时间：2022-09-24 01:35:17
一、试剂
单抗（抗vWFA3区）及SZ－34（抗vWFA2区）为本研究所研制；正常健康人全血由苏州大学附属第一医院和本研究所志愿者提供；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗人vWF抗体为；四甲基联苯胺（TMB）显色液为美国Thermo公司产品；乙酸为国产分析纯试剂。主要缓冲液：TBS缓冲液：；洗涤缓冲液：；包被缓冲液：碳酸盐缓冲液；封闭缓冲液：1％牛血清白蛋白（BSA）－TBS；样品稀释缓冲液：同封闭缓冲液；终止液：硫酸；均由本实验室制备。
二、方法
1．vWF胶原结合抑制实验乙酸酸化的人胎盘Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原浓度均为20μg／ml，以100μl／孔包被在96孔板上4℃过夜，经洗涤后，每孔用含10g／LBSA的TBS以200μl／孔封闭过夜。经TBS－0．1％Tween再次洗涤后，每孔分别加入正常人混合血浆50μl和SZ－12350μl共计100μl／孔，单抗SZ－123浓度依次倍比稀释，空白对照孔为100μl1％BSA－TBS。37℃孵育2h，用洗涤缓冲液洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人vWF抗体于37℃孵育2h，洗涤3次，用TMB显色10min，硫酸3mol／ml终止反应，酶标仪450nm检测。单抗SZ－34作阴性对照，方法同上。每次实验重复3次，取均值。2．平板流动小室内血小板黏附实验用75％酒精消毒载玻片，自然晾干，将100μg／ml乙酸酸化的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原分别包被在载玻片上，4℃过夜，经0．9％生理盐水洗涤后用2％BSA－PBS封闭过夜，经0．9％生理盐水洗涤后，备用。应用剪切力为1000s－1的FlowChamber实验，整个灌注过程均在37℃小室中进行，经肝素（40U／ml）抗凝的人全血2管，1管加单抗SZ－123，另1管为SZ－34阴性对照，均在37℃孵育10min，然后全血在包被有胶原的载玻片表面小室中灌注，将经血小板黏附的载玻片表面用生理盐水灌注2次后，在倒置显微镜下观察血小板的黏附情况。
三、平板流动小室内血小板黏附实验
在高条件下，SZ－123抑制人血小板在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原上的；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原表面血小板黏附率分别为90％、95％、60％，加有单抗SZ－123的全血血小板表面黏附率分别为11％、4％、28％。一讨论血栓形成过程中，血管内皮细胞受到损伤时内皮下胶原等细胞外基质暴露，与循环血液中vWF结合，使vWF构型发生改变，或者在高剪切力条件下vWF构型发生改变，暴露了血小板膜糖蛋白GPⅠb的结合位点，vWF在血小板和血管壁之间形成桥梁介导血小板黏附到受损的血管壁或病变的血管部位，使血小板黏附、聚集和活化，引起活化血小板释放进一步放大，最终引起血液的凝固和血栓的形成。胶原是激活血小板的重要物质，能诱导血小板呈不可逆聚集。在内皮损伤后，胶原首先激活血小板，从而启动凝血链锁反应产生凝血酶，血小板继续被活化，并不断释放出ADP和血栓素A2，导致血小板在局部不断地被激活。胶原与血小板之间的相互作用是保证血小板发生牢固黏附和聚集反应、并形成血小板血栓的关键步骤。vWF主要通过A1和A3区与血小板GPⅠb和胶原结合，A1区主要参与GPⅠb和Ⅳ型胶原的结合，A3区则主要参与Ⅰ、Ⅲ型胶原的结合，在不同情况下（如不同流体动力学或不同细胞外基质），A1和A3区将发挥不同程度的作用。我们之前报道了1株特异性针对vWFA3区的单抗SZ－123，该单抗不仅能抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合，还能抑制vWF与血小板的结合，这一结果提示vWFA3区胶原结合部位可能动态调节vWFA1区的功能。本研究的各型胶原结合抑制实验再次验证了这种猜测，SZ－123对A3区结合的Ⅰ、Ⅲ型胶原抑制率达到95％和96％，而对A1区结合的Ⅳ型胶原也有一定的抑制功能，且说明了单抗SZ－123对血管内皮下各型胶原均有抑制作用，验证了单抗SZ－123的抗血栓作用。血管损伤后，血管剪切力诱导vWF发生自发性聚集，并募集血液循环中的血小板，使血小板黏附于受损内皮下的胶原纤维中，从而启动血栓形成FlowChamber模拟了体内血管剪切力、温度等环境，通过这种方式来检验单抗SZ－123的抗血栓作用，证实SZ－123具有很好的抗血小板聚集功能。综上所述，本研究通过体外的胶原结合抑制实验及模拟体内血管环境的FlowChamber实验验证了SZ－123作为新一代抗血小板药物的效能，为SZ－123成为新一代的抗血小板药物临床使用提供更充分的实验数据支持。
作者：姚拾秀江淼赵益明单位：苏州大学