冬凌草生物学研究进展

摘要：冬凌草（Rabdosia rubescens）是唇形科香茶菜属一种抗肿瘤药用植物，二萜类主要成分冬凌草甲素是其主要的活性物质。对冬凌草的生物学特性、分布、遗传多样性、冬凌草甲素及其抗癌活性、冬凌草甲素生物合成路径及其二萜类合酶、冬凌草的转录组等研究方面进行了综述，为冬凌草种质资源的合理开发利用及其相关的生物分子机制进一步发现奠定基础。

关键词：冬凌草（Rabdosia rubescens）；遗传多样性；生物合成路径；转录组

中图分类号：R282.71 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）19-4901-06

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.19.002

Abstract： Rabdosia rubescens is an antitumor medicinal plant in Labiatae family. Diterpenes，especially oridonin，were the main active components in this plant. The biological characteristics，distribution，genetic diversity，oridonin and its antitumor activity，biosynthesis pathways of oridonin and its diterpenes synthase，and transcriptome of R. rubescens were summarized，to provide scientific reference for the rational exploitation and utilization of germplasm resource of R. rubescens and further discovery of the relative bio-molecular mechanisms.

Key words： Rabdosia rubescens； genetic diversity； biosynthesis pathways； transcriptome

冬凌草，学名碎米桠[Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.]，拉丁文学名由原来的[Isodon rubescens（Hemsl.） Hara]修订为[Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.）][1]，唇形科香茶菜属多年生草本或亚灌木植物的干燥地上部分，是一种重要的药用植物，主要分布于黄河、长江流域，主产于河南济源太行山一带[2]。冬凌草全草入药，药苦、甘，性微寒；具有清热解毒、活血止痛、抗菌消炎[3]等功效，其粗制剂具有抗癌作用[4]。冬凌草中含有萜类、黄酮类、生物碱、甾体、挥发油、氨基酸、有机酸、单糖等成分[5]，其中对映-贝壳杉烷类二萜化合物，特别是冬凌草甲素是冬凌草中含量最高、生物活性较强、药用价值和经济价值丰富的一类有效成分[6]。冬凌草由于被肆意采挖造成了资源濒于枯竭、品种退化、活性成分减少等问题。目前，对冬凌草的研究更多地集中在化学成分及其药理作用方面，而对冬凌草遗传多样性及其代谢路径等方面还有待进一步研究。本文就其生物学特性、资源分布、遗传多样性、冬凌草甲素及其抗癌机制、冬凌草甲素生物合成路径及其二萜类合酶、冬凌草的转录组研究方面进行了综述，旨在为有效运用生物学研究方法来改善冬凌草人工栽培中存在的问题，改善其代谢途径以及提高其活性成分奠定基础。

1 冬凌草的生物学特性

冬凌草为亚灌木植物，高0.3～1.2 m，木质根茎，有长纤维状须根。茎直立，多数，基部近圆柱形，无毛，皮层纵向剥落，上部多分枝，分枝具花序，茎上部及分枝均四棱形，具条纹，带紫红色。茎叶对生，聚伞花序3～5花，最下部者有时多至7花。花盘环状，小坚果倒卵状三棱形，淡褐色，无毛。花期7～10月，果期8～11月[7]。冬凌草染色体数目为2n=2x=24[8]。冬凌草种子均为倒卵形，但不同发育程度冬凌草种子在形态特征上明显不同，从种皮颜色上可以将其分为褐色具花纹和褐色种子两大类。董诚明等[9]研究发现种子蛋白表达量的差异导致两种不同的发育类型。冬凌草的表皮细胞的形状、气孔类型均相同，但其叶基形状、叶长、叶宽、叶表皮微形态特征存在明显的差异[10]。随着冬凌草日常需求量的增加，冬凌草的栽培技术得到了很大的改进，从种子繁殖、幼苗扦插、移植栽培、病虫防治等方面提高种苗的产量[11-13]。通过组织培养技术建立冬凌草无性快繁体系是促进冬凌草大面积人工栽培， 缓解自然资源匮乏现状的有效途径[14，15]。

2 冬凌草的地理分布

唇形科香茶菜属[Rabdosia （Bl.） Hassk]植物全世界约有150种，在非洲南部、南亚、东南亚以及东欧等地区都有分布。中国有90 个种和21个变种，在湖北、四川、贵州、广西、陕西、甘肃、山西、河南、河北、浙江、安徽、江西及湖南等省区均有分布，主要分布在长江以南以及西南各省区。冬凌草属于广布种，在湖北、四川、贵州、广西、陕西、甘肃、山西、河南、河北、浙江、安徽、江西及湖南等省区均有分布。主要集中分布于太行山区，药用冬凌草也主要产于这一地区。王新民等[16]采用中药材产地适宜性分析地理信息系统（TCMGIS）分析得出冬凌草全国适宜区分布（图1）。冬凌草的分布很广，而随着各地对其需求量的增加，野生的冬凌草资源濒临枯竭，因此通过对不同地区的自然居群进行遗传多样性分析，并收集代表性的种质资源，建立冬凌草核心种质库，筛选优良的种质资源才能实现冬凌草的大面积人工种植。

3 冬凌草遗传多样性研究

研究遗传多样性的方法包括形态宏观水平的性状统计和分子微观水平的同工酶、等位酶以及DNA分子标记方法，例如RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP和DNA测序等。DNA分子标记方法的研究对象是遗传物质本身，不受物种所处环境条件和发育阶段的影响，又能反映环境条件对物种遗传选择的影响，成为研究物种遗传多样性和品种鉴定的主要方法。表1中总结了目前冬凌草及其相关香茶菜属的遗传多样性的研究概况。除了上述分子标记方法外，现在又发展了许多现代分子标记技术，郭培国等[17]运用微卫星锚定片段长度多态性（Microsatellite-anchored fragment length polymorphism，MFLP）利用扩增片段长度多态性（AFLP）和SSR锚锭引物技术的双重原理建立的一种分子标记技术对菜薹种质遗传多样性进行了分析。而冬凌草的遗传多样性分析还停留在初始阶段。

李国民等[22]从遗传距离上对不同地区、各种类型的冬凌草进行了基因水平的分类，研究表明产地差异和类型差异共同影响了冬凌草种质资源的多样性和复杂性，冬凌草在物种水平上具有较高的遗传多样性，居群水平遗传多样性较低，大部分遗传变异存在于居群间，与其他研究类似[25]。而魏俊杰[26]在研究河南济源地区的两种冬凌草（一类是含有冬凌草甲素的冬凌草，另一类是含OGP-46的冬凌草）时，从内环境因素中的内生菌及遗传因素中的rDNA ITS序列两方面探讨形成这种差异的可能原因，但2种类型的冬凌草在ITS序列上并未表现出显著的差异。说明居群内拥有较低的居群特有多态位点，但这些位点是否与次生代谢产物合成基因相关，是否可以作为分子鉴定的依据，还有待进一步研究。

冬凌草的种质资源多种多样，不同地区冬凌草二萜类成分明显不同，而不同变异类型冬凌草二萜类成分也发生变化，无明显规律性。植株的生长受到各种因素的影响，光、温度、湿度、土壤肥沃程度、海拔、气候条件等都能明显地影响冬凌草的生长及其次生代谢产物的合成。随着产地生态环境的不同，其次生代谢成分的结构类型会有较大的变化，这种次生代谢成分上的多样性是常见的生物多样性现象的表现之一。在贵州产冬凌草中就没有发现冬凌草甲素和乙素的存在，而在河南产的冬凌草中就主要含有冬凌草甲素[27]。陈随清等[28]通过冬凌草指纹图谱对来自不同产地和不同类型的冬凌草进行分析发现不同地区冬凌草二萜类成分明显不同。不同地区冬凌草二萜类成分不同，而且同一地区的同一株冬凌草不同部位的二萜类成分也有较大的差异。廖伟玲等[29]采用薄层色谱法对冬凌草中齐墩果酸和冬凌草甲素进行定性鉴别，高效液相色谱法测定冬凌草甲素含量，发现不同地方分布、冬凌草不同部位冬凌草甲素含量都有较大的差别。说明冬凌草随着产地生态环境（海拔、水、土和气候条件等）的不同，其次生代谢成分的结构类型会有较大的变化。仅从化学成分差异去分析冬凌草的种质资源的分布规律和差异是远远不够的，尤其是在DNA分子标记发展迅速的情况下，可以深入到遗传分子层面去分析其遗传差异，并运用基因工程技术对其进行改造。如通过组织培养对优良的冬凌草进行人工栽培，能有效解决野生冬凌草的匮乏问题；研究冬凌草内二萜类主要成分冬凌草甲素的生物合成路径并克隆相关酶的基因，通过转基因技术改造出能合成更多冬凌草甲素的冬凌草。

4 冬凌草甲素及其抗癌活性

冬凌草甲素（Oridonin）属7，20-环氧型对映-贝壳杉烷类二萜化合物，为无色针状结晶，味道极苦，微溶于水，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂。冬凌草甲素有很高的抗癌活性，其抗癌活性是由于分子中α-亚甲基环戊酮部分结构，裂环或亚甲基饱和则作用消失[30，31]。冬凌草甲素分子式为C20H28O6，相对分子质量为364.43，熔点为248～250 ℃，分子结构见图2。

冬凌草甲素显著抑制人肺癌细胞系A549和PC-9细胞的体外增殖、黏附和侵袭，将细胞周期阻滞在G2/M期，促进E-cadherin的表达，下调CDK1、β-catenin等抗体的表达和NF-κB转录活性[33]。冬凌草甲素通过与受体结合或抑制肿瘤细胞的钠泵转运活性，从而抑制肿瘤细胞从周围环境中摄取营养物质，延缓肿瘤细胞的生长速度，使瘤体缩小甚至消失。冬凌草甲素还有抑制急性淋巴细胞白血病细胞系（CEM）的作用，通过破坏CEM的细胞膜和诱导其细胞凋亡，上调和下调与细胞凋亡相关的蛋白以发挥抗白血病作用[34]。冬凌草甲素目前在治疗肿瘤方面有很重要的作用，因此研究冬凌草甲素的生物合成路径及其相关基因的克隆，通过转基因技术改造其生物合成，以期得到含有大量冬凌草甲素的冬凌草是冬凌草研究的一个重要方向。

5 冬凌草甲素生物合成路径、二萜类合酶及其相关基因的克隆

冬凌草甲素通过甲羟戊酸途径（Mevalonic acid，MVA）和脱氧木酮糖-5-磷酸途径（Methyl-D-erythritol phosphate，MEP）形成异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate，IPP），以形成的IPP为前体物质形成脚6基脚6基焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP），再以GGPP为底物在二萜合酶的催化作用下形成二萜骨架或终产物（即贝壳杉烯化合物），然后通过细胞色素P450修饰底物结构[35]生成冬凌草甲素。图3为冬凌草甲素的生物合成路径[36，37]。

合成冬凌草甲素相关的酶有MVA途径的硫解酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶（HMGS）、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）、甲羟戊酸激酶（MK）、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶（MVAPP）；MEP途径的脱氧木酮糖-5-磷酸合酶、脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶（DXP synthase）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶、2-甲基赤藓糖-2，4-环二磷酸合酶、1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-二磷酸合酶、异戊烯基单磷酸激酶；通过MVA途径和MEP途径形成IPP，再由IPP通过一系列的反应合成贝壳杉烯化合物，这一过程需要的生物合酶有脚6基焦磷酸合成酶（Geranyl pyrophosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase，FDS）、脚6脚6基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl pyrophosphate synthase，GPS）、柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl diphosphate synthase，CDS）、贝壳杉烯合酶（Kaurene synthase，KS）等，最后通过细胞色素P450修饰底物结构生成最终的冬凌草甲素。虽然人们知道了冬凌草甲素的生物合成路径，但是目前未见到以冬凌草为材料研究合成冬凌草甲素的酶及其相关基因克隆的报道，上述基因在其他植物或微生物中已经被克隆出来，表2是目前对合成冬凌草甲素部分合酶及其相关基因在不同植物中的克隆情况。GenBank中并没有发现冬凌草中合成冬凌草甲素相关的酶基因，这无疑给冬凌草甲素的生物合成路径研究带来困难，在目前生物信息学等交叉学科的迅速发展下，冬凌草甲素的生物合成路径中酶基因的研究肯定会得到突破。

6 冬凌草的转录组研究

冬凌草转录组方面的研究很少，截至到2015年11月13日NCBI登录的冬凌草的基因序列只有61条。随着生物理论的发展，衍生出了很多的生物学研究方法，系统发生学、种群遗传学还有条形码的分类等，更进一步深化生物学的研究。夏至等[41]通过分子鉴定和亲缘关系研究的方法得出5条叶绿体基因序列、5条ITS片段序列。Yu等[42]通过研究唇形科香茶菜属的系统发生关系和生物地理学得到3条叶绿体基因序列、1条花序基因、1条ITS。Harris等[43]运用一种结合系统发生学和种群遗传学的方法研究得出对应的序列28条，微卫星标记得到微卫星序列11条[21]。陕西省微生物研究所的Li等上传18S基因3条。陈士林等上传叶绿体基因序列2条，1条ITS序列。2015年4月，来自河南大学的Zhu上传了冬凌草中1条乙酰辅酶a-C-乙酰转移酶基因完整序列，长度为1 254 bp，这也是目前已知的惟一冬凌草生物合酶基因。

二萜类作为冬凌草最主要的抗癌成分，特别是二萜类的冬凌草甲素，它们的生物合成途径倍受重视。二萜类的生物合成路径有很多种，二萜化合物生物合成途径中的相关酶，特别是二萜合酶成为近年来研究的热点，当然二萜合酶相关基因在其他植物中研究有许多，在冬凌草中的研究目前还没有。加拿大学者对包括冬凌草在内的低等到高等共10个含有二萜类化合物的植物进行454、Illumina转录组测序后进行二萜代谢路径中二萜合成酶和P450家族基因挖掘。在近1百万个萜类合成相关的转录本中发现了46个新的二萜合成酶和400个相关的P450基因[44]。冬凌草叶子的454、Illumina GA II、Illumina Hiseq2000这3个转录组的数据登录在NCBI，但是基因序列并没有注释。随着生物研究方法的不断丰富，如生物信息学的发展，冬凌草的研究除了以系统发生分类学和遗传多样性方面，还可以更深入地进行转录组序列分析，为冬凌草生物合成路径的研究奠定基础。

7 前景与展望

冬凌草作为天然药物在临床上的应用非常广泛，具有清热解毒、活血止痛之功效，现代研究证明还有抗肿瘤作用，具有很高的药用价值。对冬凌草的生物学特性、主要化学成分到分子生物学阶段的研究，无疑还存在许多方面的不足。通过对冬凌草遗传多样性和种质资源的研究，可以筛选出优良的种质资源，以便人工栽培。

目前研究最多的化学成分是冬凌草的二萜类，而来源于冬凌草中的二萜类往往含量低，且天然冬凌草资源有限，因此关于二萜类在生物体内的合成路径越来越受到人们的关注。冬凌草中的二萜类属于对映-贝壳杉烷类二萜化合物，其相对应的生物合成途径过程长而复杂，至今对于冬凌草二萜类合成路径的研究处于初级阶段。研究二萜类的合成相关基因和阐明其代谢途径将成为冬凌草也是大多数药用植物现代化研究的发展趋势之一。随着对冬凌草研究的不断深入，借助于代谢调控等生物工程手段，实现药用成分的人工介入生物生产是未来的发展方向之一。

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