现代生物技术的“筛选”问题/

筛选信息能力作为一种科学思维能力，可以大大提高学生分析和解决生物问题的能力。在高中生物学中“筛选”是培育生物新类型常用的手段，以下是在高中生物学习过程中常常遇到的有关“筛选”问题的归纳总结。

一、 微生物培养中的筛选问题

对于微生物来说，不同的微生物需要不同的培养基。培养基就是根据不同微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。从物理性质来讲，常用固体培养基通过平板划线分离法或稀释涂布分离法进行分离筛选目的菌种，如在以尿素为唯一氮源的固体培养基中，采用稀释涂布分离法可筛选出以尿素为唯一氮源的微生物；从目的用途上讲，常用选择培养基进行筛选目的菌种。选择培养基就是在培养基中加入某种化学物质，抑制不需要的微生物生长，以获得人们所需的微生物。如培养基中缺乏碳源可筛选出自养型微生物，培养基中缺乏氮源可筛选出自生固氮菌，培养基中加入高浓度食盐可筛选出金黄色葡萄球菌。利用微生物进行现酵生产，其首要任务就是通过上述方法从自然界中分离筛选出符合生产要求的单一优良野生菌种，然后再经过诱变育种、基因工程或细胞工程获得优良菌种。

二、基因工程中的筛选问题

基因工程的核心步骤是形成重组DNA，即用同一种限制酶处理目的基因和质粒，使其露出相同的粘性末端，然后在适量的DNA连接酶作用下，形成一个封闭式的环状DNA。这些环状DNA有两种是由一个DN段形成的，即目的基因环状物和质粒环状物；有三种是由两个DN段形成的，即质粒自连的环状物（即普通质粒）、目的基因自连的环状物、质粒与目的基因相连的环状物（即重组质粒或重组DNA）。

如何从这五种环状物中筛选出重组质粒，并将其导入到受体细胞呢？首先要选择质粒，选择的质粒应具备两种或两种以上抗生素抗性基因，如图1所示。然后将目的基因插入到其中的一个抗生素抗性基因，如将目的基因插入到四环素抗性基因（Tetr），导致Tetr结构破坏而无法表达。

在进行导入操作时，普通质粒和重组质粒都可能导入受体细胞，而目的基因自连的环状物无法导入，因此在导入操作后存在三种受体细胞的混合物：多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通受体细胞）、很少导入普通质粒的受体细胞（不含目的基因）和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。

第一次筛选：将含有三种受体细胞的混合物接种到含氨芐青霉素的选择培养基中培养，普通受体细胞不含氨芐青霉素抗性基因（Ampr）无法生存，而导入普通质粒和重组质粒的受体细胞都具有Ampr，所以都能生存和增殖，长成菌落。从而筛选出导入普通质粒和重组质粒的受体细胞。

第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，构成印章（即接种工具，图2和图3A所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图3B）；再把此印章在另一个含四环素抗性基因的选择培养基（图3D）的平板上印一下。这样，由于重组质粒的Tetr被目的基因破坏，不能形成菌落的即为含有重组质粒的受体细胞，根据对比（如图3C和3D所示），就能在母平板的培养基上筛选出含有目的基因的受体细胞。

三、细胞工程中的筛选问题

1. 植物体细胞杂交

在植物体细胞杂交过程中，将A和B两细胞去细胞壁后人工诱导原生质体融合形成融合体（AB），还有未融合体（A、B）、多元融合体（AA、BB）和嵌合体。但只有AB型细胞是植物体细胞杂交所需的杂种细胞。因此在杂种细胞形成后还应有一个筛选过程。筛选的方法有：（1）突变细胞系互补选择法：包括叶绿体缺失互补、营养缺陷互补、抗性互补和遗传互补等，前两种为隐性性状，其实施的关键是作为遗传标记的有关突变体的利用。遗传互补是一种很好的筛选方法， 即两个突变的细胞融合后才能正常生长，但由于受到突变体不易获得的限制，且有些突变体不易再生，该法应用并不广泛；（2）物理特异性差异选择法：利用两个原生质体亲本的物理特异性差异的选择，例如根据愈伤组织的颜色、荧光特性等在显微镜下机械分离杂种细胞。当以荧光特性作为依据时，可采用流式细胞光度仪来分离杂种细胞，该法不但准确、效率高，而且用荧光化合物标记原生质体并不影响细胞再生植株的能力，但价格昂贵；（3）生长特异性差异选择法：根据两种原生质体亲本的生长特异性（如形态、色泽）来选择；（4）不对称融合法：不对称融合指一方亲本的全部原生质体与另一方亲本的部分核物质及胞质重组，产生不对称杂种。一般用碘乙酰胺处理受体使其酶失活，单独培养不能生长和分裂；而供体由于受到射线辐射，大部分染色体受到损伤，细胞不能生长；只有融合体发生互补作用才能生长，从而筛选出杂种细胞。

融合后的原生质体，在适当的培养条件下，可以再生出新的细胞壁，进而进行细胞分裂及分化，形成再生植株。获得再生植株后， 还必须对其进行严格的鉴定，可以从基因组DNA和基因表达两方面来进一步确认。前者主要是利用各种已知的分子标记如限制性片段长度多态性、随机扩增多态性DNA、简单重复序列、扩增片段长度多态性等进行杂种鉴定， 后者主要是通过同工酶、次生代谢产物的分析来确定杂种植株。例如Austin等通过对再生植株苹果酸脱氢酶、磷酸葡糖异构酶等酶的同工酶进行分析获得了杂种植株。 此外，形态学（植株表现型）及细胞学（染色体的形态和数目）的观察和比较也是常用手段。

2. 单克隆抗体的制备

在单克隆抗体的制备过程中，首先用相应抗原刺激小鼠，当从小鼠脾脏中分离出能产生抗体的效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合时，将会形成多种细胞的混合体，包括B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、B－B融合细胞、骨髓瘤－骨髓瘤融合细胞、B－骨髓瘤融合细胞（即杂交瘤细胞）和细胞多聚体（容易死亡，无需筛选），如何从混合细胞中提取到杂交瘤细胞呢？

第一次筛选：目的是获得代谢缺陷型骨髓瘤细胞。通过突变诱导次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞，并经过毒性培养基筛选出的HGPRT-或TK-骨髓瘤细胞。具体方法是将诱导突变的骨髓瘤细胞放入含氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤的培养基上，含HGPRT的骨髓瘤细胞会将氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤转变成相应的核苷酸形式参与DNA合成而发生毒性作用，使细胞致死。而HGPRT-骨髓瘤细胞由于HGPRT活性丧失，不能使用含氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤，能生活在高浓度的含氮鸟嘌呤或6－硫代鸟嘌呤的培养基上。同理，在培养基中加入5－溴尿嘧啶脱氧核苷（BudR），可筛选出TK-骨髓瘤细胞。

第二次筛选（图4中A过程）：目的是从5种细胞中筛选出杂交瘤细胞（用HAT选择培养基）。HAT选择培养基是在普通培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物质配制而成。而细胞的DNA合成途径有两条：主要合成途径（D途径）是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为辅酶参与，而氨基蝶呤是叶酸的抑制物，可阻断细胞合成DNA。辅助途径（S途径）可直接利用外源核苷酸合成DNA，在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在情况下，经次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用下合成DNA。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞和融合的骨髓瘤－骨髓瘤细胞由于培养基中氨基蝶呤存在无法利用D途径合成DNA；又因缺乏HGPRT或TK，不能利用S途径合成DNA而死亡。未融合的B淋巴细胞和融合的B-B淋巴细胞虽具有HGPRT和TK，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有杂交瘤细胞从B淋巴细胞获得了HGPRT和TK，并具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，所以能在HAT培养基中存活和增殖，从而最终筛选出杂交瘤细胞。

第三次筛选（图4中B过程）：目的是获得产生特异性抗体的杂交瘤细胞。在实际免疫中，由于实验小鼠在注射目标抗原前，其体内已有大量病原体，会存在大量的针对不同类型抗原的效应B细胞，因此不同的杂交瘤细胞产生的抗体也不同。目前从杂交瘤细胞群中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞最常用的方法是有限稀释法，将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释后，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个杂交瘤细胞，再由这些单细胞克隆生长，当细胞培养形成群落到覆盖10%～20%孔底时，吸取培养液的上清液用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）测定，其原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在聚苯乙烯等固相载体上的可溶性抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。利用上述方法可筛选出针对目标抗原的抗体的阳性杂交瘤细胞，并使其扩大培养或冷冻保存。

四、胚胎工程中的筛选问题

随着生殖生物学领域的不断拓展，人类辅助生殖技术也相应得到了飞速的发展，自世界首例体外受精－胚胎移植（IVF－ET）婴儿诞生以来，该技术已开展了约三十年。尽管IVF－ET为众多不孕患者带来福音，但是其成功率仍然较低。大部分的胚胎死亡发生在移植前的早期胚胎培养阶段，仅有50％的体外培养胚胎能在第六天发育到囊胚阶段，移植后的胚胎发育为胎儿的比例也不足15％。为了提高妊娠率，将多个胚胎同时植入，却导致了多胎妊娠率的大幅升高。因此筛选出最具有发育潜能的早期优质胚胎进行移植是提高妊娠率、减少多胎妊娠的有效途径。

移植前进行遗传学筛查（PGS）作为一种低危险度的移植前遗传学诊断（PGD），是近十几年出现的以提高妊娠率、活产率为目的的早期产前诊断方法，适用于高龄妇女、反复种植失败、染色体结构异常的重复性流产等不孕不育夫妇，获得可接受的妊娠率。其通过对非整倍体（染色体数目发生异常）的筛选，选择染色体核型正常的胚胎进行移植。而胚胎的非整倍性是导致移植失败进而使IVF－ET成功率低的主要原因。PGS的具体做法是从IVF后的八细胞胚中取出1～2个卵裂球，用荧光原位细胞杂交融合（FISH）或PCR对这些细胞进行分析，确定有遗传缺陷的胚胎。只有那些通过PGD检查无遗传缺陷的胚胎才能植入子宫，这样就避免了妊娠终止。FISH可以对处于分裂间期或中期的完整细胞核中的特殊染色体进行检查，以鉴别胚胎的性别（这对于避免X染色体的伴性遗传疾病十分重要）、检查染色体的非整倍性（如Down氏综合征）和主要的染色体畸形（如染色体易位），而用PCR技术扩增特殊的基因序列可以对单个基因进行检查。尽管用于PGS的单细胞PCR诊断具有极高的敏感性，但其精确性和可靠性仍会受到扩增失败、污染和等位基因缺失等因素的影响，所以新的PCR方法正在被不断研究评估当中。■