高效液相色谱—电雾式检测器同时测定猪、牛、羊、熊胆粉中5种胆汁酸的含量

摘要：建立了高效液相色谱电雾式检测器（HPLCCAD）同时测定猪、熊、牛、羊胆粉中5种胆汁酸的检测方法，优化了色谱条件，采用冰醋酸乙腈水（0.1∶30∶70， V/V）与乙腈梯度洗脱，使用Waters HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温35.0 ℃，流速0.3 mL/min，进样量10 μL。本方法对5种胆汁酸的定量限均为30 ng，检出限均为6 ng，线性范围均为0.6～300 mg/L，相关系数为0.9988～0.9994，加标回收率（n=6）为85.0%～97.1%，各胆粉样品经碱加热水解后测定各胆汁酸的含量，结果与文献报道一致。将本方法与高效液相色谱蒸发光散射检测器（HPLCELSD）法相比较，结果显示，CAD的灵敏度为ELSD的3.0倍，线性范围比ELSD高2个数量级，并且CAD的响应因子比ELSD更具有一致性。

关键词：高效液相色谱； 电雾式检测器； 蒸发光散射检测器； 胆粉； 胆汁酸

1引言

胆汁酸（Bile acid）是脂肪代谢的必需物质，常见的具有药物活性的胆汁酸有胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸，其中，熊去氧胆酸为熊胆所特有，并且被认为是这些胆汁酸中最有效的活性成分[1，2]，而猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸等均为替代品或人工合成熊去氧胆酸的原料[3]，因此，鉴别胆粉种属来源和测定各种胆汁酸含量十分必要[4]。目前，使用反相高效液相色谱法（RPHPLC）可以实现这些胆汁酸的定性和定量分析[5]。但由于胆汁酸是一类紫外吸收较弱的固醇类化合物，使用紫外检测器（UV）检测灵敏度很低[6]，目前大多采用蒸发光散射检测器（ELSD）检测[7]。

电雾式检测器（Charged Aerosol Detector，CAD）是一种通用型检测器[8]，对不同结构的化合物有统一的响应，已经被应用于检测脂类[9]、皂苷类[10]等弱紫外吸收的物质。本文使用HPLCCAD同时测定熊、猪、牛、羊胆粉中5种胆汁酸的含量，结果显示，本方法可用于测定各种胆汁酸的含量及鉴别胆粉的种属来源。将本方法与高效液相色谱蒸发光散射检测器（HPLCELSD）法相比较，CAD的灵敏度为ELSD的3.0倍，线性范围比ELSD高2个数量级，并且CAD的响应因子比ELSD更具有一致性。

2实验部分

2.1仪器和试剂

Ultimate 3000液相色谱（美国赛默飞世尔科技公司）配备Corona Ultra电雾式检测器及Chromeleon 7.1色谱工作站，Waters Acquity UPLC（美国沃特世公司）配备Acquity ELSD检测器及Empower 2.0色谱工作站，XS205D型分析天平（德国梅特勒托利多公司），DGG9023A型电热恒温箱（上海森信实验仪器有限公司）。胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸标准品、牛胆粉、羊胆粉、熊胆粉、猪胆粉（中国食品药品检定研究院）； 乙腈（色谱纯，美国Honeywell公司）， 冰醋酸、NaOH、HCl（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2.2标准溶液的配制

2.3样品前处理

3结果与讨论

3.1色谱条件优化

胆汁酸的极性较大，选择对极性化合物具有较强保留的Waters HSS T3色谱柱，使用梯度洗脱方式可以实现5种胆汁酸完全分离，且该色谱柱的柱流失较低，可以降低基线噪音，适用于通用型检测器ELSD和CAD（见图1）。胆汁酸为酸性化合物，使用0.1%冰醋酸作流动相可抑制胆汁酸电离，使其在反相色谱柱中获得更好的保留效果。该色谱条件与质谱兼容，对于复杂样品也可直接转移至质谱分析[12]。