提高霍乱弧菌检出率的几种方法探讨

【关键词】 霍乱弧菌;微量板培养法;VBNC状态

【中国分类号】 R 378. 3【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0491-01

多年来，国内、外对霍乱弧菌进行了大量研究，建立了许多有效的检测方法，其中传统细菌培养、生化检测、血清学分型及噬菌体分型、PCR等快速诊断方法己广泛应用于霍乱弧菌的检测及分型研究。随着霍乱防治中一些新问题的出现，如霍乱弧菌不同的生存状态及霍乱弧菌的变异等，PH值的下降，干扰物质组胺的形成，传统的方法已不能适应新的需求，对提高霍乱弧菌检出率几种方法探讨如下：

1. 四硼酸钠缓冲液的间接增菌法能有效控制增菌条件

哈尔滨市近些年曾出现三次霍乱疫情，并且每年对外环境及肠道门诊的腹泻病人进行霍乱弧菌监测，在对外环境监测时偶然可在江水检出霍乱弧菌。而海(水)产品按《霍乱防治手册》的检验方法一直未能检出本病原菌。这些疑点始终困扰着检测工作者，通过反复的实验，发现用碱性蛋白胨水洗出后直接增菌极不利于霍乱弧菌生长，甚至有一定的反作用，同时菌型易变异。针对这一特点我们对标本采用硼酸钠缓冲溶液洗脱溶解间接增菌的方法［1］，控制增菌条件，有效地解决直接增菌法的不足。

间接增菌法： 取搅碎组织检样20rnl 加入100 rn1四硼酸钠缓冲液。充分振摇，室温放置15-30 rnin 让其渣自然沉淀。吸取上清液10rnl 置另一灭菌试管中，加入5倍浓碱性蛋白胨水4-8rnl混匀，37℃ 经12 h培养后，分离于庆大霉素琼脂平板，挑选菌落，菌株鉴定按《霍乱防治手册》。

四硼酸钠的用量与PH值和物理状况有一定的互比关系。样品量和缓冲液量在l：5之间相对适宜；小于1：5时达不到控制该菌的生长条件，组织溶解物多；大于l：5时虽不影响生长条件，但稀释倍数过大会影响菌数含量，影响检验结果。

霍乱弧菌是一群嗜碱畏酸的菌群，海(水)产品标本中含有丰富的蛋白质和其它微生物，这些物质及培养基中的营养成分，通过37℃培养，蛋白质变性酸败，PH值迅速下降，产生大量的干扰物质组胺，不利于霍乱弧菌的生长，反而成了其它肠杆菌等杂菌生长的良好环境，从而严重地影响了阳性检出。间接增菌法最小检出为0. 01 cfu /g直接增菌法则是2. 1 cfu /g两法相比前法可提高检出敏感度和最小检出量5个对数以上。提高了方法的灵敏度及结果的准确性和可靠性。

2．缩短增菌时间和转种普通琼脂平板的快速方法

2.1 方法 取1m l 患者粪便或棉拭子接种于10ml 硷性蛋白胨水中, 置37℃作增菌培养。快速方法为增菌2 h后取表面生长物或菌膜转种普通琼脂平板，6 h后即可挑取可疑菌落进行鉴定。

2.2结果 此方法在10 h内可报出阳性结果, 常规方法则20 h报出阳性结果。

增菌2h 即可转种是由于: (1) 霍乱弧菌已被增殖数十倍, 足以转种。(2) 霍乱弧菌有耐硷性，而多数细菌在此环境中生长受到抑制, 早期转种,使用普通琼脂平板也能获得较纯的菌株。(3) 随着霍乱弧菌的生长, 使增菌液的PH 下降, 此时其它细菌开始生长。增菌时间越长, 杂菌的数目也越多, 给分离培养带来困难, 甚至造成潜漏检。

3. 霍乱弧菌微量板培养法［2］

3.1方法：打开袋装微板，观察孔内培养基颇色无异常变化、呈淡粉红色后，按待检标本依次编号，每孔接种一份样品，每块板可检测24份。取经碱性胨水37℃ 6-8 h增菌的待检标本培养物一环接种到孔内，轻轻划线分离，置入37℃孵箱培养过夜。

3.2结果以培养孔内有菌生长且培养基出现黄色变化的为疑似阳性，挑取孔内菌苔(落)少许，与霍乱弧菌01群多价及0139乱诊断血清做玻片凝集，凝集阳性即可报告初步结果，并将该孔培养物转种营养琼脂平板纯培养后，进一步做菌株鉴定和血清分型。凡是培养孔内无细菌生长无颇色变化或虽有细菌生长但培养孔内无颇色变化的，均可作为阴性报告。

该法与常规法相比有以下优点:灵敏度高，抗原凝集性好，培养板体积小、培养基量少(每孔仅用1m1),容量大(每板可做24份样品)，操作简便，不需要特殊设备，微量培养板消毒、清洗后，可回收再利用，在发生水污染及食物中毒，尤其象汶川发生大地震等突发事件中，工作量大尤为实用。

4. VBNC状态的霍乱弧菌的检测

霍乱弧菌进入VBNC状态后［3］，使用常规方法培养不出霍乱弧菌，但是可以通过一些抗体染色或核酸检测方法检测是否在样品中存在霍乱弧菌。

4.1直接或间接免疫荧光染色:霍乱弧菌进入VBNC状态后，其形态虽然有所变化，仍具有免疫原性，因此可以通过抗原抗体结合的方法，在一抗或二抗上标记荧光信号，通过荧光显微镜观察霍乱弧菌。常用的是直接免疫荧光染色。取5 ul菌液，均匀地涂抹在载玻片上，自然干燥后，乙醇固定。然后使用标记了异硫氰酸荧光素(FITC)的抗O1或抗O139的单克隆抗体结合10min PBS冲洗载玻片，自然干燥后滴加荧光封固剂，用荧光显微镜进行观察

4.2结果:具有生存能力的细菌可被染成绿色，死亡的细菌则被染成红色。此方法主要是判断细菌的细胞壁是否完整，从而判定细菌是否具有生存能力。荧光染料PI不能通过细菌的细胞壁进入细菌体内，因此，只有细胞壁有破损的细菌才能被PI染成红色。而荧光染料SYT09可以通过细胞壁进入细菌体内，将DNA染成绿色。

5．结束语

间接增菌法在四硼酸钠缓冲液的作用下，首先将组织中污染的霍乱弧菌等微生物洗出溶释，让其游离在特定的条件下，然后进行增菌。缓冲溶液维持了霍乱弧菌生长的良好环境，防止了干扰物的产生，抑制了其它杂菌的生长。在急性腹泻患者粪便培养霍乱弧菌的方法中采用缩短增菌时间和先转种普通琼脂平板来缩短培养时间, 同时保留传统的培养方法, 既可加快阳性结果的报出时间, 又保留传统的培养方法防止漏诊。众所共知，霍乱弧菌隐性感染者占绝大多数，为查明病因，开展疫源检索是流行病调查的必要手段，所以霍乱疫情现场疫源检索的样品数量往往较多，提高检测速度是微板法的主要特点之一。VBNC状态的提出，帮助我们了解了霍乱弧菌在环境中生存的一种特殊的生理状态，并通过特殊的实验技术，发现这种在形态上有所变化的霍乱弧菌，可以帮助我们判断样品所属水域是否存在潜在的公共卫生安全隐患。

参考文献

［1］ 陈国雄，陈德云等 海(水)产品中霍乱弧菌检验方法的研究 中国卫生检验杂志2007年2月第17卷

［2］ 刘捷，高涛，张明理等.霍乱弧菌微量培养法的实验研究［J］新疆霍乱防治研究专辑.2005.20(增刊):125- 127.

［3］ 徐潇、阔飘 疾病监测2010年3月第25卷第3期 活的非可培养状态霍乱弧菌研究进展