生物人工肝细胞材料肝细胞株的研究进展

【关键词】 肝细胞株

【关键词】 肝，人工；肝/细胞学；肝细胞株；永生化程序

0引言

肝细胞是生物人工肝支持系统的核心原材料，生物人工肝对肝衰竭患者的肝支持作用依赖于所用肝细胞的生物学功能. 无论是动物肝细胞还是人肝细胞，在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间有限、传代困难等缺点. 采用永生化程序建立肝细胞株就成为解决生物人工肝细胞来源的重要途径，而永生化的人肝细胞株则可为生物人工肝提供取之不尽的细胞源. 现就这一方面的研究进展综述如下.

1肿瘤来源的肝细胞株

肿瘤来源的肝细胞株是指由肿瘤组织分离、克隆而来的具有某些正常肝细胞功能的细胞株. 其中HepG2细胞具有某些类似于正常肝细胞的代谢解毒功能，但细胞的分化功能和分化程度均较低. Khalil等［1］发现，将HepG2细胞包裹于海藻酸珠内，形成内聚性球形集落后可培养20+d，其合成与解毒功能均显著加强，细胞增殖明显，活力显著增强，白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原等成倍增加，细胞色素P450活性显著高于单层培养(4倍以上)，雄烯二酮代谢的5种酶活性明显上调. 形态观察见HepG2细胞在海藻酸盐珠内增殖成内聚性集落，保持正常的细胞形态与结构. 最近，他们利用HepG2细胞(包裹于海藻酸珠内)构成的生物人工肝治疗兔肝衰竭模型，显示能有效地改善其肝衰系统参数(如舒张压、血氧饱和度等)［2］.

考虑到生物人工肝所用细胞材料的转化代谢功能较生物合成尤为重要，特别是在治疗肝性脑病中，去除血氨的作用更为关键. Omasa等［3］将构建的谷氨酰胺合成酶(GS)基因质粒导入无氨清除能力的HepG2细胞，用含甲硫氨酸亚枫(MSX)的培养液选择性培养，获得新的MSX抗性GSHepG2. 该细胞株的氨清除能力可达原代肝细胞的四分之一，若提供适量锌离子可使其氨清除能力进一步提高近50%. 并且可在循环流式反应器长期培养，细胞数量由107增至109，去氨能力大大增强［4］. GSHepG2细胞型生物人工肝可明显延长肝衰竭动物的存活时间，并可用于长期反复治疗［5］. 另外，Yang等［6］将连接蛋白32(Cx32)基因转染到HepG2细胞内，使新的细胞株之间的缝隙连接加强，同时也使其白蛋白分泌和氨清除能力提高2倍以上. Naiki等［7］利用腺病毒将肝细胞核因子4(HNF4)基因导入无氨清除能力的细胞. 在新的细胞中，细胞色素P450、谷氨酰胺合成酶、α抗膜蛋白酶、载脂蛋白等基因的表达增加，特别是其氨清除能力提高明显.

C3A细胞是从肝母细胞瘤分离获得的类似但分化程度高于HepG2的肝细胞株，在空心纤维生物反应器中接种2gC3A细胞，可在1周内增殖到200 g，并具有良好的肝细胞特异功能. 但与猪肝细胞相比，C3A细胞株的P450IA1活性、氨清除以及氨基酸代谢等均较低. Filippi等［8］研究显示，利用UoE培养基预处理的C3A后，能显著提高其尿素、白蛋白、葡萄糖等的合成以及半乳糖的清除能力. C3A是目前唯一用于人工肝临床研究的肝肿瘤细胞株，且己有10年之久，取得了较好的效果［9］，但至今未能进一步扩大应用，可能仍主要与安全考虑有关. 除了上述细胞外，肿瘤来源肝细胞还有HuH6, JHH2等，也开始了用于生物人工肝的基础研究［10］，二者均能高分泌AFP，白蛋白，表达鸟氨酸氨甲酰基转移酯mRNA和乙醇脱氢酶mRNA.

2病毒转染的肝细胞株

病毒转染是建立细胞株的常用方法之一，但所建细胞株的肿瘤性质较为突出. OUMS29是一株人胎肝细胞转染PSV3neo质粒获得的含有SV40LargeT肿瘤抗原(SV40Tag)的肝细胞株，表达许多特殊肝脏功能的基因，可明显降低血氨水平，改善肝性脑病，能够为急性肝衰竭模型动物提供代谢支持作用，提高短期生存率［11］. OUMS29细胞株移植入裸鼠并未显示恶性特征，无转移瘤形成，相比之下HepG2细胞可在2 wk内引起裸鼠多发性肿瘤，说明OUMS29细胞的恶性程度较低. 新近，Kobayashi等［12］为了使OUMS29细胞更接近于临床应用的要求，成功地通过逆转录病毒介导基因释放的方式，将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)自杀基因(suicide gene)转入OUMS29细胞，形成一种新的OUMS29/TK细胞，该细胞株具有高分化的肝细胞功能，在无血清培养基中生长良好，具有肝实质细胞的特征. 此外，采用MTT法检测发现该细胞对GCV(ganciclovir)的敏感度是OUMS29细胞的100倍. 作者认为OUMS29/TK细胞严格调控，具有无限活性，有可能用于生物人工肝.

尽管SV40Tag转染的肝细胞株能提高外科型急性肝衰竭鼠的存活率，能防治门腔静脉分流模型鼠血氨升高所致的肝性脑病，可纠正Gunn鼠胆红素结合缺陷. 但SV40Tag长期存在于永生化的肝细胞可增加移植受体肿瘤转移生长的危险性. 为克服这一缺陷，Cai等［13］对SV40Tag转染细胞株的建立方法进行了改进，建立了新的病毒转染肝细胞株CB8. 建株方法的第一步是将含SV40Tag单纯麻疹病毒胸昔激酶和潮霉素抗性基因侧面连接LoxP位点的重组SSR69逆转录病毒导入鼠肝细胞；第二步再用含有基因编码Cre重组酶的重组腺病毒(AdCre)，在特殊位点重组而将SV40Tag切除. 在第一步完成后，肝细胞得以永生化. 当SV40Tag被Cre重组酶切除后，细胞停止生长，DNA合成下降90%，多种肝特殊性mRNA表达出现或增多，形态和细胞极性表现出更多的分化肝细胞特征，在免疫严重缺陷鼠体内形成的肿瘤停止生长. 这种通过切割有害基因的办法，为肝细胞株的应用提供了新的安全保障.

Hep Z细胞株也是从肝活检标本中分离、经转染获得的人肝细胞株，该细胞株具有细胞色素P450活性等肝细胞特异性代谢功能，能永久传代且增殖能力强. 最近，Werner等［14］采用旋转培养系统和生物反应器分别对Hep Z细胞进行了大孔明胶型CultiSpher G微载体大量高密度培养，研究结果显示永生化的Hep Z细胞具有原始的肝细胞代谢功能，可大量培养，适用于生物人工肝系统.

3可恢复性肝细胞株

近年来，国外学者设计了一种可恢复性永生化程序，为解决细胞材料问题提供了新的思路及手段. 其基本原理实际上就是前述Cai等建立CB8细胞株的思路，即是先将永生化基因SV40T导入原代细胞以获得永生化细胞株，使其获得体外增殖能力，然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因，使细胞株恢复到永生化前的状态. 如Kobayashi等［15］对原代成人肝细胞进行可逆性永生化程序，建立了一株可恢复性的永生化肝细胞NKNT3(reverted NKNT3)，引起同行的极大关注，有可能为生物人工肝支持提供用之不竭的肝细胞材料［16］. NKNT3细胞很大程度上与CB8相似，系将连接有LoxP重组靶基因的SV40T逆转入正常原代人肝细胞而建立的，NKNT3细胞具有肝实质细胞的形态学特征，可表达SV40T，可在体外进行永生化培养. 尽管NKNT3细胞株也保持了表达肝脏代谢的关键基因(谷酰胺合成酶、GST等)，但当切除了SV40T基因后，上述基因的表达水平戏剧性地增加，而且也只有当SV40T切除后该细胞株的白蛋白、人血凝血因子ⅩmRNA才能检测出来. NKNT3细胞对SCID小鼠无致瘤作用. 经能表达Cre重组酶的复制缺陷重组腺病毒转导，NKNT3不再表达SV40T，且分化程度更高，核浆比及胞浆颗粒类似肝细胞. 动物实验己经显示将NKNT3细胞植入90%肝切除大鼠的脾脏可显著改善其生化指标与临床表现，残余肝叶增大并示明显肝再生，脾脏“肝化”，存活率达60%(空白对照组模型大鼠全部死亡). 他们在NKNT3细胞的基础上，将p21基因导入细胞内使细胞在GO/G1阻滞，进一步改善了肝细胞表型，提高了白蛋白和细胞色素P450的表达［17］. 同时，他们用几乎相同的方法构建了可恢复性人内皮细胞株HNNT2［18］和肝星型细胞株TWNTs, TWNT1和NKNT3细胞共同培养时可以加强NKNT3细胞的细胞素色P4503A4和2C9的表达［19］. 可恢复性NKNT3细胞良好的肝细胞功能和无致瘤及致病毒感染之虑，再加上可复性的肝非实质细胞株共同培养，将在今后生物人工肝中有着良好应用前景.

【参考文献】

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