浅谈蛋白克隆的功能鉴定方法

一、CsupOBP1与不同气味化合物的结合能力

荧光探针1-NPN和CsupOBP1的结合曲线。荧光强度随加入1-NPN浓度的提高而增强，求得两者间的结合常数为10．93μmol/L。以1-NPN为探针，利用荧光竞争结合实验测定了38种不同化合物与CsupOBP1的结合能力(图5:B～H)。结果显示，在被测化合物中，只有β-紫罗兰酮与CsupOBP1的结合能力最强，结合常数达9．53μmol/L，其他化合物的结合能力均较差。其中，在测定CsupOBP1与烷烃类和脂肪酸类化合物的结合能力时，随配体浓度的提高荧光强度反而上升，表明CsupOBP1与脂肪酸无结合能力。

二、二化螟成虫对不同植物气味的触角电位反应

根据体外配体结合能力的测定结果，选取β-紫罗兰酮等4种与CsupOBP1具有较强结合能力的植物气味进行了触角电位反应测定。结果表明，雌雄成虫对被测气味［雄虫对(+)-雪松醇除外］均可产生显著的EAG反应。4种气味相比较，雄虫对β-紫罗兰酮产生的反应显著强于其他3种化合物，但在雌虫中4种气味间没有显著差异。另外，雄虫对β-紫罗兰酮的EAG反应明显强于雌虫的反应(5．86mV)，两者相差近1倍。

三、讨论

本研究从二化螟克隆了一个非典型的OBP基因CsupOBP1，同时也是在二化螟中发现的第一个Minus-COBP，说明了二化螟中OBP种类的多样性。系统进化分析表明，CsupOBP1和另外8个Minus-COBP形成一个独立的分支，它们分别来源于家蚕(5个)、棉铃虫(2个)和烟芽夜蛾(1个)。前人对不同昆虫基因组序列所含OBP的比较发现，Minus-COBP更多存在于较原始的昆虫中，而Plus-COBP则更多存在于进化的物种中，因此推测ClassicOBP(典型OBP)和Plus-COBP起源于。鉴于半胱氨酸(Cystein)位点间可以形成二硫键，且二硫键在高级结构及其稳定上起重要作用，OBP向着产生更多二硫键的方向进化，可能使OBP的结构更为复杂，以适应对特殊气味物质的嗅觉需求。组织表达谱分析及雌雄差异比较是了解基因功能的基本途经。利用RT-qPCR技术的测定结果表明，CsupOBP1在二化螟幼虫期的表达量远高于成虫期，表明该基因在幼虫期可能起到更为重要的作用;而在幼虫头部的表达量是其他部位的2倍以上，鉴于头部作为嗅觉和味觉的中心，暗示该基因在幼虫的嗅觉和味觉中起作用。类似地，家蚕OBP23基因在成虫期的表达量也明显低于幼虫期。在成虫期，CsupOBP1在足和翅的表达量最高。除触角外，很多昆虫的足和翅上也分布有一些味觉及嗅觉感器，行使特定的化感功能，如一些鳞翅目昆虫的前足跗节上着生有化感器，用于感受同种雌虫产卵时随卵一起分泌到叶片上的抑卵信息素，从而调节同种雌虫在不同的叶片(或部位)产卵，避免后代对食物的过度竞争。CsupOBP1在足和翅中的显著高表达，其功能值得进一步研究。此外，CsupOBP1在雄虫触角中也具有较高的表达，但雌虫触角的表达量却很低，这意味着CsupOBP1在雄蛾的嗅觉中可能起到更为重要的作用。为了进一步探讨CsupOBP1的嗅觉功能，我们利用原核表达系统和亲和层析法对其进行了大量表达和纯化，然后体外测定了CsupOBP1与包括常见植物气味在内的38种化合物的结合能力。在结合试验中，一般认为结合常数(Ki值)在10μmol/L以下时说明配体和蛋白有较好的结合能力。而本研究所测配体中，只有β-紫罗兰酮与CsupOBP1的结合能力低于这个标准。前人对棉铃虫2个的研究也发现，2个OBP在被测的85种化合物中均以与β-紫罗兰酮的结合能力最强，结合常数分别为。

四、结论

β-紫罗兰酮作为一种香味组分，广泛存在于包括水稻在内的很多植物的花和其他组织中，而昆虫常常利用一些香味物质对寄主植物进行定位综合组织表达谱及配体结合实验结果，我们推测CsupOBP1可能通过对植物气味(特别是β-紫罗兰酮)的感受，从而在二化螟幼虫及成虫对寄主植物或组织的嗅觉定向中起作用。本文以成虫触角进行的触角电位测定结果也与该推测一致，无论雌虫还是雄虫对β-紫罗兰酮等几种气味物质均可产生显著的触角电位反应，而且雄虫对β-紫罗兰酮的EAG反应显著强于其他3种气味物质;此外，雄虫对β-紫罗兰酮的EAG反应2倍于雌虫的反应，这与CsupOBP1在雄虫触角内的表达量显著高于雌虫触角的结果也是一致的，进一步说明CsupOBP1在雄蛾的嗅觉中可能起到更为重要的作用。最后要指出的是，本文通过组织表达特性、体外配体结合试验及触角电生理测定，均间接说明CsupOBP1在二化螟对寄主植物气味(特别是β-紫罗兰酮)的嗅觉中起作用，但确定性的结论有待利用基因沉默等技术进一步研究。

作者：贾洪芳单位：北京科技大学