、神经系统疾病及细胞因子基因治疗的临床前研究取得了一定成绩[7]。基因治疗按靶细胞类型分为生殖细胞(Germ-lineCell)基因治疗和体细胞(SomaticCell)基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以、卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于生殖细胞基因治疗涉及一系列伦理学问题，如人权问题、阻碍人类多样性的问题以及基因歧视等，生殖细胞基因治疗仍属[8]。体细胞基因治疗是当前基因治疗研究的主流，但是仍处于临床试验阶段，存在较高的风险性和不稳定性。基因治疗由于自身技术的高度复杂和难以控制，同时涉及一定的社会伦理学问题，应用于临床医学必然会引起相关的法律问题。
二、基因治疗在临床医学应用中的法律问题
（一）隐私权
基因(Gene)是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位。基因有两个特点，一是能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；二是基因能够“突变”，突变绝大多数会导致疾病，另外一小部分是非致病突变。非致病突变给自然选择带来了原始材料，使生物可以在自然选择中被选择出最适合自然的个体。基因与人类的健康密切相关。基因的特点决定了基因具有特殊的地位①，基因治疗过程中必然涉及到患者基因的隐私权保护。一是基因隐私保密权。保护个人隐私的隐蔽性、不公开性是使个人隐私保持其受法律保护状态的前提。基因信息不仅与个人密切相关，而且与个人的后代相关。因而,个人享有对其基因信息进行保密,不为他人所知的权利。[9]二是基因隐私的知晓权。获取基因进行基因研究必须向基因的所有者进行告知，让基因所有者知情，使其知道自己的基因作何用途。[10]三是基因隐私利用权。是指自然人依法对自己的基因信息进行积极利用,以满足自己精神、物质等方面需要的权利。[9]四是基因隐私支配权。这是基因隐私权的核心内容。任何单位或个人未经基因提供者本人的同意或授权，不得随意公开、使用或处置基因提供者的基因信息。[10]如利用基因信息进行相关科研等活动时，必须征得提供者的同意。五是基因隐私维护权。是指自然人对于自己的基因隐私所享有的维护其不可侵犯性,在受到非法侵害时可以寻求司法救济的权利。[9]例如，非经基因提供者的同意，将其基因信息进行商业活动时，基因提供者有权依靠法律得到相关赔偿。
（二）知情同意书的签订
任何医疗活动都会存在风险，为保护医患双方的权益，大部分临床医疗活动均要签订相关知情同意书，并受法律保护。基因治疗应用到临床医学，签订知情同意书同样至关重要。我国1994年颁布的《医疗机构管理条例实施细则》第六十二条和八十八条以及2002年颁布的《医疗事故处理条例》第十一条规定，患者在医疗过程中对自己的病情、诊断、治疗享有知情权。医方施行手术、特殊检查或特殊治疗时，必须征得患者同意。概言之，患者知情同意权包括了解权、被告知权、选择权、拒绝权和同意权，但不宜告知患者的（仍应告知其家属）除外。特殊检查、治疗系指该检查、治疗具有一定危险性，或因患者本质特殊、病情危急可能产生不良后果，或系临床试验性，或收费较多。基因治疗治疗显然属于上述法律规定中的特殊检查和治疗范畴。基因治疗不同于传统的医疗活动，其高科技、高要求及高风险等特点必然决定此类知情同意书的特殊性。受试者有权利要求被告知基因治疗实施单位及人员的资格以及经验、风险效益比、其他可替代的保守治疗途径、保密问题、受伤害时的赔偿等等。实施单位还必须有一份针对使用的基因产品的专业医师的指示说明，包括依实验所知的产品药性、毒性和治疗效果等。[11]考虑到基因治疗的复杂和难以理解性，一般人不是很容易透彻理解，应当成立相关部门，如基因治疗专家咨询委员会等，帮助患者及家属真正了解基因治疗及知情同意书的内容，真正维护患者及其家属的利益。
（三）治疗方案的规范
基因治疗现在还大多仍处于临床试验阶段，还不是一种成熟和稳定的治疗技术，存在较多不宜克服的难题，其中最为突出的是：
1.效率问题
基因治疗的时效比较短暂。基因治疗成功的前提是导入治疗性DNA的靶细胞能发挥功能，并且能够在体内长时间存活并且性能稳定。然而，导入的外源性的DN段会导致许多细胞快速分化从而很大程度上可能基因治疗的持续性。患者必须经过多轮治疗，如前所述的第一例成功的基因治疗病例中，1-2月就要进行一次，每次费用大概两万多美元，代价相当昂贵。[1-2]此外，任何外物进入人体组织后，人体的免疫系统就会被激发产生免疫应答以防御入侵者，而这种免疫应答在某种程度上也会降低基因治疗的效果。
2.安全性问题
病毒是大多数基因治疗研究中选择的载体，会对病人带来许多潜在危险，比如其毒性、免疫和炎症反应以及基因控制和定位的问题。基因治疗的安全性是目前基因治疗争论最为激烈的问题，比较著名的是前文提到的那位18岁美国病人死于基因治疗。患者死亡的主要原因是基因治疗对象选择有误及用药剂量过大，尽管病毒载体进入细胞后是随机整合至宿主细胞染色体的，但其仍具有潜在的插入突变可能性。[12]基因治疗属于高端的新医疗技术，存在相当高的风险。由于技术的限制性以及可能涉及相关的社会伦理问题，基因治疗在实施时必须遵循一定规范，必须由相关部门进行管制和监督。1993年，我国卫生部颁布了《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，将人的体细胞治疗及基因治疗的临床研究纳入《药品管理法》的法制化管理。2003年，我国药监局又颁布了《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，较为详细地规定了基因治疗研究的技术标准和操作规范。
三、我国临床基因治疗的立法思考
（一）国外基因治疗的立法经验
1.美国
1976年，美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)成立了重组DNA咨询委员会(RAC)并制定世界上第一个实验室基因工程应用法规《重组DNA分子实验室准则》，首开了政府对生物技术发展进行控制的先例。随后，在基因治疗进入临床研究前的1985年，美国NIH制订了针对体细胞基因治疗的指导准则《人类体细胞基因治疗的设计和呈批考虑要点》，是这一领域里第一个系统的成文规章。[13]美国对基因治疗临床试验的监督由健康和人类服务部的食品与药品管理局和人体研究保护办公室两个法定机构负责。所有从事人体研究的研究者，无论是来自学术机构还是工业界，都必须遵循上述机构的监督管理[14]。
2.英国
1989年，英国政府成立基因疗法伦理委员会，作为临床治疗的审批和监督机构。1993年成立基因治疗咨询委员会，对基因治疗临床方案的可接受性进行审查和管理，协调与其他相关机构的关系。[13]
3.奥地利
奥地利基因治疗的管理要遵循基因技术法的有关规定。体细胞基因治疗只能在被批准的医院里由特定的医疗小组进行，并要得到相关政府机构和伦理委员会的同意。[14]
4.德国
德国1984年由司法部和科研部召集医生、生物学家、哲学家、法学家、宗教代表组成了一个基因分析和基因治疗的研究小组，为政府的立法提供咨询报告，并基于报告提出了一系列相关的法律法规。[13]德国1990年制定世界上第一部“基因技术法”，分七部分四十二节。[14]
（二）我国临床基因治疗的立法建议
基因治疗对个体及人类生命的影响程度远远超过了传统医疗技术，其风险也是目前的医疗经验知识无法掌控的。同时，基因治疗还可能引发不少社会伦理问题。这些问题的解决离不开法律的支持。就本人观点而言，我国临床基因治疗的立法至少应包括以下内容：
1.治疗范畴的立法
首先要确定临床基因治疗的范畴，何种基因治疗可以在人体内进行等基本问题。最为典型的是生殖细胞基因治疗，它涉及平等问题和其他个人侵害问题，如优生主义、基因歧视等，各国对其一般都持反对态度。[8]就我国目前而言，可以通过法律规定临床医学基因治疗的基本范畴，同时规定设立相关伦理委员会进行协助管制。
2.治疗方案审核的立法
除了涉及相应的社会伦理问题，基因治疗还存在高风险且费用昂贵，如何权衡“受益/风险”的比例也相当重要。我国可以指定或成立相关机构或部门，进行临床基因治疗方案的严格审核。
3.规范化治疗方面的立法
临床基因治疗，从方案的选择、实施到最后的疗效评估等，都应严格按照一套规范化的程序进行。美国的基因治疗临床研究伦理审查已制度化。美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)生物制品评估和研究中心(CBER)负责对基因治疗、细胞治疗的安全性和有效性的评价。美国国立卫生研究院下设的生物技术活动办公室(OBA)执行对基因治疗研究的监管。人体研究保护办公室侧重于对受试者的保护，而所有涉及人类受试者的临床试验都要接受地方伦理委员会审查。英国参与基因治疗监管和审查相关的政府部门包括医学和医疗产品管理局(MHPRA)、转基因作物(GMOs)科学咨询委员会、基因治疗咨询委员会(GTAC)、地方伦理委员会。[7]就我国而言，关于临床基因治疗规范化方面的立法，至少考虑以下几方面内容：首先，临床基因治疗资格的审查机制。基因治疗资格的获得必须通过严格审查，包括相关的治疗设施及人员配备是否达到必需的标准。其次，获得资格后的施行人必须严格按照标准的基因治疗方案进行治疗。现在可参照的是《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以及《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》这两份文件，之后可随着基因治疗的日趋成熟作相应修改补充或专门立法规定。[15]再者，应当成立或指定相关部门对临床基因治疗规范化的实施进行不间断的监督和管制，及时发现并处理基因治疗过程中的问题。同时，还应追踪患者的治疗效果，作相应的评估分析。最后，应当建立基因治疗数据库。数据库的数据应准确详实，并配有相应的对照、评估以及传播信息的保护机制。[14]
4.侵权方面的立法
基因治疗的技术高难度性以及涉及相关社会伦理学问题等特点使得它在临床医学操作过程中更易发生医患矛盾。我国2010年7月开始施行的《侵权责任法》专设第七章规定医疗损害责任相关问题。基因治疗应用于临床医学，同样将涉及相关的侵权问题。一是隐私权。由于基因治疗的特殊性，基因治疗过程中患者的隐私权保护尤为重要。《侵权责任法》第六十二条是患者的隐私权保护相关规定，临床基因治疗在这方面的立法可参照此法并结合自身特点作相应补充。二是知情同意书的签订。除了《侵权责任法》第五十五条关于患者知情权的相关规定外，基因治疗作为一种特殊治疗，其知情同意书中还应详细阐述基因治疗实施单位和个人的资格及经历、基因治疗的详细过程及疗效、可能产生的各种风险、治疗费用等内容。由于基因治疗的复杂和难以理解性，还应指定或成立相关部门，如基因治疗专家咨询委员会等，帮助患者及家属真正了解基因治疗和知情同意书的内容再做出是否签订的决定，真正维护患者及其家属的利益。临床基因治疗在这方面的法律规定应该进行全面的考量。三是规范化治疗。《侵权责任法》第五十八条第一款规定，违反法律、行政法规、规章以及其他有关诊疗规范的规定导致患者有损害，推定医疗机构有过错。基因治疗作为一种高难度、高风险的治疗方案，施行规范化的保守治疗将更加安全，因此应该制定相应的法规进行管制。
5.对治疗方法本身保护的立法
基因治疗自身能否依法得到保护，尤其是能否通过被授予专利权得到保护，一直是全球争论的焦点。基于人道主义的考虑以及疾病治疗方法因人而异缺乏重复性的考虑，大多数国家对疾病治疗方法不予以专利保护。基因治疗属于疾病治疗的方法，所以目前大多数国家都同样不予以专利保护。[16]《欧洲专利公约》(EuropeanPatentConvention,EPC)对授予专利的要求是新颖性、实用性以及创造性，其中第52(4)条指出，通过外科手术等治疗和诊断人类或动物疾病的方法不符合其工业化实用性的要求，不应被授予专利。基因治疗作为一种疾病治疗方法，在欧洲同样不被授予专利保护。此外，其真正目的还在于保护公共利益，使公众避免花费昂贵的医疗服务费用。然而，并不是所有基因治疗相关的发明都被EPC排斥在专利保护范围之外。EPC为用于基因治疗方法的产品，特别是物质或其化学成分提供专利权保护，这些产品的新颖性可参照EPC第54(5)条规定确定。即使这些物质或化学成分以前就被人知晓，但只要作为一种治疗、手术或者诊断的方法第一次被发现，仍然可以被授予专利。[16]例如，在ADA-SCID基因治疗中，导入含有缺陷基因正确拷贝数的病毒颗粒到体内的治疗方法并不能被授予专利，但治疗过程中用的这种遗传学已发生改变的病毒可以被授予专利，这个病毒将被授予治疗ADA-SCID医学使用的专利保护，即使它之前已被授予别的非医学使用专利保护。专利法对于技术发展的推动作用不容小觑，生物技术也不例外。作为这个领域的领先者，美国和欧盟都不否认这个观点。根据美国专利法的规定，疾病治疗的方法包括基因治疗，是可以被授予专利保护的。这样势必促进本土对基因治疗的深入研究，最终在这一领域处于垄断地位。关于这一点，对基因治疗专利化保护限制的欧盟也已日益意识到来自美国的竞争压力，并且意识到自身的法律规定已经限制了本土在这一领域的发展，现已采取相关措施逐渐扩大对基因治疗的保护范围。我国专利法第二十五条明确规定，对“疾病的诊断和治疗方法”不授予专利权。因此，我国对基因治疗本身不应给予专利保护。然而，用于基因治疗的药物或器械等产品，则应该按照现行《专利法实施细则》等法律授予专利保护，以维护发明者的利益和刺激我国基因治疗的研究，从而促进我国基因治疗技术水平的发展。
四、结语
肿瘤直径小于3厘米的小肝癌通常以手术切除为主，对于不能切除的肝癌可以采用化疗、放疗、介入的方法进行治疗。比起手术来，介入治疗属于微创手术，其治疗过程较为简单、安全，病人痛苦小，出血少、恢复快等多种优点，因此也受到了患者的认可。肝移植虽是肝癌患者获得根治性治愈的唯一希望，但根据米兰标准，如果肝癌患者的单个肿瘤直径超过3厘米，多个肿瘤累积直径超过5厘米时，不建议患者实施肝移植。
手术、化疗、放疗、介入和肝移植，这些方法虽有其优点，但又存在各自的局限性，不能完全满足患者的需要。为此，无数医学专家又开始寻求新的理想的治疗方法。
现在已知许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。癌症实际上也是一种与基因有关的疾病，癌症的发生和发展与基因的改变有着密切的关系，基因治疗针对的就是肿瘤发生的根源。因此，基因治疗作为肿瘤治疗的新方法已逐渐进入人们的视野，并且正在逐渐进入临床。但大多数人对基因治疗的概念还不是十分了解，听上去好像还有点深奥。那么，什么是基因治疗，它的作用机理是什么，能治疗哪些疾病，效果如何，与其他治疗相比有什么优势，它今后的发展趋势和临床应用前景会是什么样的?
什么是基因治疗
基因治疗简单说就是用基因治病。癌症就是某些基因的突变造成的。应用正常的或野生型病毒的基因，校正或者替换人体细胞或组织内有缺陷的或致病的基因，使人体细胞依旧发挥正常的功能，来达到防治肿瘤的目的。专业上将所用的这种正常的或野生型病毒的基因称为目的基因，把人体内的细胞基因称为宿主细胞基因，肿瘤细胞叫靶细胞。将目的基因导入靶细胞以后，目的基因与宿主有缺陷的或致病的基因整合在一起，使目的基因成为宿主细胞遗传物质的一部分。这种方法又叫病毒载体方法。
肿瘤的基因治疗
肿瘤基因治疗技术目前分为两大类：一类称之为替代技术或添加技术，另一类是基因的封闭技术。临床上选用的方法主要有肿瘤自杀基因治疗和P53基因治疗两种。
肿瘤自杀基因就是将治疗基因用各种方法送入到肿瘤或异常细胞中，来抑制肿瘤生长或使肿瘤细胞死亡。治疗基因包括抑癌基因和诱使肿瘤死亡的基因。基因封闭技术是通过封闭或降解肿瘤基因达到治疗的目的，如P53肿瘤抑制基因。
治疗基因是怎样进入癌细胞的
将目的基因导入到靶细胞中的方法很多，大体上可分为物理学方法、化学方法，融合方法以及病毒载体方法四大类。目前绝大多数基因治疗采用的是病毒载体方法，因为病毒载体方法的基因转移效率很高，在合适条件下可达到100％，因而更受重视。
基因的导入方法有点像火箭发射，用一种经过改造的病毒作为火箭，把治疗基因“发射”到戒备森严的癌细胞内部，干扰其DNA的复制，从而让癌细胞自杀。基因药物对癌细胞有一种特殊的亲和力，进入人体后直接奔向癌细胞，与癌细胞亲密结合，把癌细胞杀死在萌芽状态。
下面我们通过肿瘤自杀基因的导入过程来了解病毒载体方法就更容易懂了。
肿瘤自杀基因
肿瘤自杀基因又称为TK基因。目前，经美国食品与药品管理局(FDA)批准的类似TK基因制剂临床试验在全球已经超过60个，用于多种肿瘤的治疗。自杀基因有很多种，北京佑安医院采用的是重组腺病毒一胸苷激酶基因制剂联合更昔洛韦的方法。重组腺病毒～胸苷激酶基因简称ADV-TK基因(这是一个专业术语，念起来有点绕口，知道就行了，下面还会多次提到，慢慢就熟悉了。)，胸苷激酶基因是从经过基因工程改造的单纯疱疹病毒里面抽出一个基因片段，经过改造后成为专门攻击癌症细胞的基因，这是要杀进肿瘤的炮弹，由“火箭”重组腺病毒将其运送到癌细胞中，有目标地直接插入到癌细胞的DNA中，破坏癌细胞的DNA，破坏后癌细胞的DNA是不完整的，不但不能再继续生长，而且会自杀死亡。
ADV-TK对肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、上皮癌等14种肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，抑瘤率可高达80％～90％。
基因治疗肝癌的给药途径
临床采用的给药途径主要有三种方法：瘤内注射、肝动脉灌注、门静脉注射。
瘤内注射是在B超的引导下，通过经皮穿刺将基因制品直接导入肿瘤局部。这种方法目的性强、操作简便、直观的优点，注射针头与身体的接触面积小，治疗所引起的免疫反应也很小。
肝动脉灌注，通过介入的方式进行动脉插管，将基因治疗药物直接注入肿瘤的供血动脉，药物随血流分布在整个肿瘤区域，使肿瘤区域和整个肝脏中的基因药物浓度增高，增加了肿瘤细胞的转染率。还可以用介入法经血管留置药盒，为基因治疗药物的多次导入提供了条件。
门静脉注射，由于胃肠道肿瘤主要通过门脉循环转移至肝脏，门静脉对少血供的肝癌、小肝癌、门静脉癌栓、转移瘤、卫星结节、大肝癌的周边包膜的供血起重要作用，因此经门静脉途径注射基因治疗药物也作为一种有效的给药途径。
治疗中的两个关键问题
高效性和靶向性是肿瘤基因治疗中存在的两个关键性问题。
问题一：国际上70％的抗肿瘤基因制剂采用了腺病毒负载的肿瘤自杀基因。实际上就是把重组的腺病毒和所携带的胸苷激酶基因片段打到癌细胞中。那么，打入多少病毒才够呢?多了，有可能使正常细胞也携带该基因制剂，其结果不但杀灭肿瘤细胞，也会杀死正常细胞，严重时可能导致患者死亡。少了，就不能杀灭肿瘤细胞。因此，每次治疗中使用的病毒量要根据肿瘤的大小来确定打入的基因量，过去规定基因治疗中每次使用剂量最大不得超过2×1013病毒颗粒。另外，一次基因治疗的有效时间约为20～30天，在此之后，未能杀灭的肿瘤细胞仍将继续生长，且人体还将对基因制剂产生抗体，每注射一次基因，其作用可能衰减25％，几次之后基因治疗就将无效。因此，剂量和疗程的准确关系到治疗的效果。
问题二：怎样做到既不影响正常的人体细胞，又要准确杀死肿瘤细胞。
就肝癌的基因治疗来说，肝癌自杀基因疗法采用的重组腺病毒载体较好地解决了这一问题，用重组腺病毒作为载体是经过多次试验和和多种病毒载体的选择后确认的。重组腺病毒载体能携带外源基因(如上面提到的胸苷激酶基因片段)靶向性地整合到靶细胞基因(肝癌的基因)组中，实现目的基因的持久稳定表达。
基因治疗的好处
经过肿瘤自杀基因瘤内治疗后，肿瘤的生长明显地受到了抑制，而且正常的肝脏组织不受影响。基因治疗属于微创治疗病人痛苦小，治疗过程用时短，治疗后卧床6～8小时后即可下床活动。一般说来，两个疗程即可见到疗效。就目前的治疗效果看来，基因治疗没有什么坏处，不会使注入基因的肿瘤细胞扩散，也不会影响肝脏的正常功能。由于腺病毒DNA不整合入宿主细胞基因组，所以对人体没有遗传性影响，而且作为基因载体，重组后的腺病毒具有感染效率高和安全的特点，成为药物敏感基因转导肝癌细胞的有效载体。
另外，它所特有的“旁观者效应”在治疗中也起到了非常好的作用。
基因治疗的应用前景
虽然基因治疗还没有完全应用于临床，但在临床的试验观察中，已让肝癌患者看到了希望，有些小肝癌患者，经过两个疗程的基因治疗后，经手术证实癌细胞完全坏死。虽然还有些弱点需要克服，但基因疗法与其他疗法、手术治疗，介入治疗、化疗，放疗以及肝移植的联合应用，可以互补其缺点，相互协调，增加抗肿瘤效果，这将成为今后肝癌治疗的发展方向。
【关键词】基因疗法;重组p53基因腺病毒;肿瘤;抗肿瘤药
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率增长最快，已成为恶性肿瘤死亡的首要原因。采用现有的手术、化疗和放疗等传统治疗方法，其总生存率不到15%，随着分子技术研究的不断深入，基因治疗不断展示出可喜的应用前景。基因治疗是从疾病发生的根本原因———基因入手治疗疾病，是近20年来在肿瘤等严重危害人类健康的疾病治疗领域迅速崛起和发展的高新技术。其中，重组人p53腺病毒制品(Adp53)治疗肿瘤的研究最为深入，进展也最快。美国FDA于1995年首次批准了Adp53制品用于治疗恶性肿瘤的临床试验，截至2016年8月，世界范围内已开展基因治疗临床试验2356项，采用Adp53制品治疗肿瘤的临床试验占103项，其中16项用于治疗肺癌。我国自主研发的重组人p53腺病毒注射液(Gendicine，Adp53)，已率先于2004年3月获准上市，用于恶性肿瘤的治疗，成为全球首个上市的基因治疗药物。在肿瘤治疗临床研究中，Adp53已显示出良好的安全性和明确的疗效，为恶性肿瘤的治疗开辟了新途径。
1作用机制
p53基因研究已历经37年，是公认的“基因组保护神”，人类60%以上肿瘤的发生与其变异有关。Adp53基因通常是由改构的5型或2型腺病毒基因与野生型人p53基因重组而成。Adp53转染人肿瘤细胞，使外源性野生型p53基因在人肿瘤细胞内表达，治疗基因p53和腺病毒载体两方面的因素参与了Adp53对肿瘤的治疗作用。p53基因主要通过以下机制杀灭肿瘤细胞:(1)在细胞核内以转录依赖方式，以及在线粒体、高尔基体内以非转录依赖方式同时启动肿瘤细胞凋亡通路;(2)激活NK细胞等［10，11］机体免疫应答因子，发挥“旁杀伤效应”;(3)抑制肿瘤细胞的DNA修复功能及抗凋亡功能、下调多药耐药基因的表达，从而逆转肿瘤细胞对放/化疗的抗性;(4)阻截肿瘤细胞生存信号的传递，使其“休眠”在细胞周期的任何阶段;(5)抑制肿瘤细胞葡萄糖摄取及ATP产生、下调血管生成因子的表达，切断肿瘤组织血供;(6)下调基质金属蛋白酶MMP的表达，抑制肿瘤细胞黏附及其浸润转移。腺病毒载体可激发机体的免疫系统，可能通过对神经-内分泌-免疫系统的整体调节，产生多种神经因子、激素和细胞因子，有效提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫能力，增强NK细胞和细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。其表现主要为患者出现Ⅰ/Ⅱ度自限性发热。此外，患者用药后普遍表现出食欲增强、化疗和放疗毒副反应减轻，这对于提高患者的生活质量和抗病能力均有十分重要的临床意义，其作用机制有待进一步探讨。
2临床应用的安全性
Adp53是一种有活性的基因工程重组腺病毒颗粒，其结构由治疗基因p53和腺病毒载体两部分构成。p53基因普遍存在于人体细胞中，是细胞“基因组保护神”，是人体内功能最强大的肿瘤抑制基因;载体腺病毒为缺失了E1区基因的复制缺陷性5型或2型腺病毒，只对细胞一次性感染，进入细胞后不会复制，也不会整合入宿主细胞基因组DNA，应用一些有损DNA的肿瘤治疗方法，如放疗和化疗等，并不增加重组腺病毒的整合频率，5型和2型腺病毒是腺病毒家族中致病力最弱的病毒株，野生型该病毒株通常也不致病。因此，理论上讲，Adp53是一种安全的基因治疗产品。国内外临床研究结果也表明，Adp53临床应用安全:采用了瘤内注射、腔室灌注(腹腔、胸腔、膀胱等)、动脉介入等局部给药方式和静脉点滴给药途径;使用了单药治疗、与手术、化疗、放疗等传统手段联合的不同治疗方案;治疗了23种不同类型的肿瘤;涉及不同给药剂量和不同治疗疗程，均表明该制品临床使用安全，常见不良反应为Ⅰ/Ⅱ度自限性发烧，部分患者出现恶心、寒战，无其他严重不良反应。未能检测到最大耐受量。
3临床试验与临床探索性研究
肿瘤抑制基因p53在细胞周期调控和DNA发生损伤时的细胞凋亡中具有重要作用。肺癌的p53基因突变率高达50%以上，p53基因突变是肺癌中发生频率最高的遗传改变，p53基因失活对肺癌的产生起重要作用。由于复发和转移性肺癌缺乏有效治疗手段，同时肺癌中p53基因突变率较高，所以Adp53基因治疗肺癌的研究受到广泛的重视。
3．1临床试验概况
自1995年美国FDA批准Adp53治疗肿瘤第一个临床试验方案以来，迄今已有16项使用该制品的临床试验用于肺癌治疗。其中我国的Adp53注射液已获准上市，美国、德国、瑞士比利时和日本均有处于不同临床试验阶段的项目已开展或正在进行中。
3．1．1Ⅰ期临床试验
Schuler等对15例晚期NSCLC患者在CT引导或支气管镜下瘤内单次注射Adp53治疗，分107、108、109、1010PFU四个剂量组，观察到高剂量组成功地转导了野生型p53基因，RT-PCR检测6例肿瘤组织中有野生型p53表达，4例病情稳定，除Ⅰ～Ⅱ度发热、寒战、治疗相关疼痛外，没有观察到明显毒性。表明瘤内注射Adp53是可行的，Adp53能成功导入肿瘤细胞。Kauczor等在CT引导下将1×1010PFUAdp53单点注入6例NSCLC患者的肿瘤中心部位，或多点注射在瘤内的不同部位，结果显示，除流感样症状外，无其他明显毒副反应发生，治疗28d后，CT证实6例中有4例肿瘤停止生长。Swisher等报道了对28例传统治疗失败的非小细胞肺癌(non-small-celllungcarcinoma，NSCLC)患者在CT引导或支气管镜下给予瘤内注射Adp53治疗，剂量为1×106～1×1011PFU，1次/月。28例共进行了84次治疗，23例重复治疗6次。结果显示，28例中12例肿瘤组织中表达p53。可评价疗效者25例，2例肿瘤部分缓解，16例肿瘤保持稳定2～14个月，且毒性反应轻微，包括注射局部疼痛、一过性发热(常见)、轻度咯血(少数支气管镜下注射患者)，无过敏反应及其它毒性反应。表明Adp53对晚期NSCLC患者多次重复注射是安全的。
Weill等对12例气道阻塞的NSCLC患者(鳞癌和腺癌各6例)，在支气管镜下行瘤内注射Adp53，剂量为1×106～1×1011PFU/次，单纯Adp53治疗组5例，Adp53+顺铂组(顺铂80mg/m2，静脉滴注第1天，Adp53第4天)7例，28d为一个周期，共治疗6个周期。结果显示，6例呼吸道阻塞症状明显缓解(单纯Adp53治疗组1例，Adp53+顺铂组5例)，3例肿瘤达到部分缓解(单纯Adp53治疗组1例，Adp53+顺铂组2例)，中位生存期为143d，Ⅰ～Ⅱ度发热多见，其他毒性少见。Nemunaitis等［31］选择24例晚期NSCLC患者，在CT引导下给予梯度剂量的Adp53(1×106～1×1011PFU/次)联合顺铂瘤内注射，第4天，顺铂80mg/m2静脉滴注第1天，每28d为一个周期，共6个周期。23例可评价患者中有2例肿瘤部分缓解，17例疗效稳定，4例病情进展;8例出现短暂的自限性发热，化疗相关性毒性没有增加，43%的可评价患者肿瘤内检测到外源p53基因表达。该研究表明，瘤内注射Adp53联合顺铂化疗是一种耐受性较好且具有临床疗效的治疗方案。
Carbone等采用支气管内直接滴注Adp53，剂量为2×109VP、2×1010VP、2×1011VP、5×1011VP或2×1012VP，治疗25例支气管肺泡癌患者，2周内接受2次滴注为一个治疗周期，每次只针对单个受累肺叶。除2×1012VP剂量组的4例中有1例发生Ⅳ度肺部毒性、1例在完成第2周期约1个月后死亡外，其他23例均安全完成治疗。治疗4周后进行影像学评价，25例中可评价者24例，其中1例肿瘤部分缓解，17例肿瘤停止生长。在22例取得完整肺功能数据的患者中有3例患者的肺活量提高20%以上。许多患者自我感觉呼吸状况改善，表明支气管内直接滴注对治疗支气管肺泡癌是可行的。以上瘤内注射Adp53治疗NSCLC患者的Ⅰ期临床试验结果均显示，Adp53无论是单次注射较高剂量还是多次重复注射，均显示较低毒性，以注射部位疼痛及自限性发热多见，联合顺铂化疗未增加化疗相关性毒性，外源性p53基因能有效表达，Adp53的抗肿瘤效应在注射部位局部最高，能导致肿瘤消退和延长局部病灶的稳定。支气管肺泡癌为肺泡内弥漫方式生长，不易直接注射，采用支气管内滴注可以到达肿瘤细胞。
3．1．2Ⅱ期临床试验
Schuler等将Adp53与铂类联合应用治疗25例Ⅲ/Ⅳ期NSCLC患者，治疗方案:A组，卡铂AUC6第1天+紫杉醇175mg/m2第1天;B组，顺铂100mg/m2第1天+长春瑞滨25mg/m2第1、8、15、22天联合瘤体内注射7．5×1012VPAdp53第1天。共进行了68个周期的治疗，20例完成3个以上周期的治疗。结果显示，两组总疗效(基因治疗联合化疗组52%，单纯化疗组48%)和生存期无统计学差异，基因治疗联合化疗可促进肿瘤消退，68%患者肿瘤组织中表达外源性p53基因。研究还发现，用p53基因治疗时，可用p21基因作为其观察指标，基因治疗联合化疗组治疗前后活检组织分析发现，只有表现出肿瘤消退或停止生长的病例才能检测到p53靶基因p21基因的表达，说明p21基因的表达上调是p53基因治疗NSCLC所表现生物效应的敏感指标。Swisher等应用Adp53联合放疗治疗19例不宜行手术或化放疗的非转移性NSCLC患者，在支气管镜下或CT引导下瘤内注射Adp53(剂量为7．5×1012VP)第1、18、32天，同时接受一个疗程的放疗，剂量为60Gy，17例患者按计划完成所有治疗，治疗完成后3个月进行原发肿瘤病理活检显示，63%(12/19)患者病理活检阴性，16%(3/19)患者仍有残存肿瘤组织，21%(4/19)患者无法评估，而单独放疗者病理阴性率不到20%。
行CT和支气管镜检查发现，5%(1/19)患者肿瘤完全缓解，58%(11/19)患者肿瘤部分缓解，16%(3/19)患者肿瘤停止生长，2例不能评价疗效，可评价患者的有效率达71%。RT-PCR定量分析检测到肿瘤组织中4个p53相关基因p21、Fas、BAK和MDM2的表达都增高，说明外源性p53基因导入肿瘤组织后发挥了生物学效应。最常见的毒性反应为Ⅰ～Ⅱ度发热(79%)和寒战(53%)。表明瘤内注射Adp53联合放疗能被很好耐受，Adp53没有增加放疗的毒性，BAK基因的表达与Adp53转导密切相关。以上两个Ⅱ期临床试验结果表明，Ad2p53与放化疗联用均未增加放化疗毒性，能明显增加NSCLC患者的临床疗效，联合化疗可以促进肿瘤消退。正进行的Ⅲ期临床试验将对Adp53基因治疗联合标准治疗是否能令患者临床受益给出一个最终的结论。
3．2临床探索性研究
官泳松等在CT引导下经皮穿刺瘤内注射或经支气管动脉灌注Adp53治疗15例肺癌患者，给药2～5d，行BAI灌注化疗药物;根据病情变化再次进行Adp53和(或)BAI。治疗后常规使用CT评价疗效。全部15例均完成治疗，并接受随访2～11个月。有效率(CR+PR)46．7%(7/15)，1例肺部肿块消失，6例肺部肿块缩小，3例纵隔淋巴结缩小，1例胸水减少，仅1例肿瘤长大，14例临床症状有不同程度缓解93．3%(14/15)。p53治疗后6例发热(38～40℃)，未观察到基因药物的其他严重不良反应。结果初步显示，Adp53与BAI联合应用是一种治疗肺癌安全、有效的方法。田耕等对20例晚期NSCLC患者行CT引导下瘤内注射Adp53治疗晚期非小细胞肺癌，治疗后出现发热41例次，占41%(其中需药物处理的11例次)，咯血7例次，占7%(经观察和药物治疗后恢复)，气胸5例次，占25%(经吸氧和观察后恢复)。治疗前后血常规、肝、肾功能检查无统计学差异。结果表明CT引导下瘤内注射Adp53是一种安全可行的治疗方法，合理选择穿刺路径、熟练掌握操作技巧是减少并发症的关键。翁准等观察了Adp53在晚期肺癌治疗中的疗效和毒副反应。12例Ⅲb-Ⅳ期肺癌及3例肺转移癌患者，CT引导瘤内注射Adp53，1次/周×4疗程;通过临床观察、CT和病理对照及短期随访进行评价。治疗后2个月观察肿瘤缩小5例(33．3%)，无变化7例(46．7%)，增大3例(20%)。治疗后病理观察:癌组织坏死，癌细胞稀少;除自限性发热外，无明显毒副反应。瘤内注射Adp53治疗肺癌，能较好地抑制局部肿瘤的发展，尤其对失去手术机会，不能耐受放化疗的患者，是一种可行且有前景的方法。
刘艳华等选择经病理证实为晚期NSCLC患者100例，随机分为两组，A组接受Adp53联合化疗的治疗方案(治疗组)，B组仅接受化疗(对照组)。按照实体瘤的疗效评价标准(RECIST)评估患者的近期疗效。按WHO抗癌药物毒副作用分级标准评价毒性。A组患者有效率(RR)为48%(24/50)，B组为28%(14/50)，差异有统计学意义(P=0．039);两组患者主要不良反应为化疗的骨髓移植和胃肠道反应，发生率无统计学差异。治疗组患者出现发热、寒战、肌肉酸痛的概率高于对照组。表明:Adp53联合化疗治疗晚期NSCLC近期疗效满意，不良反应可耐受。上述研究表明，Adp53瘤内注射或联合介入方式给药，均能有效治疗肺癌，单用时即可显示明显疗效，与化疗联合使用时能有效提高疗效，并未增加化疗的毒副作用。
综上所述，目前世界范围内研究最为深入的基因治疗制品———Adp53，临床使用安全，常见的不良反应仅为Ⅰ/Ⅱ度自限性发热。该制品与放化疗等治疗方法联合使用，可产生显著的协同抗癌效应，且可逆转肿瘤细胞对放化疗的抗性，减轻放化疗的毒副反应，提高患者生活质量。Adp53有望与三大传统治疗手段携手，为肺癌患者的治疗带来新的希望。肿瘤是一种多基因疾病，今后用于治疗的基因应是多种基因的联合。临床前研究已显示，多基因联合转导的抗肿瘤效应好于单基因，用于肿瘤治疗的基因将不局限于少数抑癌基因及细胞周期、细胞调控的基因，而会扩大选择范围。同时，基因治疗的一些问题，包括基因载体、基因转移率、组织特异靶向性、安全性、治疗方案选择等也会逐渐解决。由于基因治疗是从肿瘤发病机制的角度进行治疗，为肿瘤治疗提供了一种全新的方式，因而在肿瘤的防治中具有广阔的前景。
卵巢癌是女性生殖系统常见的三大肿瘤之一，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但是因其早期无明显临床症状，致使等患者出现症状后再就医往往为时已晚，所以其死亡率是妇科恶性肿瘤的首位。近年来，随着分子生物学的发展, 基因治疗作为一种新的医学技术得以迅速发展，为肿瘤的治疗开创了新的领域。下面介绍几种具有应用前景的卵巢癌基因治疗策略。
1 诱导细胞凋亡基因疗法
诱导细胞凋亡基因疗法是一种通过选择性表达或导入某些外源基因诱导肿瘤细胞凋亡,增强对化疗的敏感性的有效基因疗法。Survivin是最近新发现的一种凋亡抑制基因,属于凋亡抑制蛋白(inhibition apop tosis p rotein, IAP) 家族的新成员，所有分化成熟的组织中均检测不到其表达，而大多数常见肿瘤组织内如肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌中表达异常升高[1]，其与恶性肿瘤的发生、发展、血管生成、肿瘤的预后关系密切。
Wall等[2]应用细胞分子生物学技术通过抑制Survivin基因蛋白的磷酸化过程来提高肿瘤细胞的凋亡率,从而达到治疗肿瘤的目的。Survivin的多态序列中, 34位氨基酸为苏氨酸,是细胞周期素依赖蛋白激酶P34cdc22的磷酸化点,该位点的磷酸化对维持Survivin的凋亡抑制功能非常重要。以丙氨酸取代后的突变体(T34A)可以使凋亡抑制功能丧失,以此突变体转染Hela癌细胞,突变体的高度表达可以诱导转染细胞的自发性凋亡。经证实,新一类的抗癌药物GGTls中的GGTI-298 和GGTI-2166通过阻抑PBK/AKT和survivin途径来诱导顺铂敏感和耐药的人类卵巢上皮性癌细胞凋亡。在GGTI-298和GGTI-2166治疗后, PBK和AKT激酶水平降低,生存素表达明显减少。构成上活化的AKT2和/或生存素的异位表达能明显地复苏被GGTI-298诱导凋亡的人类癌细胞。其前的研究显示Akt调节生长因子诱导的生存素,而p53抑制生存素的表达。然而,构成上活化的AKT2却不能复苏GGTIs下调生存素,再进一步, GGTIs在野生型p53和p53不足的卵巢癌细胞株中均能抑制存活素的表达并诱导细胞程序性死亡。这些资料表明GGTI-298和GGTI -2166不依赖于p53而针对PBK/AKT和survivin 类似途径来诱导凋亡[3]。
2 抑制细胞信号传导通路疗法
研究表明,表皮生长因子受体(EGFR)在许多恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤的发生、转移、预后等密切相关。Shih等在脑细胞瘤中发现了原癌基因neu，Padly等证实该癌基因编码的185kDa的蛋白质P185neu与EGFR的基因一样同CerbB具有同源序列，故将EGFR基因命名为CerbB-1（HER-1），neu基因命名为CerbB-2（HER-2）。近年来，又陆续发现了CerbB-3（HER-3）CerbB-4（HER-4），组成了EGFR家族。此家族成员均是具有酪氨酸蛋白激酶活性（TPK）的生长因子受体。
CerbB-2的过度表达与卵巢癌患者生存期、生存率及卵巢癌的耐药性的发生密切相关[4]。Herceptin作为人源性单克隆抗体, 与CerbB-2 的细胞外部分有高度亲和力, 能靶向结合于表达CerbB-2的卵巢癌细胞, 阻断配体介导的细胞信号传导，影响上皮细胞生长，也可通过诱导抗体介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。Mauricio等通过将Herceptin 与肿瘤坏死因子联合应用于阳性的CerbB-2卵巢癌细胞系,发现Herceptin能通过抑制酪氨酸激酶来增强肿瘤坏死因子引起的细胞凋亡效应。临床应用Herceptin治疗CerbB-2阳性卵巢癌已取得良好的治疗效果。
3 多重耐药基因疗法
卵巢癌化疗失败的根本原因是产生化疗药物耐药性。研究发现, 在对顺铂、阿霉素耐药的卵巢癌细胞株中72%的细胞出现了MDR1 基因的过度表达。抑制MDR1 基因的表达, 不仅使细胞内化疗药物浓度增加，也增强细胞对药物的敏感性[5]。
卵巢癌多细胞球体多药耐药糖蛋白Pgp表达的升高与细胞周期素依赖性激酶抑制剂p27呈正相关[6]。p27可使细胞周期蛋白E和细胞周期依赖性蛋白激酶2的活性受到抑制，使细胞周期停滞在G1期，对细胞周期进行负调控。Xing[7]将p27ASON经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780、CAOV3，用锥虫蓝排除实验法和流式细胞仪检测细胞凋亡率来分别比较单层细胞p27ASON转染前后培养的多细胞球体的紫杉醇敏感性，结果表明，p27ASON可以下调p27的表达，防止细胞间黏附并促进细胞增殖而下调Pgp的表达，从而一定程度逆转卵巢癌对紫杉醇化疗的耐药性。
4 突变补偿疗法
突变补偿是消除主要致肿瘤基因,取代改变的肿瘤抑制基因,或干扰某些生长因子及其受体的功能。将特异性基因导入肿瘤细胞,纠正肿瘤细胞的基因缺陷,使细胞周期停滞、诱导细胞程序性死亡或使肿瘤细胞对化疗和放疗敏感。编码人类免疫缺陷腺病毒与野生型P53 (SCH58500)重组体腹膜注射有良好疗效,既安全又可耐受,并且联合铂类化疗在复发性卵巢癌患者有更好的效果。
目前研究最为深入的抑癌基因为P53。在30%～79%卵巢癌中出现了P53异常。实验证明野生型P53基因转染到有P53 基因突变的卵巢癌细胞,既抑制肿瘤的生长,又具有旁观者效应[2]。2005年Ad-P53基因治疗获准进行Ⅲ期临床试验，现我国重组人P53腺病毒（今又生）广泛应用于临床卵巢癌的治疗并取得了良好的治疗效果。
5 反义基因疗法
它是利用反义技术设计与异常激活有害基因及其mRNA互补的反义寡核苷酸,特异性封闭这些基因使其不表达或低表达,从而达到减少基因产物,抑制细胞恶变的作用。由于该疗法是从核酸角度着眼,故而是一种最根本、最有前途的治疗方法。Fei R[8]针对CerbB-2基因和c-myc基因,联合抗基因治疗,靶向CerbB-2和c-myc,抑制卵巢癌细胞COC(1)细胞增殖和CerbB-2及c-myc基因表达。c-raf-1可被ras基因激活之外还存在独立的激活途径:可被酪氨酸激酶src与JAK1、蛋白激酶Cα、神经酰胺活化的蛋白激酶等激活。因而c-raf-1是EGFR介导的信号转导系统上的关系基因之一[9],c-raf-1是理想的基因治疗靶点。CerbB-2 ASODN 与CerbB-2 mRNA 5’端编码区互补,Craf-1 ASODN 与Craf-1 mRNA 3’端非编码区互补。Pirollo等针对raf-1、H-ras、CerbB-2基因设计合成的硫代ASO,不仅能抑制卵巢癌细胞生长,而且能增加对放疗的敏感性。
Zaffaroni等[10]在体外和体内的研究中利用针对Survivin的反义寡苷酸治疗肿瘤,发现肿瘤的生长速度减慢,并且可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,如紫杉醇、顺铂和鬼臼乙叉甙及对照射和免疫治疗的敏感性。研究表明靶向抑制survivin基因表达在肿瘤治疗中有巨大的潜在价值。
等针对端粒酶hTERT设计合成反义脱氧寡核苷酸,对卵巢癌细胞系SKOV3及ES-2进行反义基因治疗,能通过抑制端粒酶活性,增强细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等抑制卵巢癌细胞生长,与CDDP合用能增强对癌细胞的杀伤作用。
基因治疗为卵巢癌的治疗展现了一个极有希望的前景。学者们正针对卵巢癌的基因治疗中存在的一些问题,研究载体改良,增强目的基因靶向性等,迎接根治卵巢癌的挑战。相信随着人类基因组计划的完成,分子生物学等学科的进一步深入发展,人类将开辟卵巢癌基因治疗的新纪元。
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【关键词】青光眼基因治疗
Advancesingenetherapyforglaucoma
AbstractPreviousstudiesinmoleculargeneticshaveindicatedinglaucomaelevatedintraocularpressureanddamageofdeathofretinalganglioncellsmayberelatedtotheabnormalityofrelatedgene.Sogenetherapyhasbeengraduallyappliedinmedicaldomainasakindofnewtreatmentmethod,itprovidesextensiveprospectforthepreventionandcureofglaucoma.Thispaperreviewsadvancesingenetherapyforglaucoma.
·KEYwordS:glaucoma;genetherapy
0引言
青光眼是一组以进行性视神经损害和神经元丧失为特征的眼部疾患。青光眼作为全世界第二位的致盲眼病,其有效防治越来越成为防盲治盲和公共卫生工作的重点。眼压升高和缺血是引起青光眼性视网膜神经节细胞(retinalganglioncells，RGCs)丧失的两个刺激因素，高眼压将直接损害视神经轴突，并导致RGC不可逆性丧失。由于RGC死亡的确切分子机制还不是很清楚，目前还没有有效的治疗来预防严重青光眼患者的视功能丧失[1]。目前青光眼的治疗仍以降低眼压为主,但常用的药物存在较严重的并发症。而手术治疗如滤过性手术,效果不是很理想，一方面很多患者术后因发生滤过泡疤痕化而影响眼压控制，另一方面一些患者即使眼压已经控制达正常范围,他们的视功能损害仍继续进展,且无有效的治疗方法。
基因治疗是用基因工程技术,对基因进行改建、修饰和置换,或对异常基因表达进行干预以治疗疾病的方法。其含义是从导入基因纠正遗传病的基因缺陷,扩大到导入外源基因达到治疗效果的所有治疗方法。转基因技术适合治疗青光眼，在于青光眼的慢性过程和比较明确的病理学基础[2]。解剖学、遗传学和基因表达图谱已经证明转基因技术治疗青光眼，包括改善房水引流、减少滤过泡疤痕形成和保护RGC已成为可能。本文对青光眼基因治疗研究现状进行综述。
1转基因治疗青光眼的靶组织
青光眼基因疗法特有的靶组织结构或细胞类型包括小梁网(trabecularmeshwork,TM)、睫状上皮(ciliaryepithelium,CE)、睫状肌(ciliarymuscle,CM)、视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)和Müller细胞(MCs)。小梁网位于前房角，是一种由不同内皮细胞和细胞基质以特定结构形成的海绵状组织;它负责维持房水流出的阻力和保持眼球的形状。睫状上皮包括两种紧密连接的覆盖在睫状突的细胞层，外层细胞面向后房，是非色素性上皮，主要分泌房水。房水产生后，进入前房，通过小梁细胞和内层Schlemm管壁离开眼球而进入静脉系统。睫状肌紧邻睫状上皮和小梁网。一旦睫状肌收缩，晶状体调节力增加，小梁网的构型发生变化，房水流出易度增加。RGCs，视网膜的最内层细胞，通过其轴突将光信号传导至大脑，其轴突组成了视神经。许多刺激伤害，通常是眼压升高引起RGCs损害和凋亡，最后导致视神经纤维丧失[3]。
2青光眼基因治疗的有关载体
能将遗传物质传送入视网膜或RGC的载体系统至少应具备以下四种生物学特性：(1)能对准目标的特有细胞类型，其目标或者是受染细胞，或者是邻近细胞，例如，引入分泌性治疗药物的基因。(2)基因传导应该有效，即现有的载体滴度和有限的剂量可以很安全地注射入各种视网膜间隙，传代基因能有效地复制，并进入足够多的靶细胞，允许治疗药物在视网膜特定部位进行表达。(3)载体相关表达应该恒定并适当地持续较长时间。(4)载体本身毒性应该很低，这包括药理学毒性、针对传导基因产物、输入载体或者源于输入载体的任何表达基因的局部和全身免疫反应。
目前用于青光眼转基因治疗，并满足这些生物学特性的载体可分为病毒和非病毒两种方法：
2.1病毒方法病毒方法是利用载有目的基因的复制缺陷病毒感染靶细胞。
2.1.1相关的DNA病毒载体⑴腺病毒(adenovirus，Ad)载体：最初的腺病毒载体能够搭载大约8kb的传代DNA。几种早期的病毒基因的附加失活作用产生的复制缺陷病毒载体能够在传导的视网膜细胞中生长并形成很高的滴度。基因表达通常在接种后24h内出现，这使得在动物模型中进行研究变得非常方便。重组的腺病毒由于宿主对输入的病毒颗粒本身和因为感染而产生的大量病毒蛋白质的反应，故具有相对的免疫原性。然而，眼部的相对免疫特性使得暂时性的腺病毒相关的基因治疗仍然有效。由于重组的腺病毒DNA并不能稳定地整合入宿主染色体的DNA中，所以其在眼组织中传达的基因表达是暂时性的，一般保存1～3mo。如果其引起的免疫反应能进一步减轻的话，特殊的短期基因治疗干预，将是有利时机[4]。⑵腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体：通常这种病毒感染人类，并不引起已知的疾病。它是一种小的单链DNA病毒，它本身只产生非常小的蛋白质，因此具有相对的非免疫原性。如果没有与野生型辅助病毒(通常是人类腺病毒)一同感染，野生型AAV能稳定地整合入人类19号染色体的特定位点，并建立隐匿性感染。相反，由于在重组的AAV(rAAV)中删除了这种特殊整合位点所必需的病毒rep蛋白质，目前的AAV载体并不具备这种特性。然而，体内实验显示，rAAV能在长达数周或数月内缓慢地整合入随机的染色点，这取决于靶细胞，也使得长期性的、或者是永久性的传导成为可能。与重组的腺病毒不一样，rAAV似乎能传导正常的RGC和光感受器细胞与视网膜色素上皮细胞。但是，当前的rAAV具有两大缺陷：①它限定了搭载的DNA不能超过4.8kb。尽管AAV适合于目前的可用于视神经保护治疗的绝大部分基因，但是，只有有限的空间用于调节成分，这是为精确地协调和控制基因表达所必需的，才能起作用。②如果rAAV整合确实是随机的话，理论上就存在插入的基因突变。这使得临床前期研究比其他载体更加费时，而且不可能很快用于视网膜变性疾病的动物模型中。目前一种新的，更加有效的rAAV包装技术能很好地避免低病毒滴度和野生型腺病毒辅助剂的低水平污染引起的一些早期问题[5]。⑶单疱病毒(herpessimplevirus,HSV)载体：HSV能有效地将有益基因转入青光眼相关的结构和细胞。在猴和啮齿类，通过前房注射，在TM和CE转染效率很高，而其他细胞如虹膜色素上皮细胞和角膜内皮细胞转染效率较低。只有在CMV启动子和HSV载体一起进行实验时，基因表达最多持续10d[6,7]。HSV在RGCs亦能产生有效的转染，但在灵长类，其传导位置只局限于传送部位[3]。
2.1.2逆转录病毒(RV)载体其优点是目的基因可以整合到染色体上,可以实现稳定长期表达,而且转移效率高。但目前应用于基因疗法的大部分RNA病毒载体都是源于鼠类白血病逆转录病毒。它不能转染非增殖期的细胞,所以不适用于角膜内皮及视网膜等组织的基因转染。相反，基于人类免疫缺陷病毒(humanimmuno-deficiencyviruses，HIV)和猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyviruses，SIV)的慢病毒载体(lentiviralvectors)，编码诸如vpr之类的蛋白质，允许细胞核输入病毒基因组，而不影响相伴随的有丝分裂。慢病毒载体(lentiviralvectors)：这种载体通常是假表型的，即为包被另外一种病毒蛋白质作准备。能够以这种方式搭载慢病毒，并具有这种特性的细胞通常是CD4+T细胞，允许慢病毒感染多种细胞。慢病毒含有泡状口腔炎病毒(vesicularstomatitisvirus，VSV-G)的糖蛋白，已经成功地用于鼠类视网膜。在一次接种后能感染整个视网膜，并能至少稳定3mo。它需要将染色体整合，才能获得基因表达，这提示病毒载体能在RGC进行长时期传导。但是这种载体具有以下几种技术缺陷：①任何基于人类的免疫缺陷病毒的载体系统在可以用于人类之前，都必须证明不会产生野生型人类免疫缺陷病毒。许多新近的基于病毒载体已经删除了原来的人类免疫缺陷病毒基因组的重要节段，因此，进一步减少了产生感染性病毒的危险性。②按照目前的滴度，需要30～100μL重组病毒才能达到整个人类视网膜。最近，病毒颗粒的稳定性和浓缩技术已得到明显改善，因此，容量问题将会被解决。③需要关心的是基于人类免疫缺陷病毒载体的整合问题。整合位点似乎是随机的，因此，可能存在整合所导致的基因突变。很可能需要更精细和更大的启动子以平衡转基因和内源性基因的长期表达。染色质结构已被认为是基因表达的重要调节子，并强化了近端启动子不仅仅只是一个重要想法的思想。病毒载体整合入基因组的位点往往影响治疗性基因的表达，所以，下一代的启动子应该含有开放性染色质的调节子，诸如位点控制元素，它可以在一些情况下以暂时性的方式上调或下调治疗性基因产物水平。继续研究视网膜细胞特殊的启动子，已被认为是基因疗法的必要进展[8]。Lotery等[9]通过玻璃体切割和视网膜下注射将重组的猫免疫缺陷病毒(recombinantfelineimmuno-deficiencyvirus,rFIV)载体将β半乳糖酶基因转染入cynomolgus猴视网膜。结果表明光感受器和Müller细胞有极好的转基因表达。局部炎症反应只局限在注射部位。电生理检查表明，视功能不因载体注射而受到明显影响。这提示视网膜下应用rFIV载体能转导非灵长类视网膜各种类型的视网膜细胞，rFIV载体具有潜在的治疗作用，并可用于人眼的基
因疗法。Loewen等[10]采用视网膜下注射2μL的猫免疫缺陷病毒(felineimmuno-deficiencyvirus,FIV)或腺病毒载体，比较两种载体行视网膜转基因的长期表达情况，在剂量-反应研究中，2×105传导单位(transducingunits,TU)中，两种载体在视网膜的传导范围一致;但在长期表达研究中，在不同的时间点(1wk;1，3，6，12和16mo)FIV载体的表达程度(grade)均比腺病毒载体高。但大部分腺病毒注射眼均出现了局部巨噬细胞样细胞的聚集和视网膜结构的破坏。结果表明，慢病毒载体经随访16mo仍能持久表达，可用于慢性视网膜疾病的基因治疗。
2.2非病毒方法包括脂质体介导法和受体介导法等。与病毒方法相比,没有致癌性,也排除了病毒感染,缺点是整合率低。近年来,人们对脂质体介导的转移方法有了较多的研究,转导效率有很大提高,如脂质体转染试剂Lipofectin及其新一代产品Lipofectimine。Hangai等[11，12]用其特殊的脂质体转染系统对视网膜感光细胞层取得了较好的转染效果,但基因表达时间较用AV载体明显短,注射后30d时基因表达已经十分微弱或消失。由于脂质体介导法还具有安全、方便的优点,所以是一种很有前途的目的基因运载体系。Hart等[13]用受体介导法转染视网膜组织也取得了较好效果。
3青光眼的基因治疗效果
尽管大多数青光眼的遗传基因尚不清楚，但编码眼压降低和/或视神经保护基因的转染和表达可改变相关细胞的生理状态和阻止发病。与其他慢性疾病一样，应用基因治疗青光眼将提供长期有效的治疗效果。
3.1改善房水循环目前可用于处理眼前节组织降低眼压的药物必须每天用药，那么顺从性是个主要问题。基因疗法可以减轻这个问题。
3.1.1减少房水的生成房水的生成主要靠睫状突非色素上皮逆浓度梯度,将Na+泵入后房。睫状突非色素上皮细胞紧密连接,形成血-房水屏障,在Na+/K+ATP酶的作用下,Na+由细胞主动分泌入后房,这是一个耗能过程,且与HCO3-和Cl-协同转运。而通过α2，β2肾上腺素能受体可调节腺苷酸环化酶的活性,继而影响Na+/K+ATP酶的活性[14]。目前许多药物都有抑制与房水生成相关的酶或离子泵的作用,如Na+/K+ATP酶对乌巴因(ouabain)敏感,可被其抑制而减少房水的生成;目前应用较多的β2受体阻滞剂,其作用机制就是抑制睫状体上皮的离子泵或酶的活性,引起第二信使的改变从而抑制房水的生成。以上研究结果提示,可以通过影响与房水生成相关的几个步骤减少房水的生成。根据房水的生成原理,目前至少可由以下几个途径通过基因敲除的方法减少房水的生成：⑴基因敲除与房水生成相关的酶或相关的离子通道;⑵基因敲除腺苷酸环化酶减少房水的生成;⑶基因敲除G蛋白,减少房水的生成。
3.1.2疏通房水流出通道增加房水的排出将外源基因导入小梁网以治疗青光眼，Borras等[15]将外源基因导入小梁网细胞中,基因可表达7d。Budenz等[16]将含有lacZ基因的腺病毒载体注入前房和玻璃体内,结果发现小梁网细胞可表达持续14d。使用灌注眼培养系统,Borras等[17]将管蛋白(tubulin)基因导入小梁网细胞中,可降低眼压。
3.2视神经及视网膜神经节细胞的保护性治疗[18]青光眼性RGCS凋亡的激发因素主要有神经营养因子的剥夺和兴奋性毒素一氧化氮的毒性作用。高眼压或低血流灌注压导致缺血缺氧等，使RGC轴浆流中断，靶源性神经营养因子供应中断，同时兴奋性毒素大量产生，激活诱导凋亡的基因作用于细胞表面受体，启动RGC凋亡程序。已有研究表明重复眼内注射神经营养因子能暂时性拯救因轴突损伤导致的RGC死亡。采用基因疗法转染这些营养因子，能克服重复注射带来的并发症。
脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是一种重要的RGC存活因子。DiPolo等[19]通过玻璃体腔内BDNF表达的腺病毒载体能暂时性延缓视神经横断性损伤后RGC死亡。但是基于腺病毒载体的转基因表达有效时间相对较短，而且其本身易引起炎症反应。腺相关病毒(AAV)载体能够在视网膜进行长期的转基因表达，引起的眼部炎症反应很轻微。Martin等[20]通过采用532nm二极管激光处理大鼠小梁网引起中等程度的慢性眼压升高，只导致特异性的RGC丧失，而不损害其他视网膜层。他们采用独创的AAV-BDNF结合土拨鼠肝炎逆转录调节元素(woodchuckhepatitispost-transcriptionalregulatoryelement,WPRE),单次玻璃体腔内病毒注射2wk内就很容易在大鼠RGC层神经元产生很高的转染效率。结果表明实验性青光眼4wk后，玻璃体腔内注射AAV-BDNF-WPRE与单纯注射生理盐水或不含BDNF的对照病毒相比，能明显增加RGC的存活率(轴突计数)，进一步支持神经营养疗法可作为青光眼降低眼压的补充治疗的潜在可行性。
Dingwell[21]等证实碱性成纤维生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)在RGC生长发育过程中是一种潜在的刺激因子。但Cui[22]在视神经颅内段轴性损伤后，采用眼内注射bFGF蛋白质未能显示RGC再生。据推测，这是由于bFGF在体内的半衰期很短，在眼内持续时间有限。Sapieha等[23]采用视神经微压榨伤(micro-crushlesion)制作视神经损伤模型，用重组AAV将bFGF基因转入成年SD大鼠玻璃体腔，以利于bFGF的持久释放。与对照组的神经相比，FGF-2基因转染后，视神经轴突从病变部位向后的数量要多10倍，这种上调反应与FGF受体-1表达相关。bFGF转基因表达只对受损的RGC起暂时性的保护作用，而且这种神经营养因子对轴突延伸并不能代表神经元存活数量的增加。
近年来，睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNDF)被证明是能改善受损的RGC的存活与再生最有前途的神经营养因子之一。VanAdel等[24]采用视神经横断性损伤作为在体模型，评价具有自我失活的复制缺陷的慢病毒相关的载体转染人类睫状神经营养因子(SIN-PGK-CNFT)对成年大鼠RGC轴突存活率的影响。他们采用单次玻璃体内注射慢病毒编码的人CNTF(LV-CNTF)基因或细菌β-半乳糖酶(LV-LacZ)作为对照组，在大鼠视神经轴性损伤后14d与21d检测RGC的存活情况。结果表明，与对照组相比，用lentiviral作为载体应用CNTF，能明显增强RGC的存活，而且效果比单纯玻璃体内注射重组人CNTF要好。
色素上皮源性因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)，是一种50kDa蛋白质，由人胚胎视网膜色素上皮细胞分泌。已经证明PEDF是一种有希望的内源性新生血管形成抑制剂和神经保护蛋白质。Takita等[25]采用前房内灌注生理盐水，将大鼠眼压升高至110mmHg，持续60min，制作压力诱导的视网膜缺血-再灌注模型。在模型制作前4d玻璃体腔内注射腺病毒载体表达的PEDF(AdPEDF.11)颗粒。结果表明，节细胞层细胞密度明显多于对照组(AdNull.11);但凋亡细胞数(TUNEL阳性细胞)明显少于对照组。提示腺病毒载体相关的眼内PEDF表达能明显增加视网膜缺血-再灌注(急性高眼压)损伤神经元的存活率，这种保护作用可能源于抑制缺血诱导的凋亡，并认为转基因方法能直接干扰因视网膜缺血所导致的细胞程序化死亡。
原癌基因bcl-2的过度表达可以减少细胞凋亡，但它是否影响轴突再生尚无定论。bcl-2在胚胎感觉神经元的体外实验以及生后受损RGC的体内、外实验中可以促进轴突生长，但却不能诱导新生小鼠轴突重建。在成年啮齿类动物，即使去除了髓鞘相关抑制分子或加入周围神经移植物，bcl-2过度表达仍不能进一步加强轴突再生。Bcl-XL是bcl-2家族的一个成员，去除该基因可增加发育性细胞死亡，而过度表达可保护生后及成年神经元免于创伤、缺氧、代谢等损伤[26]。Kretz等[26]将Bcl-XL通过腺病毒载体在体外、体内受损的RGC中过度表达后，发现能使培养的RGC轴突的数目、总长度增加，活体视网膜内RGC的轴突可以长入邻近的视神经断端，但不能通过瘢痕形成的区域。其中机制有待阐明，Bcl-2和Bcl-XL很可能是通过调节细胞存活和再生的通路而起作用的。
3.3抑制滤过泡的瘢痕化[27,28]眼压升高是青光眼的主要危险因素，施行手术降低眼压仍然是治疗青光眼的主要手段。滤过性手术是目前常用的抗青光眼手术，但术后滤过道的疤痕形成将导致手术失败，因此常常在术中或术后联合应用抗代谢药物，如丝裂霉素C(mitomycin,MMC)和5-氟尿嘧啶以减少滤过道的疤痕形成。但它们同时也会产生意想不到的副作用，如低眼压和由于细胞破坏导致的组织变性。基因疗法能预防青光眼滤过性手术后增殖的伤口愈合反应。Perkins等[29]给新西兰白兔施行
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全层巩膜切除术，并在以角膜缘为基底的结膜瓣下放置浸有含人p21基因(rAd.p21)的复制缺陷的重组腺病毒、非特异的绿荧光蛋白标记基因(greenfluorescentprotein，GFP)、β-半乳糖酶(beta-galactosidase)、MMC(0.5g/L)及平衡盐溶液的纤维素海绵5min。结果表明，经rAD.p21基因处理的筋膜成纤维细胞DNA合成和细胞生长呈现剂量依赖性抑制。但MMC引起薄壁滤过泡、前房积脓等并发症，在rAD.p21基因处理组未发现。两组在实验结束时均可见功能性滤过泡。这提示rAD.p21基因疗法能为青光眼滤过性手术提供有效的抗纤维增殖作用，但没有MMC相关的并发症发生。为进一步了解rAD.p21基因的适应证，Wen等[30]研究了兔眼结膜局部转染腺病毒p21基因后，载体传送、靶组织的转基因表达、炎症反应、非靶组织的生物分布和免疫反应等特征。结果表明，结膜下注射rAd.p21后，其生物分布只局限于眼组织;滤过性手术后，将rAd.p21转染至结膜下，术后早期引起急性炎症反应，但到第14天时与安慰剂对照组无明显区别。这些结果显示，将基因局部转染至结膜是一个非常合适的眼部基因转染模型。
Heatley等[31]先采用重组腺病毒将人类p21(WAF-1/cip-1)基因引入猴高眼压眼，然后施行小梁切除术，结果表明经p21处理眼造瘘口在功能上、组织学上均保持开放，并没有发现在对照眼上出现丝裂霉素C治疗的副作用。Yoon等[32]在正常兔眼施行青光眼滤过性手术后，结膜下注射2μghumanRAD50(hRAD50)基因，采用光镜和电镜比较hRAD50处理组与MMC处理组和正常对照组的形态学改变。结果表明，局部应用RAD50的抗纤维增殖作用与MMC相同，但没有结膜上皮基质层的损害，提示hRAD50可作为一种可能的抗纤维增殖药物用于青光眼滤过性手术，但需要更进一步研究其可能存在的全身并发症。
4与青光眼组织相关的潜在的靶基因
4.1小梁网①细胞骨架调节蛋白：通过破坏细胞骨架结构，刺激房水流出增加;②Myocilin基因：高度表达野生型位点，竞争突变位点;③金属蛋白酶：细胞外基质重新塑型[3]。
4.2睫状上皮①调节房水生成24h节律的基因：减少夜间房水生成增加所导致的潜在性的危险眼压水平。②β肾上能受体增进睫状体细胞对药物反应的潜能，抑制房水生成。③减少房水生成的其他基因(神经多肽链)：调整小梁网和睫状肌的功能[3]。
4.3睫状肌细胞①X基因：上调前列腺素的合成;②金属蛋白酶：产生基质金属蛋白酶，增加葡萄膜巩膜通道房水流出[3]。
4.4视网膜神经节细胞①神经营养素受体(TrkB)：增加RGC对神经营养因子反应的潜能;②神经营养素基因(BcIX)：增加内源性抗凋亡基因产物水平以拮抗BAX功能;③Bax基因：反义结构以减少BAX蛋白水平;④Hsp70/72基因：增进RGC对内源性刺激反应能力，以抵抗损害性刺激[3]。
4.5Müller细胞①GLAST：上调内源性谷氨酸盐运输体，增进细胞外基质谷氨酸盐水平;②神经营养素基因：为RGC提供神经营养素的替代资源[3]。
5青光眼基因治疗存在的问题和展望
基因治疗最常见的负面反应表现在前房内出现的主要由单核细胞浸润组成的炎症反应。这种反应在灵长类比啮齿类更常见，至少发生在HSV载体中。在注射高浓度腺病毒载体时，兔眼和猴眼都可能出现严重的炎症反应，这可能与载体病毒诱导的炎症前细胞激酶的作用有关。而且，这种炎症反应是剂量依赖性的，但AAV和LV载体并不诱导炎症反应。
目前,青光眼基因治疗在眼科领域尚处于实验起始阶段,既面临基因治疗普遍碰到的问题,也有青光眼治疗中的特殊问题,还有许多理论、技术等方面的问题亟待解决。我们需要更好地理解小梁细胞的细胞外基质，细胞骨架改型和细胞信号事件;更好地理解房水的产生和调节，睫状上皮释放的能改变小梁网功能的因子;更好地理解RGC在经受各种刺激和升高与不升高眼压条件下细胞死亡的激活通路;更好地理解机体对各种载体系统的内在的和抗原特性的免疫反应;更好地理解这些反应在啮齿类和灵长类动物的差别以减轻这些反应类型。同时需要能够模仿导致眼压升高的小梁网和睫状上皮变化的动物模型以检测基因治疗的效果。努力确认与青光眼相关的其他基因将为更好的基因治疗策略提供重要线索。最后，关键是要理解为什么源于不同载体的异位基因表达会在不同的眼组织细胞中终止;关键是要证实启动子或其他基因表达元件能够提供长期的转基因表达[3]。
总之，随着分子生物学的飞速发展与基因工程的日新月异,过去的困难现已迎刃而解,相信在不久的将来，青光眼基因治疗一定会在临床上逐步展现其优越性。
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早在20世纪50年代人们已知道是各类基因控制细胞增生，80～90年代癌症基因研究更进入高潮。
俗话说有矛必有盾。科学家自1970年找到第一个癌基因，至今已发现20种不同的癌基因，10余种癌抑制基因。癌基因诱发细胞增生，而癌抑制基因恰恰相反，但是当癌抑制基因受到某些因素影响发生突变，它就失去了这一抑制作用，其结果必然是癌基因无法无天，细胞增殖加快。1994年又发现了细胞凋亡基因，它不仅能使细胞停止分裂，更能使细胞死亡。同样，当凋亡基因受到某些因素影响发生突变时，也会失去其凋亡作用。因此，当癌基因在遗传、免疫、内分泌、精神等内在因素，及生物、物理、化学、营养等外在因素（统称致癌因素）触发后开始启动，而癌抑制基因及凋亡基因又发生突变，失去抑制癌基因的作用的时候，癌症就发生了。
癌症基因调控旨在了解哪些基因发生变异后，采取各种手段，包括药物来“纠正”变异基因，达到治疗目的。癌症基因治疗世界各国均在努力探索中，在我国，中医药调控基因已见端倪、方兴未艾。如砒霜中有效成分三氧化二砷治疗白血病有效，其既能下调凋亡抑制基因，又能上调凋亡诱导基因的表达，诱导癌细胞加速死亡。另外，雄黄（含砷）、轻粉（含汞）同样具有调控细胞凋亡作用。蟾蜍所含华蟾素低浓度时促进细胞分裂、增生和诱导细胞分化，高浓度时抑制细胞生长、促进细胞凋亡，并对人白血病细胞系、大肠癌细胞系有诱导凋亡作用。莪术中提取的榄香烯，可诱导人白血病细胞、人肝癌腹水癌细胞凋亡，并明显影响肿瘤细胞的分裂周期。槲皮素可诱导癌细胞凋亡，抑制癌基因表达。淫羊藿苷能诱导白血病细胞凋亡。除凋亡基因外，首乌能调控癌抑制基因；大蒜油可上调癌抑制基因表达水平；丹参及姜黄素可抑制癌基因突变率；穿心莲显著抑制癌基因表达；土贝母对体外培养的人肾颗粒细胞癌和褐鼠种植性人肾颗粒细胞癌的生长均具有明显的抑制作用。此外，蛇六谷、叶楸碱、地榆鞣质、芹菜素、天花粉蛋白、汉防己碱、熊果酸等都对癌细胞有诱导凋亡作用，十全大补汤、六君子汤、人参养荣汤、小柴胡汤、当归补血汤等均具有诱导不同癌细胞凋亡的作用。
中药诱导癌细胞凋亡原理众多，参与基因调控所涉及的面极广，调动了体内各种抗癌系统发挥更大的作用，与已有的手术、化疗、放疗、生物免疫治疗等相比，将会有一个极大的飞跃。我国中药品种繁多，其组成的中药复方更不计其数。可以相信，在癌症基因治疗中中药必将大有作为。
（作者每周二、四、六上午均有专家门诊）
根据临床统计，25%的生理缺陷、30%的儿童疾病和60%的成年人疾病都是由遗传病引起的。而人类遗传病大约有5000种，大部分是单基因缺陷造成的道机体是一个复杂的动态性的平衡系统。每一个基因对机体的正常功能的影响都是复杂的，任何一个基因的变化都会导致多种症状的发生。由于这些疾病病因复杂而且发生在遗传物质水平，用传统的治疗方式很难达到根治目的，而且价格昂贵周期长。基于以上这些原因，人们一直致力于寻找新的、更好的、更彻底的遗传疾病治疗方法。随着分子生物学和分子遗传学等学科的飞速发展、人们对遗传病的分子机理的深入了解以及许多遗传疾病分子模型的建立，特别是人类基因组计划超乎预想的发展和后基因组计划、蛋白质组计划的提出，使人们自己的遗传背景和基因与疾病的关系有了更清楚的认识。这些都使人的基因治疗成为可能。
基因治疗是近十年来发展起来的新型医疗技术，有广阔的研究、应用和开发前景，但是，它还需要解决许多基础研究和技术方面的问题，才能具有真正的实用价值。总而言之，基因治疗随着分子生物学、分子遗传学和临床医学等学科的发展，它将日益走向成熟。
白介素12基因治疗肿瘤实验研究
项目简介：该研究以缺陷型Adv5腺病毒为载体构建、包装了携带白介素12基因和重组腺病毒AdvCMVIL12。病毒滴度测定显示该重组腺病毒具有很高的滴度；生物学活性测定表明，当病毒滴度为100MOI时，培养的rTMC细胞上清中白介素12的分泌量达到3417±736NG/1×10^6细胞/24h；体内实验结果表明，局部注射AdvCMVIL12对多种不同的肿瘤有明显的抗肿瘤效果，对四种肿瘤rTMC-RTC-R2、H22、XTC-1的抑制率分别为67%、66%、93%、6.4%。AdvCMVIL12能够在瘤体内产生大量具有生物学活性的细胞因子白介素12，从而解决了单纯注射白介素12达到治疗剂量时所带来的毒副作用。
所处阶段：中期阶段
纳米载体介导基因治疗研究
项目简介：该项目进行了将纳米技术、基因工程技术与干细胞工程技术结合起来，促进基因治疗的研究。项目以丙烯酸甲酯和乙二胺为起始单体合成聚酰胺－胺树枝状聚合物（PAMAM Dendrimer），该聚合物纳米载体可有效地将目的基因（绿色荧光蛋白基因pEGFP-C1）转入造血干细胞、胚胎肝细胞、树突状细胞、Hela细胞、K562细胞等；分别构建了抗凋亡信号分子（Caspase-3）、抗MHC Ⅱ类抗原转录活化子（Class Ⅱ transactivator，CIITA）、抗慢性粒细胞性白血病BCR-ABL融合基因的核酶序列的真核表达载体。
项目成果将为各种血液及实体肿瘤的基因治疗增添新的研究方法，有望解决骨髓移植和组织工程细胞来源的问题。
恶性肿瘤基因治疗系列探讨
项目简介：该课题分四部分：血管抑素基因治疗抑制肿瘤新生血管形成；反义缺氧诱导因子基因治疗提高肿瘤免疫治疗的疗效，达到根除肿瘤的效果；联合VHL和反义缺氧诱导因子基因从不同层面阻断肿瘤缺氧诱导反应，根除肿瘤；联合应用血管抑素和内皮抑素基因治疗抑制了转移肿瘤的生长延长了动物的生存期。研究中主要对基因治疗的转染效率，基因表达的水平，相关下游基因的表达，肿瘤生长曲线，肿瘤内血管的密度，肿瘤细胞凋亡，动物的生存率等进行了检测。
项目为恶性肿瘤的基因治疗提供了理论根据，研究中创立了新的基因治疗方法，尤其是在联合抗血管化治疗和免疫治疗，阻断缺氧诱导反应治疗，VHL基因治疗和经肌肉基因治疗等方面，理论上有创新，基因治疗方法上有改进，有较大的社会和经济效益。
所处阶段：中期阶段
血友病A基因治疗临床前研究
项目简介：基因治疗是治疗遗传性疾病的根本措施。该研究以血友病A（遗传性凝血因子VⅢ缺陷症）为契口，在FVⅢcDNA克隆和去B区（BDD）FVⅢcDNA改造获得成功的基础上，又致力于研究安全有效的表达载体、适宜的基因特异靶细胞以及血友病A动物模型等研究工作。
该研究首选复制缺陷性逆转录病毒、脂质体（DOTAP）和纳米材料（聚酰胺－胺型树枝状聚合物，PAMAM）作为BDDFVⅢcDNA表达载体，无论在体内、外均获得高效表达。
此外，项目课题组与美国宾夕法尼亚大学合作建立了腺相关病毒载体（AAV）制备技术平台，并正在进行BDDFVⅢcDNA在rAAV中的表达研究；该课题组还正在与国内南方模式动物中心和澳大利亚Monach大学合作进行血友病A动物模型的制备，均已取得较好的进展，并继续作深入合作研究。该项目同时对多种遗传性凝血因子缺陷症进行了分子发病机制的研究，为进一步作基因治疗奠定了基础。
反义基因治疗慢性髓细胞白血病研究
项目简介：该项成果运用反义基因技术，研究了AS PS-ODN、AS PS-ODN与CTX联合以及HIV-AS PS-ODN等对CML细胞的生长、细胞凋亡及bcr/abl基因表达的影响。研究中开发了第三代新型病毒载体系统HIV-Vector，转导率为99%，明显高于病毒载体（38%）；AS PS-ODN+CTX新的联合方案及HIV-AS PS-ODN新载体转导AS PS-ODN，均大大提高其转导率；对慢性髓细胞白血病细胞的诱导凋亡作用明显增强，可能解决由于反义核酸用量过大、价格昂贵而难以临床应用的难点。
所处阶段：中期阶段
实验性肝纤维化反义基因治疗研究
项目简介：该课题应用重组DNA技术构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒，并将其转移至纤维化大鼠肝内和体外培养的大鼠肝脏星形细胞中，结果显示构建的反义TIMP-1表达质粒可在肝星形细胞中及肝纤维化大鼠体内确切表达，导致肝星形细胞培养液间质胶原酶活性显著增加，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达明显下调；并促使治疗组动物肝组织活化间质胶原酶及潜在胶原酶活性均有较明显增加，羟脯氨酸含量下降。同时成功构建了反义TβRⅠ、TβRⅡ真核细胞表达质粒，经导入免疫性大鼠肝纤维化模型中，结果表明重组质粒在动物体内能确切表达，并在mRNA水平上封闭实验性大鼠肝脏中TβRⅠ、TβRⅡ的基因和蛋白质表达。可显著降低肝组织羟脯氨酸含量，明显减少肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积，并促进肝脏病理一定程度的改善。
实验性癫痫后脑损伤机制及基因治疗
项目简介：该课题经过5年研究成功地制作了与人类癫痫高度相近的大鼠杏仁核点燃癫痫动物模型，从病理形态学检查明确了癫痫的脑损伤改变，并系统研究了神经递质、神经营养因子、缝隙蛋白等实验性癫痫中的变化，探讨了突破重建在癫痫中的作用。证实神经递质、神经调质及缝隙连接在癫痫发病中起重要作用，明确癫痫是多因素共同作用的结果。在癫痫治疗方面针对CX43形成的特异性GJ阴断剂－连接蛋白拟似肽和广谱的GJ阻断剂－甘珀酸，对脑电活动的抑制作用进行对比研究。以利于查明癫痫治疗的新的靶点，为癫痫的有效防治提供一条新途径和新思路。该研究从超微结构、形态学、分子生物学角度探讨了癫痫后脑损伤改变及神经递质、神经营养因子、缝隙连接、突触重建等在癫痫发生发展中的重要作用，明确了癫痫脑损伤的多源性调节机制，并从基因水平对癫痫的治疗进行了探讨，发现了较为有效的治疗进行了探讨，发现了较为有效的治疗途径和方法，为今后的进一步研究奠定了基础。
应用基因治疗技术修复组织创伤实验研究
项目简介：该研究的目的在于利用重组复制缺陷型腺病毒载体介导，应用VEGF增加随意皮瓣、轴型皮瓣、静脉皮瓣远端新生血管形成，防止缺血造成的皮瓣坏死。该研究利用制备的载体AdCMV-VEGF为复制缺陷性腺病毒，能感染真核细胞并表达VEGF，表达的VEGF具有增加血管能透性，促进血管增生的生物学活性。同时建立了生理性皮瓣、非生理性皮瓣缺血模型。进行了基因局部真皮下注射皮瓣预制，局部真皮下应用腺病毒载体具有安全、简便、创伤小特点，远位转染少，外源基因主要在局部表达，对全身影响小。发现腺病毒为载体在体内表达时间短的特点。
融合CD-ES基因治疗恶性肿瘤实验研究
项目简介：研究将两个不同功能的基因（CD 、ES）作成融合基因，再导入穿梭质粒，最后通过细菌内重组法及在293细胞内包装、扩增重组腺病毒 (rAdCDglyES)，使其具有直接杀伤瘤细胞，阻止瘤新生血管形成、间接杀伤瘤细胞和阻止瘤远端转移及放疗增敏作用增强放疗疗效。
抑瘤多肽TSF及其基因治疗载体组合物
项目简介：该发明涉及一种新的重组腺病毒载体介导的抗肿瘤治疗组合物，具有靶向性抗肿瘤组织内血管新生、抑制肿瘤包括造血系统恶性肿瘤生长及转移作用，具体步骤是以特异引物经PT-PCR方法从正常人外周血细胞克隆出编码TSF多肽的cDNA序列，以AdEasy System在人胚肾细胞293中构建、包装表达TSF的重组腺病毒载体，大规模制备并纯化该载体用于体内外活性测定。
腺病毒介导基因治疗与放疗联合治疗肿瘤研究
项目简介：为提高肿瘤基因治疗的疗效，减少其副作用，研究其与常规的放疗结合。首次将AdCMVIL-12基因疗法与传统放疗联合治疗小鼠Lewis肺癌，发现联合疗法有互相促进作用。体外实验首次证实电离辐射明显提高了腺病毒对Lewis肺癌细胞的转染率，从而提高了IL-12的表达。用放疗与腺病毒介导的IL-12基因联合应用，增加腺病毒转染率，提高了抗肿瘤疗效，降低了副作用。为肿瘤的基因治疗提供新的线索，并将会带来一定的社会效益和经济效益。
HSV-TK和B7联合基因治疗乳腺癌实验研究
项目简介：该试验将HSV―TK、B7基因经逆转录病毒介导，并转导GCV对乳腺癌细胞进行体外细胞、体内荷瘤抗肿瘤作用观察。理论依据为：逆转录病毒载体将外源目的基因整合到靶细胞染色体；HSV―TK被导入细胞后，其TK基因对GCV的敏感性提高并使之磷酸化，竟争性地抑制细胞DNA的合成而杀死肿瘤细胞；HSV―TK/GCV系统具有“旁观者效应”，扩大杀伤范围；将B7基因引入肿瘤细胞后可刺激机体T淋巴细胞的免疫性，使肿瘤细胞具有高免疫原性。
该试验主要创新点在于在国内外首次将TK/B7不同的目的基因联合应用治疗乳腺癌，观察到治疗上的协同性，取得了满意的效果，在晚期乳腺癌的治疗方面有良好的推广应用前景。
门静脉高压症时一氧化氮在发病中的作用及基因治疗研究
项目简介：肝内阻力增加是肝硬化门静脉高压症（PHT）的始动因素，而由血管活性物质增多引起的高动力循环在PHT的维持中起重要作用。该研究旨在探讨一氧化氮（NO）在PHT发病机理中的作用以及一氧化氮合酶（NOS）基因治疗PHT的效果。
该研究从分子水平系统阐明了NO在PHT发病机理中的重要作用，进一步阐明了PHT的发病机理；首次应用免疫豁免原理进行FasL-NOS联合基因治疗PHT的研究，为PHT的治疗开辟了新的途径。对NOS基因治疗PHT目前还停留在动物实验阶段，进入临床应用尚存在治疗效果的评价、基因治疗的安全性和治疗效费比等问题。
导入人组织激肽释放酶基因治疗肾性高血压实验研究
项目简介：该项目利用基因工程技术，提取正常人胰腺组织RNA，采用oligo（dT）引物进行RT-PCR。回收PCR产物，插入质粒KS。利用高保真pfu Taq酶扩增激肽释放酶基因片段，产物酶切处理后，和不同载体片段用T4连接酶连接，完成原核、真核载体的构建。将连接产物转化、转染不同的细菌、细胞，筛选克隆，按照不同载体的要求，选择最佳的实验条件进行人胰腺激肽释放酶的表达。应用改良的电位滴定法，分析重组人胰腺组织激肽释放酶活性。项目克隆人组织激肽释放酶基因并进行序列分析，构建人组织激肽释放酶基因表达载体，筛选高效表达菌株，进行重组人组织激肽释放酶的制备及活性分析。
基因联合放疗、化疗、免疫对结直肠癌复发转移治疗研究
项目简介：该项目针对了临床实体肿瘤治疗的重点与难点和目前基因治疗方法上的缺陷和不足。将基因治疗与放疗、化疗和免疫治疗相结合，为结直肠癌局部复发、转移和其他实体瘤的治疗提供了新的手段和方法，也为肿瘤基因治疗的临床应用探索了新途径。采用双启动子调控目的基因的表达，提高了基因治疗的靶向性和安全性。放射线促CD基因转染刺激DCs激活T细胞的作用可用于制备肿瘤疫苗，提高肿瘤疫苗的安全性和特异性。该研究结果为进一步研发具有自主知识产权的针对结直肠癌复发和转移的重组双启动子调控自杀基因治疗药物奠定了实验基础。
株单纯疱疹病毒胸苷激酶基因及其应用
在6月16日发表于“Science Translational Medicine杂志”的一篇在线文章上,你可以阅读到加利福尼亚州杜阿尔特市Hope癌症中心研究人员领导的这项研究工作。
免疫系统的一种癌症——发生淋巴瘤的艾滋病患者,经常用一种干细胞疗法——自体HCT(造血细胞移植)去治疗,以便用健康和有功能的细胞去取代那些已发生病变的骨髓。
这种做法能够缓解淋巴瘤症状,但并不能从根本上解决艾滋病毒的感染问题,这样一来最可能导致的结果就是:给那些终身抗逆转录病毒治疗的患者遗留下了艾滋病毒阳性的问题,从而他们终有一天可能会对之产生抗药性。
因此在这一研究中,基因疗法资深作者John Zaia,Aaron D和Edith Miller Chair博士,Hope城病毒学主席及其同事们,对四例经历标准HCT治疗的患者,采用了一个特别的程序作为第一个步骤,以便艾滋病毒转向“造血细胞介导”的基因疗法。
他们从四例患者中提取健康的造血干细胞,对它们加以修改;其中包括三例抗艾滋病病毒核糖核酸(RNAs),后者能阻断艾滋病毒感染新的细胞。
然后他们将与正常干细胞混合后及修改后的干细胞注入回病人,并定期采集血液样本,观察在那些接受治疗的病人中的已修改后干细胞在血液中如何长时间持续存在。研究人员说,没有任一病人发现对这种治疗有任何副作用。
萨雅告诉记者:“我们仍在观察下列证据:在移植两年之后患者正在产生的治疗性基因,其中包括siRNA.
他和他的同事的结论是:“这些研究结果支持发展出一种针对艾滋病毒的RNA介导的细胞治疗平台。”
在Hope城的这些研究人员所发展出的这种基因疗法,使用了核酶与“微干扰”核糖核酸(siRNA),RNA的短链选择性地沉默特定的抗艾滋病毒感染的基因。医学|教育网搜集整理在该报告中作者说,他们创造的siRNA表达了三种抗艾滋病毒之功能:CCR5核酶,转/反短钗RNA和TAR诱饵。
这种CCR5核酶分子能中止了病人的白血细胞产生CCR5,后者是艾滋病毒用于进入宿主细胞的一种蛋白质。如果没有CCR5对艾滋病毒的“抢劫”,病人的免疫细胞能有效地抵抗艾滋病毒并防止其感染发生。
在TAR诱饵成份存在源自这种艾滋病毒的监管Tat蛋白时,这种siRNA也能直接失活艾滋病毒。
这些研究人员在一份声明中表示:本研究目的是要“重新启动”免疫系统识别并以艾滋病毒为标靶的反应,并降低其病毒载量。
领衔作者David DiGiusto博士,Hope's城的血液和造血细胞移植科教授说:“虽然高活性的抗逆转录病毒药物已经设法把艾滋病毒感染,从一种立即死亡状态转变成一种可处置的长期慢性疾病状态,但我们仍然需要寻求治疗方法。”
他补充说:“我们的研究和临床试验正在表明,用这种新的方法治疗艾滋病患者的承诺。”
与此同时,该研究团队正在继续进行更多的研究和临床试验,以便改善这种治疗方法;这样患者就能接受更多的转基因干细胞,以便他们能够产生对艾滋病毒更大的耐受性。