有氧运动和白藜芦醇对肥胖大鼠脂联素受体及下游信号通路的影响

摘要：为了探讨有氧运动和白藜芦醇对肥胖大鼠脂联素受体及下游信号通路的影响及机制，将40只大鼠分成5组，分别为普通对照组（C）、肥胖模型对照组（D）、肥胖运动组（E）、白藜芦醇对照组（F）、白藜芦醇运动组（G）；造模完成后，E和G组采用6周跑台训练，F和G组按照大鼠称重后40 mg/kg的白藜芦醇（Res）剂量进行6周灌胃。用ELISA法测得血清脂联素；RT-PCR方法测得AdipoR1、AdipoR2及PPARγ、AMPKα蛋白表达。结果发现：（1）血清脂联素水平模型组低于普通对照组，而模型组中白藜芦醇运动组最高；（2）脂联素受体1和2的蛋白表达，白藜芦醇运动组均高于其它各模型组；（3）普通对照组PPARγmRNA表达最高，而AMPKαmRNA表达白藜芦醇运动组最高；以上结果说明，本实验中通过运动和白藜芦醇联合干预，提高血清脂联素及受体的水平，从而降低TG、GLU等相关指标，脂联素受体激活下游信号通路蛋白AMPKαmRNA和PPARγmRNA，并使其表达增加，从而在一定程度上改善大鼠内脏脂肪细胞的紊乱，减少脂肪合成，增加血清TG清除，减少脂肪组织脂肪积聚，对改善大鼠肥胖起到了一定的作用。

关键词：运动生物化学；脂朕素受体；有氧运动；白藜芦醇；血清脂联素；大鼠

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-7116（2012）06-0139-06

肥胖症与高血压、高血脂、高血糖等心脑血管疾病密切相关，研究肥胖的发生及控制的理论与方法是目前亟待解决的问题。发生肥胖的原因众多，其中，高脂饮食和不正确的生活方式，是引起肥胖发生最主要的因素[1]。

脂联素作为近年来发现的一种由脂肪细胞分泌的特异性蛋白，可通过与靶细胞膜上的脂联素受体结合，激活下游信号通路，促进脂肪酸氧化和葡萄糖摄取，参与葡萄糖、脂肪代谢调节。近年来研究显示，运动和白藜芦醇单独干预均可提高脂联素及受体水平[2-3]，但通过双重干预的作用，对脂联素受体下游信号通路的研究尚未见到报道。本研究试图通过二者联合干预的共同作用，观察脂联素及受体下游信号通路蛋白表达的变化，探讨有氧运动和白藜芦醇联合干预的叠加作用，为更有效改善肥胖症提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物与动物分组

雄性SD大鼠40只（（190±5.0） g，购自广州中医药大学），适应性喂养1周后（环境温度20～25℃），随机分为5组每组8只：普通对照组（C）、肥胖模型对照组（D）、肥胖运动组（E）、白藜芦醇对照组（F）、白藜芦醇运动组（G）。普通对照组采用普通饲料喂养，其它各模型组均为高脂饲料喂养，自由饮食饮水。高脂饲料比例（质量比）：碳水化合物（60%）、蛋白质（20%）、脂肪（5%）。高脂喂养26周。分组时组间体重无显著性差异。

1.2 动物运动及灌胃方式

训练模型：Bedford等根据大鼠体重/摄氧量回归方程所建立的递增运动负荷训练大鼠模型[4]。正式训练前，大鼠进行适应性训练1周。正式训练开始，速度为运动强度65% VO2max，20～25 m/min；每天训练1 h，09：00～10：00训练，每周训练5 d。共6周。

给药时间和剂量：模型建立成功后，F组和G组每天08：00给药，每周7 d。大鼠称重后按照40 mg/kg剂量的白藜芦醇（Res）溶于1 mL的双蒸水中，形成混溶液后进行灌胃[5]。

1.3 动物组织取材

训练、灌药结束后取材，各组大鼠采用水合氯醛麻醉，取腹部正中线切口，迅速腹主动脉取血6～8 mL，采血后，快速取出腹部脂肪组织称量并记录，做好标记，立即将脂肪标本置于液氮中，然后放于-80 ℃的冰箱中保存。

1.4 血液指标的测定

将3 mL血置于EDTA抗凝管中，以4 000 r/min离心5 min分离血清，取2 mL置于EDTA抗凝管中。血脂、血糖、HDL（好胆固醇）、LDL（坏胆固醇）检测均采用暨南大学华侨医院全自动生化分析仪（HITACH公司7020全自动生化分析仪）进行测定。

血清脂联素的测定采用酶联免疫吸附法，具体步骤按试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）说明进行。其原理为双抗体夹心法，即用初抗包被，标准品或待测样品中的脂联素与其特异性结合，再加入标记的兔抗鼠脂联素抗体，它可与SA-HRP特异性结合。SA-HRP可催化底物显色，加入中止液，用酶标仪读取每孔的光密度值，样品中脂联素的浓度与其光密度值成正比关系。

1.5 RT-PCR法测定大鼠脂肪组织基因表达

用RT-PCR方法测定脂肪组织中AdipoR1、AdipoR2、AMPK、PPARγ的mRNA基因表达。（引物序列见表1）。

用Trizol试剂，采用一步法提取组织中总RNA，逆转录（RT）（按试剂盒说明书），然后进入PCR反应，PCR过程：30 μL PCR反应体系：15×PCR buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL、Taq酶0.4 μL、MgCl2 22 μL、ddH 2O 7.3 μL、引物各2 μL。PCR循环反应条件：AdipoR1和R2 94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；AMPKα、PPARγ 97 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50循环。结果用SMART VIEW ANALYSIS PROGRAM凝胶成像分析软件系统进行处理分析。

1.6 数据处理

所有数据以平均数±标准差（ ±s）表示，使用SPSS17.0软件包进行统计学处理，选用单因素方差分析，P

2 实验结果及分析

2.1 高脂模型的指标体系

大鼠跑台训练结束后，在最后一次训练结束后5 h内测定大鼠血清甘油三酯（TG）、血糖（GLU）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）。结果见表2。

从表1可以看到，D组的TG、GLU、LDL值都显著高于其他各组（P

2.2 六周训练期间大鼠体重变化

从图1中可见，肥胖大鼠模型建立成功后，进行6周训练和白藜芦醇干预，D组大鼠体重一直处于增长的态势且高于其它各组，差异具有非常显著性（P

从图2A中看到，C组血清脂联素质量浓度最高，F组低于E组，D组显著低于其它各组（P

2.4 各组大鼠脂肪组织PPARγmRNA表达的变化

图3中显示，D组PPARγmRNA低于其它各组，且差异有非常显著性（P

2.5 各组大鼠脂肪组织AMPKαmRNA表达

从图4中可以看出：D组低于其它各组且差异存在非常显著性（P

目前在研究肥胖的发病机制及治疗方案中，建立可靠的动物模型是非常关键的。鉴于高脂饮食是诱导肥胖发生最主要的因素，同时高脂饮食作为营养性肥胖造模最常用的方法，本实验通过20周的高脂饮食喂养，成功建立了营养性肥胖大鼠模型。为下一步实验工作提供了研究基础和平台。肥胖模型建立成功后，经过6周的跑台训练和白藜芦醇联合干预后，白藜芦醇运动组大鼠的TG、GLU、LDL明显降低，HDL增加，体重增加较肥胖模型组缓慢，表明有氧运动及白藜芦醇联合干预对减轻肥胖有一定效果，也印证了适宜运动和白藜芦醇可以改善肥胖的症状。

3.2 运动和白藜芦醇对脂联素及其受体的影响

脂联素是脂肪组织特异性分泌的一种脂肪细胞因子，它能够影响机体处理糖类和脂肪的能力。脂联素除了直接作用于外周组织，也通过作用于中枢神经系统来提高糖脂代谢，从而减轻体重，减少脂肪含量。脂联素作用的机制与其两个受体有关，即AdipoR1、AdipoR2[6]。脂联素受体在脂肪代谢、分化过程中具有重要作用。

本实验结果发现，肥胖模型组血清脂联素及其受体明显低于普通对照组，表明肥胖大鼠脂联素水平降低；脂联素水平与脂肪量成反比，脂联素降低是体脂增加的一个反馈抑制，这可能是肥胖进一步发展的因素之一。大量的研究表明通过运动可以提高脂联素及其受体水平[7-9]，本研究结果与前人研究一致，肥胖运动组血清脂联素及其受体表达提高，说明通过运动干预可上调脂联素水平，从而降低体脂，加速脂代谢水平，一定程度上改善机体肥胖。

白藜芦醇主要来源于葡萄、虎杖等植物，具有降血脂[10]、抗氧化[11]等作用。白藜芦醇可调节载脂蛋白，作为配体与相应受体结合，参与脂蛋白的代谢，促使体内脂代谢趋于正常，从而调节机体脂质与脂蛋白代谢紊乱，Leonor River a 等人检测到经白藜芦醇预处理后，肥胖Zuker大鼠内脏脂肪组织脂联素的含量明显增加，提示白藜芦醇对脂联素合成具有上调的作用[12]。本实验中单纯白藜芦醇干预组，脂联素水平及其受体表达均高于肥胖模型组，这可能是因为白藜芦醇激活了Sirt1，限制了机体摄入过多热量；Sirt1能通过激活转录因子（Foxo1）并调节转录因子（Foxo1）与C/EBP的相互作用，增加血清脂联素及其受体的表达。

研究发现通过有氧运动和白藜芦醇单独干预，均可提高肥胖大鼠脂联素及其受体的表达；本研究的重点在于观察二者的共同干预作用，结果发现白藜芦醇运动组脂联素及受体表达高于有氧运动组或白藜芦醇单独干预组，提示二者共同干预对脂联素及受体的表达具有叠加效应，这可能是在双重刺激下，脂联素受体下游信号通路蛋白增加，结合脂联素基因启动子上PPRE，增强脂联素基因启动子的活性，影响脂联素的表达和分泌。

3.3 运动和白藜芦醇对脂联素下游信号通路的影响

脂联素在靶细胞膜上与脂联素受体结合，可激活下游信号通路蛋白AMPK、PPAR等，从而参与对葡萄糖、脂肪代谢过程的调节。脂联素通过与受体结合刺激PPAR，使其活性提高，从而增加葡萄糖的摄取和脂肪酸氧化[13]。Tsuchida等[14]用脂联素作用C2C12细胞后发现PPAR配体活性提高，刺激了脂肪酸氧化，说明PPAR可能是脂联素传导信号通路中的一个重要信号分子。最新研究显示8周的运动训练能够上调骨骼肌中PPARγ表达，从而提高抗炎作用，有效抑制胆固醇的运输[15]。Yamauchi等[6]用脂联素作用C2C12肌细胞后，发现AMPK及Acc的磷酸化增加，当C2C12肌细胞AdipoR1表达提高后，上述效应更为明显，说明脂联素通过与受体结合，活化AMPK进而发挥生物学作用。长期运动可对AMPK活性反复刺激，在运动适应过程中提高骨骼肌安静状态AMPK的活性[16-18]。

本实验中通过6周运动发现，肥胖运动组较肥胖模型对照组PPARγ和AMPKα蛋白表达升高。有氧运动时机体动员脂肪供能占优势，释放FFA进入血液，氧化供能。另外，也动员和氧化脂肪组织内甘油三酯，使血液和细胞内FFA处于活跃的产生、利用的动态过程之中。许多脂肪酸是PPARγ的天然配体，因此推断运动通过对内源性配体的影响，激活PPARγ表达。同时运动上调脂联素受体与PPARγ和AMPKα结合刺激脂肪酸氧化，增加血清TG清除，减少脂肪组织脂肪积聚。

研究发现白藜芦醇是PPARγ的激活剂[19]。小鼠实验证明，白藜芦醇能够改善高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗[20]。李晓寒等研究发现高脂条件下，白藜芦醇能激活PPARγmRNA的表达从而抑制脂代谢紊乱。Jing Shang等发现白藜芦醇能促进AMPK磷酸化，从而表现出改善胰岛素抵抗的作用[21]。通过白藜芦醇改善高脂诱导的IR大鼠的研究，发现此过程与激活AMPK有关[22]。本研究中白藜芦醇组较肥胖模型对照组 PPARγ和AMPKα蛋白表达升高，这与脂联素及其受体升高进而激活下游通路AMPKα蛋白的表达有关，其机制可能是白藜芦醇通过激活SIRT1和PGC-1途径完成。白芦藜醇激活下游信号通路蛋白，在一定程度上提高糖代谢的水平同时减少脂质沉积。

本研究首次探讨运动训练和白藜芦醇共同干预对脂联素受体下游信号通路蛋白表达的影响。研究发现，6周跑台训练或白藜芦醇单独干预均能提高脂联素受体下游通路蛋白的表达，这对于改善大鼠肥胖具有重要意义。那么二者共同干预能否起到叠加效应呢？结果显示二者共同干预能够提高肥胖大鼠脂肪组织中脂联素受体下游蛋白表达，其中PPARγ蛋白表达量高于其它各模型组，但无显著性差异；而AMPKα蛋白表达显著高于其它各模型组。二者呈现出叠加效应。二者共同干预增加了PPARγ和AMPKα蛋白的表达，表明运动训练和白藜芦醇共同干预比单一因素干预，更有有效的激活了肥胖大鼠脂联素受体下游信号通路，使通路蛋白表达增加。

本研究通过运动和白藜芦醇联合干预动物试验，使脂联素及其受体水平升高，同时增加了下游信号通路中PPARγ和AMPKα蛋白表达。脂联素受体和下游蛋白相结合刺激脂肪酸氧化，在一定程度上改善大鼠内脏脂肪细胞的紊乱，减少脂肪合成，增加血清TG清除，减少脂肪组织脂肪积聚。因此，本研究认为有氧运动和白藜芦醇联合干预可能是一种改善肥胖症的理想方法。

参考文献：

[1] Bradley R L，Jeon J Y，Liu F F，et al. Voluntary exercise improves insulin sensitivity and adipose tissue inflammation in diet-induced obese mice[J]. Am J Phy-siol Endocrinol Metab，2008，295（3）：E586-594.

[2] Stumvoll M，Tschritter O，Fritsche A，et al. Asso-ciation and the TG polymorphism in adiponectin with obesity and insulin sensitivity：interaction with family of type 2 diabetes[J]. Diabetes，2002，51（1）：37-41.

[3] 王安平. 白藜芦醇对脂联素表达和多聚化的调控及机制研究[D]. 长沙：中南大学，2011.

[4] Bedford T G，Tipton C M，Wilson N C，et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J]. Appl Physiol，1979，47（6）：1278-1283.

[5] Gómez-Zorita S，Fernández-Quintela A，Macarulla M T，et al. Resveratrol attenuates steatosis in obese Zucker rats by decreasing fatty acid availability and re-ducing oxidative stress[J]. British Journal of Nutrition，2011，107（2）：202-210.

[6] Yamauchi T，Kamon J. Cloning of adiponectin re-ceptors that mediate anti diabetic metabolic effects[J]. Nature，2003，423（6941）：762-769.

[7] Bruun J M，Helge J W，Richelsen B，et al. Diet and exercise reduce low-grade inflammation and macro-phage in filtration in adipose tissue but not in skeletal muscle in severely obese subjects[J]. Am J Physiol En-docrinol Metab，2006，290（5）：E961-967.

[8] Miyazaki S，Izawa T，Ogasawara J E，et al. Effect of exercise training on adipocyte size dependent expres-sion of leptin and adiponectin[J]. Life Sci，2010，86（17-18）：691-698.

[9] Gollisch K S，Brandauer J，Jessen N，et al. Effects of exercise training on subcutaneous and visceral adipose tissue in normal- and high-fat diet-fed rats[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297（2）：E495-504.

[10] Baolin L，Inami Y，Tanaka H，et al. Resveratrol inhibits the release of mediators from bone mar-row-derived mouse mast cells invitro[J]. Planta Med，2004，70（4）：305-309.

[11] Cao Z，Li Y. Potent induction of cellular antioxi-dants and phase 2 enzymes by resveratrol in cardiomyo-cytes：protection against oxidative and electrophilic in-jury [J]. Eur J Pharmacol，2004，489（1-2）：39-48.

[12] Jones R G，Plas D R，KubekS，et al. AMP-activated protein kinase induces p53-dependent metabolic check point[J]. Cell，2005，18：283-293.

[13] 方彩华，李良鸣，周亮，等. 运动对脂联素水平影响研究进展[J]. 中国运动医学杂志，2009，28（2）：78-79.

[14] Tsuchida A，Yamauchi T，Takekawa S，et al. Pe-roxisome proliferators-activated receptor （PPAR）-α acti-vation increases adiponectin receptors and reduces obes-ity-related inflammation in adipose tissue：comparison of activation of PPAR-α，PPAR-γ，and their combina-tion[J]. Diabetes，2005，54（12）：3358-3370.

[15] Thomas A W，Davies N A，Moir H，et al. Exer-cise-associated generation of PPAR γ ligands activates PPAR γ signaling events and up regulate genes related to lipid metabolism[J]. Appl Physiol，2012，112（5）：806-815.

[16] Kim E K，Miller I，Aja S，et al. C75，a fatty ac-id synthase inhibitor，reduces food intake via hypotha-lamic AMP2 activated protein kinase[J]. J Biol Chem，2004，279（19）：19970-19976.

[17] Frosig C，Jorgensen，Hardie D G，et al. AMPK activated protein in kinas in activity and protein expres-sion are regulated by endure training in human skeletal muscle[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2004，286（3）：E411-417.

[18] Langford J，Viese M，Ploug T，et al. Time course of GLUT4 and AMPK protein expression in hum an skeletal muscle during one month of physical training[J]. Scand J Med Sci Sports，2003，13（3）：169-174.

[19] Scherer P E，Williams S，Fogliano M，et al. A novel serum protein similar to C1q，produced exclu-sively in adipocytes[J]. J Biol Chem，1995，270（45）：26746-26749.

[20] Toyama T，Nakamura H，Harano Y，et al. PPAR-α activate antioxidant enzymes and suppress he-patic fibrosis in rats[J]. Biochem Biophys Res Com-mun，2004，324（2）：697-704.

[21] Wolf A M，Wolf D，Avila M A，et al. Up-regulation of the anti-inflammatory adipokine adi-ponectin in acute liver failure in mice[J]. Hepatol，2006，44（3）：537-543.

[22] Tontonoz P，Hu E，Graves R A，et al. mPPAR gamma 2：tissue-specific regulator of an adipocyte en-hancer[J]. Genes Dev，1994，8（10）：1224-1234.