时间：2023-02-27 21:48:24
关键词基因治疗;治疗方式;发展前景
中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01
美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。
1基因治疗的方式
1.1体内基因治疗
体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。
1.2反义疗法
反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。
1.3通过核酶的基因治疗
20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。
1.4自杀基因疗法
自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。
2基因治疗存在的问题
2.1基因治疗的社会和伦理问题
基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。
2.2基因治疗的技术问题
目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。
3展望
以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。整理
4参考文献
[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科学出版社,2004.
[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.
[3] alton e w,geddes d m,gill d r,et al.towards gene therapy for cystic fibrosis[j].gene ther,1998,5(3):291-292.
关键词基因治疗;治疗方式;发展前景
中图分类号r459.9文献标识码a文章编号 1007-5739(2010)01-0025-01
美国是世界上最早开展基因治疗的国家,也是目前开展基因治疗最多的国家。我国在1991年7月开始基因治疗的临床研究,最早的工作是对b型血友病的基因治疗及利用抑癌基因对癌症的基因治疗[1]。基因治疗目前主要用于治疗对人类健康威胁严重的疾病,包括遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。
1基因治疗的方式
1.1体内基因治疗
体内基因治疗是指将具有治疗功能的基因直接转入病人的某一特定组织中。利用反转录病毒载体已成功地将真核基因转入动物细胞,但通过质粒dna的直接操作,将更加省时而且产量较高;采用温和病毒载体的体内基因治疗主要是通过腺病毒和单纯疱疹病毒来完成的,即将载有矫正基因的载体直接注射入需要这些基因的组织。以腺病毒为载体的体内疗法在遗传性疾病方面,目前主要见于囊性纤维变性的基因治疗研究。多数研究表明,基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷,使跨上皮基础电位下降,肺功能有所改善[3]。
1.2反义疗法
反义疗法主要是通过阻遏或降低目的基因的表达而达到治疗的目的。反义疗法是通过引入目的基因的rna的反义序列而达到上述目的。当引入的反义rna与mrna相配比后,用于翻译的mrna的量就大大减少,因而合成的蛋白的量也相应大大减少。引入的反义序列也可能与基因组dna互补配对,从而阻遏mrna的转录。这2种情况都会使细胞中靶基因编码的蛋白合成大大减少,以达到基因治疗的目的。
1.3通过核酶的基因治疗
20世纪80年代初,美国科学家cech和altman发现了核酶,核酶是指由rna组成的酶,能够序列特异性地抑制靶mrna。近年来,核酶在抑制癌基因的表达[4]、增强肿瘤对药物的敏感性及抑制肿瘤血管的生成等方面的应用得到了广泛的研究。
1.4自杀基因疗法
自杀基因疗法是恶性肿瘤基因治疗领域最有希望的方法之一,已广泛用于各种恶性肿瘤的基础研究和临床试验性治疗。它是用药物敏感基因转染肿瘤细胞,其基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒性的药物,影响细胞的dna合成,从而引起该肿瘤细胞的死亡。
2基因治疗存在的问题
2.1基因治疗的社会和伦理问题
基因治疗不仅仅是一种医疗方法,它还涉及很多其他问题。因为当人们试图“纠正”人类自身“不正常”的基因时,这种纠正的后果是无法预料的。由于人类的遗传信息非常复杂,转基因也可能带来不可预料的后果,没有人能保证这种基因结构的改变绝对不会造成人类某一未知功能的缺失。另外,当人们试图把基因治疗引入生殖细胞时,又涉及后代基因结构的改变问题,且改变将直接影响这个“未来人”,这是一个很难解决的伦理问题。
2.2基因治疗的技术问题
目前,基因治疗的对象是单基因的缺陷,但许多疾病涉及多个基因之间复杂的调控和表达关系。对这类疾病的基因治疗难度很大,因为向细胞中导入多个基因后,使几个基因之间能保持正常的调控关系几乎是不可能的。即使是单基因缺陷症,使导入细胞的基因能正常表达也是一个较复杂的问题。将基因导入细胞后,其表达量的多少是直接影响能否达到治疗的目的和有无副作用的关键。但这个问题将会在人类基因组计划完成的基础上,对人类后基因组计划的开展,弄清了人类基因之间复杂的调控联系后而最终得到解决。只有这样,才能在基因治疗中尽量做到使导入的基因处于正确的调控下,取得治疗效果,消除副作用。
3展望
以基因转移为基础的基因治疗要在临床上很好地应用,还有待理论和各种技术的进一步发展。过去20~30年基因治疗的发展已取得了巨大成就,已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法,不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将向2个方向发展:一是基础研究更加深入,以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多,实施方案更加优化,判断标准更加客观,评价效果更加精确。总之,随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展,基因治疗也会不断发展,日趋成熟,很多难题会得到解决,并在临床上得到广泛应用。 编辑整理
4参考文献
[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科学出版社,2004.
[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.
[3] alton e w,geddes d m,gill d r,et al.towards gene therapy for cystic fibrosis[j].gene ther,1998,5(3):291-292.
理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明［1-5］，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。本文即对该类载体的研究进展做一简介。
1HIV-1基因组的基本结构［6］
HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5′LTR-gag-pro-pol-env-3′LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述。
2构建HIV-1载体系统的基本原理［7］
HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种［1］。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
3HIV-1载体系统的改进
近年来，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力［8］、筛选抗病毒药物［9］、评价Env糖蛋白的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用［10］等。而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果［1～3］，主要包括以下几方面的改进。
3.1包膜蛋白
最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等［1］设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了HIV-1载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予HIV载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使HIV-1载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。这样的改进无疑是HIV载体系统走向应用而迈出的一大步。
3.2包装成分
包装成分的构建应在不影响重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍。Naldini等［1，2］在构建包装质粒pCMVΔR9和pCMVΔR8.2时，分别在env基因阅读框架前插入了多个终止密码子或删除了env基因中1.4kp的序列，代之以终止密码子，以阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等［3］将包装包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除，结果发现它们对于产生HIV-1载体颗粒是非必需的，即使完全删除，得到的载体颗粒仍具备转导非分裂细胞的能力。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素［11，12］，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。
3.3载体质粒
载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明［7］，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等［1～3］在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。对于载体上需含有多少顺式作用序列为最佳，目前尚不完全靖楚。
4HIV-1载体介导基因转移的体内外实验
迄今，Trono课题组构建的HIV-1载体系统已在体外转导过人子宫颈癌细胞(HeLa)、鼠成纤维细胞(208F)、原代培养的人巨噬细胞、人呼吸道上皮细胞等，结果表明［1-5］，HIV-1载体无论对分裂细胞还是非分裂细胞均能转导，但对非分裂细胞的转导效率与细胞所停止的周期有关。HIV-1载体对G0期细胞的转导效率不如对静止于G1/S或G2期的效率高，停止于G0期的时间越长，这种差别越大。这可能是由于某些G0期细胞内脱氧核苷酸浓度低、影响了反转录步骤，造成报告基因未表达所致的表观现象。实际上，HIV-1载体有的已进入到G0期的靶细胞内，建立了转录中间体。一旦这类细胞进入细胞周期，载体所携带的基因就会表达。
在动物体内实验中，Naldini等［1］将HIV载体注射成年大鼠脑组织，30天后取脑组织，未观察到病理变化，免疫组化显示报告基因能够在终末分化的神经元中表达，证明HIV载体对体内基因转移是有效的。此后，他们将重组病毒在转导前用dNTP和多胺处理，以增加病毒内逆转录反应，可使对大鼠神经元的转录数率提高2倍，报告基因可表达3个月以上［2］。Miyoshi等［4］将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的HIV载体注射大鼠眼球，GFP能在感光细胞和视网膜色素细胞中表达，如果以视紫质启动子控制GFP，则可在感光细胞异地高表达。
对于HIV-1载体进入非分裂细胞后的表达是否全部由整合形式产生，目前尚有不同意见。Naldini等［2］将包装质粒中的整合酶基因突变，如此而产生的HIV载体不能在非分裂细胞中表达，因此认为HIV载体的表达全部由整合形式产生；而Goldman等［5］却在转导细胞中测到了HIV载体前病毒的非整合形式，认为不能排除两种形式同时存在的可能。
在用HIV-1载体已经进行的所有体内外实验中［1～5］，未出现过有复制力的HIV，说明其安全性是有保证的。
5HIV载体的基因治疗中的应用前景
5.1获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗［7，13］
目前对于AIDS的基因治疗方案，基本上是以逆转录病毒载体介导的方式，将抗病毒基因体外导入CD4+T淋巴细胞或CD34+的造血祖细胞，再回输体内。常用的抗病毒基因包括自杀基因、反义RNA、核酶、RNA诱饵的相应DNA序列以及调节蛋白或结构蛋白的突变体基因等。由于这些治疗基因不能到达巨噬细胞和多能干细胞，困此难以重建免疫；此外，体外操作费用昂贵，不适于大规模应用。
HIV-1载体的研究为AIDS的基因治疗带来了新的希望，它可能具有以下优势：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的载体颗粒可以将抗病毒基因直接运抵CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，适于直接的体内治疗，而包被了VSV包膜的载体颗粒又能感染多能干细胞，有利于免疫重建；第二，患者体内的野生型HIV-1可将携带抗病毒基因的载体拯救出来，使载体扩增并扩散到周围更多的细胞中发挥抗病毒作用；第三，如果将抗病毒基因置于HIV-1本身的长末端重复序列(LTR)控制之下转导细胞，则只有当HIV-1感染该细胞时，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才会表达，使基因表达具有了靶向性。
5.2神经系统疾病的基因治疗［1，2，14］
Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性脑病，由编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一种退行性脑病，由于产生多巴的神经元退化，导致大脑纹状体内多巴胺水平降低，临床上给患者注射左旋多巴可改善症状，但长期注射及药物的副作用令患者难以承受。较为理想的方式是在脑内持续表达酪氨酸羟化酶(TH)，使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴；Alzheimer氏病也是一种多因素引起的退行性脑病，造成大脑皮质和海马回神经元萎缩，通常采用神经营养因子防止神经元退化。由于HIV-1载体能够体内转导神经元并建立长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基因治疗非常具有吸引力。可以设想，分别将编码HPRT、TH或神经营养因子的基因通过HIV-1载体介导，体内注射至神经元，有可能对上述疾病产生良好效果。
5.3血液系统疾病的基因治疗［15］
造血干细胞一直被认为是对血液系统恶性肿瘤或其它疾病(如地中海贫血、镰刀性红细胞贫血、血友病等)进行基因治疗的理想靶细胞，但由于缺乏使目的基因在造血干细胞稳定表达的方法，这方面的研究进展不明显。尽管小鼠逆转录病毒载体能够转导经细胞因子刺激后进入细胞周期的造血干细胞，但经此处理的干细胞性质可能会发生改变。HIV载体则可通过直接转导静止的干细胞避免这类问题。将多药耐药(MDR)基因导入造血干细胞，可使其耐受大剂量化疗，可能成为治疗白血病和其它恶性肿瘤的有效途径；将正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分别导入造血干细胞，有望对地中海贫血、镰刀性红细胞贫血和血友病产生疗效。
5.4其它
囊性纤维化(CF)是由于缺损囊性纤维性穿膜传导调节蛋白(CFTR)而引起的一种人类遗传病，其特点是粘液腺功能不足，粘液中含有异常糖蛋白，因而粘液的粘度不正常而影响呼吸道上皮和消化道上皮，引起慢性感染，直至死亡［16］。针对CF的基因治疗研究已进行了多年，试用过各种载体，效果不甚理想。最近，Goldman等［5］用HIV-1载体进行了尝试，动物实验表明，导入CFTR基因后CF缺陷可被纠正。但他们同时也发现，HIV-1载体转导增殖中的呼吸道上皮细胞效果较好，而对完全分化的上皮细胞则效率很低。目前尚不完全清楚转导受限的机制，有待进一步研究。
色素性视网膜炎是一种遗传性的进行性视网膜退变，症状包括视野进行性减小、夜盲、视网膜色素沉着等。研究发现，将视杆细胞cGMP磷酸二酯酶γ亚单位基因导入感光细胞有可能纠正视网膜退变，但导入时机以及导入多少感光细胞才能保持视觉功能尚不清楚。由于成熟的视网膜细胞绝大部分为终末分化细胞，因此HIV-1载体为视网膜病变的研究与治疗带来了希望［4］。
6存在问题
尽管HIV-1载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像目前常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞［17，18］均不理想。据报道，Vpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂［19，20］，也是建立包装细胞的主要障碍之一。如果确如前文所述，包装质粒中的vpr基因并非必需、去除后不影响载体的转导能力，则建立稳定的包装细胞是大有希望的。
在保证HIV-1载体的安全性上，迄今已做了种种努力，要产生有复制力的HIV，必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。即使如此，一旦用于人体试验，仍然不能打消人们对感染有复制力的HIV-1的顾虑。更为谨慎的做法是，以非人类的慢病毒为基础构建载体，如猴免疫缺损病毒(SIV)、猪和牛免疫缺损病毒(FIV和BIV)、马传染性贫血病病毒等，而目前这些工作尚属空白。
(本文承蒙侯云德院士审阅，特此致谢)
参考文献
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基因治疗(GeneTherapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，而达到治疗目的。1991年美国实施了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案，科学家W.FrenchAnderson等将含有正常ADA（AdenosineDeaminase，腺苷脱氨酶）基因的逆转录病毒转入一个4岁患有ADA-SCID（SevereCombinedImmunodeficiency，严重复合免疫缺陷综合征）的女孩的白细胞内，并用白细胞介素Ⅱ(IL-2)刺激其增殖，经10天左右再经静泳输入到此患儿体内。大约1－2月治疗一次。8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25％，两年后基本恢复正常，未见明显副作用。此后又进行第2例治疗并获得类似的效果[1-2]。
这是基因治疗史上的里程碑，迅速引起了全球基因治疗的研究热潮。然而，基因治疗的发展并不是一帆风顺的。1999年，美国一名年仅18岁的青年JesseGelsinger因患鸟氨酸转氨甲酰酶不足症（一种遗传性疾病）在美国宾夕法尼亚大学人类基因治疗中心接受基因治疗时不幸死亡，这一事件震惊了当时的科技界。基因治疗一度跌入低谷，各国对基因治疗临床试验的资助大幅减少[3]。基因治疗在争议中不断地前进，最近几年已取得不俗进展，重新成为各国研究的热点。RNAi（RNAinterference,RNA干扰）是基因治疗的又一亮点，其在神经性、遗传性、病毒性等疾病中的治疗研究已经展开[4]。2009年，针对X-连锁型肾上腺脑白质营养不良症(X-linkedAdrenoleukodystrophy，X-ALD)的基因治疗初见成效，并被《Science》评为年度十大科学发现之一[5]。正如《Science》评论指出：在饱受科学界质疑以及制药业遗忘多年后，近几年基因治疗在应对严重遗传性疾病方面取得了重大突破，再次优雅的回归[6-7]。在我国，基因治疗也有一定发展。1991年，复旦大学薛京伦教授研究小组进行了国内首例基因治疗临床试验。
2003年，人类首例商业化基因治疗产品“重组Ad-p53腺病毒注射液”在深圳诞生。目前，我国已在在遗传病、肿瘤、神经系统疾病及细胞因子基因治疗的临床前研究取得了一定成绩[7]。基因治疗按靶细胞类型分为生殖细胞(Germ-lineCell)基因治疗和体细胞(SomaticCell)基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以、卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于生殖细胞基因治疗涉及一系列伦理学问题，如人权问题、阻碍人类多样性的问题以及基因歧视等，生殖细胞基因治疗仍属[8]。体细胞基因治疗是当前基因治疗研究的主流，但是仍处于临床试验阶段，存在较高的风险性和不稳定性。基因治疗由于自身技术的高度复杂和难以控制，同时涉及一定的社会伦理学问题，应用于临床医学必然会引起相关的法律问题。
二、基因治疗在临床医学应用中的法律问题
（一）隐私权
基因(Gene)是指携带有遗传信息的DNA序列，是控制性状的基本遗传单位。基因有两个特点，一是能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；二是基因能够“突变”，突变绝大多数会导致疾病，另外一小部分是非致病突变。非致病突变给自然选择带来了原始材料，使生物可以在自然选择中被选择出最适合自然的个体。基因与人类的健康密切相关。基因的特点决定了基因具有特殊的地位①，基因治疗过程中必然涉及到患者基因的隐私权保护。一是基因隐私保密权。保护个人隐私的隐蔽性、不公开性是使个人隐私保持其受法律保护状态的前提。基因信息不仅与个人密切相关，而且与个人的后代相关。因而,个人享有对其基因信息进行保密,不为他人所知的权利。[9]二是基因隐私的知晓权。获取基因进行基因研究必须向基因的所有者进行告知，让基因所有者知情，使其知道自己的基因作何用途。[10]三是基因隐私利用权。是指自然人依法对自己的基因信息进行积极利用,以满足自己精神、物质等方面需要的权利。[9]四是基因隐私支配权。这是基因隐私权的核心内容。任何单位或个人未经基因提供者本人的同意或授权，不得随意公开、使用或处置基因提供者的基因信息。[10]如利用基因信息进行相关科研等活动时，必须征得提供者的同意。五是基因隐私维护权。是指自然人对于自己的基因隐私所享有的维护其不可侵犯性,在受到非法侵害时可以寻求司法救济的权利。[9]例如，非经基因提供者的同意，将其基因信息进行商业活动时，基因提供者有权依靠法律得到相关赔偿。
（二）知情同意书的签订
任何医疗活动都会存在风险，为保护医患双方的权益，大部分临床医疗活动均要签订相关知情同意书，并受法律保护。基因治疗应用到临床医学，签订知情同意书同样至关重要。我国1994年颁布的《医疗机构管理条例实施细则》第六十二条和八十八条以及2002年颁布的《医疗事故处理条例》第十一条规定，患者在医疗过程中对自己的病情、诊断、治疗享有知情权。医方施行手术、特殊检查或特殊治疗时，必须征得患者同意。概言之，患者知情同意权包括了解权、被告知权、选择权、拒绝权和同意权，但不宜告知患者的（仍应告知其家属）除外。特殊检查、治疗系指该检查、治疗具有一定危险性，或因患者本质特殊、病情危急可能产生不良后果，或系临床试验性，或收费较多。基因治疗治疗显然属于上述法律规定中的特殊检查和治疗范畴。基因治疗不同于传统的医疗活动，其高科技、高要求及高风险等特点必然决定此类知情同意书的特殊性。受试者有权利要求被告知基因治疗实施单位及人员的资格以及经验、风险效益比、其他可替代的保守治疗途径、保密问题、受伤害时的赔偿等等。实施单位还必须有一份针对使用的基因产品的专业医师的指示说明，包括依实验所知的产品药性、毒性和治疗效果等。[11]考虑到基因治疗的复杂和难以理解性，一般人不是很容易透彻理解，应当成立相关部门，如基因治疗专家咨询委员会等，帮助患者及家属真正了解基因治疗及知情同意书的内容，真正维护患者及其家属的利益。
（三）治疗方案的规范
基因治疗现在还大多仍处于临床试验阶段，还不是一种成熟和稳定的治疗技术，存在较多不宜克服的难题，其中最为突出的是：
1.效率问题
基因治疗的时效比较短暂。基因治疗成功的前提是导入治疗性DNA的靶细胞能发挥功能，并且能够在体内长时间存活并且性能稳定。然而，导入的外源性的DN段会导致许多细胞快速分化从而很大程度上可能基因治疗的持续性。患者必须经过多轮治疗，如前所述的第一例成功的基因治疗病例中，1-2月就要进行一次，每次费用大概两万多美元，代价相当昂贵。[1-2]此外，任何外物进入人体组织后，人体的免疫系统就会被激发产生免疫应答以防御入侵者，而这种免疫应答在某种程度上也会降低基因治疗的效果。
2.安全性问题
病毒是大多数基因治疗研究中选择的载体，会对病人带来许多潜在危险，比如其毒性、免疫和炎症反应以及基因控制和定位的问题。基因治疗的安全性是目前基因治疗争论最为激烈的问题，比较著名的是前文提到的那位18岁美国病人死于基因治疗。患者死亡的主要原因是基因治疗对象选择有误及用药剂量过大，尽管病毒载体进入细胞后是随机整合至宿主细胞染色体的，但其仍具有潜在的插入突变可能性。[12]基因治疗属于高端的新医疗技术，存在相当高的风险。由于技术的限制性以及可能涉及相关的社会伦理问题，基因治疗在实施时必须遵循一定规范，必须由相关部门进行管制和监督。1993年，我国卫生部颁布了《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》，将人的体细胞治疗及基因治疗的临床研究纳入《药品管理法》的法制化管理。2003年，我国药监局又颁布了《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，较为详细地规定了基因治疗研究的技术标准和操作规范。
三、我国临床基因治疗的立法思考
（一）国外基因治疗的立法经验
1.美国
1976年，美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)成立了重组DNA咨询委员会(RAC)并制定世界上第一个实验室基因工程应用法规《重组DNA分子实验室准则》，首开了政府对生物技术发展进行控制的先例。随后，在基因治疗进入临床研究前的1985年，美国NIH制订了针对体细胞基因治疗的指导准则《人类体细胞基因治疗的设计和呈批考虑要点》，是这一领域里第一个系统的成文规章。[13]美国对基因治疗临床试验的监督由健康和人类服务部的食品与药品管理局和人体研究保护办公室两个法定机构负责。所有从事人体研究的研究者，无论是来自学术机构还是工业界，都必须遵循上述机构的监督管理[14]。
2.英国
1989年，英国政府成立基因疗法伦理委员会，作为临床治疗的审批和监督机构。1993年成立基因治疗咨询委员会，对基因治疗临床方案的可接受性进行审查和管理，协调与其他相关机构的关系。[13]
3.奥地利
奥地利基因治疗的管理要遵循基因技术法的有关规定。体细胞基因治疗只能在被批准的医院里由特定的医疗小组进行，并要得到相关政府机构和伦理委员会的同意。[14]
4.德国
德国1984年由司法部和科研部召集医生、生物学家、哲学家、法学家、宗教代表组成了一个基因分析和基因治疗的研究小组，为政府的立法提供咨询报告，并基于报告提出了一系列相关的法律法规。[13]德国1990年制定世界上第一部“基因技术法”，分七部分四十二节。[14]
（二）我国临床基因治疗的立法建议
基因治疗对个体及人类生命的影响程度远远超过了传统医疗技术，其风险也是目前的医疗经验知识无法掌控的。同时，基因治疗还可能引发不少社会伦理问题。这些问题的解决离不开法律的支持。就本人观点而言，我国临床基因治疗的立法至少应包括以下内容：
1.治疗范畴的立法
首先要确定临床基因治疗的范畴，何种基因治疗可以在人体内进行等基本问题。最为典型的是生殖细胞基因治疗，它涉及平等问题和其他个人侵害问题，如优生主义、基因歧视等，各国对其一般都持反对态度。[8]就我国目前而言，可以通过法律规定临床医学基因治疗的基本范畴，同时规定设立相关伦理委员会进行协助管制。
2.治疗方案审核的立法
除了涉及相应的社会伦理问题，基因治疗还存在高风险且费用昂贵，如何权衡“受益/风险”的比例也相当重要。我国可以指定或成立相关机构或部门，进行临床基因治疗方案的严格审核。
3.规范化治疗方面的立法
临床基因治疗，从方案的选择、实施到最后的疗效评估等，都应严格按照一套规范化的程序进行。美国的基因治疗临床研究伦理审查已制度化。美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)生物制品评估和研究中心(CBER)负责对基因治疗、细胞治疗的安全性和有效性的评价。美国国立卫生研究院下设的生物技术活动办公室(OBA)执行对基因治疗研究的监管。人体研究保护办公室侧重于对受试者的保护，而所有涉及人类受试者的临床试验都要接受地方伦理委员会审查。英国参与基因治疗监管和审查相关的政府部门包括医学和医疗产品管理局(MHPRA)、转基因作物(GMOs)科学咨询委员会、基因治疗咨询委员会(GTAC)、地方伦理委员会。[7]就我国而言，关于临床基因治疗规范化方面的立法，至少考虑以下几方面内容：首先，临床基因治疗资格的审查机制。基因治疗资格的获得必须通过严格审查，包括相关的治疗设施及人员配备是否达到必需的标准。其次，获得资格后的施行人必须严格按照标准的基因治疗方案进行治疗。现在可参照的是《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以及《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》这两份文件，之后可随着基因治疗的日趋成熟作相应修改补充或专门立法规定。[15]再者，应当成立或指定相关部门对临床基因治疗规范化的实施进行不间断的监督和管制，及时发现并处理基因治疗过程中的问题。同时，还应追踪患者的治疗效果，作相应的评估分析。最后，应当建立基因治疗数据库。数据库的数据应准确详实，并配有相应的对照、评估以及传播信息的保护机制。[14]
4.侵权方面的立法
基因治疗的技术高难度性以及涉及相关社会伦理学问题等特点使得它在临床医学操作过程中更易发生医患矛盾。我国2010年7月开始施行的《侵权责任法》专设第七章规定医疗损害责任相关问题。基因治疗应用于临床医学，同样将涉及相关的侵权问题。一是隐私权。由于基因治疗的特殊性，基因治疗过程中患者的隐私权保护尤为重要。《侵权责任法》第六十二条是患者的隐私权保护相关规定，临床基因治疗在这方面的立法可参照此法并结合自身特点作相应补充。二是知情同意书的签订。除了《侵权责任法》第五十五条关于患者知情权的相关规定外，基因治疗作为一种特殊治疗，其知情同意书中还应详细阐述基因治疗实施单位和个人的资格及经历、基因治疗的详细过程及疗效、可能产生的各种风险、治疗费用等内容。由于基因治疗的复杂和难以理解性，还应指定或成立相关部门，如基因治疗专家咨询委员会等，帮助患者及家属真正了解基因治疗和知情同意书的内容再做出是否签订的决定，真正维护患者及其家属的利益。临床基因治疗在这方面的法律规定应该进行全面的考量。三是规范化治疗。《侵权责任法》第五十八条第一款规定，违反法律、行政法规、规章以及其他有关诊疗规范的规定导致患者有损害，推定医疗机构有过错。基因治疗作为一种高难度、高风险的治疗方案，施行规范化的保守治疗将更加安全，因此应该制定相应的法规进行管制。
5.对治疗方法本身保护的立法
基因治疗自身能否依法得到保护，尤其是能否通过被授予专利权得到保护，一直是全球争论的焦点。基于人道主义的考虑以及疾病治疗方法因人而异缺乏重复性的考虑，大多数国家对疾病治疗方法不予以专利保护。基因治疗属于疾病治疗的方法，所以目前大多数国家都同样不予以专利保护。[16]《欧洲专利公约》(EuropeanPatentConvention,EPC)对授予专利的要求是新颖性、实用性以及创造性，其中第52(4)条指出，通过外科手术等治疗和诊断人类或动物疾病的方法不符合其工业化实用性的要求，不应被授予专利。基因治疗作为一种疾病治疗方法，在欧洲同样不被授予专利保护。此外，其真正目的还在于保护公共利益，使公众避免花费昂贵的医疗服务费用。然而，并不是所有基因治疗相关的发明都被EPC排斥在专利保护范围之外。EPC为用于基因治疗方法的产品，特别是物质或其化学成分提供专利权保护，这些产品的新颖性可参照EPC第54(5)条规定确定。即使这些物质或化学成分以前就被人知晓，但只要作为一种治疗、手术或者诊断的方法第一次被发现，仍然可以被授予专利。[16]例如，在ADA-SCID基因治疗中，导入含有缺陷基因正确拷贝数的病毒颗粒到体内的治疗方法并不能被授予专利，但治疗过程中用的这种遗传学已发生改变的病毒可以被授予专利，这个病毒将被授予治疗ADA-SCID医学使用的专利保护，即使它之前已被授予别的非医学使用专利保护。专利法对于技术发展的推动作用不容小觑，生物技术也不例外。作为这个领域的领先者，美国和欧盟都不否认这个观点。根据美国专利法的规定，疾病治疗的方法包括基因治疗，是可以被授予专利保护的。这样势必促进本土对基因治疗的深入研究，最终在这一领域处于垄断地位。关于这一点，对基因治疗专利化保护限制的欧盟也已日益意识到来自美国的竞争压力，并且意识到自身的法律规定已经限制了本土在这一领域的发展，现已采取相关措施逐渐扩大对基因治疗的保护范围。我国专利法第二十五条明确规定，对“疾病的诊断和治疗方法”不授予专利权。因此，我国对基因治疗本身不应给予专利保护。然而，用于基因治疗的药物或器械等产品，则应该按照现行《专利法实施细则》等法律授予专利保护，以维护发明者的利益和刺激我国基因治疗的研究，从而促进我国基因治疗技术水平的发展。
四、结语
帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是一种以脑内多巴胺能神经元进行性丢失和路易小体形成为特征的神经退行性疾病，主要表现为运动迟缓、肌强直、震颤、姿势步态异常等运动障碍，亦常伴有嗅觉减退、睡眠障碍等多种非运动症状。目前临床上主要以药物治疗、康复训练、脑深部电刺激等对症治疗为主，尚没有控制疾病发展的有效手段。基因治疗技术通过将目的基因导入相关脑区影响特异性蛋白质表达，有可能延缓多巴胺能神经元的丢失或纠正神经递质失衡。近期有多项临床研究尝试通过立体定向手术导入靶基因，从保护多巴胺能神经元、提高多巴胺递质、拮抗抑制性神经递质等不同角度治疗PD[1-2]。本文就相关研究进展进行综述。
1神经营养因子基因治疗策略
在PD的病程中，多巴胺能神经元的变性坏死是逐渐发生的，故在疾病发展过程中保护残存的多巴胺能神经元、防止其继续死亡有望阻断PD进展。研究表明[3]，转化生长因子α（transforminggrowthfactor-α，TGF-α）、血小板源性生长因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）、神经营养因子（neurturin，NTN）及胶质源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrphicfactor，GDNF)均对多巴胺神经元有营养保护作用。这些措施在各种帕金森病动物模型上均被证实可提高多巴胺能神经元的存活率，阻止神经元进一步变性，从而改善运动症状。其中以GDNF和NTN研究最多，且均进入临床研究阶段。
GDNF为转化生长因子-β超家族成员之一，但与转化生长因子-β超家族中其他成员不同，GDNF是通过激活酪氨酸激酶Ret来激活细胞内下游的信号通路[4]。并且GDNF对多巴胺能神经元具有神经保护和修复作用，能促进多巴胺能神经元的存活及其形态分化，并增加外源性多巴胺吸收的亲和性。有研究发现，将慢病毒介导的GDNF基因导入MPTP诱导的PD猴模型的纹状体和黑质中，结果发现TH免疫阳性神经元增加7倍，表明GDNF能够调节中脑腹侧多巴胺神经元的存活及表型，并能使黑质神经元向多巴胺神经元转化从而弥补局部神经元的缺失[5]。然而GDNF的长期应用可能会同时影响到正常的神经元的功能：研究显示，GDNF在纹状体的长期过表达可下调正常黑质纹状体系统多巴胺神经元的TH表达水平，黑质致密部THmRNA的表达降著减少[6]。在I/II期临床试验中，显示出了部分疗效：入选的34例PD患者中，GDNF组患者双侧壳核输注重组人GDNF，治疗6个月后GDNF组和对照组UPDRS运动评分改善分别平均为10%和4.5%；PET示GDNF组患者背侧壳核18F-左旋多巴吸收值增加23.1%，而对照组无明显变化[7]；但是，GDNF组患者全都出现了不良事件，主要表现为感觉异常、头痛、上呼吸道感染、运动障碍等，而对照组患者全部出现以运动障碍为主的不良事件。研究者认为这可能与GDNF剂量过高或其扩散吸收需要较长的时间有关，将来的研究可通过设计细胞或病毒载体的表达系统，调控GDNF稳定长期表达。NTN与GDNF有相同的结构和功能特性，在体内能通过激活GDNF家族受体而促进多巴胺能神经元的存活[8]。
在MPTP诱导的PD猴模型的实验中，立体定向注射2型腺相关病毒介导的NTN（AAV2-NTN），治疗后4个月发现存活的黑质神经元增加及运动损害改善，并且治疗后NTN持续表达长达12个月。随后进行了I期临床试验，入选的12例PD患者经立体定向手术在双侧壳核内注射不同剂量AAV2-NTN[9]。患者部分运动功能得到改善，不服药时UPDRS运动评分平均改善14分，PET示治疗后18F-左旋多巴吸收无变化，手术操作耐受良好，1年后均无严重不良事件发生。接着进行了II期临床试验，38例患者为治疗组，通过头颅立体定向技术向双侧壳核内缓慢微量输注共80uLAAV2-NTN（5.4×1011单位），20例患者进入假手术对照组，仅接受头颅钻孔定位（不穿透颅骨内表面）而不给予任何液体[10]；治疗后12个月“不服药时UPDRS评分”组间无显著差异，PET扫描示18F-左旋多巴吸收值组间亦无显著差异，但在治疗后18个月，治疗组患者UPDRS评分的降低显著优于对照组，提示NTN基因治疗起效缓慢，可能需更长的随访期才能体现出疗效差异。实验组有13例出现了严重不良事件,对照组有4名出现严重不良事件,研究者分析可能与手术操作相关。初步研究显示，NTN基因治疗可能有助于改善帕金森病患者运动症状，但其起效缓慢，且安全性还需进行多中心临床试验进一步评估。
2酶替代基因治疗策略
多巴胺是由酪氨酸在多种酶的协同催化作用下，经过复杂的生化反应最终生成的。其中，有3种酶对多巴胺的高效合成最为重要：酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase，TH）在黑质纹状体将L-酪氨酸转变成左旋多巴，随之经芳香族氨基酸脱羧酶（aromaticL-aminoaciddecarboxylase，AADC）转变多巴胺；GTP-环化水解酶1（GTPcyclohydro⁃lase-1，GCH1）是合成TH辅助因子——四氢生物蝶呤的限速酶[11]。帕金森病患者黑质多巴胺能神经元进行性变性，导致多巴胺显著性下降，而通过长期口服左旋多巴来增加多巴胺含量会产生一系列严重的运动并发症[2]。酶替代基因治疗是通过在纹状体表达多巴胺合成的关键酶来提高多巴胺含量，从而改善临床症状，并减少口服药物剂量。
2.1AADC基因治疗有研究表明，表达AADC的细胞在进展期PD患者服用左旋多巴的治疗中起重要作用，能显著提高外源左旋多巴的脱羧效率，使其更高效地转换为多巴胺，从而降低左旋多巴需求量及其不良反应[12]。在此基础上研究者开展了一系列AADC基因治疗PD的尝试：在AADC基因联合c17.2神经干细胞移植入大鼠纹状体内的实验中，实验组大鼠行为学明显改善，且纹状体TH阳性细胞明显增多[13]；在MPTP诱导的猴PD模型中单侧纹状体输注腺相关病毒介导的AADC（AAV-AADC），FMT-PET扫描示尾状核AADC表达信号随着时间延长而增加；行为学表现得到一定改善，但部分出现不良反应，如肢体活动过度、刻板动作、幻觉、注意力分散；长期随访研究证实治疗效应持续8年，并且没有其他严重不良事件出现[14]。随后开展了I期临床试验，在中重度PD患者双侧壳核内输注AAV-AADC，且使用2个不同剂量组（9×1010和3×1011单位），UPDRS总评分及运动评分得到一定改善，FMT-PET扫描信号显示AADC表达增加，分别为30%（低剂量组）、75%（高剂量组）[15]。但有3例患者出现颅内出血，可能与神经外科手术操作有关；有4例患者随后（基因治疗10~15个月后）需进一步行DBS治疗[16-17]。目前研究表明，AAV-AADC基因治疗可能有效，相关不良事件很可能与基因载体输注的手术方法有关。正进行的I/II期临床试验有助于进一步评估AAV-AADC的疗效及安全性。
2.2GCH1和TH基因治疗除了AADC，帕金森病患者纹状体内TH、BH4与GCH1的表达也低于正常，通过提高纹状体局部GCH1的表达，可弥补BH4的耗损，同时可稳定TH的表达并增强其活力。与AADC相比，联合GCH1和TH是一种组合酶基因治疗策略。研究显示，在大鼠PD模型单侧纹状体输注AAV-TH-GCH1共表达基因，治疗4周后大鼠运动功能改善，且改善程度与纹状体内多巴胺恢复水平相关；免疫组化染色示纹状体和部分皮质区域出现大量转入基因表达但同时伴有苍白球神经元的丢失[18]。随后研究者在大鼠PD模型植入可稳定调控多巴胺生成的基因表达系统，通过偶联二氢叶酸还原酶（dihydrofolate，DD）形成重组DD-GCH1基因组，给予甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，TMP）调控多巴胺的生成[19]。结果显示给TMP后，AAV-TH-DD-GCH1组大鼠行为学显著改善并持续到33周，生成多巴胺含量较对照组高且稳定，其疗效与TMP给药剂量和时间相关。目前相关研究尚未进入临床研究阶段。
2.3AADC，GCH1，TH基因联合治疗通过构建慢病毒载体（Lentiviral）同时转导AADC、GCH1、TH这三种多巴胺合成的关键酶基因来增加多巴胺的合成，这一方案能够明显改善PD大鼠的运动功能[20]。进一步研究发现，在MPTP诱导猴PD模型注射这种病毒载体12个月后，运动功能改善，并且没有引起其他运动障碍[21]。随后研究者开展了I/II期临床试验，设计三种不同剂量的联合基因治疗组（Lenti-AADC-TH-GCH1），通过立体定位技术在PD患者双侧纹状体输注Lenti-AADC-TH-GCH1[22]。随访结果显示：UPDRS运动评分(不服药时)较基线明显减少；无严重不良事件发生；仅有2例患者随后接受了脑深部电刺激术。4年随访数据初步证明这一基因联合治疗方案的安全性及有效性，具有较好的发展前景。
3GAD基因治疗策略
PD黑质神经元的退变导致纹状体多巴胺的显著耗竭，主要抑制性传出神经核团——黑质网状部及苍白球内侧部在过度激活的丘脑底核(subthalamicnucleus，STN）核团的驱动下传出过多的抑制性冲动，从而引起以运动障碍为主的PD症状——静止性震颤、肌强直、运动迟缓和步态紊乱[23]。STN局部高频刺激（deepbrainstimulation，DBS）是进展期PD治疗的有效手段，其通过阻断STN神经元的活性而降低STN神经元传出的抑制性神经冲动，同时提高黑质网状部局部神经递质Υ-氨基丁酸（GABA）的浓度[24]。因此，应用基因治疗提高STN及其终末区局部GABA神经递质的浓度可改善PD的临床症状。GABA为脑内主要的抑制性神经递质，可由谷氨酸脱羧酶的两种异构体GAD65和GAD67产生，将GAD65基因转入大鼠STN，可显著改善PD大鼠模型的症状，而局部转染GAD67基因却无这一效果[25]。用AAV-GAD65处理6-OHDA诱导的PD小鼠，电生理记录发现GABA释放增加；随之刺激STN，运动功能得到改善。接着进行AAV-GAD治疗MPTP诱导的PD猴的研究，发现帕金森病临床指标显著改善，并且疗效超过56周，注射部位FDG-PET活性相应明显增加[26]。该研究结果初步显示GAD基因治疗安全，且无不良事件发生。在随后的I期临床试验中，入选12例PD患者，单侧丘脑底核经立体定向技术注射AAV-GAD65,治疗后12个月UPDRS运动评分显著改善，同侧FDG-PET吸收增加，同侧丘脑的代谢活性明显减弱[27]，在围手术期内未出现与治疗有关的不良事件。研究者又开展了II期临床试验，治疗组随机分配22例患者（接受双侧丘脑底核注射AAV2-GAD），假手术组23名患者，治疗后6个月，治疗组UPDRS评分结果较对照组略有改善但差异无统计学意义(P=0.19)，无严重不良事件发生，术后MRI未显示丘脑底核损害，副作用相对轻微，包括头痛和恶心[28]。AAV2-GAD的临床试验研究表明该方法相对安全，还需进行更多的研究来比较这些结果疗效与传统DBS治疗的疗效。
4基因治疗选用的载体
目前，病毒载体可以将外源基因成功带入PD动物模型的中枢神经系统，对维持携带基因的表达有特定的优势(通过形成游离基因或整合到宿主基因)。现阶段应用于临床试验的主要为AAV和慢病毒载体。AAV是一种辅助依赖型的细小病毒，由4.7kb的单链DNA和包裹的二十面蛋白衣壳组成，在递送基因时不影响正常基因的功能，可长期稳定表达外源基因[29]。AAV有多种亚型，迄今以血清型命名AAV亚型分为AAV1-AAV12，主要以人类和灵长类动物为宿主，其中AAV1-6是从人类组织中分离获得。尽管不同AAV血清型的病毒都具有二十面体结构，但其衣壳蛋白在序列与空间构象上具有多样性，使得其细胞结合受体以及细胞嗜性存在显著差异[30]。AAV2和AAV3的主要受体为硫酸肝素蛋白多糖；AAV4的受体为O-连接的唾液酸；AAV1、AAV5和AAV6的受体为N-连接的唾液酸；AAV8的受体为层黏连蛋白受体LamR；AAV9对心肌的亲和性较高[31]。目前用于PD研究的主要有AAV2、AAV8和AAV9，且AAV载体在末端重复序列之间最多可携带长4.5kb的外源基因[32]。慢病毒为一类逆转录病毒的总称，由慢病毒改建而来的载体系统以其高效而稳定的基因转移效率及低免疫原性成为近年来研究者们的常用选择[33]。慢病毒载体主要具有以下特点：既可以转染处于有丝分裂活跃期细胞，又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期细胞；由慢病毒载体携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力；可兼容多个转录启动子；经过改建后的慢病毒载体可容纳约10kb的外源基因[34]。
5基因治疗手术方式
目前向PD患者脑内输注携带目的基因的载体均通过立体定向技术实现，病毒载体将目的基因整合入靶细胞基因组，并调节其稳定表达。注射靶区主要为与帕金森病病理改变密切相关的部位，不同研究依携带基因的不同而选择不同的注射部位：纹状体（Lenti-AADC-TH-GCH1），术后患者出现头痛、脑水肿、硬膜下血肿（进针手术部位）等[22]；壳核（AAV2-NTN、AAV-AADC），患者出现与手术操作相关的并发症如惊厥、脑水肿、出血、短暂精神改变、尿潴留等[10]；丘脑底核（AAV2-GAD），术后患者出现头痛、恶心等[28]。这些临床研究均未出现与基因治疗药物相关的不良事件，其并发症主要与手术操作相关，改进手术方法及增强术后护理有可能减少相关并发症的发生。
6展望
多项临床前期实验、小规模I期和II期临床研究显示，基因治疗对缓解PD症状、改善PD运动功能有较好的疗效，并且未出现与目的基因、病毒载体相关的并发症，很可能成为PD治疗的新方法，特别以慢病毒介导的AADC、GCH1、TH联合基因治疗方案展现出较好地转化前景。在此基础上，选择合适的病毒载体携带不同基因精确地植入相关脑区，并探索植入基因长期表达的调控策略，如：探索调控药物的剂量与时间窗关系，从而使目的基因能以生理方式稳定表达，提高基因治疗的效果，阻止PD的病理进展。不同治疗策略之间优缺点的比较尚有待进一步研究，同时需完善手术方式，减少与手术操作相关的并发症，改善患者生活质量。
肿瘤直径小于3厘米的小肝癌通常以手术切除为主，对于不能切除的肝癌可以采用化疗、放疗、介入的方法进行治疗。比起手术来，介入治疗属于微创手术，其治疗过程较为简单、安全，病人痛苦小，出血少、恢复快等多种优点，因此也受到了患者的认可。肝移植虽是肝癌患者获得根治性治愈的唯一希望，但根据米兰标准，如果肝癌患者的单个肿瘤直径超过3厘米，多个肿瘤累积直径超过5厘米时，不建议患者实施肝移植。
手术、化疗、放疗、介入和肝移植，这些方法虽有其优点，但又存在各自的局限性，不能完全满足患者的需要。为此，无数医学专家又开始寻求新的理想的治疗方法。
现在已知许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。癌症实际上也是一种与基因有关的疾病，癌症的发生和发展与基因的改变有着密切的关系，基因治疗针对的就是肿瘤发生的根源。因此，基因治疗作为肿瘤治疗的新方法已逐渐进入人们的视野，并且正在逐渐进入临床。但大多数人对基因治疗的概念还不是十分了解，听上去好像还有点深奥。那么，什么是基因治疗，它的作用机理是什么，能治疗哪些疾病，效果如何，与其他治疗相比有什么优势，它今后的发展趋势和临床应用前景会是什么样的?
什么是基因治疗
基因治疗简单说就是用基因治病。癌症就是某些基因的突变造成的。应用正常的或野生型病毒的基因，校正或者替换人体细胞或组织内有缺陷的或致病的基因，使人体细胞依旧发挥正常的功能，来达到防治肿瘤的目的。专业上将所用的这种正常的或野生型病毒的基因称为目的基因，把人体内的细胞基因称为宿主细胞基因，肿瘤细胞叫靶细胞。将目的基因导入靶细胞以后，目的基因与宿主有缺陷的或致病的基因整合在一起，使目的基因成为宿主细胞遗传物质的一部分。这种方法又叫病毒载体方法。
肿瘤的基因治疗
肿瘤基因治疗技术目前分为两大类：一类称之为替代技术或添加技术，另一类是基因的封闭技术。临床上选用的方法主要有肿瘤自杀基因治疗和P53基因治疗两种。
肿瘤自杀基因就是将治疗基因用各种方法送入到肿瘤或异常细胞中，来抑制肿瘤生长或使肿瘤细胞死亡。治疗基因包括抑癌基因和诱使肿瘤死亡的基因。基因封闭技术是通过封闭或降解肿瘤基因达到治疗的目的，如P53肿瘤抑制基因。
治疗基因是怎样进入癌细胞的
将目的基因导入到靶细胞中的方法很多，大体上可分为物理学方法、化学方法，融合方法以及病毒载体方法四大类。目前绝大多数基因治疗采用的是病毒载体方法，因为病毒载体方法的基因转移效率很高，在合适条件下可达到100％，因而更受重视。
基因的导入方法有点像火箭发射，用一种经过改造的病毒作为火箭，把治疗基因“发射”到戒备森严的癌细胞内部，干扰其DNA的复制，从而让癌细胞自杀。基因药物对癌细胞有一种特殊的亲和力，进入人体后直接奔向癌细胞，与癌细胞亲密结合，把癌细胞杀死在萌芽状态。
下面我们通过肿瘤自杀基因的导入过程来了解病毒载体方法就更容易懂了。
肿瘤自杀基因
肿瘤自杀基因又称为TK基因。目前，经美国食品与药品管理局(FDA)批准的类似TK基因制剂临床试验在全球已经超过60个，用于多种肿瘤的治疗。自杀基因有很多种，北京佑安医院采用的是重组腺病毒一胸苷激酶基因制剂联合更昔洛韦的方法。重组腺病毒～胸苷激酶基因简称ADV-TK基因(这是一个专业术语，念起来有点绕口，知道就行了，下面还会多次提到，慢慢就熟悉了。)，胸苷激酶基因是从经过基因工程改造的单纯疱疹病毒里面抽出一个基因片段，经过改造后成为专门攻击癌症细胞的基因，这是要杀进肿瘤的炮弹，由“火箭”重组腺病毒将其运送到癌细胞中，有目标地直接插入到癌细胞的DNA中，破坏癌细胞的DNA，破坏后癌细胞的DNA是不完整的，不但不能再继续生长，而且会自杀死亡。
ADV-TK对肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、上皮癌等14种肿瘤细胞均有明显的杀伤作用，抑瘤率可高达80％～90％。
基因治疗肝癌的给药途径
临床采用的给药途径主要有三种方法：瘤内注射、肝动脉灌注、门静脉注射。
瘤内注射是在B超的引导下，通过经皮穿刺将基因制品直接导入肿瘤局部。这种方法目的性强、操作简便、直观的优点，注射针头与身体的接触面积小，治疗所引起的免疫反应也很小。
肝动脉灌注，通过介入的方式进行动脉插管，将基因治疗药物直接注入肿瘤的供血动脉，药物随血流分布在整个肿瘤区域，使肿瘤区域和整个肝脏中的基因药物浓度增高，增加了肿瘤细胞的转染率。还可以用介入法经血管留置药盒，为基因治疗药物的多次导入提供了条件。
门静脉注射，由于胃肠道肿瘤主要通过门脉循环转移至肝脏，门静脉对少血供的肝癌、小肝癌、门静脉癌栓、转移瘤、卫星结节、大肝癌的周边包膜的供血起重要作用，因此经门静脉途径注射基因治疗药物也作为一种有效的给药途径。
治疗中的两个关键问题
高效性和靶向性是肿瘤基因治疗中存在的两个关键性问题。
问题一：国际上70％的抗肿瘤基因制剂采用了腺病毒负载的肿瘤自杀基因。实际上就是把重组的腺病毒和所携带的胸苷激酶基因片段打到癌细胞中。那么，打入多少病毒才够呢?多了，有可能使正常细胞也携带该基因制剂，其结果不但杀灭肿瘤细胞，也会杀死正常细胞，严重时可能导致患者死亡。少了，就不能杀灭肿瘤细胞。因此，每次治疗中使用的病毒量要根据肿瘤的大小来确定打入的基因量，过去规定基因治疗中每次使用剂量最大不得超过2×1013病毒颗粒。另外，一次基因治疗的有效时间约为20～30天，在此之后，未能杀灭的肿瘤细胞仍将继续生长，且人体还将对基因制剂产生抗体，每注射一次基因，其作用可能衰减25％，几次之后基因治疗就将无效。因此，剂量和疗程的准确关系到治疗的效果。
问题二：怎样做到既不影响正常的人体细胞，又要准确杀死肿瘤细胞。
就肝癌的基因治疗来说，肝癌自杀基因疗法采用的重组腺病毒载体较好地解决了这一问题，用重组腺病毒作为载体是经过多次试验和和多种病毒载体的选择后确认的。重组腺病毒载体能携带外源基因(如上面提到的胸苷激酶基因片段)靶向性地整合到靶细胞基因(肝癌的基因)组中，实现目的基因的持久稳定表达。
基因治疗的好处
经过肿瘤自杀基因瘤内治疗后，肿瘤的生长明显地受到了抑制，而且正常的肝脏组织不受影响。基因治疗属于微创治疗病人痛苦小，治疗过程用时短，治疗后卧床6～8小时后即可下床活动。一般说来，两个疗程即可见到疗效。就目前的治疗效果看来，基因治疗没有什么坏处，不会使注入基因的肿瘤细胞扩散，也不会影响肝脏的正常功能。由于腺病毒DNA不整合入宿主细胞基因组，所以对人体没有遗传性影响，而且作为基因载体，重组后的腺病毒具有感染效率高和安全的特点，成为药物敏感基因转导肝癌细胞的有效载体。
另外，它所特有的“旁观者效应”在治疗中也起到了非常好的作用。
基因治疗的应用前景
虽然基因治疗还没有完全应用于临床，但在临床的试验观察中，已让肝癌患者看到了希望，有些小肝癌患者，经过两个疗程的基因治疗后，经手术证实癌细胞完全坏死。虽然还有些弱点需要克服，但基因疗法与其他疗法、手术治疗，介入治疗、化疗，放疗以及肝移植的联合应用，可以互补其缺点，相互协调，增加抗肿瘤效果，这将成为今后肝癌治疗的发展方向。
卵巢癌是女性生殖系统常见的三大肿瘤之一，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但是因其早期无明显临床症状，致使等患者出现症状后再就医往往为时已晚，所以其死亡率是妇科恶性肿瘤的首位。近年来，随着分子生物学的发展, 基因治疗作为一种新的医学技术得以迅速发展，为肿瘤的治疗开创了新的领域。下面介绍几种具有应用前景的卵巢癌基因治疗策略。
1 诱导细胞凋亡基因疗法
诱导细胞凋亡基因疗法是一种通过选择性表达或导入某些外源基因诱导肿瘤细胞凋亡,增强对化疗的敏感性的有效基因疗法。Survivin是最近新发现的一种凋亡抑制基因,属于凋亡抑制蛋白(inhibition apop tosis p rotein, IAP) 家族的新成员，所有分化成熟的组织中均检测不到其表达，而大多数常见肿瘤组织内如肺癌、胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌中表达异常升高[1]，其与恶性肿瘤的发生、发展、血管生成、肿瘤的预后关系密切。
Wall等[2]应用细胞分子生物学技术通过抑制Survivin基因蛋白的磷酸化过程来提高肿瘤细胞的凋亡率,从而达到治疗肿瘤的目的。Survivin的多态序列中, 34位氨基酸为苏氨酸,是细胞周期素依赖蛋白激酶P34cdc22的磷酸化点,该位点的磷酸化对维持Survivin的凋亡抑制功能非常重要。以丙氨酸取代后的突变体(T34A)可以使凋亡抑制功能丧失,以此突变体转染Hela癌细胞,突变体的高度表达可以诱导转染细胞的自发性凋亡。经证实,新一类的抗癌药物GGTls中的GGTI-298 和GGTI-2166通过阻抑PBK/AKT和survivin途径来诱导顺铂敏感和耐药的人类卵巢上皮性癌细胞凋亡。在GGTI-298和GGTI-2166治疗后, PBK和AKT激酶水平降低,生存素表达明显减少。构成上活化的AKT2和/或生存素的异位表达能明显地复苏被GGTI-298诱导凋亡的人类癌细胞。其前的研究显示Akt调节生长因子诱导的生存素,而p53抑制生存素的表达。然而,构成上活化的AKT2却不能复苏GGTIs下调生存素,再进一步, GGTIs在野生型p53和p53不足的卵巢癌细胞株中均能抑制存活素的表达并诱导细胞程序性死亡。这些资料表明GGTI-298和GGTI -2166不依赖于p53而针对PBK/AKT和survivin 类似途径来诱导凋亡[3]。
2 抑制细胞信号传导通路疗法
研究表明,表皮生长因子受体(EGFR)在许多恶性肿瘤中呈高表达,并与肿瘤的发生、转移、预后等密切相关。Shih等在脑细胞瘤中发现了原癌基因neu，Padly等证实该癌基因编码的185kDa的蛋白质P185neu与EGFR的基因一样同CerbB具有同源序列，故将EGFR基因命名为CerbB-1（HER-1），neu基因命名为CerbB-2（HER-2）。近年来，又陆续发现了CerbB-3（HER-3）CerbB-4（HER-4），组成了EGFR家族。此家族成员均是具有酪氨酸蛋白激酶活性（TPK）的生长因子受体。
CerbB-2的过度表达与卵巢癌患者生存期、生存率及卵巢癌的耐药性的发生密切相关[4]。Herceptin作为人源性单克隆抗体, 与CerbB-2 的细胞外部分有高度亲和力, 能靶向结合于表达CerbB-2的卵巢癌细胞, 阻断配体介导的细胞信号传导，影响上皮细胞生长，也可通过诱导抗体介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。Mauricio等通过将Herceptin 与肿瘤坏死因子联合应用于阳性的CerbB-2卵巢癌细胞系,发现Herceptin能通过抑制酪氨酸激酶来增强肿瘤坏死因子引起的细胞凋亡效应。临床应用Herceptin治疗CerbB-2阳性卵巢癌已取得良好的治疗效果。
3 多重耐药基因疗法
卵巢癌化疗失败的根本原因是产生化疗药物耐药性。研究发现, 在对顺铂、阿霉素耐药的卵巢癌细胞株中72%的细胞出现了MDR1 基因的过度表达。抑制MDR1 基因的表达, 不仅使细胞内化疗药物浓度增加，也增强细胞对药物的敏感性[5]。
卵巢癌多细胞球体多药耐药糖蛋白Pgp表达的升高与细胞周期素依赖性激酶抑制剂p27呈正相关[6]。p27可使细胞周期蛋白E和细胞周期依赖性蛋白激酶2的活性受到抑制，使细胞周期停滞在G1期，对细胞周期进行负调控。Xing[7]将p27ASON经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780、CAOV3，用锥虫蓝排除实验法和流式细胞仪检测细胞凋亡率来分别比较单层细胞p27ASON转染前后培养的多细胞球体的紫杉醇敏感性，结果表明，p27ASON可以下调p27的表达，防止细胞间黏附并促进细胞增殖而下调Pgp的表达，从而一定程度逆转卵巢癌对紫杉醇化疗的耐药性。
4 突变补偿疗法
突变补偿是消除主要致肿瘤基因,取代改变的肿瘤抑制基因,或干扰某些生长因子及其受体的功能。将特异性基因导入肿瘤细胞,纠正肿瘤细胞的基因缺陷,使细胞周期停滞、诱导细胞程序性死亡或使肿瘤细胞对化疗和放疗敏感。编码人类免疫缺陷腺病毒与野生型P53 (SCH58500)重组体腹膜注射有良好疗效,既安全又可耐受,并且联合铂类化疗在复发性卵巢癌患者有更好的效果。
目前研究最为深入的抑癌基因为P53。在30%～79%卵巢癌中出现了P53异常。实验证明野生型P53基因转染到有P53 基因突变的卵巢癌细胞,既抑制肿瘤的生长,又具有旁观者效应[2]。2005年Ad-P53基因治疗获准进行Ⅲ期临床试验，现我国重组人P53腺病毒（今又生）广泛应用于临床卵巢癌的治疗并取得了良好的治疗效果。
5 反义基因疗法
它是利用反义技术设计与异常激活有害基因及其mRNA互补的反义寡核苷酸,特异性封闭这些基因使其不表达或低表达,从而达到减少基因产物,抑制细胞恶变的作用。由于该疗法是从核酸角度着眼,故而是一种最根本、最有前途的治疗方法。Fei R[8]针对CerbB-2基因和c-myc基因,联合抗基因治疗,靶向CerbB-2和c-myc,抑制卵巢癌细胞COC(1)细胞增殖和CerbB-2及c-myc基因表达。c-raf-1可被ras基因激活之外还存在独立的激活途径:可被酪氨酸激酶src与JAK1、蛋白激酶Cα、神经酰胺活化的蛋白激酶等激活。因而c-raf-1是EGFR介导的信号转导系统上的关系基因之一[9],c-raf-1是理想的基因治疗靶点。CerbB-2 ASODN 与CerbB-2 mRNA 5’端编码区互补,Craf-1 ASODN 与Craf-1 mRNA 3’端非编码区互补。Pirollo等针对raf-1、H-ras、CerbB-2基因设计合成的硫代ASO,不仅能抑制卵巢癌细胞生长,而且能增加对放疗的敏感性。
Zaffaroni等[10]在体外和体内的研究中利用针对Survivin的反义寡苷酸治疗肿瘤,发现肿瘤的生长速度减慢,并且可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,如紫杉醇、顺铂和鬼臼乙叉甙及对照射和免疫治疗的敏感性。研究表明靶向抑制survivin基因表达在肿瘤治疗中有巨大的潜在价值。
等针对端粒酶hTERT设计合成反义脱氧寡核苷酸,对卵巢癌细胞系SKOV3及ES-2进行反义基因治疗,能通过抑制端粒酶活性,增强细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等抑制卵巢癌细胞生长,与CDDP合用能增强对癌细胞的杀伤作用。
基因治疗为卵巢癌的治疗展现了一个极有希望的前景。学者们正针对卵巢癌的基因治疗中存在的一些问题,研究载体改良,增强目的基因靶向性等,迎接根治卵巢癌的挑战。相信随着人类基因组计划的完成,分子生物学等学科的进一步深入发展,人类将开辟卵巢癌基因治疗的新纪元。
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关键词：基因治疗；靶向治疗；体细胞治疗；进展
1、前言
基因治疗研究是采用基因工程技术，将正常基因导入靶细胞，从而对基因缺陷引起的疾病而进行的治疗。基因治疗是针对疾病的根源，即基因所进行的治疗，现广泛应用于肿瘤及心血管疾病的治疗研究[1]。在遗传性疾病或是肿瘤的治疗中，传统的药物治疗不能够完全控制疾病的恶化，肿瘤疾病的手术治疗能够缓解病症，但是会造成组织不能够恢复重建，影响患者的正常生活。基因治疗针对遗传性疾病、心血管疾病、感染性疾病以及恶性肿瘤等相关的治疗方面具有防范的应用，而且不影响患病组织重建以及生长。基因治疗是随着细胞生物学、免疫生物学以及分子生物学的发展而发展起来的，本文将对基因研究的发展进展进行综述研究，同时指出基因研究的发展方向。
2、基因治疗技术
2.1 基因治疗技术的发展现状
在生物医学领域，人类的疾病的根源是基因发生缺陷，包括遗传缺陷或是外界环境造成的生理缺陷。在基因学中，人类的疾病主要可以分为三大类：（1）单基因病，即其中一个基因发生缺陷而导致的疾病；（2）多基因病，病症的诱因既表型都呈现多样性；（3）获得性基因病，由于病原的侵入而产生的疾病。基因治疗技术是随着对基因的不断认识而发展起来的，最初的基因治疗技术是将具有正常功能的细胞导入具有缺陷的靶细胞内从而对疾病进行治疗的技术。随着对基因的研究不断加深，以及细胞生物学、免疫生物学和分子生物学的而不断发展，基因治疗技术已经发展成为将遗传物质导入到人体细胞，从而进行治疗的技术，其中基因治疗技术包括核酸治疗、反义基因治疗以及DNA疫苗的治疗技术。
2.2 基因技术的形式
根据基因的治疗方式，可以采用体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。
2.2.1 生殖细胞基因治疗
通过在生殖细胞中将正常基因导入，然后在外界将其培养生成正常的个体，从而采用移植等技术对患者进行治疗。但是这种治疗方法涉及到人类伦理的问题，所以现阶段的生殖细胞基因治疗主要是针对动物使用。这种靶细胞的治疗方法的成功率并不高，整体发展较为缓慢。
2.2.2 体细胞基因治疗
体细胞基因治疗是将具有正常功能的细胞转移到具有基因缺陷的靶细胞内，在正常基因细胞的增值过程中，取代具有基因缺陷的细胞，从而达到治疗的作用。这种基因治疗方法主要是对基因的缺陷进行补偿，并且在治疗的过程中只需要针对某一种类型的细胞中集中表达，采取少量的基因控制就可以达到治疗的目的。目前这种基因治疗的方法广泛的应用于疾病的基因治疗中。
2.2.3 基因治疗的载体
在基因技术中，基因治疗的疗效受到基因的的载体的影响。在进行治疗中，常用的有病毒性载体以及非病毒性载体两类[2]。现在最常使用的病毒性载体主要有：（1）牛痘苗病毒，牛痘苗病毒分子量大可以用于短期的基因表达，是一种可用于多种基因表达的高效病毒性基因，但是容易引起免疫反应；（2）逆转录病毒载体，逆转录病毒具有转染范围广、感染率高并且不易发生病变的优点，是现阶段应用得最为广泛的载体；（3）腺病毒载体是一种没有包膜结构的病毒，在复制增值的过程中不依赖于宿主细胞的分裂，且不与宿主的基因组发生整合，因此相对安全，并且可以直接作用于体内。
非病毒性载体主要使用的有：（1）脂质体，脂质体在人体内可以长期稳定的存在，并且对人体的正常细胞影响较小；（2）线粒体载体，这种载体可以在生物体内共存并且不产生免疫反应；（3）噬菌体载体，这种载体增值，容量大，在基因治理中具有靶向性强的优点。
3、基因治疗技术最新进展
3.1 恶性肿瘤的基因治疗
恶性肿瘤的基因治疗的种类很多，在进行肿瘤的治疗中，主要采用的是肿瘤抑制基因治疗、免疫基因治疗以及药物敏感性基因治疗等方面。
3.1.1 肿瘤抑制基因治疗
肿瘤细胞的最大特点是能够在人体内进行增值，因此在进行肿瘤的治疗中，采用合适的方法抑制肿瘤病毒的增值，使肿瘤的情况得到控制甚至所有改善。在肿瘤抑制基因治疗研究的早期，采用原激活物抑制剂I型基因腺病毒载体、鸡贫血病毒（CAV）等能够对肿瘤基因进行有效的抑制，同时对人体的正常细胞的影响较小。现阶段对肿瘤抑制基因治疗中应用得最为广泛的是P53腺病毒，在进行治疗的过程中，采用P53腺病毒载体，对在人体内产生肿瘤抑制的作用。在医学临床实践中，该方法已经用于肺癌、乳腺癌、喉癌等实体性肿瘤的治疗。
3.1.2 免疫基因治疗
免疫基因治疗的原理是通过将细胞基因注入到人体内，从而增强机体对肿瘤细胞的免疫能力，常用的方法主要有（1）肿瘤抗原基因的免疫治疗，将肿瘤的抗原基因导入到患者体内，使患者的肿瘤细胞的免疫原性增强；（2）利用细胞因子进行基因治疗，通过将B7-1，GM-CSF等细胞因子对肿瘤细胞进行转染，增强了对肿瘤细胞的免疫反应；（3）利用反义核酸的作用，作为信息药物对肿瘤基因进行治疗。
3.1.3 药物敏感性基因治疗
通过单纯孢疹病毒胸苷激酶基因治疗，可以有效的治疗肿瘤细胞。这种治疗方式，是将“自杀”基因导入到肿瘤细胞中，通过与肿瘤细胞相互作用，从而产生出能够杀死肿瘤细胞的药物，这种药物对人体的正常细胞没有明显的作用，但是可以有效的杀死肿瘤细胞。这种药物敏感型基因治疗的方法可以有效的应用于脑恶性胶质细胞瘤的治疗，与化疗相结合，能够有效的提升治疗的效果。
3.2 传染性疾病基因治疗
3.2.1 AIDS基因治疗
AIDS的基因治疗，主要采用基因技术抑制HIV的繁殖。（1）采用反义核酸能够有效的阻断HIV繁殖中所需的Tat的增值，从而抑制AIDS的增值；（2）基因被动免疫疗法，利用具有单抗的2F5的H与L链作用于腺体从而产生2F5型抗体，该抗体能够对HIV分离株进行处理，从而阻止HIV的复制。
3.2.2 乙肝基因治疗
乙型病毒性肝炎是一种传染性疾病，容易引起肝细胞炎症、纤维化。采用基因治疗方法，可以对乙型肝炎病毒进行控制。最初采用HBV核酸疫苗进行治疗，利用基因枪将DNA疫苗质粒打入人体，但是由于DNA疫苗会诱发免疫反应，所以得到的结果并不理想。在随后的基因治疗中，采用表面抗原的乙肝DNA疫苗进行接种处理，产生了较强的CTL反应。pCMV-S2. S DNA 疫苗已经在实验中证明了有良好的临床效果，通过DNA疫苗接种后，接受试验的慢性乙肝患者的HBV DNA水平下降，其中一名体内的HBV得到全部清除。采用基因疗法治疗乙肝，主要是诱导HBV的CTL反应，从而对乙肝病毒的复制进行抑制。
4、基因治疗前景
基因治疗的研究需要以基因诊断为基础，但是在现阶段，对于人类基因组的运转还没有充分的了解的情况下，采用基因治疗会导致不可预期的后果。在现阶段的基因治疗中，靶向治疗是一种重要的治疗方法，但是在进行靶向治疗的过程中，病毒携带基因会对有缺陷的靶细胞以及正常细胞同时产生作用，所以导致正常细胞产生病变的可能[3]。采用脂质体进行传递，可能会使外来基因发生过分表达，从而造成蛋白质的免疫反应。
基因治疗能够治疗多种疾病，而且前几年的临床治疗也取了的巨大的进展，但是基因治疗还存在着很多问题尚未解决。随着基因技术的不断发展，基因治疗会在疾病防御和临床治疗过程发挥更加重大的作用。
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