烹饪原料中大豆卵磷脂的研究分析

摘 要：本文主要研究了超声波辅助法萃取大豆粉中的卵磷脂的工艺条件及HPLC-ELSD检测样品中卵磷脂的含量，确定最佳工艺条件。利用响应面分析法对超声波提取大豆卵磷脂的工艺进行优化。在单因素试验基础上，选择超声温度、超声时间、液料比和溶剂浓度为自变量，以大豆卵磷脂提取率为响应值，采用中心组合设计的方法，研究各自变量及其交互作用对卵磷脂提取率的影响。利用Design Expert 8.0.5.0分析确定最佳提取工艺，得出超声波提取大豆卵磷脂工艺的最佳条件为超声水浴温度50 ℃、液料比35:1 、超声功率100W 、超声时间50min。在此条件下，卵磷脂提取率为5.4mg/g。

关键词：卵磷脂；超声波提取；响应面分析；HPLC；检测

本实验以超声波辅助法萃取大豆粉中的卵磷脂，HPLC-ELSD检测大豆卵磷脂含量。通过单因素实验及在此基础上用Design Expert 8.0.5.0设计试验，分析确定最佳提取工艺，为工业化生产大豆卵磷脂提供参考数据。

1、材料与方法

1.1试验材料

大豆：品种为“千金豆”

大豆卵磷脂标准品：纯度99.99%，美国sigma公司

无水乙醇：北京化工厂

电热鼓风干燥箱：型号：DHG-9075A上海一恒科学仪器有限公司

高速万能粉碎机：功率460W天津市泰斯特仪器有限公司

分析天平：型号AL2041 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

超声波清洗机：型 号：KQ-500DE 超 声 功 率：500（W）

离心机：H-1850R长沙湘仪离心机仪器有限公司

超纯水机:AWL-1002-U 艾科浦高端超纯水专家公司

HPLC仪:日本津岛公司的LC-20A系统,配有ELSD检测器,SCL-10A系统控制器,

1.2试验方法

1.2.1萃取原理及工艺流程

超声波萃取原理：利用超声的空化效应、机械振动、热效应等多重作用,在流体内产生瞬间的高温高压场,对流体中的固体表面产生强大剪切力,加速天然活性成分的溶出和强化传质过程,从而能促进传质分离过程。 超声波提取工艺流程：40℃恒温干燥—粉碎—过筛—称量—加入乙醇—超声—静置—离心—微滤—超声脱气—冻存。

1.2.2实验设计

1.2.2.1单因素实验设计

表1 单因素实验设计

1.2.2.2 Design Expert 实验设计

根据单因素实验结果，Design-Expert 8.0.5.0分析软件的Box-Behnken设计试验，选择重要因素进行响应面优化试验设计，得出重要因素之间的交互作用及最佳工艺条件。

1.2.3 检测

优化检测条件，对标准样品和制备样品进行HPLC-ELSD 检测，制作校准曲线，得出制备样品中卵磷脂含量。

1.2.4 计算

卵磷脂得率=纯卵磷脂质量/大豆粉质量（mg/g）

2、实验过程及结果分析

2.1超声波辅助萃取卵磷脂

精确称取1.000g豆粉,装入50ml离心管中，按照实验设计加入乙醇，振荡混匀,在超声萃取条件下萃取一定时间。超声完毕后，在室温下静置冷却一定时间，离心5min后，制备样品液。

2.2样品液制备

用一次性注射器吸取离心管上清液，用0.45μm 的有机相过滤头过滤，注射到冻存管中，放入-18℃冰箱保存待用。

2.3标准液的配制

准确称取大豆卵磷脂标准品12.1 mg，置于10ml 的茶色容量瓶中，用色谱乙醇定容，配成卵磷脂含量 1.21 mg/mL 的大豆卵磷脂标准液，过0.45μm 的有机相过滤头，保存在冻存管中，-18 ℃保存待用。

2.4大豆卵磷脂检测

2.4.1 流动相的配制

准确量取异丙醇（色谱级）550ml，正己烷（色普级）280 ml， 过0.45 μm 的有机相滤膜，混合于一溶剂瓶中，超声20 min；在超纯水机上接取10ml电导率为 18 Ω·cm 的超纯水，置于溶剂瓶中，超声脱气20 min。

2.4.2色谱条件

正相高效液相色谱法:瑞典Kromasil silica 100-5色谱柱(250mm×4.6 mm ID, 5 μm填料粒度);V(异丙醇)/V(正己烷)/ V(水)=55/28/10体系为流动相,流速为0.8mL/min；柱温31℃。

蒸发光散色检测器（ELSD -3300）参数：空气流速 2 L/min；漂移管温度 60 ℃；增益 2。

2.4.3大豆卵磷脂检测及结果分析

2.4.3.1标准曲线的绘制

吸取2 ml的大豆卵磷脂标准液Ⅱ过 0.45μm 的有机相滤膜，置于干净冻存管中，准确吸取冻存管中的溶液1μL、2μL、6μL、8μL、10μL ，12μL分别进样，按色谱条件进样分析检测。以卵磷脂进样量的对数值为横坐标X，峰面积积分值的对数值为纵坐标Y，回归方程为：Y = 1.3986x +5.8943 (R2 = 0.9998)。

2.4.3.2重复性试验

准确吸取 10μL 标准溶液，按照色谱条件重复进样5次，按标准曲线计算卵磷脂的含量，并记录保留时间，进行统计分析，结果见表。保留时间及卵磷脂含量的RSD均在5%以下，表明本实验具有良好的重现性，色谱条件合理。

表2 高效液相色谱法测定卵磷脂的重复性结果

2.4.3.3稳定性试验

分别精确吸取10μL 卵磷脂标准液和卵磷脂样品液，按照色谱条件每 1 h 进样一次，共5次，分析测定卵磷脂的含量，结果见表，标准液与样品液中卵磷脂的含量的RSD均在5% 以下，表明卵磷脂在 5 h 内测定结果稳定。

表3 高校液相色谱法检测标准液和样品中卵磷脂的稳定性

2.4.3.4加标回收率试验

准确称取大豆粉1 g (卵磷脂含量6.2mg/g)，精确至0.001 g，准确加入卵磷脂标准溶液5ml(1.21mg/ml)，按样品液制备方法制备供试液，按色谱条件进样，重复测定 3次，计算样品加样回收率，计算结果显示，平均回收率是99.9967%，相对标准偏差RSD是0.027%。

2.5.单因素实验结果

分别对大豆粉目数，超声时间、超声功率、超声温度、静置时间以及萃取溶剂乙醇的浓度，固液比，超声次数这些因素进行单因素实验，结果如下：

2.5.1 大豆粉过筛目数对卵磷脂得率的影响

大豆粉越细，与溶剂乙醇接触面越大，卵磷脂萃取率越高。

2.5.2 超声功率对卵磷脂得率的影响

超声功率越大，对流体中的固体表面产生强大剪切力越大，有利于卵磷脂的萃取。在100%功率卵磷脂萃取率最高。所以选取萃取功率100%。

2.5.3 超声时间对卵磷脂得率的影响

超声时间越长，卵磷脂萃取率越大，但萃取时间过长，会浪费能源，影响经济效益，且在60min后卵磷脂得率增加趋势缓慢。综合考虑，以超声时间60min为最佳。

2.5.4 超声温度对卵磷脂得率的影响

卵磷脂的提取率随温度的升高而增加,50℃达到最大,然后逐渐下降 。一般情况下,温度升高,有利于提高溶质的传质速率,由于卵磷脂在乙醇中的溶解是放热过程,溶解度随温度的升高而减小。而且在高温下，卵磷脂易分解变质。所以综合这几方面的影响,萃取温度取40～60℃之间较为最佳。

2.5.5乙醇浓度对卵磷脂得率的影响

卵磷脂的得率在乙醇浓度为90%时达到最高点。分析原因可能是磷脂在水中易形成胶体，70%的乙醇中含有水量较多，导致被萃取物质结团，阻碍了溶质的传质，使卵磷脂无法被充分萃取出来。90%的乙醇，得率最高，分析其原因可能是卵磷脂是双亲物质，即亲水又亲油，少量的水有利于卵磷脂和乙醇充分接触，有利于传质,所以90%的乙醇萃取率最高，而100%反而下降。

2.6 Design Expert 实验设计及结果分析

2.6.1 Design Expert 实验设计

根据单因素实验结果，超声时间，超声温度，乙醇浓度，料液等对卵磷脂得率都有影响。考虑到这些因素对卵磷脂提取的综合影响，采用采用Box-Behnken设计方案，进一步优化超声波提取大豆卵磷脂工艺。根据Box-Behnken设计原理共设计27个试验处理组合，每个组合设3个平行样，分别测定大豆卵磷脂得率（R1），试验设计方案及结果见表2。

2.6.2拟合模型的建立及方差分析

应用Design-Expert 8.0.5.0软件对表2的试验结果进行多元回归拟合，获得卵磷脂得率（R1）对液料比（A），乙醇浓度（B）,和水浴温度（C）,时间（ D）4个自变量的二次多项式回归模型:

R1=5.07+0.32A+0.14B+0.17C-0.06D-0.20AB+0.088AC+0.11AD-0.020BC

+0.23BD-0.00325CD+0.016 A2-0.47B2 -0.96C2-0.54 D2 ，在试验范围内可用此模型来分析和预测超声波提取大豆卵磷脂工艺条件。

2.6.3验证试验

根据所得到的模型，应用Design-Expert8.0.5.0软件可以预测在稳定状态下的最优工艺条件是超声水浴温度51.37℃，萃取时间 81.31min，液料比 35:1（g/ml），乙醇浓度84.72%，萃取率可达到5.428mg/g..为检验预测结果是否与真实情况相一致，根据模型预测的最佳工艺条件进行近似试验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为超声水浴温度50℃、超声时间80 min，液料比35:1，乙醇浓度85%。提取率平均值为5.4mg/g.与预测值相差不大，且重复性好，说明优化结果可靠。

3、结果与讨论

本研究首先通过单因素试验分别考察大豆粉目数，超声时间、超声功率、超声温度、静置时间以及萃取溶剂乙醇的浓度，固液比和超声次数对卵磷脂提取量的影响，在此基础上，采用Design-Expert软件的中心组合设计方法设计四因素三水平实验响应面试验，建立了数学模型，高效液相色谱法检测卵磷脂含量，得到了较优的提取工艺条件，最后得到了卵磷脂的最佳提取工艺条件：萃取温度50℃，萃取时间80min，乙醇浓度85%，液料比35：1萃取率可达到5.4 mg/g. 采用超声波均质萃取法来提取大豆磷脂比传统溶剂萃取法传质速度快，萃取效率高，在工业化生产上有良好前景。

参考文献

[1]张秀青，于才渊，王大海。超声波辅助从浓缩磷脂中提取高纯粉状磷脂的研究