细胞培养范文

细胞培养范文第1篇

自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响

软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：

1.1转化生长因子beta(TGF-β)

TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。TGF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此，TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生长因子参与对细胞的调节作用［6］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-NingQi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF-β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。

体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IGFBP；(2)增加IGF受体的结合位点；(3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［11］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的合成有促进作用［12］。

1.2骨形态发生蛋白(BMP)

BMP是TGFβ的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员，其对无血清培养的高密度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提高mRNA和Ⅱ型胶原的合成能力。实验rhBMP(OP-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原而Ⅰ、Ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明OP-1对人软骨细胞特异性胶原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更显著［13］。在培养软骨细胞生长周期的不同时期，BMP的作用也不同，rhBMP调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14］。关节软骨细胞原代培养时表达了BMP-4功能性受体。1998年Rach1,venena等实验证明BMP2和维生素C共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时BMP-2独自干预下细胞凋亡明显少于维生素C的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。

1.3胰岛素样生长因子(IGFs)

IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由两种相关多肽组成即IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。在软骨细胞表面有IGF的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。IGF-Ⅰ能与软骨细胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内IGF-Ⅰ能促进骨骺软骨生长。而IGF-Ⅱ能刺激软骨细胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎细胞的生长。但IGF-Ⅰ对成年软骨细胞的作用强于IGF-Ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨细胞表面的IGF-Ⅱ的受体与IGF-Ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不同。而IGF结合蛋白(IGF1BPs)它通过特异性结合IGFs而起作用，尽管目前对IGFBPs的生理功能还不十分清楚，但它们对IGFs的调节作用是肯定的，它们通过结合IGFs减少了IGFs与其受体的相互作用，从而降低了IGFs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节IGFBPs的产生，IGFBPs反过来调节IGF的作用，同时表明IL-1α、TNF-α降低细胞对IGF-Ⅰ的反应性可能是通过增加IGFBPs而起作用。

1.4成纤维细胞生长因子(FGFs)

FGFs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成，而bFGF是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与IGF有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。

1.5白介素和肿瘤坏死因子(IL、TNF)

近来报道IL-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成同时IL-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。TNF是通过IL-1而抑制Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，但其作用远弱于IL-1。

2力学刺激对培养软骨细胞的影响

关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中Ⅱ型胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起重要作用，其中静压力刺激减少了Ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］实验表明持续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素mRNA的表达，改变了高尔基氏器的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4种物理特性发生变化；①静水压；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力促进基质降解而高频循环压力则促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重要调节者，但软骨细胞又如何接受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，整合素就在软骨细胞与胞外基质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、β)转膜糖蛋白特异性受体，力学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而影响着基因表达和调控细胞生长和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素合成也上调，力学刺激增加了α2整事素亚单位mRNA表达。实验表明在软骨细胞培养一周后，给予循环压力刺激15次/min，结果3h后，循环压力促进了Ⅱ型胶原和聚合素mRNA的表达，从而说明胞外基质调节整合素来应答力学刺激。α2β1整合素是Ⅱ型胶原受体。软骨基质受体作为一种应力感受器在软骨基质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质合成，而静压力则促进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学刺激、细胞外基质、整合素、细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。Takahaki-k［23］等实验证鞒咚降木菜褂盏糏L－6和TNF-αmRNA表达增加而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达，组织与细胞变形可兴奋ECM受体［24］细胞膜张力受体、细胞网架结构［25］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作用在有效范围内与压力值无关，而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压力抑制软骨细胞的合成代谢，一定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。

3其它因素对培养软骨细胞的影响

体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、PH细胞的接种密度、血清浓度、氧分压及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。Freed［27］等将软骨细胞移植于DGA、PLA进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩增了近8.3倍，且传代后细胞产生蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状，常利用胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、PGA、PLA等为附属物进行三维培养。也有学者认为无血清培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基PH值轻度偏碱不利于蛋白多糖的合成，偏酸则相反。低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年Baragi［29］等将IL-Rα和标记基因LacZ分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎软骨组织块一起培养，结果表明与IL-1Rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制IL-1β的作用而与LacZ细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨细胞从而维持其表型。

4结束语

体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况，但要维持其正常表型则受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞因子对体外培养软骨细胞的作用非单一的，而是一个复杂的网络调节作用，如生长因子的生物学活性是由受体介导的，生长因子在软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经过特异性的激活才能发挥作用。生长因子之间存在基因表达及其活性的相互调控TGF-β能促进PDGF的A链和B链的mRNA表达和分泌［30］。bFGF能促进TGF-βmRNA的表达，诱导间充质细胞分化成软骨细胞，增强TGF对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间还存在受体水平的调控，胰岛素不影响TGF-Ⅱ型受体的亲和力但增加了Ⅱ型受体的数目引起受体上调效应，从而Ⅱ型受体与Ⅰ型受体竞争，使胰岛素与Ⅰ型受体结合减少。IL-1可使TNF受体下调，而IFN-γ却使TNF受体上调等。但是网络生长因子如何调控体外培养软骨细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外基质还需进一步的研究。总之软骨细胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培养条件及其方式，细胞的微环境，PH值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。随着细胞生物学和分子生物学的发展，软骨细胞体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素会渐为人们所明晰，为组织工程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库(永生化软骨细胞)及揭示退变性骨关节病又开拓了一条新的途径。

参考文献：

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细胞培养范文第2篇

自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响

软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL-1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下：

1.1转化生长因子beta(TGF-β)

TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。TGF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了低亲和力受体表型(kd=appiox1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此，TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过不同的途径［4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶活性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分化调控生?ひ蜃硬斡攵韵赴牡鹘谧饔茫?］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号的应答过程中同样也有调节作用。Wen-NingQi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF-β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。

体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IGFBP；(2)增加IGF受体的结合位点；(3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［11］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的合成有促进作用［12］。

1.2骨形态发生蛋白(BMP)

BMP是TGFβ的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员，其对无血清培养的高密度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提高mRNA和Ⅱ型胶原的合成能力。实验rhBMP(OP-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原而Ⅰ、Ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明OP-1对人软骨细胞特异性胶原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更显著［13］。在培养软骨细胞生长周期的不同时期，BMP的作用也不同，rhBMP调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14］。关节软骨细胞原代培养时表达了BMP-4功能性受体。1998年Rach1,venena等实验证明BMP2和维生素C共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时BMP-2独自干预下细胞凋亡明显少于维生素C的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。

1.3胰岛素样生长因子(IGFs)

IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由两种相关多肽组成即IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。在软骨细胞表面有IGF的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。IGF-Ⅰ能与软骨细胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内IGF-Ⅰ能促进骨骺软骨生长。而IGF-Ⅱ能刺激软骨细胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎细胞的生长。但IGF-Ⅰ对成年软骨细胞的作用强于IGF-Ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨细胞表面的IGF-Ⅱ的受体与IGF-Ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不同。而IGF结合蛋白(IGF1BPs)它通过特异性结合IGFs而起作用，尽管目前对IGFBPs的生理功能还不十分清楚，但它们对IGFs的调节作用是肯定的，它们通过结合IGFs减少了IGFs与其受体的相互作用，从而降低了IGFs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节IGFBPs的产生，IGFBPs反过来调节IGF的作用，同时表明IL-1α、TNF-α降低细胞对IGF-Ⅰ的反应性可能是通过增加IGFBPs而起作用。

1.4成纤维细胞生长因子(FGFs)

FGFs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、成熟和胞外基质的合成，而bFGF是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与IGF有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。

1.5白介素和肿瘤坏死因子(IL、TNF)

近来报道IL-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成同时IL-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。TNF是通过IL-1而抑制Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，但其作用远弱于IL-1。

2力学刺激对培养软骨细胞的影响

关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中Ⅱ型胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起重要作用，其中静压力刺激减少了Ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］实验表明持续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素mRNA的表达，改变了高尔基氏器的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4种物理特性发生变化；①静水压；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力促进基质降解而高频循环压力则促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重要调节者，但软骨细胞又如何接受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，整合素就在软骨细胞与胞外基质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、β)转膜糖蛋白特异性受体，力学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而影响着基因表达和调控细胞生长和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素合成也上调，力学刺激增加了α2整事素亚单位mRNA表达。实验表明在软骨细胞培养一周后，给予循环压力刺激15次/min，结果3h后，循环压力促进了Ⅱ型胶原和聚合素mRNA的表达，从而说明胞外基质调节整合素来应答力学刺激。α2β1整合素是Ⅱ型胶原受体。软骨基质受体作为一种应力感受器在软骨基质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质合成，而静压力则促进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学刺激、细胞外基质、整合素、细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。Takahaki-k［23］等实验证鞒咚降木菜褂盏糏L－6和TNF-αmRNA表达增加而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达，组织与细胞变形可兴奋ECM受体［24］细胞膜张力受体、细胞网架结构［25］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作用在有效范围内与压力值无关，而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压力抑制软骨细胞的合成代谢，一定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。

3其它因素对培养软骨细胞的影响

体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、PH细胞的接种密度、血清浓度、氧分压及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。Freed［27］等将软骨细胞移植于DGA、PLA进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩增了近8.3倍，且传代后细胞产生蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状，常利用胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、PGA、PLA等为附属物进行三维培养。也有学者认为无血清培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基PH值轻度偏碱不利于蛋白多糖的合成，偏酸则相反。低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年Baragi［29］等将IL-Rα和标记基因LacZ分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎软骨组织块一起培养，结果表明与IL-1Rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制IL-1β的作用而与LacZ细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨细胞从而维持其表型。

4结束语

细胞培养范文第3篇

自从1965年chestman和smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来 ［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。 实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽 然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所 表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持 表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其 细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其 生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分 裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分 泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌 或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响

软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外 大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益 深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培 养研究又提出了一个新方向。近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化 等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细 胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基 质合成代谢的细胞因子有：igfs.tgf-βs.pdgf,fgf.egf，对软骨细胞有抑制作用的有il- 1、il-2、il-7、tnf-α、ifn-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下 ：

1.1转化生长因子beta(tgf-β)

tgf-β最初是由robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。t gf-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明tgf-βs具有促进软骨细胞增 殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。f.redni等实验证明培养兔关 节软骨细胞表达了不同的tgfβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在s期表现了 低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而go/g期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此 ， tgf-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明tgf-β更多的结合在go/g1 期比s期的同步化软骨细胞，从而说明tgf-βs对软骨细胞的作用是通过 不同的途径［ 4］。也有学者证明tgf-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重 作用，1-10ng/ml浓度的tgf-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的ⅱ型 胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/l浓度下，tgf-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶 活 性，减少软骨细胞ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明tgf-β可 抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。tgf-β可能与多种因素如胞外基质和其它分 化调控生长因子参与对细胞的调节作用［6］。tgf-β在细胞对其它各种分化信号 的应答过程中同样也有调节作用。wen-ning qi等实验证明ⅱ型胶原能特异的调节tgf- β刺激软骨细胞合成ⅱ型前胶原dna和蛋白多糖，同时说明ⅱ型胶原在tgf-β存在的条件下 调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此ⅱ型胶原基因表达的变化在 tgf存在条件下受ⅱ型胶原的调控［7，8］。

体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如tgf-βs、igfs、fgf、bmp、 il-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，tgf-β对igf的分泌作用有三种，(1)减少41kd的ig fbp；(2)增加igf受体的结合位点；(3)下调了诱导型igf-1受体的自身磷酸化［9］ ，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为tgf-β和igf可以使反分化 的软骨细胞再分化诱导和持久表达ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培 养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌il-1有关，而tgfβ可作为一种il-1的拮抗剂，减 少了il-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了il-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。tgfβ可能通过以下两种途径拮抗il-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制 剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的合成有促进作用［1 2］。

1.2骨形态发生蛋白(bmp)

bmp是tgfβ的超家族成员之一，bmp-7(op-1)是bmp家族中的一员，其对无血清培养的高密 度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提 高mrna和ⅱ型胶原的合成能力。实验rhbmp(op-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成 蛋白多糖和ⅱ型胶原而ⅰ、ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明op-1对人软骨细胞特异性胶 原、蛋白多糖的促合成作用比igf-ⅰ、tgf-β和激活素更显著［13］。在培养软 骨细胞生长周期的不同时期，bmp的作用也不同，rhbmp调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于 细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14 ］。关节软骨细胞原代培养时表达了bmp-4功能性受体。1998年rach1,venena等实 验证明bmp2和维生素c共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时bmp-2独自干预下 细胞凋亡明显少于维生素c的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数 量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为 肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。

1.3胰岛素样生长因子(igfs)

igf于1953年由salmon和danghaday研究表明，igfs家族由两种相关多肽组成即igf-ⅰ和igf -ⅱ。在软骨细胞表面有igf的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。igf-ⅰ能与软骨细 胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。igf-ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成ⅱ 型胶原和蛋白多糖，igf-ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内igf-ⅰ能促进骨 骺软骨生长。而igf-ⅱ能刺激软骨细胞dna和rna的合成且比igf-ⅰ更有效的刺激胚胎细 胞的生长。但igf-ⅰ对成年软骨细胞的作用强于igf-ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨 细胞表面的igf-ⅱ的受体与igf-ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不 同。而igf结合蛋白(igf1bps)它通过特异性结合igfs而起作用，尽管目前对igfbps的生理功 能还不十分清楚，但它们对igfs的调节作用是肯定的，它们通过结合igfs减少了igfs与其受 体的相互作用，从而降低了igfs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节igfbps的产 生，igfbps反过来调节igf的作用，同时表明il-1α、tnf-α降低细胞对igf-ⅰ的反应 性可能是通过增加igfbps而起作用。

1.4成纤维细胞生长因子(fgfs)

fgfs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中 广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、 成熟和胞外基质的合成，而bfgf是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨 细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与igf有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝 分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。

1.5白介素和肿瘤坏死因子(il、tnf)

近来报道il-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性ⅱ、ⅳ型胶 原的合成，而促进ⅰ、ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合 成同时il-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提 高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。tnf是通过il-1而抑制ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成 ，但其作用远弱于il-1。

2力学刺激对培养软骨细胞的影响

关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中ⅱ型 胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发 生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因 素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有ⅱ、ⅳ型胶原合成 减少，ⅰ、ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形 态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种 是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起 重要作用，其中静压力刺激减少了ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进ⅱ型 胶 原和蛋白多糖的合成［16，17］，k.koarninnta［18］实验表明持 续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素mrna的表达，改变了高尔基氏器 的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4种物理特性发生变化；①静水压 ；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力促进基质降解而高频循环压力则 促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重要调节者，但软骨细胞又如何接 受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，整合素就在软骨细胞与胞外基 质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、β)转膜糖蛋白特异性受体，力 学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而影响着基因表达和调控细胞生长 和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素合成也上调，力学刺激 增加了α2整事素亚单位mrna表达。实验表明在软骨细胞培养一周后，给予循环压力刺激 15次/min，结果3h后，循环压力促进了ⅱ型胶原和聚合素mrna的表达，从而说明胞外基 质 调节整合素来应答力学刺激。α2 β1整合素是ⅱ型胶原受体。软骨基质受体作为一 种 应力感受器在软骨基质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质 合成，而静压力则促进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学 刺激、细胞外基质、整合素、细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。taka haki-k［23］等实验证鞒?咚?降木菜?褂盏?l－6和tnf-α mrna表达增加 而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达， 组织与细胞变形可兴奋ecm受体［24］细胞膜张力受体、细胞网架结构［25 ］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作用在有效范围内与压力值无关， 而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压力抑制软骨细胞的合成代谢，一 定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。

3其它因素对培养软骨细胞的影响

体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的ⅱ、ⅳ型胶原合成减少，ⅰ、ⅲ 型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、ph细胞的接种密度、血清浓度、氧分压 及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。 体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。freed［27］等将软骨细胞移 植于dga、pla进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩增了近8.3倍，且传代后细 胞产生蛋白多糖和ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状，常利用 胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、pga、pla等为附属物进行三维培养。也有学者认为无血清 培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基ph值轻度偏碱不利于蛋白多糖的合成，偏酸则相反。 低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年baragi［29］等将il - rα和标记基因lacz分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎软骨组织块 一起培养，结果表明与il-1rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制il-1β的作用而与lacz 细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨细胞从而维 持其表型。

4结束语

体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况，但要维持其正常表型则 受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞因子对体外培养软骨细胞的作用非单一 的，而是一个复杂的网络调节作用，如生长因子的生物学活性是由受体介导的，生长因子在 软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经过特异性的激活才能发挥作用。生长因 子之间存在基因表达及其活性的相互调控tgf-β能促进pdgf的a链和b链的mrna表达和分泌 ［30］。bfgf能促进tgf-β mrna的表达，诱导间充质细胞分化成软骨细胞，增强 tgf对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间还存在受体水平的调控，胰岛素不 影响tgf-ⅱ型受体的亲和力但增加了ⅱ型受体的数目引起受体上调效应，从而ⅱ型受体与 ⅰ型受体竞争，使胰岛素与ⅰ型受体结合减少。il-1可使tnf受体下调，而ifn-γ却使tnf 受体上调等。但是网络生长因子如何调控体外培养软骨细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥 大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外基质还需进一步的研究。总之软骨细 胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培养条件及其方式，细胞的微环境，ph 值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。随着细胞生物学和分子生物学的发展，软骨细胞 体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素会渐为人们所明晰，为组织工 程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库(永生化软骨细胞)及揭示退变性 骨关节病又开拓了一条新的途径。

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细胞培养范文第4篇

【关键词】植物细胞 培养技术 研究发展

一、植物细胞培养发展简介

十九世纪九十年代，Haberlandt首先进行了植物细胞的培养；1939年， White， Nobecourt，Gau theret分别，提出非分化的植物细胞可以无限期地进行培养， 为植物细胞培养的发展奠定了基础。1942年，Gau theret发现植物细胞培养可产生次级代谢产物；1954年，Muir等第一次进行了植物细胞悬浮培养；自从1956年， Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来， 据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。

二、植物细胞培养技术

植物细胞的培养方法较复杂，根据培养对象可分为原生质体培养和单细胞培养；根据培养基的类型可分为固体培养和液体培养两大类；根据培养方式分为悬浮培养、平板培养、看护培养及固定化细胞培养等；根据培养规模大小可分为小规模培养和大批量培养。

（一）植物细胞培养的基本技术。

1.固体培养

固体培养是加入一定量凝固剂的液体培养基作为培养基的培养方式，其优点是简便，对实验设备要求简单，缺点是外植体或愈伤组织只有一部分表面能接触培养基，容易产生浓度差，影响其生长速度；同时固体培养基不利于气体交换和物质排泄，造成毒害；另外还有光线分布不均匀等缺点。

2.液体培养

液体培养是以配置的营养液作为培养基的培养方式，液体培养静止液体培养和震荡液体培养。液体培养弥补了固体培养的不足，但要求技术较高，成本较贵。

（二）单细胞培养技术。

1.看护培养技术

用一块愈伤组织来看护单细胞使之生长和增殖的方法称为看护培养。这种从单细胞起源的愈伤组织连同它衍生的培养物一起叫做一个单细胞无性系。此系统提供了一个单细胞系，它的生长因子是由愈伤组织和培养基提供的。

2.平板培养技术

平板培养是将一定密度的悬浮培养细胞接种到一薄层的固体培养基上进行培养的技术。由于平板培养具有筛选效率高、筛选量大、操作简单等优点，被广泛用于遗传变异、细胞分裂分化和细胞次生代谢物合成的种细胞筛选等各种需要获得单细胞克隆的研究。

3.微室培养技术

微室培养是将细胞培养在微量容器的少量培养基中，如凹穴载玻片上或多室培养盘内。优点是在培养过程中可连续进行显微观察以及多因子大量组合实验。但由于培养量少，水分难以保持，培养基的养分及P等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。

（三）植物细胞的大规模培养。

1.固定化培养技术

植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。是由Brodelius等人于1979年首次生产植物次生代谢物应用成功的。与悬浮培养相比，它具有提高反应效率、延续反应时间及保持产物生产的稳定性等特点。

2.两相培养技术

在培养体系中加入水溶性或脂溶性有机物或者具有吸附作用的多聚物使培养体系分为上下两相，细胞或组织在水中生长和合成次生代谢物质， 次生代谢物质分泌出后再转移到有机相中， 然后再从有机相分离植物次生代谢物的技术， 称为两相培养技术。其优点是由于产物的不断释放与回收，有可能真正实现植物细胞的连续培养，从而降低生产成本。

3.反义技术

根据碱基互补原理，人工合成或生物体合成特定互补DNA或RN段，抑制或封闭某些基因表达的技术， 通过此技术，可以将反义DNA或RN段导入植物细胞，使催化某一分支代谢的关键酶活性受抑制或加强， 从而提高目的物的含量， 同时抑制其他化合物合成。

4.冠瘿培养技术

利用根癌农杆菌感染植物可以将Ti质粒的T - DN段（含有诱导冠瘿组织发生的tms基因和tmr基因）整合进入植物细胞的基因组，诱导细胞冠瘿组织的发生。冠瘿组织离体培养具有激素自主性、增殖速率较快等特点，另外，次生代谢产物合成稳定性和能力较强，用来生产有用的次生代谢产物有良好的开发前景。

5.毛状根培养技术

毛状根是双子叶植物各器官受发根土壤杆菌（A grobacterium rhizogenes） 感染后产生的病态组织。感染过程中，发根农杆菌Ti质粒T - DNA转移并整合到植物基因组中。具有激素自养，增殖速度快，次级代谢产物含量高且稳定等特点。

6.添加诱导子或引导物技术

诱导子是一种能引起植物过敏反应的物质， 当它在与植物的相互作用时， 能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达， 进而活化特定次生代谢途径， 积累特定地目的次生代谢物， 从而提高植物次生代谢产物的产量。

7.两步培养技术

植物细胞生物量增长与代谢产物积累之间是不同步的，用同一种培养基同时达到细胞的最佳生长和最佳次级代谢产物的积累是不现实的，因此采用两步培养技术，即在不同阶段使用不同的培养基。在细胞的生长阶段使用生长培养基，促进生物量的增长，生产培养阶段使用生产培养基，促进产物的生成，从而达到提高产物产率的目的。

8.植物细胞悬浮培养生物反应器技术

植物细胞悬浮培养生物反应器技术是发酵技术在植物细胞大规模培养的应用。植物细胞培养对反应器的要求简单、坚固、价廉、多用途、操作稳定、维修更换附件方便之外，要求反应器在满足供氧的前提下，能为细胞的生长、次生代谢产物的合成提供一最佳的外部条件，即均一的反应体系、温和的流场、合适的细胞团太小以及分布。生物反应器技术具有很多优点： 工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便等。

9.三维细胞培养技术

三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞一载体复合物。目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中，涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少，但这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。

三、植物细胞培养存在的问题

（一）适用范围较窄。

许多的植物类型或基因型还不能按照人们的目的用现有的技术培养成功。甚至一些重要农作物的基本技术如棉花花药培养研究， 至今尚未取得突破。

（二）所建的技术体系稳定性差。

同一技术在不同实验室、不同的人操作， 甚至不同的批次之间都有差异， 难以推广应用。

（三）随机性太强。

由于组织细胞培养过程中一些作用机制还不太清楚， 当无性繁殖扩增保存材料时， 对无性系变异现象无法控制， 长期培养的材料往往会失去分化能力。而进行无性变异筛选时希望的变异个体又因变异率低而选不出。

参考文献：

[1]王海波，程奇.植物细胞工程的回顾与展望[J]，科技导报，1993，3.

[2]刘书志.植物细胞培养和植物细胞培养装置[J]，工业技术，2011，31.

[3]李晓惠，陈蕾.植物细胞培养技术的发展与应用[J]，安徽农学通报，2006，12.

[4]王亚珍.植物细胞培养研究的最新进展[J]，沈阳农业大学学报，1998，29.

细胞培养范文第5篇

关键词：植物；干细胞；培养；生长特性

中图分类号：R282.2／R282.71　文献标识码：A　文章编号：1672-979X(2012)01-0052-04

植物来源的天然产物作为先导化合物和药物的主要来源，曾在制药业的发展中发挥过非常重要的作用。近年其地位日渐衰落，主要是因天然植物生长缓慢、活性成分含量低，致使此类化合物的来源难以保障，难以适应现代制药业工业化大生产的需求。

鉴于天然化合物具有重要的药用潜力和经济价值，随着现代科学的发展，各领域的学者为解决其来源给出了自己的答案，较有成效的研究主要集中在以下几方面：(1)在微生物中表达天然产物的合成途径，采用转基因工程菌发酵方式生产某些活性成分，如紫杉醇等；(2)以容易获得的化工原料或天然前体为基础，半合成某些结构复杂的化合物，例如：青蒿素等；(3)植物组织培养，定向生产目标成分，如紫草素等。然而，由于很多天然产物化学结构非常复杂和独特，涉及的生物合成途径也非常多，例如紫杉醇(20步反应)、喜树碱(11步反应)、长春新碱(18步反应)等化合物的生物合成均涉及一系列繁杂的酶促反应，要化学合成需要多达数十步反应。这样的天然产物在很长一段时间内是难以依靠化学合成或者合成途径表达的方法实现原料供应的。而植物培养技术，以生源植物细胞或组织固有的生物合成途径为基础，利用内源的相关酶系统，结合诱导子和生物反应器技术，定向生产目标成分，经过多年研究，已经有成功工业化的案例(表1)。如日本Mitsui Petrochemical Industries采用人工培养紫草细胞方法获得紫草素，实现了该成分的工业化生产。所得的紫草素不仅用以生产抗炎药，制成唇膏，在本国高科技绿色产品的概念推动下，当年销售量达到200万支，获得了良好的市场效益。美国Phyton Biotech公司利用红豆杉细胞培养技术，结合大量的诱导子实验，创立了紫杉醇高产的方法，其专利中披露的最高产量达902 mg／L。该公司目前已经获得FDA批准，以此专利技术为施贵宝公司供应紫杉醇。

1.植物培养技术面临的挑战

尽管已有许多成功的案例，植物培养技术在适应工业化生产过程中，仍要面临着很多问题需要解决。(1)很多活性成分在生源植物中的分布，呈现组织特异性。某些特定的组织培养物(如：茎、根、芽、毛状根等)，可以表现出与生源植物类似的代谢产物谱，但脱分化细胞中的二次代谢产物丰度非常低，甚至根本没有。例如：喜树碱在脱分化细胞中含量非常低，或者根本检测不到，但在喜树的根培养物中，其含量则与原植物不相上下。与此类似的是，在黄花蒿的脱分化细胞中，也没能检测到其抗疟成分――青蒿素。虽然，培养特定组织容易获得较高产率，但是，该类培养物在常用的生物反应器中难以生长，甚至不能存活，需要开发定制特殊的反应器，难以适应现阶段工业化生产的需要。脱分化细胞在该方面具有明显的优势，能够很好的适应商业化生产的需要。因此，如何提高脱分化细胞中目标成分的含量及产量，已成为目前植物组织培养研究的热点。现阶段采用的方法有：细胞系优选、培养条件优化、诱导子的使用、前体饲喂、阶段培养、灌注培养、细胞固定化等。根据具体情况选择不同的方法，可以获得较理想的结果。(2)植物细胞长期培养时，由于细胞不均一、基因突变、环境因素影响等原因，其生理、生化以及遗传性状逐渐发生变化，成为其商业化的另一大障碍。含量低和易变性作为植物细胞培养商业化的两大阻碍。迄今的研究多集中在前者上，经过多年努力，已建立了一系列卓有成效的实验技术和解决方案。相对而言，控制可变性的研究尚处于较浅水平，鲜有确实可行的方法。近年，在长期培养的细胞系中，随着培养时间延长，代谢产物含量普遍降低，使研究者日益关注植物细胞培养中可变性的机制以及控制方法。由于植物的种间差异和多样性，使此问题异常复杂，传统的研究方法和角度难以对此问题做出全面解答。由韩国和英国学者开发的植物干细胞培养技术，利用干细胞生长和遗传特性方面的优势，为解决上述问题提供了一个全新的方案。

2.植物干细胞培养基本方法

2010年11月，韩国Unhwa公司和英国爱丁堡大学的研究者将以红豆杉干细胞培养为主体的研究成果，以“Cultured cambial meristematic cells as a source of plantnatural products”为题在Nature的子刊Nature Biotechnology上发表。该刊同期还发表了对此成果进行报道评论的综述“Plant natural products from cultured multipotentcells”。以红豆杉体系为代表的植物干细胞培养技术，吸引了全世界的关注。

植物干细胞培养技术，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。植物干细胞培养技术，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。

根据目标干细胞的不同，目前较为成功的植物干细胞培养方法主要有以下几种。

木本植物维管形成层分生(以红豆杉为例)：采取野生红豆杉的新生枝条，表面灭菌后切开；将含有形成层、韧皮部、皮质和表皮的组织轻轻地从木质部剥离；将获得的组织在分离培养基上培养30d后，新生的形成层细胞和其他脱分化细胞(愈伤组织)因组织现状的差异自然分离――形成层细胞为均一生长的平板状组织，愈伤组织则为不规则的聚集生长物；将获得形成层细胞转移到生长培养基上培养。目前报道该方法成功的案例仅限于红豆杉属。

草本植物储藏根的维管形成层(以人参为例)：取户外培育、平滑无伤口的人参，表面灭菌；将主根削成薄片，再切成长5～7 mm，宽5～7 mm，高2～5 mm，使每片都含有形成层；将制备好的外植体用蔗糖高渗透液处理，使分化的组织――皮层、韧皮部、木质部、髓部等失去活力，仅形成层能保留生命力；将渗透液处理过的的外植体转移到诱导培养基，培养3-7 d后，外植体的形成层变成淡黄色；再过7～14 d后，淡黄色部分有一圈细胞生长出；将外植体继代到生长培养基，培养10-20 d后，即可分离得形成层细胞，所得细胞继续在同样的培养基上培养。目前，仅有人参属确实报道成功建立了该类干细胞培养体系。

静止中心(以水稻为例)：将稻谷剥皮，表面灭菌，干燥至水分完全去除；将干种子种入培养基，25℃下培养5 d，使其发芽；种子发芽5-6 d后，收集含有静止中心的根组织，去掉根端的根冠，从切口开始截取1 mm长作为外植体；将外植体放入诱导培养基，30 d后观察到细胞被

诱导出：所得静止中心干细胞为白色，均一，且周围环绕着黏性物质(黏原蛋白)，而一般根组织得到的细胞不均一，黄色，无黏性物质，这些差异使干细胞可以和其它细胞自然分离；将分离得到的静止中心干细胞转移到生长培养基。目前，利用该方法可以获得水稻、玉米等植物的干细胞培养体系。

3.植物干细胞培养体系的特性研究

不同来源的植物干细胞培养体系，有着不同的生长特性(表2)，这些特性决定了其各自的用途。这些方法由韩国Unhwa公司开发，现已申请了一系列相关专利。

所有的研究中，考察红豆杉干细胞培养体系的生长特性最为深入和全面。在完成了培养体系的初步建立工作后，研究者首先考察了获得细胞的形态、遗传学特征和基因组学方面的考察，以验证培养的细胞确为维管形成层细胞。另一方面，对培养体系的生长特性进行了研究，主要考察了细胞生长速度、长期培养稳定性(时长22个月)以及对生物反应器的适应性，并与脱分化得到的愈伤组织进行对比。红豆杉干细胞培养体系不仅生长速度快，性状稳定，而且由于细胞具有游离生长、液泡分散的特性，培养体系对各种类型(气升式、搅拌桨式)、各种规格(3L、10L、20L、3吨)的生物反应器均具有良好的适应性，具备了商业化生产的基本条件。为开发培养体系的实用价值，研究者诱导了所得培养体系活性成分，使其中紫杉醇含量提高了数十倍，并进一步进行灌注培养，促使更多的紫杉醇分泌到培养基中[含量268 mg／kg(细胞鲜重)，分泌率74％]。此外，研究者还系列测试了红豆杉干细胞提取物的抗癌活性，在抑制HHC-95肺癌细胞、PC-3前列腺癌等瘤株的实验中，提取物均显示了可与紫杉醇媲美的抗癌效果(该实验所用的培养体系未经诱导，经检测基本不含紫杉醇)。以上工作，从各方面为该技术的商业化提供了有力的技术支持。

对于水稻等干细胞的研究，主要目的是建立植物细胞银行。建立细胞银行可使植物细胞采用类似动物细胞冻存一复苏的培养方法，彻底解决植物细胞培养过程中的变异问题。该策略虽简单可行，但是一般的植物细胞却难以在冻存后顺利复苏，其存活率非常低，且回复生长能力的延迟期漫长。因此，该方面的研究一直停滞不前。如表2所示，以上各种干细胞的一个共同特征就是可在冻存条件下保持良好的生命力，这使植物细胞银行的建立具备了良好的前提。此外，植物干细胞培养体系建立方法的多样性使该技术具有普遍推广的潜力，因而可以预见，植物细胞银行中能够容纳的植物种类将非常丰富。作者相信，随着植物细胞银行的建立，不仅可以为植物细胞培养的稳定性提供一个切实有效的解决方法，而且将在植物种质资源的保存方面发挥关键作用。

目前，人参干细胞的研究成果，主要用于保健品和化妆品的开发，除了相关专利和文章外，已有相关产品面世。相信在植物干细胞这个高科技和全天然概念推动下，该类产品将会很快地在高端市场占有一席之地。

4.植物干细胞培养体系的应用展望

植物干细胞培养的相关报道给植物培养研究带来了新的视角和方法，特别是为长期培养过程中细胞的稳定性和细胞长期保存等问题提供了很好的备选答案，但在目前有限的相关报道中，仍存在着一些不足和疑问。以报道最为充分的红豆杉系统为例，未经诱导的干细胞体系中，基本不含有紫杉醇，研究者需要经过诱导提高其含量。但是，诱导后的细胞是否仍保持着干细胞的特性，尚未进行过相关考察。再者，研究人员发现，经过22个月的培养，干细胞的生长速度和外观都保持着稳定，然而，没有文献表明长期培养细胞的显微形态、遗传学特征和基因组学等方面是否保持稳定。此外，课题的研究者采用自行诱导的愈伤组织作为对照体系，与干细胞进行生长率、稳定性、紫杉醇含量等多项指标对比，表现出干细胞的优越性。如前文所述，美国Phyton公司已经采用红豆杉愈伤组织成功地生产紫杉醇，并已获FDA批准作为施贵宝公司的紫杉醇供应商，其专利在细胞生长、代谢产物积累等方面均有系统研究，并取得了很好的效果。因此，Lee等所做的干细胞和脱分化细胞的性能对比，只能说明研究者所在实验室培养系统的优劣，尚不能真正说明干细胞培养与脱分化培养这两种技术的优势。

细胞培养范文第6篇

诱导多能干细胞只是干细胞的一种，但是，可以绕开使用胚胎干细胞的伦理限制，而且具有丰富的来源，因此被视为再生医学和器官移植的重要突破。此后，研究人员就希望能用诱导多能干细胞在实验室中培养和生成各种器官、组织和细胞，用以治疗更多疾病。现在，研究人员发现，诱导多能干细胞确实能培养并生成有生理功能的多种器官、组织和细胞。

诱导多能干细胞培育出肝脏

英国《自然》杂志2013年7月3日报道，日本横滨市立大学谷口英树研究小组与美国西奈山医学院研究人员合作，利用人类诱导多能干细胞培育出微小肝芽，然后移植到小鼠体内，结果这些肝芽成功生长成微型人类肝脏或称“迷你肝脏”，并像健康器官一样具有正常的肝功能。这是世界上首例用诱导多能干细胞培养的立体肝脏。在此之前，已经有研究小组能够用诱导多能干细胞培养出肝细胞，但是还不能培养出可以在人体内发挥功能的立体结构肝脏。

日本和美国研究人员利用人类诱导多能干细胞培养的肝脏从严格意义上来说还不是肝脏，但是可以看成是微小肝脏，它们的直径只有4毫米～5毫米，却表现出了肝脏的生物活性和生理功能。

研制的过程是，将人类皮肤细胞重编程为诱导多能干细胞，并且让其分化成表达肝脏基因的早期肝细胞。然后在培养基中加入从脐带血中提取的内皮细胞和制造骨骼、软骨和脂肪的间充质干细胞，内皮细胞的作用是指挥血管排列和生成。此后，这些细胞在培养基中自行成长为球状的细胞团，如同人类胚胎中肝脏最初的发育一样。两个月后，这些细胞团快速生长成直径为4毫米～5毫米的微小肝脏，研究人员再把这种微小肝脏移植到小鼠的皮肤下。此后，微小肝脏与小鼠的血管慢慢连接起来，最终发育成类似成体肝脏的器官。这种微小肝脏还接管了小鼠肝脏的一些正常的工作。

为了验证这种微小肝脏是否有生理功能，研究人员对小鼠注射了两种药物，以检查肝脏是否有代谢药物的功能。这两种药物是抗炎药酮洛芬和治疗高血压的药物异哇胍。结果发现，小鼠的血液中产生了通常来自人类肝脏的代谢产物而非小鼠肝脏的代谢产物。这说明移植进小鼠体内的微小肝脏发挥了作用。

同时，研究人员还做了一个对照研究，以检测微小肝脏是否有解毒功能，以便帮助肝功能衰竭的小鼠存活。实验用了两组小鼠，一组小鼠的每一只体内都植入了12个诱导多能干细胞培养的微小肝脏，另一组小鼠作为对照组，未植入微小肝脏。研究人员对两组小鼠都注射白喉毒素。结果，移植了微小肝脏的一组小鼠有近1/3存活超过了40天，而对照组小鼠在10天内都死亡了。

此外，研究还发现，诱导多能干细胞生成的微小肝脏能够分泌肝脏的特异性蛋白，也能清除血液中的毒素，并且产生人类特异性代谢物。诱导多能干细胞生成的微小肝脏最为重要的特点是，它很快就能与附近的血管融合，从而获得受体血液系统的支持。这是器官移植最重要的一步，因为有了受体血液系统的支持，而且不受到受体免疫系统的排斥，移植的器官就会持续生长，成为受体体内的一员。因此，尽管这种能首次连接到受体血液系统的具有复杂生理功能的器官还比较微小，但已经是再生医学的一个重要里程碑。

当然，未来如果能进一步表明诱导多能干细胞培养的微小肝脏移植进人体后不受人的免疫系统排斥，那么微小肝脏就可以移植给人体，至少可以取代成人30%的正常肝脏功能。这对于挽救肝功能衰竭的患者具有重要的意义。当然，如果诱导多能干细胞培养肝脏的技术进一步成熟和有效，则有可能培养出像成人肝脏那么大的肝脏，器官移植将会获得突破性进展，因为病人再也不用长时间等待供体器官了。但是，要达到这一步可能还要等上较长时间。

培育简单器官和组织更容易

由于肝脏具有较为复杂的多种生理功能，如解毒功能、代谢功能、分泌胆汁、免疫防御功能等，这就意味着用干细胞培育肝脏更具挑战性和复杂性。因此，在用干细胞培育较为简单的器官方面，应当更有收获。事实也完全证明了这一点。

现在，多个国家的研究人员已经能用诱导多能干细胞培育多种简单的器官，如血管、肌肉、毛囊等。

美国麻省总医院史迪尔肿瘤生物学实验室主任雷克思·杰恩等人利用人类诱导多能干细胞衍生的血管前体细胞，在小鼠身上培育成了有生理功能的血管，而且这些血管维持活性长达280天。

用人类诱导多能干细胞培育的血管主要可以用于治疗心血管病和糖尿病导致的血管损害。比如，糖尿病晚期常导致病人的大血管并发症，如动脉粥样硬化、冠状动脉狭窄（可导致冠心病甚至心肌梗塞）、供应大脑的血管狭窄（可导致脑缺血甚至脑梗塞）、供应下肢的血管狭窄（可导致下肢的疼痛和坏疽），这时就可以用再造血管的方法来治疗晚期糖尿病人。同时，还可以用新血管为新生组织提供血液供应。

过去的一些研究显示，利用人类诱导多能干细胞能生成构建血管所需的内皮细胞，但是，将这些细胞导入到小鼠身上却无法形成持久的血管。于是，麻省总医院的研究人员利用来自健康成人以及1型糖尿病病人的人类诱导多能干细胞，在小鼠大脑外表面和皮肤下生成了血管。研究小组采用了一种最初用于人类胚胎干细胞衍生内皮细胞的方法，以此来扩大和培养人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞群生成能够形成血管的内皮细胞。

随后，研究人员把这些内皮细胞与间充质前体细胞（可生成必要的结构细胞）一起移植到小鼠大脑的表面。在两周内，移植细胞形成了血液灌注的血管网络，它们与邻近的天然血管一样发挥了功能，并在小鼠体内持续发挥功能长达9个月。此外，研究人员也用同样的方法在小鼠皮肤下移植内皮细胞与间充质前体细胞，结果也生成了功能性的血管。但是，在皮肤下的移植需要移植更多的细胞，约为移植到大脑的5倍以上，并且生成的血管的寿命比在大脑生成的血管寿命短。

这项研究还表明，来自健康人的细胞和患1型糖尿病患者的人类诱导多能干细胞衍生的内皮细胞都可以生成能长期维持功能的血管。但是，不同的人类诱导多能干细胞和包括来自同一患者的不同细胞系在生成血管的潜力上有差异，因此，还需要更深入地了解干细胞生成血管的更多机理，而且需要找到更好的方法来操控生成特定器官所需的特异内皮细胞类型。

当然，由人类诱导多能干细胞生成的血管是否能应用于糖尿病病人，还需要在安全性和实用性方面进行更深入的研究，但毕竟这项研究已经让人们看到了一些希望。

另一方面，用干细胞培养成熟的心肌也有了新的突破。过去，在培养基中培养的心肌细胞并不像人体心肌细胞那样具有生理功能，例如传导生物电信号和收缩。为了解决这些问题，美国杜克大学生物医学工程系的尼纳德·伯萨克等人采取了一种新的方法来培育心肌，即用胚胎干细胞来培养心肌。胚胎干细胞不同于诱导多能干细胞，可能会受到伦理制约，而且所能获得的胚胎干细胞也有限，当然其全能分化和生长的效果优于诱导多能干细胞。

研究人员在实验室中把人胚胎干细胞分化得到的心肌细胞放入三维水凝胶中。此后，心肌细胞自行组装成心肌束，形成了纤维细胞在外、内皮细胞穿插其中的三维结构。而且，这种组织并非是心肌细胞的堆积，而是一块8毫米×8毫米的心肌组织，并且达到了与体内心肌细胞类似的功能指标。通过注入不同的药物可以检测心肌电传导性能的变化和检测药物对心肌收缩能力的影响。由此证明，这种由胚胎干细胞培养的心肌组织不仅可以传导生物电流，而且可以自主搏动。

研究人员认为，这种心肌组织的结构和功能都超过了以前的人工心肌，也是迄今为止和人体组织最接近的人造心肌薄片。虽然这是依靠胚胎干细胞培养的，但是，通过仔细总结培养的机理，未来可以通过提取心脏病人的皮肤细胞以获取诱导多能干细胞，再由后者来培养特异的心肌组织或心脏，如此，则可以修补病人的坏死心肌，或者直接为病人移植用其自身的皮肤细胞培养的心脏。

培育血细胞

诱导多能干细胞还能培育更多的血细胞，以用于输血、诊断和治疗疾病。

人的血液由血浆和血细胞组成。血浆相当于结缔组织的细胞间质，为浅黄色半透明液体，其中除含有大量水分以外，还有无机盐、纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、酶、激素、各种营养物质、代谢产物等。血细胞则分为红细胞、白细胞、血小板。人的血细胞总是在不断地新陈代谢。红细胞的平均寿命约120天，有粒白细胞和血小板的生存期限一般不超过10天。淋巴细胞的生存期长短不等，从几个小时到几年。一般而言，血细胞及血小板来自造血器官，红细胞、有粒白细胞及血小板由红骨髓产生，无粒白细胞则由淋巴结和脾脏产生。但是，由于疾病和造血功能异常会导致一些血液方面的疾病，如贫血。

贫血是指人体外周血液中红细胞容量减少并低于正常范围下限的一种疾病，但是由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白（Hb）浓度来代替。在中国一般把成年男性Hb

因此，贫血的根本原因是红细胞减少，因而导致血红蛋白减少，血液携氧供氧能力下降，这就会对全身造成不同程度的影响。例如，造成神经系统的损害，表现为头昏、耳鸣、头痛、失眠、多梦、记忆力减退、注意力不集中等；贫血更影响呼吸循环系统，表现为气急或呼吸困难，并且有心悸、心律失常和心功能不全；贫血也影响消化系统，因为贫血时消化腺分泌减少甚至腺体萎缩，进而导致消化功能降低、消化不良，出现腹部胀满、食欲减低、大便规律和性状的改变等。

长期以来，治疗慢性贫血的效果并不如意。研究人员也在寻找新的方法，例如输血和单独输入红细胞。但是，输血和输入红细胞也可能发生排异反应和输血反应，甚至染上其他传染性疾病。如果能用病人的皮肤细胞产生诱导多能干细胞，再由后者生成红细胞，就可以把红细胞输入病人体内，治疗贫血。

现在，美国波士顿大学医学院的乔治·墨菲与波士顿大学公共健康学院的戴维·希尔领导的研究团队采用一种新的方法，对诱导多能干细胞进行分化，在试管内制造出了大量的人类红细胞和血小板。这些红细胞有望用于治疗贫血和诊断疟疾、镰状细胞贫血，而血小板则可用来检查心血管病和治疗凝血障碍。

研究人员先是从波士顿大学再生医学中心的诱导多能干细胞库获得人类诱导多能干细胞，然后让这些细胞接触生长因子，随后添加了用来调节芳香烃受体（AhR）通路的化合物。以前的研究表明，这一通路会通过芳香烃受体与环境中的有毒物质相互作用来促进癌细胞发育。但是，使用这种新方法可以使功能性红细胞和血小板的产量在短时间内大量增加。

细胞培养范文第7篇

[关键词]动物细胞培养　动物血清

动物细胞培养培养基中要加入动物血清,而其在培养过程中究竟起什么作用,一直是高中教学的疑点。为了解决这个问题通过查阅相关资料从血清的成分出发得出以下结论。

一、血清及其成分

血清是血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出,放人试管中,不加抗凝剂,则凝血反应被激活,血液迅速凝固,形成胶冻。凝血块收缩,其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清,也可于凝血后经离心取得。从成分上看动物血清的成分主要包括:水90.7血清白蛋白4.4血清球蛋白2.1氨基酸氮0.005尿素氮0.012其他非蛋白氮0.025葡萄糖0.08乳糖0.025各种脂肪酸0.38脂肪0.14卵磷脂0.2胆固醇O,22钠离子0.38钾离子0.02钙离子0.01镁离子0.0035亚铁离子0.0001氯离子0.36磷酸氢根离子0.01硫酸根离子0.001碳酸氢根离子0.17DPG SGOT各种激素酶碱基各种氨基酸(以上数据均为百分比)。从成分上看血清在动物细胞培养中的作用是很复杂的。

二、各成分的功能

1　可以起到营养物质的作用

动物在代谢的过程中所需的营养包括水、无机盐、维生素、糖类、脂肪、氨基酸和纤维素等。这些成分动物血清都可以提供给体外培养的动物细胞,但这些营养物质(除水以外)的含量在动物血清中所占的比例很少,而且主要的营养物质在动物细胞培养基的配制中已经添加了。所以,从这些角度看动物细胞培养加入的动物血清虽然能起到为培养的动物细胞提供营养物质的作用,但这并不是主要的作用。

2　可以起到调节的作用

动物细胞的代谢离不开调节。在动物体内有两种调节方式来维持动物代谢的稳定,而细胞本身的代谢调节中激素调节的作用很关键。血清中提供了适量且比例适中的各种各样的激素来保证动物细胞离体后的正常代谢。

3　可以为动物细胞提供必需物质

在微生物的培养中要为培养的微生物提供生长因子。同样动物细胞代谢过程中有很多物质是动物细胞所必需而自身无法合成的的,例如碱基、维生素、氨基酸等微量物质,它们的作用非常重要,细胞需要它们合成核酸和蛋白质,缺乏-要导致细胞生长不良甚至死亡;提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力;,提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物。这些物质都存在于血清中,如果在配制培养基的时候一项项添加是非常麻烦的。所以加入动物血清类似微生物培养中的天然培养基的做法,简单方便、效果好。

4　可以为离体的动物细胞提供能量及解毒功能

血清中存在大量的糖类、脂类物质,这些物质可以为动物细胞提供大量的能量。有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用。

5　是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源

动物细胞培养的一个很重要的用途就是用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养,可以获得大量自身的皮肤细胞,为大面积烧伤的病人移植。人工皮肤的制备需要培养的细胞贴附在薄膜上形成皮肤组织,血清就为这个过程提供所需因子。

6　起酸碱度缓冲液作用

在动物血清中存在丰富的无机盐,还具有很多缓冲物质,在培养基的酸碱度发生变化时起到缓冲作用。

7　提供蛋白酶抑制剂

使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。

总之,动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能,更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等,这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10%～20%)。

参考文献

[1]王玢,左明雪等

人体及动物生理学(第二版)

北京:高等教育出版社、2008

[2]现代汉语词典(第五版),中国科学院语言研究所词典鳊辑室编

细胞培养范文第8篇

关键词：腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜

腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善[1]。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关，其中腹膜间皮细胞的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素[2]。因此，建立人腹膜间皮细胞培养体系，为体外研究人腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。

早在20世纪80年代初，Wu等[3]通过直接从患者腹水中获取腹膜间皮细胞的方法，成功地培养出人腹膜间皮细胞。此后Kern[4]和Stylianou[5]等分别采用胶原酶消化组织法和直接种植法，培养出人腹膜间皮细胞，Stylianou并完整地阐述了人腹膜间皮细胞的鉴定方法。虽然目前人腹膜间皮细胞培养方法很多，但由于培养人腹膜间皮细胞的条件苛刻且易受成纤维细胞污染等原因，要获得大量、高纯度的人腹膜间皮细胞仍为实验研究中的难题。我们综合文献方法并加以改进，建立了人腹膜间皮细胞体外培养方法。

1材料与方法

1.1取材

无菌取自江苏省中医院普外科、肛肠科腹部手术切除的大网膜。

1.2主要仪器设备

眼科剪、镊，培养皿，50mL培养瓶，吸管，10mL尖底离心管，CO2培养箱，超净台，离心机，倒置相差显微镜，100目不锈钢筛，0.22滤膜过滤器。

1.3主要试剂

1.3.1PBS液氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.56g，磷酸二氢钾0.2g溶于1000mL三蒸水中，过滤灭菌分装，室温保存。

1.3.21640培养基InvitrogenCorporation公司产品，按说明配制，并使其含有青链霉素各100U/mL，小牛血清20%。

1.3.3细胞消化液胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）2.5g，EDTA二钠盐0.16g溶于1000mLPBS液中，过滤除菌，分装于小瓶内，-20℃保存。

1.3.4免疫组化抗体波形蛋白抗体，第8因子抗体，CD45抗体均为福建迈新公司产品。

1.4腹膜间皮细胞的原代培养

无菌摘取腹部手术切除的大网膜，剪取血管脂肪相对少的网膜组织，大小约3cm×3cm，将剪取的网膜组织置于含500U/mL青霉素和500L/mL链霉素的无菌生理盐水中浸泡20min，然后用生理盐水流动冲洗5min，将漂洗后的网膜组织平铺于无菌培养皿内，再用PBS反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的网膜组织剪成1cm×1cm大小，加入0.2%胰蛋白酶-0.02%EDTA细胞消化液20mL，用吸管反复吹打均匀，装于50mL培养瓶内，放置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱内消化25min，每5min振摇1次，最后5min保持静止。消化结束后将消化液用100目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含20%体积分数的胎牛血清的RPMI-1640完全培养液终止消化。用移液器分装于10mL尖底离心管，1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于50mL培养瓶，放置于37℃，5%CO2培养箱内培养。

1.5腹膜间皮细胞的传代培养

原代细胞培养24h后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内一半的陈旧培养液，此后每3d全换液1次。约培养5~8d细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS漂洗2次，每瓶加入完全消化液2mL，在37℃，5%CO2培养箱内消化15min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入4mL完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内1000r/min，离心10min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，传代于6孔板（将盖玻片裁成4片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡5~10min，取出，在干燥箱内60℃烘干1h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于6孔板内，每孔3片）内，加入适量完全培养液。继续在37℃，5%CO2，湿度95%的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。

1.6腹膜间皮细胞的鉴定

1.6.1免疫组化鉴定①吸去6孔板内培养液，PBS（pH7.2~7.4）洗2次，每次3min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗2遍，随即放入10%中尔马林固定30min；蒸馏水洗4次，每次3min。②加入0.1%TritonX100（PBSpH7.4配制），室温10min，PBS洗3次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45无须修复，波形蛋白和第8因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育60minBPS洗3次每次5min，去除PBS。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂A，室温下20min，PBS洗3次，每次3min。每张盖玻片滴加50LElivision试剂盒中的试剂B，室温下30min，BPS洗4次，每次5min）。④DAB显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的DAB显色溶液，在显微镜下观察3~10min；自来水洗5min，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过70%、80%、90%、95%酒精各1次，100%酒精2次，每次1min；透明，过二甲苯溶液3次，每次3min。⑥封片，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。自然通风干燥。普通光学显微镜观察，拍照。

1.6.2扫描电镜鉴定①细胞准备：同间皮细胞传代，取出细胞爬片浸入PBS中漂洗细胞表面；②固定：将细胞爬片放入青霉素小瓶中，加入4℃预冷的3%的戊二醛，4℃过夜。吸出固定液，用PBS浸洗2次，每次10min。再加入4℃预冷的1%的四氧化锇，在4℃固定1h。PBS浸洗2次，每次10min。③脱水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐级脱水，各10min。④置换：将样品放入醋酸异戊醋:丙酮=l:1的混合液中10min，然后放入醋酸异戊酯中2次，各10min；⑤临界点干燥：预冷临界点干燥室的样品室，使其温度降到0℃，将玻片放入样品篮，样品篮的上下两面事先铺好滤纸，在保证细胞被醋酸异戊醋浸润的情况下，将样品篮放入样品室。拧紧室盖，充入液态CO2，同时缓慢排出CO2气体，反复3次，使液态CO2置换出细胞中的醋酸异戊醋，加热样品室，使CO2达到临界状态。缓慢的排出CO2，待样品室压力降为零，取出样品。⑥离子溅射镀膜：从样品篮中取出玻片，用银胶将干燥样品粘到样品托上。

导电胶干燥后，将样品托放入离子溅射仪的真空罩内，抽真空。当真空度达0.1托后，加高压1000V，离子溅射镀膜。⑦电镜观察：启动扫描电镜，安装样品，观察细胞表面结构，拍照。

1.6.3透射电镜鉴定①消化间皮细胞，1000r/min，离心5min，3%戊二醛固定，PBS洗涤2次，每次20min；②1%锇酸固定30min，PBS浸洗2次，每次10min；③脱水：用30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精逐级脱水，各10min；④100%丙酮固定10min；Epon812浸泡、包埋；⑤LKB-V型超薄切片机切片（70m）；H-600透射电镜（日本）下观察、拍片。

2结果

刚从大网膜消化下来的间皮细胞在倒置显微镜下为葡萄串状，50%的间皮细胞大约24h左右贴壁，个别细胞伸展。72h所有贴壁细胞均伸展，呈多形性（梭形、椭圆形、多角形等），边缘不整，细胞呈现拉网状生长，与相邻的细胞相互连接。以后细胞拉网生长现象减少，生长融合呈多角形，大小较为一致，似铺路鹅卵石样外观。细胞经传代培养后，2~4代细胞的形态与生长方式与原代细胞基本无异。5代开始间皮细胞增殖明显缓慢。

2.1免疫组化鉴定

光镜下观察所培养细胞的波形蛋白染色为阳性，是间皮细胞的特征。波形蛋白抗原阳性，CD45、第8因子抗原阴性可排除成纤维细胞、血管内皮细胞和白细胞。

2.2超微结构

扫描电镜下细胞完全铺展，与周围对比不强烈。细胞呈椭圆形或多角形，胞核圆形，位于细胞中央、较小，有核处细胞隆起较厚。细胞表面大量密集的微绒毛，细胞周围高密度的绒毛在背景中形成高密度的晕圈。透射电镜检查：细胞表面存在大量多少不等的微绒毛，细胞浆内丰富的内质网和线粒体，未见Weibelpalade小体。

3讨论

间皮细胞培养中要注意以下几点：①正确确定首次换液时间，避免换液过早，首次换液越晚越好，最好第3天进行，动作轻柔，减少振荡。原代培养头3天尽量勿动培养液，以免干扰间皮细胞贴壁，换液越早丢失的间皮细胞数目越多；②胰蛋白酶消化后，消化液中的间皮细胞不要，因为最先消化下来的往往是活力不好的细胞。终止消化后用培养液吹打下来的细胞活力好，生长快；③注入培养瓶中的间皮细胞要具备一定细胞密度，不要太稀。生长良好的细胞可提供“化学信使”去促进其它细胞生长，因此细胞密集时它们彼此能提供和接受该“化学信使”越长越好；假若过稀，则可因缺乏该化学信使而停止生长、死亡。此外，腹膜供体的年龄越年轻越好。

虽然目前国内、外的文献已介绍了多种间皮细胞的培养方法，但这些培养方法均较为复杂且重复性不高，不能满足科学研究的需要。本实验所建立的体外人腹膜间皮细胞培养模型，操作简单，培养迅速，4~7d即可传代，可重复性强。

【参考文献】

〔1〕MillerG,BomanJ,ShrierI,etal.Naturalhistoryofpatientswithadhesivesmallbowelobstruction〔J〕.BrJSurg,2000,87:1240

细胞培养范文第9篇

植物组织培养在农业生产中的应用、动物细胞培养的过程及影响因素一直是高考命题的热点。命题会利用信息材料为背景以图解的形式考查有关植物组织培养的相关知识，或结合植物育种、动物细胞培养等知识进行综合考查。

二、复习建议

本部分题目中常出现操作流程图或装置图，如植物组织培养的操作流程图、动物细胞培养过程图等，复习过程中要注意运用列表比较的方法分析不同技术手段的异同点，注意掌握各种技术手段中的特殊点和关键环节；要善于识别这些图解，要知道图中所表示的物质、结构和过程，知道每个环节的操作要点，并对一些现象进行正确分析。

三、知识梳理

（一）植物组织培养

1.原理：植物细胞具有全能性。

2.过程。

3.植物组织培养过程的几点说明。

（1）外植体的选择与制备。

①选择外植体时，由于外植体的脱分化难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而有很大差异，因此，选择哪些作为外植体应注意。一般来讲，烟草、胡萝卜、植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶和成熟的老组织则较难。

②制备外植体首先要消毒，其次要选取有形成层（形成层细胞易脱分化）的部分。

（2）严格的无菌条件。

植物组织培养用的培养基含有植物生长发育所需要的各种营养物质，这些营养物质同样为细菌等微小的生物提供了适合的营养。在这种培养基上，细菌等微小的生物比植物细胞具有更强的新陈代谢能力，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此，植物组织培养要想取得成功，必须有效地防止细菌等的污染，保证培养材料、培养基、培养用具严格无菌。

（3）完全的营养条件。

离体的植物细胞失去了植物的自养能力，所以需要为其提供包括水、有机营养、矿质营养、维生素等营养物质。

（4）光照条件。

离体的植物细胞、组织和器官脱分化形成愈伤组织时，需避光处理；而愈伤组织再分化形成植物幼苗时，需光照处理。

（5）激素调控。

①生长素类含量＞细胞分裂素类含量：诱导植物组织脱分化和根原基形成。

②生长素类含量＜细胞分裂素类含量：诱导愈伤组织再分化和芽原基形成。

③赤霉素类：促进分化的丛芽和小植株快速生长。

【易混警示】分化、脱分化、再分化。

比较内容脱分化再分化分化过程外植体愈伤组织愈伤组织幼苗形成体

特点排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞有根、芽需要条件a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例适中；d.不需光a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例高（或低）诱导生根（或生芽）；d.光照在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生差异的过程，具有普遍性、持久性、稳定性和不可逆性；分化的结果是形成不同的组织器官，帮助个体完成正常的生长发育4.植物组织培养技术的应用。

（1）植物繁殖的新途径。

①微型繁殖。

实质植物组织培养原理植物细胞的全能性条件培养基中加入细胞生命活动所需的水、矿质元素和小分子有机物，还有激素，更重要的是所有加入的物质必须是无菌的，操作过程必须是在无菌条件下操作，这样繁殖的幼苗才是无毒的微型繁殖

技术的

优点a.能保持亲本的一切优良性状，子代个体具有的遗传物质与亲本一样

b.选材少，培养周期短，繁殖率高

c.不受自然生长季节的限制，便于自动化管理，有利于进行工厂化培养范围作物脱毒，人工种子中的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽的获得采用的技术均是微型繁殖②作物脱毒：a.解决方法：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。b.理论基础：植物分生区附近病毒极少，甚至无病毒。c.特点：繁殖速度快；幼苗遗传背景均一；不受季节和地区限制。

③人工种子（如下图）。

人工种子主要由三部分组成:

a.胚状体(分生组织),它相当于天然种子的胚,是有生命的物质结构；

b.供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的“人工胚乳”；

c.具有保护作用的“人工种皮”。

【特别提醒】人工种皮是保证包裹在其中的胚状体顺利生长发育成小植株的关键部分，针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。

（2）作物新品种的培育。

①单倍体育种：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。

a.原理：整个单倍体育种过程的原理是染色体变异，其中的花药离体培养是利用细胞的全能性。

b.过程：通过花药离体培养获得单倍体植株，染色体加倍后当年可得到稳定遗传的优良品种，极大地缩短了育种年限。如下图：

花药离体培养单倍体幼苗种水仙素诱导染色体数目加倍纯合子

②突变体的利用。

a.来源：植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断分生状态，容易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变，从这些突变的个体中可以筛选出对人们有用的个体，培育新品种。如下图：

b.实质：植物组织培养。

c.形成原因:培养细胞一直处于不断分生的状态，容易受外界一些条件的影响而发生突变。

③细胞产物的工厂化生产：可以利用植物组织培养技术大量生产某些细胞产物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。

【易混警示】单倍体育种和突变体利用的比较。

项目原理优点成果单倍体

育种染色体变异明显缩短育种年限单育1号烟草品种，11号水稻和京花1号小麦品种等突变体

利用基因突变产生新基因，大幅度改良某些性状抗花叶病毒的甘蔗；抗盐碱的野生烟草等（二）动物细胞培养

1．概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。

2．操作流程。

3.过程解读。

（1）原理：细胞增殖。

(2)动物细胞培养的条件。

①充足的营养供给――微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。

②适宜的温度、适宜的pH。

③气体环境：O2、CO2。

④无菌、无毒环境培养液和培养用具杀菌消毒

培养过程加抗生素杀菌

定期更换培养液，清除代谢产物

（3）动物细胞要分散成单个细胞培养的原因：分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。

（4）选取幼龄动物的组织、器官作为材料的原因：动物细胞培养时，一般选取幼龄动物的组织、器官，其细胞的分化程度较低,增殖能力强,有丝分裂旺盛，容易培养。

（5）胰蛋白酶在培养过程中的作用及与原代培养和传代培养的联系。

原代培养和传代培养一般均需对细胞进行胰蛋白酶细胞分散处理，区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。

①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，分散后培养，即为原代培养。

②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，分散到多个培养瓶中继续培养，即为传代培养。

（6）细胞贴壁和接触抑制。

悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

4.植物组织培养与动物细胞培养的比较。

比较项目植物组织培养动物细胞培养培养基的物

理性质固体培养基液体培养基(合成培养基)原理细胞的全能性细胞的增殖培养的成分水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果新的植株或组织新的细胞系或细胞株目的①苗木的快速繁殖；②培养无病毒植株；③生产药物、香料等；④制备人工种子；⑤单倍体育种获得细胞或细胞的产物（如单克隆抗体）取材植物细嫩的部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织其他条件均为无菌操作，需要适宜的温度、pH、O2等条件【特别提醒】①两种技术手段培养过程中都进行了有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂。

②植物组织培养最终产生新个体，体现了细胞的全能性；动物细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，故不能体现细胞的全能性。

【易混警示】原代培养和传代培养的辨析。

原代培养传代培养可有两种表述：a.细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养同样有两种表述：a.细胞悬液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养四、典例展示

例1.通过植物组织培养技术可以快速繁殖、生产药物及培育无病毒的植物等。据图甲、表乙回答问题。

离体的植物器官、组织或细胞①愈伤组织②胚状体培养植物体

图甲植物组织培养过程

表乙：植物的花芽分别在含有不同比例的生长素和细胞分裂素的培养基中的生长状况

A组B组C组D组E组生长素03ppm3ppm0.03ppm0细胞分裂素00.2ppm0.002ppm1.0ppm0.2ppm花芽生

长状况仍是组

织切块形成愈

伤组织愈伤组织

分化出根愈伤组织分

化出嫩芽稍生长(1)离体的植物器官、组织或细胞能够被培养成新的植物体的原因是。

(2)用植物组织培养方法诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状体结构，若包裹上人造种皮，制成人工种子，可能解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是图甲中［］和［］过程，在此过程中被培养的细胞始终受的调节(［］内填序号)。

(3)应用植物组织培养技术培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株，其原因是。

(4)从表乙的实验结果可看出：生长素和细胞分裂素是实验中的两种重要物质。其中，新芽形成必需的条件是；而在培养形成完整新个体过程中，对它们的调控关键是。

解析：(1)植物组织培养的原理是细胞的全能性。(2)①是脱分化，得到愈伤组织，②是再分化，得到胚状体。(3)植物的根尖或茎尖分裂快，病毒尚未来得及侵染。培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株。(4)由表乙D组看出，细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度，脱分化出嫩芽。在不同培养期，细胞分裂素与生长素的浓度和比例不同，分化的器官就不同，在组织培养过程中，其浓度和比例非常关键。

答案：(1)植物细胞的全能性(2)①脱分化②再分化植物激素(3)植物的茎尖或根尖很少被病毒感染，甚至无病毒(4)细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度适当调控好不同培养期的培养基中细胞分裂素与生长素的浓度和它们的比例

例2.（2014・甘肃秦安一中第一次检测卷）某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行细胞培养。下列说法不正确的是（）

A．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理

B．为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素

C．细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是维持培养液的pH

D．将数量相等的甲、乙细胞分别置于相同适宜条件下培养，一段时间后，会观察到甲细胞的数量比乙细胞的数量多

解析：胃蛋白酶最适pH是1.5，而一般细胞培养在pH是6.5~8.0，所以不能用胃蛋白酶处理，A项错误。抗生素可以有效抑制细菌的繁殖，所以可以加入适量抗生素，B项正确。细胞培养过程中，5%CO2的作用是调节细胞培养液的pH值，故C项正确。因为肝肿瘤细胞在适宜条件下具有无限增殖的能力，而普通细胞没有此特性，所以D项正确。

答案：A

例3.回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。

(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量。

(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不被染色，原因是。

(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。

(5)在细胞培养过程中，通常在条件下保存细胞。

解析：（1）在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶可以使贴壁细胞从瓶壁上分离开来。（2）随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞。（3）由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。（4）由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此可作为显微镜观察染色体数目的最佳时期。（5）冷冻或超低温、液氮条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低，故适宜保存细胞。

答案：(1)相互接触接触抑制单层(或一层)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡不死性（大大）降低减少(3)由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不被染色(或由于死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内)(4)中(5)冷冻(或超低温、液氮)

五、巩固训练

1.（2013・北京市东城区期末卷）右图表示一定条件下将胡萝卜的离体组织培育形成试管苗的过程。下列有关叙述不正确的是（）

A．需在无菌条件下将离体组织接种到培养基中

B．图中①②过程分别表示脱分化和再分化

C．利用此过程获得的试管苗均为纯合子

D．此实验说明分化的植物细胞仍具有全部的遗传信息

2.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导的植物激素分别是（）

①体细胞全能性②离体植物器官、组织或细胞③根、芽④生长素和细胞分裂素⑤生长素和乙烯⑥愈伤组织⑦再分化⑧脱分化⑨植物体

A．①、②⑦⑥⑧③⑨、④

B．①、②⑧⑥⑦③⑨、④

C．①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤

D．①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤

3.下列关于动物细胞培养的叙述中，错误的是（）

A．用于培养的细胞多取自动物胚胎或幼龄动物

B．培养过程中需要使用胰蛋白酶等获得细胞悬液

C．动物细胞培养时要保证氧气供应，不能通二氧化碳

D．动物细胞培养时的培养基是液体培养基，并要加入血清

4.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）

A.动物细胞培养需要无菌、营养、适宜的温度和pH等条件

B.用胰蛋白酶作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞

C.放入CO2培养箱中培养动物细胞的主要目的是为了满足细胞对CO2的需求

D.细胞株一般具有恒定的染色体组型、生化特性等

5.（2013・吉林省吉林一中高三第二次摸底考试卷）植物组织培养是克隆植物的一种方法，过程如下图所示，请回答相应的问题。

(1)为了获得脱毒植株，外植体往往取自植物的花芽、叶芽等处的分生组织，其原因是。

(2)培养皿中的培养基除添加营养物质外，还需要添加植物激素，其目的是诱导外植体。

(3)在生产实践中为获得大量的细胞产物，如紫杉醇，可将①放入液体培养基中，经机械作用分散成单个细胞，制备成细胞浮液，再经过即可获得大量细胞。

(4)组织培养过程需要植物生长和繁殖的最适条件，否则在光学显微镜下可能观察到发生异常，进而使植物出现遗传不稳定甚至不育。

(5)植物组织培养技术不仅应用于花卉和果树的快速大量繁殖以及脱毒植株的获取，还广泛用于、、等育种过程中。

6.制造人工种子的原理是在组织培养得到的“胚状体”的最外面用一层有机膜包裹，并在薄膜以内放入一些营养物质，这层膜和这些营养物质分别具有种皮和胚乳的功能（如下图所示）。在制造过程中还可以加入某些农药、菌肥等。据此材料回答下列问题：

（1）胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是和。在这一过程中被培养的细胞始终受的调节。

（2）从保证人造种子正常生命力及生态系统物质循环上来看，其外部薄膜应具有等的特点。

7.（2013・福建福州期中卷）下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：

（1）容器A取材于动物胚胎或幼龄动物的原因是。

（2）容器B中一般先用酶处理，消化组织中的胶原纤维，这利用了酶的性，这样做是为了使细胞分散开来，便于细胞与充分接触。

（3）C瓶内的培养为，这一时期的细胞具有恒定的、和生化特性等。

（4）为了把C瓶中的细胞分散到D瓶中，用处理，然后配制成，再分装。

（5）在D瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是。

参考答案

1.C2.B3.C4.C

5.（1）这些部位很少受到病毒等病原体的侵害

（2）脱分化和再分化

（3）愈伤组织细胞分裂

（4）染色体结构和数目

（5）植物体细胞杂交育种基因工程育种单倍体育种

6.（1）脱分化再分化植物激素

（2）半透性（透水、透气性）和能被微生物降解

7.（1）细胞分裂旺盛

（2）胰蛋白专一培养液

（3）原代培养染色体组型病毒敏感性

（4）胰蛋白酶细胞悬浮液

细胞培养范文第10篇

参考文献：

[1]董本正.“糖类”专题的复习[J].生物学通报，2004，（09）.

[2]许凤芹，刘桂茹，杨学举.植物组织培养研究进展[J].河北农业科学，2005，（01）.

[3]杨彩菊，郝大海，杨素祥，王芳，李灿辉，陈善娜.高等植物中的蔗糖载体[J].植物生理学通讯，2006，（04）.