植物蛋白范文
时间：2023-11-06 07:48:12
植物蛋白篇1
[关键词] ABC转运蛋白亚家族功能生命活动调节
植物ABC转运蛋白又称腺昔三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters, ABC转运蛋白),由于含有一个腺苷三磷酸(ATP)的结合盒(ATP-binding cassette, ABC)而得名。ABC转运蛋白广泛存在于真核和原核生物中,目前已知人类基因组中有48个ABC转运蛋白超家族成员。在大肠杆菌K-12 基因组中, 至少有80个编码ABC转运蛋白, 约占基因组的5%。酵母中有大约31ABC转运蛋白超家族[3]。在植物界，以水稻和拟南芥为代表的ABC转运蛋白家族多达120以上, 这是植物以适应固着生活环境, 长期进化形成的。由于植物中ABC转运蛋白种类繁多、结构复杂、功能多样，参与植物一切的生命活动过程，从而引起人们的广泛关注。自从1992年国际上首次报道从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的AtPGP1（又称为AtMDR1）第一个植物ABC 转运蛋白至今，研究人员对植物ABC 转运蛋白进行了多方面的研究，从ABC转运蛋白基因克隆序列分析到功能验证，从ABC转运蛋白结构解析到转运机理的认识，从对大量ABC转运蛋白基因蛋白通俗命名到有统一的科学系统命名。本文旨在总结前人研究的基础上，对ABC 转运蛋白及其在植物生命活动调节中的作用研究进展作一综述。
1植物ABC转运蛋白分子结构特征
ABC转运蛋白含有1～2个接合ATP的盒(ABCs)或接合核苷酸的域(nucleotide-binding domains,NBDs)和跨膜域(transmembrane domain, TMD)。NBDs家族成员中有30%～40%的氨基酸序列同源。Walker等发现每个NBD包含3个特征序列, 即所谓“WalkerA”基序［GX4GK(ST)]、“WalkerB”基序［(RK)X3GX3L(hydrophobic)3］和一个ABC域［(LIVMFY)S (SG)GX3(RKA)(LIVMYA)X(LIVMF)(AG)］, ABC 域包括H环和Q环。WalkerA和WalkerB中间被ABC域隔开。在核苷酸结合域内有一个长约200个氨基酸的非常保守的片段, NBDs的结构特征及不同个体成员之间的多基因亲缘关系是用来对ABC蛋白超家族的亚家族进行分类的依据。每个TMD 都含有多个跨膜的α-螺旋(通常为4～6个), 形成了溶质跨膜(或者从膜的一侧移动到另一侧)的通道。NBD 位于膜的胞质面, 能结合并水解ATP供能；而TMD 能够利用NBF释放的能量选择底物并跨膜转运底物。与NBD相反, ABC 转运蛋白的TMD序列相似性却很低。
ABC转运蛋白的结构域组织形式多种多样。通常, 全分子的ABC转运蛋白包含2个NBD和2个TMD, 4个结构域结合在一起才能执行转运功能。在大多数已鉴定的真核ABC转运蛋白中, 最常见的排列方式是这4个结构域以正向方式TMD-NBD-TMD-NBD(如多药耐药相关蛋白，multidrug resistance associated protein，MRP)或相反的NBD-TMD-NBD- TMD(如酿酒酵母中作为排出胞内有毒化合物泵的pleiotropic drug resistance，PDR5)反向方式连接在一条多肽分子上, 形成全分子ABC转运蛋白。一些ABC转运蛋白像果蝇色素转运蛋白仅含有1个NBD和1个TMD为半分子的ABC转运蛋白EPP (Eye pigment precursor transporter)或重金属转运蛋白HMT(Heavy metal tolerance)。半分子的ABC转运蛋白通过形成二聚体或多聚体来实现功能, 这种二聚体可为同二聚体, 又可为异二聚体。通常情况下，NBD和TMD存在于不同的多肽上的转运蛋白称为1/4分子转运蛋白。也有许多ABC转运蛋白并没有参与运输, 而是参与DNA修复、基因表达的转录和调控等细胞过程, 如有些蛋白没有TMD域而是由两个NBD域融合在一起的RNaseL抑制剂。总之，各转运蛋白之间的氨基酸序列上虽有同源性, 但结构差异巨大, 这种差异可能与功能的差异有关。
2植物ABC 转运蛋白的作用机理
由于各种生物的ABC转运蛋白结构的相似性以及NBD的高度保守性，不同亚簇ABC转运蛋白的作用机制具有一定的相似性。外向性运输ABC转运蛋白的整个转运过程起始于细胞内侧底物与ABC转运蛋白TMD区的结合, 内向性运输ABC 转运蛋白, 先形成外周蛋白和底物的复合体, 而后与ABC 转运蛋白相互作用, 把底物传递给它的TMD 部分。目前，对ABC转运蛋白作用机理一种广为接受的假说就是，通过控制通道对膜内外的开放，偶联ATP的水解来实现对底物的转运，这是一种门控模式。当ABC 转运蛋白具有膜外结合蛋白时，从膜外向胞内转运底物的转运过程是: 在两个TMD之间存在一亲水性通道, 靠近膜外及胞质部分都有环形成的门。转运底物之前, 靠近外周质的门处于开放状态, 朝向胞质面的门处于关闭状态。跨膜转运时，膜外结合蛋白结合底物并呈送到TMD，随后信号传递到NBD，NBD结合并水解ATP，NBD水解ATP后构象发生变化并传递到TMD，TMD的构象发生变化，底物被送到通道中，通道朝向外周质的门随即关闭，这时朝向胞质的门开放，底物最终被送到胞内。从胞内把底物，比如药物转运到胞外，ABC 转运蛋白除了通道内外的门开放的顺序相反外，其他转运过程基本相同。
3植物ABC转运蛋白亚家族的功能研究
植物中ABC转运蛋白较动物和人类的多。随着拟南芥全基因组测序的完成，研究发现，拟南芥ABC转运蛋白开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)中占有总的编码基因比例达到0.5%，由此可见，ABC蛋白在植物生命活动中占有十分重要位置。植物之所以拥有如此多的ABC转运蛋白，可能原因有：①是植物对固着生活适应的结果，植物为抵御细胞内外各种异源性的化合物或毒素毒害，在细胞水平上将异源性的物质隔离或外排到细胞外，依赖于ABC转运蛋白的复杂的细胞解毒机制是必要的；②植物代谢途径的多样性, 植物在次生代谢中产生大量种类多样的次生代谢物需要及时的跨膜转运细胞质或区室化；③植物在生长发育过程中需要各种信号分子的应答与交流, 这些信号分子在跨膜转运的过程中也需要ABC转运蛋白；④植物与微生物的相互作用互相识别以及植物对环境中化学成分直接接触都有ABC转运蛋白在其中参与重要的活动。植物ABC转运蛋白功能的多样性还体现在，一种ABC转运蛋白往往参与植物中不同的生理活动过程，而植物中某一生理活动的完成往往也是由不同的ABC转运蛋白共同参与的。我们按照国际系统命名法将ABC转运蛋白分为亚簇(亚家族A―亚家族H)，逐一论述其功能。
3.1 亚家族A的功能
亚家族A转运蛋白在植物内的功能还不够清楚，在人体内脂质、甾醇类代谢及胆固醇、视黄醇、脂蛋白运输中起作用。拟南芥基因组中有11个半转运子ABCA基因，其中7个是冗余基因，和一个全转运子ABCA基因均排列在3号染色体上，其代表性ABCA家族包括AOH和ATH。由于拟南芥中的AOH与人的ABC1转运蛋白具有高度的序列同源性，暗示其在植物体内的脂质的运输中具有一定的功能。水稻中缺少ABCA全转运子，很可能是在植物进化过程中基因缺失引起的，因为在早期陆生植物像小立碗藓中也检测到ABCA基因的同源序列。
3.2 亚家族B的功能
亚家族B主要包括药物抗性相关蛋白（Multidrug resistance relative，MDR），抗原肽相关运载蛋白体（transporter associated with antigen processing，TAP），线粒体ABC转运蛋白（ABC transporter of the mitochondria，ATM），p-糖蛋白（p-glycoprotein，p-GP），重金属耐性蛋白（Heavy metal tolerance，HMT），Lipid A 输出蛋白（Lipid A-like exporter putative，LLP）。植物中HMT家族是一类与酵母中的HMT1同源蛋白, 通过转运重金属络合物到液泡中增强对重金属的耐性。人类的这一家族转运子主要是全转运蛋白PGP与 MDR，P-型糖蛋白多重药物抗性或脂质运输。植物中这一家族蛋白功能更具多样性，如生长素、次生代谢物和异源物质的运输。拟南芥中存在的一些类似P-糖蛋白的基因产物, 但是对它们的功能了解很少。已发现的功能包括转运植物次生代谢产物（如生物碱），涉及到受体和信号肽的转运等。Helvoort等发现MDR1和MDR2作为一种“跳跃酶(flippase)”可以将单层膜上的类脂转移到另一膜上，结果导致类脂的重排和蛋白的重新分布。目前唯一研究比较清楚的是Atpgp1蛋白，Atpgp1与弱光下拟南芥下胚轴的细胞伸长有关，Atpgp1主要存在于根和茎顶端细胞的质膜上，作为输出泵转移与细胞伸长相关的多肽类激素。属于这一亚家族的如拟南芥的AtABCB4 (AtPGP4)和日本黄连ABCB1(CjMDR1)作为输入蛋白。HMT/ATM与重金属耐性相关的线粒体ABC转运蛋白是半转运子。研究资料表明，AtABCB25又称作AtATM3/STA1，功能等同酵母ATM1，协助从线粒体的基质中输出铁硫蛋白，AtABCB25在拟南芥中过表达能提高对镉和铅的抗性，AtABCB27(AtTAP2/ALS1)在提高植物对铝毒抗性方面具有重要作用。
3.3 亚家族C的功能
C亚族是ABC全转运蛋白附加一个疏水性的N端, 该家族的原初成员是人类多种药物抗性相关蛋白HsMRP1, 能从药物抗性的肿瘤细胞中输出谷胱甘肽结合物和有机酸阴离子。随后生物化学研究植物液泡固定谷胱甘肽结合物导致发现植物中的MRPs。植物ABCC亚家族形成多基因簇, 豆科植物百脉根ABCC基因是拟南芥的3倍多，如拟南芥中的AtABCC14只有一个，而在百脉根中与之同源的基因就有6个。由于ABBCC基因在植物基因组中数量大、拷贝数多, 研究其功能相对困难，因为通过插入突变使其中某个基因丧失的功能可以由基因家族中另外的成员得以补偿。AtABCC2是与叶片衰老相关的参与叶绿素代谢物的运输, 与AtABCC2在蛋白序列同源性达87%的AtABCC1或其同源基因AtABCC11、12突变并不影响AtABCC2发挥功能。研究表明，AtABCC1是将叶酸运输到液泡中, 该基因突变对氨基蝶呤是超敏感的。这一结果表明高度同源的蛋白具有相同的亚细胞定位和相似的运输特征，在植物体内可能执行不同的生理功能。另外的研究也表明，AtABCC1、2还有其他重要的生理功能, 不同AtABCC2转运蛋白突变体根系分泌物其氨基酸的含量比野生型的要高, AtABCC2突变体影响土壤根际微生物的种类和丰度。ABCC1、8、10、14在液泡膜上, ABCC1、4既在液泡膜上也在质膜上。研究发现，拟南芥中AtABCC5，玉米ZmMRP4和水稻OsMRP13等同源基因在肌醇六磷酸的运输中有重要作用，突变体分析表明上述基因突变会降低种子内的肌醇六磷酸的含量, 同时无机磷酸的含量提高。多药物抵抗相关蛋白(MRP) 转运体属于ATP结合框(ATP binding cassette, ABC)转运体超家族, 作为ATP驱动泵, MRP不仅涉及癌药物的抵抗、细胞内脱毒反应和氧化胁迫抵抗, 而且介导GSH结合物的转运。作为GSH结合物转运体的MRP, 通过从细胞中泵出GSSG 而使胞内GSH/GSSG 比率提高, 从而在细胞氧化胁迫抵抗中发挥重要作用。液泡膜上的ABC 转运蛋白主要是MRP 亚族成员, 其主要功能是参与转运一系列有毒物质到液泡, 实现液泡对它们的螯合, 从而起到对细胞的解毒作用。Tommasini等发现AtMRP1、AtMRP2和AtMRP3可以转运GSH连接复合物, 但只有AtMRP2和AtMRP3可以转运衰老叶片叶绿素降解的代谢物。Bovet等发现拟南芥的AtMRP3基因Cd2+ 浓度的上升而呈现上调表达, 并猜测其是一种解毒蛋白。拟南芥的ABCCs在液泡运输葡糖苷和O-丙二酰叶绿素代谢起作用, 当在酵母中表达时也授予酵母对镉的抗性。在玉米中的研究发现，该亚家族成员在花青素液泡分隔和调节种子肌醇含量中也有很重要作用。C亚家族的转运蛋白不仅是解毒作用, 因为拟南芥MRP蛋白AtMRP5与离子通道的调节有关, 特别是在维持K+的细胞内稳态机制以及调节气孔的开闭方面起作用。
与植物介导的抗病反应主要有三类ABC转运蛋白家族：AtABCC1、AtABCC2、AtABCC10是与病原反应相关的第一类ABC转运蛋白家族, 是RPM1依赖的Pst DC3000的专一性诱导表达的, 不依赖EDS1、PAD4 和 SA的表达, 并AtABCC1和AtABCC2在RPP2引发的H. arabidopsidis Cala2/Col-0抗性中发挥作用。与病原反应相关的第二类ABC转运蛋白家族包括AtABCC5, AtABCC6和AtABCC7。即也是不依赖EDS1、PAD4而受RPM1依赖的信号反应或EDS1-、PAD4- 和SA依赖的RPS4介导的抗性。H.arabidopsidis Cala2/Col-0和SA处理后, AtABCC6和AtABCC7转录水平增加, AtABCC7表达也受丁香假单胞菌侵染诱导[38]。AtABCC4和AtABCC12是第三类病原反应相关蛋白，这两个基因受不依赖于EDS1-、PAD4- 和SA抗性反应诱导, 但不包括RPM1-或RPS4-介导的信号传递。因此，AtABCC2 和AtABCC10是对Pst DC3000基本的抗性反应的一部分, 与AtABCC7转录调控相似。ABC转运蛋白可能参与运输细胞内产生的次生代谢物和细胞自身代谢产生毒副产物到真菌的入侵位点, 阻止病菌的进一步入侵。
3.4 亚家族D的功能
亚家族D主要是以半转运子结构形态存在的, 发挥作用的时候主要是以同源或异源二聚体形式将脂肪酸输入过氧化物酶体中。人体内健康和发病的细胞过氧化物体膜上都存在ABC半转运蛋白, 包括PMP70、ALDP、ALDR和P70R等。Imanaka等和Yamada等分别研究发现在脂肪酸代谢物如长链乙酰CoA类型的物质转移穿过过氧化物膜的过程中, PMP70和ALDP发挥重要作用。拟南芥染色体上含有编码类似PMP70蛋白的基因, 另一个编码全长的蛋白基因也与过氧化物膜上蛋白具有同源性, 这两种半转运蛋白结构不相同, 但都有特征基序, 即在N-端和C-端都含有ABC转运蛋白的特征基序“SLGEQQR”, 这两种蛋白与哺乳动物的PMP-70蛋白有近30%的氨基酸同源。拟南芥中的AtPMP2就是将脂肪酸输入到过氧化物酶体中进行β-氧化和乙醛酸循环, 该基因的突变导致种子萌发缺陷。AtPMP1是质体半转运子蛋白, 功能有待进一步研究。
3.5 亚家族E和F的功能
亚家族E和F, 在这些亚家族中的基因包含两个NBDs，没有TMD结构域, 它们并没有明显的运输现象。亚家族E代表古细菌和真核生物, 这也许表明它代表一类基本的功能保守的亚家族ABC蛋白, 与一个酵母成员中的RNaseL抑制剂在蛋白序列上一致, 这就表明植物中的RLI同源族可能在RNA干扰的抑制中起作用。亚家族F在植物中的功能还没有确定,但在酵母与人类，它们有助于通过激活eIF-2a激酶活性调控蛋白翻译。
3.6 亚家族G的功能
亚家族G是以NBD-TMD反向序列结构域类型的转运子, 该亚家族在植物中广泛扩散, 在拟南芥与水稻中有多达40个成员, 具有广泛的功能多样性。在多基因进化树上发现他们具有很少的同源相似性。该亚家族最初是在黑腹果蝇内与眼色素的形成与运输相关的白褐复合体蛋白（white-brown complex，WBC）, 是由3个半分子的ABC蛋白形成的两个不同的异源二聚体。人类的ABCG5-8是异源二聚体, ABCG1-2是同源二聚体。AtABCG11-12与表皮细胞的烷烃类蜡质输出有关;AtABCG11与植物表面角质的累积有关, AtABCG19 (AtWBC19)与拟南芥对卡那的抗性有关, 在拟南芥中过表达AtABCG36基因提高植株对干旱与盐胁迫的抗性。现存的植物或真菌包含大量的亚家族G成员, 被认为都是从一个祖先WBC-like基因通过基因复制形成的。如真菌类的多种药物抗性基因PDR在对弱酸、药物、真菌剂和植物防御化合物抗性中起作用。在植物中，PDR具有类似的功能, 包括对病原物、铅、抗微生物萜类化合物和生长素类除草剂。研究表明，拟南芥中的AtPDR8蛋白介导拟南芥与病原微生物的相互作用中发挥作用。基因敲除AtPDR8导致拟南芥对丁香假单孢菌、白粉菌和马铃薯晚疫病菌易感性; AtPDR8蛋白将镉外排出细胞, 与植物对重金属的抗性有关。花与根、叶表面PDR基因表达模式在各种化合物和根际信号的生产方面起着很重要作用。水稻Ospdr9基因编码一个具有反向(NBT-TMD)2结构域的ABC转运蛋白, 聚乙二醇、Cd和Zn快速显著诱导Ospdr9基因的表达, 研究表明该基因的表达与细胞内活性氧胁迫以及细胞自身氧化还原状态密切相关。
3.7 亚家族H的功能
亚家族H基因在昆虫、鱼类、棘皮动物和粘菌分布广泛，但在植物中明显缺少。它们编码反向结构域组织的(NBD TMD), 不过与亚家族G成员不相关, 可能也与药物抗性相关。
4展望
ABC蛋白作为植物细胞膜蛋白的重要组成成分, 其家族成员数量多、种类广、作用方式复杂, 参与植物细胞生命活动的许多过程, 如植物激素运输、气孔调节、次生代谢物的运输和环境胁迫响应以及植物与微生物互作中发挥重要作用。随着拟南芥和水稻等模式植物基因组计划的完成和后基因组时代的到来, 越来越多的ABC蛋白基因的鉴定、克隆和功能分析, ABC蛋白在植物生命活动过程中的重要性将得以进一步解析。
ABC蛋白是一类庞大的基因家族, 每一个植物品种中都包含有几个到几十个数目不等的家族成员。近几年来, 随着越来越多植物基因组测序的完成, 人们对ABC蛋白基因家族的认识越来越深入, 伴随着更多的科学问题随之而来, 如ABC蛋白基因家族如何演变而来的？不同家族成员的功能如何？家族成员相互之间是否存在功能关联和协调？ABC蛋白基因表达调控的机制是什么？ABC转运蛋白基因在农业生产及作物育种中的实际应用如何？对这一系列问题的解答, 还需要我们做更多深入的探讨。
参考文献：
[1] Badri D V, Loyola-Vargas V M, Broeckling C D, et al. Altered profile of secondary metabolites in the root exudates of Arabidopsis ATP-binding cassette transporter mutants[J]. Plant Physiology, 2008, (146): 762-771.
[2] Badri D V, Quintana N, El Kassisa E G, et al. An ABC transporter mutation alters root exudation of phytochemicals that provokes an overhaul of natural soil microbiota[J]. Plant Physiology, 2009, (151): 2006-2017.
[3] Chen S, Sánchez-Fernández R, Lyver E R, et al. Functional characterization of AtATM1, AtATM2 and AtATM3, a subfamily of Arabidopsis half-molecule ATP-binding cassette transporters implicated in iron homeostasis[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, (282): 21561-21571.
[4] Garcia O, Bouige P, Forestier C, et al. Inventory and comparative analysis of rice and Arabidopsis ATP-binding cassette (ABC) systems[J]. Journal of Molecular Biology, 2004, (343): 249-265.
[5] Goodman C D, Casati P , Walbot V. A Multidrug Resistance-Associated Protein Involved in Anthocyanin Transport in Zea mays[J]. Plant Cell, 16: 1812-1826.
[6] Helvoort A, Smith A J, Sprong H, et al. MDR1 P-Glycoprotein is a lipid translocase of broad specificity, while MDR3 P-Glycoprotein specifically translocates phosphatidylcholine[J]. Cell, 1996, 87(3): 507-517.
[7] Kim D Y, Jin J Y, Alejandro S, et al. Overexpression of AtABCG36 improves drought and salt stress resistance in Arabidopsis.Physiologia [J]. Physiologia Plantarum, 2010, 139(2): 170-180
[8] Klein M., Burla B., Martinoia E. The multidrug resistanceassociated protein (MRP/ABCC) subfamily of ATP-binding cassette transporters in plants[J]. FEBS Letters, 2006, (580): 1112-1122.
[9] Nagy R, Grob H, Weder B, et al. The Arabidopsis ATP-binding cassette protein ATMRP5/ATABCC5 is a high affinity inositol hexakisphosphate transporter involved in guard cell signaling and phytate storage[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, (284): 33614-33622.
[10] Pighin J A, Zheng H, Balakshin L J, et al. Plant Cuticular Lipid Export Requires an ABC Transporter[J]. Science, 2004,(306): 702-704.
[11] Raichaudhuri A, Peng M, Naponelli V, et al. Plant vacuolar ATP-binding cassette transporters that translocate folates and antifolates in vitro and contribute to antifolate tolerance in vivo[J]. Journal of Biological Chemistry, 2009, (284): 8449-8460.
[12] Rensing S A, Lang D, Zimmer A D, et al. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants[J]. Science, 2008, (319): 64-69.
[13]Rocı́o Sánchez-Fernández, Emyr Davies T G, Julian O D, et al. The Arabidopsis thaliana ABC protein superfamily, a complete inventory[J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, (276): 30231-30244.
[14] Sarmiento C, Nigul L, Kazantseva J, et al. AtRLI2 is an endogenous suppressor of RNA silencing[J]. Plant Molecular Biology, 2006, (61): 153-163.
[15] [12]Suh S J, Wang Y F, Frelet A, et al.The ATP binding cassette transporter AtMRP5 modulates anion and calcium channel activities in Arabidopsis guard cells[J]. Journal of Biological Chemistry, 2007, (282): 1916-1924.
植物蛋白篇2
《植物蛋白饮料卫生标准》对植物蛋白饮料的描述是：以植物果仁、果肉及大豆为原料（如大豆、花生、杏仁、核桃仁、椰子等），经加工、调配，再经高压杀菌或无菌包装制得的乳状饮料。根据原料不同，可分为：豆乳类饮料、椰子乳饮料、杏仁乳（露）饮料、核桃露饮料和其它植物蛋白饮料。
由于细分是任何一个行业发展的终极之路，就如同植物蛋白饮料是饮料业发展的一个分支，植物蛋白饮料这个版图内的细分也是必然之势。由于各类植物蛋白饮料本身特点及功效等的不同，因此任何一类植物蛋白饮料都有成就卓越品牌的机会。按照目前的市场格局，“冰泉”和“豆豆厨”在豆奶业独霸一方；“椰树”引领着椰汁业的发展；“露露”在杏仁露中独领风骚；而“大寨”和“六个核桃”成为核桃露业的新兴翘楚；一些大牌的饮料和乳品企业如“娃哈哈”、“汇源”、“伊利”、“蒙牛”等也竞相在各类植物蛋白饮料品类中染指分羹；各品牌企业周边的众多跟风型企业更是谁不胜数。然而，放眼整个植物蛋白饮料市场，整体行业营销仍处在低水平竞争的层面，各企业基本都以本品类内领导品牌的表现为参照物，能做到的只是将众多包装雷同、口感不一、卖点近似，只靠价格有别来吸引消费者的产品呈现在消费者面前。
如果说人口众多决定了中国市场的消费潜力，那么营销跟风则体现了中国企业集体出路的悲哀。无数嗅到腥味的中小企业大量涌入同一个行业参与竞争，但运作手法却近乎雷同，最后的结局只能是大家共同在价格战的红海中走向整个行业的衰竭。“伊利”的高增长伴随着中国乳品行业容量的超速成长；“蒙牛”的跨越式发展离不开“伊利”老大哥的竞争压力和自身的破局有方。因此可以说，一味的切蛋糕不会有今天乳业的大蛋糕，乳品行业的高速成长离不开“伊利”等领头羊企业对行业健康成长的贡献；一味的跟风不会有今天的“蒙牛”，竞争并超越方是现代企业的营销出路。
植物蛋白饮料行业整体的盘子小与行业成长的时间短有关系，但更与业内企业对行业大环境的建设和竞争方略息息相关。从产销规模上看，承德露露算是该领域的领军企业，但由于露露集团和露露股份有限公司间错综复杂的裙带关系，使品牌形象和产品结构混乱异常，多年来公司营销表现一直乏善可陈，增长乏力；大寨核桃露虽是核桃露行业的开路先锋，但受其整体营销思路的匮乏最终只落得个“前人种树、后人乘凉”的结局；倒是衡水养元公司凭借“六个核桃”的成功推广，巧妙占位核桃露品类领导者的空档，但其整体销售额尚不足5亿元，仍不及植物蛋白饮料业近100亿市场份额的二十分之一；…
植物蛋白篇3
关键词Aux/IAA；ARF；植物侧根
中图分类号Q945.3文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）22-0055-04
TheEffectsofAux/IAAandARFProteinsonLateralRootFormation
HE Kai-pingWU Chu
（College of Horticulture and Gardenology，Yangtze University，Jingzhou Hubei 434025）
AbstractThe development of plant root systems is essential to the uptake of water and nutrients.The whole root system of a plant is composed of lateral roots with different orders.Therefore，lateral root formation is important for the development and productivity of plants.Lateral root formation is affected by phytohormones，especially auxin.In auxin transduction pathway，Aux/IAA and ARF proteins are important and play important roles in lateral root formation.Based on the researches on auxin transduction pathway in recent years around the world，the advances were reviewed in this paper.
Key wordsAux/IAA；ARFs；laterel root
植物侧根形成是根系发育的重要组成部分，对于植物固定、营养和水分吸收以及根际微生物活动等具有重要作用。受环境等方面的影响，与地上部分侧枝的形成相比，侧根形成具有更多的不确定性，例如何时于母根的何处形成。Aux/IAA和ARF两大类蛋白是生长素信号转导过程中的重要成分，对侧根形成具有重要影响，为进一步促进该研究的进行，该文对其研究进展作一综合评述。
1Aux/IAA蛋白对植物侧根形成的影响
拟南芥基因组编码29种Aux/IAA蛋白，这些蛋白均为短寿命的白[1-3]，且对生长素能作出反应[4]。大多数Aux/IAA蛋白都含有4个高度保守的域（即I、II、III和IV域）[5]，少数则没有，如IAA20，该蛋白缺乏II域，也不含有任何可转移的降解决定子（degron）[4]。利用III和IV域，Aux/IAA蛋白可以实现自我二聚作用，或与其他Aux/IAA蛋白或ARF蛋白实现异二聚化作用[6]。I域的功能可能与II和IV域的功能相似，因为从蛋白中删除I域并不影响Aux/IAA蛋白的降解[4]。II域则在Aux/IAA蛋白降解过程中具有重要作用。在拟南芥中，各个Aux/IAA蛋白在降解和生长素反应方面是不同的。IAA20∶LUC和表位标记的IAA20具有较长的寿命，且不受生长素的影响，相反，表位标记的IAA31也是长寿命的，但它能对生长素作出反应而迅速降解[4]。因为Aux/IAA蛋白降解对于生长素信号转导是非常重要的[7-10]，因此，Aux/IAA蛋白降解对于植物侧根的形成也是非常重要的。
Aux/IAA基因突变影响植物侧根形成。基因MASS UGUS2编码Aux/IAA19蛋白。该蛋白与转录激活因子NPH4/ARF7共同作用而调节侧根的形成[11]。在突变体msg2-1，侧根的形成受到强烈抑制。msg2-1突变体不能对外源吲哚乙酸（IAA）作出反应而恢复正常的侧根形成，但该突变体并不是完全对IAA不敏感，因为外源IAA处理可以使该突变体产生更多的侧根。这个结果表明Aux/IAA蛋白发生突变可导致侧根形成减少。
AXR3/IAA17负调节侧根形成。DEX处理AXR3/IAA17-GR植株，使侧根减少大约40%[12]。外源化学药品epiBL处理能显著地诱导AXR3/IAA17基因的表达，而AXR3/IAA17基因在油菜素类固醇不敏感突变体bri1中的表达显著下降，但在油菜素类固醇生物合成突变体bri2中的表达仅轻微下降。因此，AXR3/IAA17可能涉及油菜素类固醇的信号转导途径，这就表明在侧根形成过程中油菜素类固醇与生长素之间存在一定的对应关系。此外，AXR3/IAA17还与SHY2相互作用调节根毛的发育[13]。
在HOBBIT突变体幼苗中，AXR3/IAA17蛋白可以累积到很高的水平[14]。HOBBIT基因编码一种与APC/C的亚单元CDC27同源蛋白[14-15]，APC/C为一种E3连接酶[16-17]。在酵母和动物中，在有丝分裂过程中蛋白水解由APC/C介导[16-17]。由此可以推想，AXR3/IAA17的降解可能是通过APC/C来实现的。HOBBIT基因发生突变导致AXR3/IAA17累积，从而导致该突变体侧根减少。
SLR/IAA14蛋白对侧根形成的影响是非常奇特的。在ARF7或ARF19的启动子作用下，mIAA14-GR的表达抑制侧根的形成，正如双突变体arf7 arf19那样，且在酵母中SLR/IAA14能与ARF7和ARF19相互作用[18]，这就表明SLR/IAA14能使ARF7和ARF19失活，从而抑制侧根的形成。功能获得显性突变体slr-1完全缺乏侧根。将拟南芥野生型（Col）、slr-1和slr-1R1幼苗在MS培养基上培养10 d，这些幼苗分别形成13.9±2.9、0、1.2±1.4条侧根，且外源生长素不能回复slr-1突变体的侧根形成[18]。在slr-1突变体中，侧根缺乏是因为在侧根起始时中柱鞘细胞的细胞周期被中断。但是，中柱鞘的细胞周期进程中断并不足以说明是SLR/IAA14所介导的[19]。仅仅当中柱鞘细胞的细胞周期被激活且出现细胞的命运被特化后，侧根形成的起始才发生。因此，slr-1突变体可以被当做成连接生长素信号与侧根起始的工具。
IAA28基因发生功能获得突变也可以抑制侧根的发育。在相同条件下，与野生型植株相比，突变体iaa28-1的幼苗产生较少的侧根[20]。iaa28-1突变体不仅对生长素缀合物具有抗性，而且对不同浓度的外源自由IAA也具有抗性，表明缺损基因是在生长素反应中起作用，而不是在新陈代谢中起作用。此外，iaa28-1突变体的根系对其他植物激素，如ABA、MJ以及epiBR表现出正常的敏感性。
在拟南芥中，AXR2基因编码IAA7，显获得axr2-1突变改变了AXR2/IAA7蛋白的保守域II中单个氨基酸[21]。这种突变中断生长素反应的早期步骤[21]。在相同条件下，与野生型相比，axr2-2突变体产生更多的侧根[21-22]，但产生更少的根毛。由此可以看出，AXR2/IAA7的突变对侧根形成的影响与MSG2/IAA19、SLR/IAA14以及IAA23的突变对侧根形成的影响刚好相反，表明在侧根形成过程中，Aux/IAA蛋白具有不同的功能。
Hayashi等[23]的试验结果表明：Yokonolide B是一种奇特的生长素活动抑制剂，它可以阻断Aux/IAA蛋白的降解。Yokonolide B和蛋白酶抑制剂MG132都能抑制主根的生长，但它们对侧根形成的影响则不同：前者促进侧根的形成，而后者不能。根据这个结果，似乎可以得出这样的结论：Yo-konolide B可诱导AXR2/IAA7的累积，这种累积超过了其他Aux/IAA蛋白的功能。目前，人们对AXR2/IAA7在侧根形成过程的作用了解还不深入。因此，需要进行更多的试验研究。
SHY2基因编码IAA3。显性shy2突变引起II域中的氨基酸发生变化。shy2基因的功能获得突变和功能丧失突变均影响依赖于生长素的侧根形成。与野生型相比，功能获得突变体shy2-2的幼苗只产生很少的侧根，而功能丧失突变体突变体shy2-22和无效突变体shy2-24则产生更多更长的侧根[24]。shy2-2的表现型可能归因于SHY2/IAA3蛋白的稳定性增加[8]。生长素促进SHY2/IAA3蛋白与TIR1蛋白相互作用，而shy2-2基因的功能获得突变则降低这种相互作用，且axr1和tir1基因的突变也降低SHY2/IAA3蛋白的降解[25]。这些功能获得和功能丧失突变体的表现型说明SHY2/IAA3可调节根系中多种生长素反应，SHY2/IAA3可能激活某些生长素反应，而抑制另外一些反应。目前，人们对SHY2/IAA3蛋白所激活或抑制的蛋白尚不清楚。
此外，CRANE/IAA18蛋白中的II域发生突变则抑制侧根形成。拟南芥突变体crane-1和crane-2急剧减少侧根形成，并对生长素反应下降[26]。在根中，IAA18启动子∶∶GUS在侧根形成的早期阶段表达。酵母双杂交试验表明，IAA18与ARF7和ARF19相互作用[26]。
2ARFs蛋白和相关smRNA对侧根形成的影响
在拟南芥基因组中，存在23种基因编码ARF蛋白[1，3]。ARFs蛋白在N末端都含有DNA结合域（DBD），且大多数在C末端含有二聚化作用域（CTD）。在紧邻DBD的C末端，ARFs含有一个非保守的区域，即中间域（MR），它作为转录抑制或转录激活域起作用[27]。拥有富含谷胺酰胺的MR的ARFs为转录激活因子，而其他则为转录抑制因子。ARFs与Aux/IAA蛋白结合，形成异二聚体（如MSG2/IAA19与NPH4/ARF7的C末端域结合[11]，这样它们就不能与生长素反应基因中的AuxRE元件结合，从而不能促进生长素反应基因的表达，从而影响侧根的形成。
如上所述，NPH4/ARF7与Aux/IAA19共同作用，调节拟南芥侧根的形成，这种合作的另一方面就是生长素诱导的MSG2/IAA19基因的表达依赖于NPH4/ARF7 [11]，而NPH4/ARF7能够单独促进生长素对侧根形成的诱导[28]。功能基因组分析表明，ARF7的功能与ARF19的功能重叠[29]。在侧根形成过程的初始阶段，AFR19是必需的[30]。单突变体nph4-1和arf19-4的幼苗的侧根数量与野生型的相似，而双突变体nph4-1 arf19-4幼苗则不形成侧根[28-29]。
ARF7和ARF19调节侧根形成需激活LBD/ASLs基因。对arf7 arf19转基因植株进行目标基因分析，结果表明ARF7和ARF19直接调节生长素介导的LBD16/ASL18和/或LBD29/ASL16在根中的转录。在ARF7和ARF19缺乏的情况下，LBD16/ASL18和LBD29/ASL16的超表达可以诱导侧根的形成，而LBD16/ASL18活动的显性抑制则可抑制侧根的形成[30]。因此，在侧根形成过程中，这些LBD/ASL蛋白作用依赖ARF7和ARF19的生长素信号转导的下游。目前，LBD/ASL蛋白调节侧根形成的机理尚不清楚。
ARF2是一种植物发育的多效调节蛋白[31-32]，它是一种转录抑制蛋白[27，33-34]。Okushima等[31]鉴定3种arf突变体等位基因（arf2-6，arf2-7，arf2-8），这些突变体显示多种发育表现型，包括侧根的形成。表达格局分析表明，ProARF2∶GUS的表达可在侧根形成的初始位置检测到[31]。尽管arf2突变体幼苗的主根生长受到外源IAA的抑制，但其侧根的数量与野生型则没有差别[31]。
目前，人们尚不清楚其他ARFs蛋白对侧根形成的影响，但已知几种ARF蛋白的特性，如ARF1为转录抑制蛋白[27，33-34]，ARF5、ARF6、ARF8和ARF19拥有富含Gln的MR，可能起转录激活蛋白的作用[33]。
smRNA包括miRNA和siRNA，它们是两类非编码的RNA，它们在调节植物基因表达方面具有重要的功能。miRNA和siRNA可通过使同源的mRNA降解[35-38]、翻译抑制[39-40]或染色质修饰[41-45]等方式，从而在转录后使基因沉默，因而能极大地调节植物的生长发育以及植物对环境胁迫的反应[46-47]。同样地，miRNA和siRNA也可以对ARF基因产生影响，从而影响植物侧根的形成。
在拟南芥中，miR160负责ARF10、ARF16和ARF17的调控[46，48]。在侧根形成过程中，ARF17为负调节因子[48]，miR160对ARF17的调控则影响侧根的形成。表达5mARF17的植株可增加ARF17 mRNA水平，改变可受生长素诱导的YDK1/GH3.2、GH3.3、GH3.5和DFL1/GH3.6的水平，且5mARF17幼苗则含有较少的侧根[49]。Williams 等[50]鉴定了一种反式作用siRNA，即tasiR-ARF。这种tasiR-ARF作用于3种ARF基因（ARF2，ARF3/ETT，ARF4）。目前仍不清楚tasiR-ARF如何影响侧根形成。ARF6和ARF8在侧根形成过程为正调节因子，是miR167的目标[48]，但目前尚不清楚miR167如何影响ARF6和ARF8而对侧根形成产生作用。
miR390为拟南芥中的TAS3 tasiRNA，它裂解TAS3前体RNA，产生tasiRNA-ARF。这种tasiRNA-ARF裂解ARF3/4的转录物[51]。miR390在侧根起始的位置特异表达，在这个位置诱发tasiRNA的产生[52]。这些新产生的tasiRNA抑制ARF2、ARF3和ARF4，从而抑制侧根的形成。ARF2、ARF3和ARF4则影响生长素对miR390的累积[52]。这样，ARF2、ARF3和ARF4对miR390的正负反馈调节确保了miR390表达格局的适当限制。miR390的表达对依赖于TIR1的转录调节和生长素浓度非常敏感，且tasiRNA-ARF途径与ARF4之间的相互负调节可以改变ARF4D的时空表达格局[51]。尽管人们对miR390对侧根形成的影响尚不十分清楚，但Yoon 等[51]指出，通过miR390的转录和生长素的感应，tasiRNA-ARF途径介导生长素反应以及ARF4所介导的侧根发育过程。
如上所述，拟南芥含有23种ARF基因，那么除了上述几种ARF基因外，其他ARF基因受何种miRNA或siRNA的调节以及其对侧根形成的影响需进行更深入的研究。
3结语
侧根形成对于植物固定、营养和水分吸收以及根际微生物的活动维持等诸多方面具有重要的作用。在全球磷矿资源日益枯竭的时代，植物侧根发育对于磷吸收更为重要。植物侧根的形成受到诸多因素的影响，在侧根形成研究方面，人们涉及甚广。该综述仅限于对Aux/IAA和ARF两大类蛋白对植物侧根形成的影响进行评述，而其他许多因子均未涉及，有待于更进一步研究。
4参考文献
[1] LISCUM E，REED J W.Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development[J].Plant Mol Biol，2002，49（3-4）：387-400.
[2] HAGEN G，GUILFOYLE T.Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J].Plant Mol Biol，2002，49（3-4）：373-385.
[3] REMINGTON D L，VISION T J，GUILFOYLE T J，et al.Contrasting modes of diversification in the Aux/IAA and ARF gene families[J].Plant Physiol，2004，135（3）：1738-1752.
[4] DREHER K A，BROWN J，SAW R E，et al.The Arabidopsis Aux/IAA protein family has diversified in degradation and auxin responsiveness[J].Plant Cell，2006，18（3）：699-714.
[5] ALBEL S，NGUYEN MD，THEOLOGIS A.The PS-IAA4/5-like family of early auxin-inducible mRNAs in Arabidopsis thaliana[J].J Mol Biol，1995，251（4）：533-549.
[6] ULMASOV T，HAGEN G，GUILFOYLE T J.Dimerization and DNA binding of auxin response factors[J].Plant J，1999，19（3）：309-319.
[7] WORLEY CK，ZENSER N，RAMOS J，et al.Degradation of Aux/IAA prot-eins is essential for normal auxin signaling[J].Plant J，2000，21（6）：553-562.
[8] COLON-CARMONA A，CHEN D L，YEH K C，et al.Aux/IAA proteins are phosphorlated by phytochrome in vitro[J].Plant Physiol，2000，124：1728-1738.
[9] OUELLET F，OVERVOORDE P J，THEOLOGIS A.IAA17/AXR3：bioch-emical insight into an auxin mutant phenotype[J].Plant Cell，2001，13（4）：829-842.
[10] TIWARI S B，WANG X J，HAGEN G，et al.AUX/IAA proteins are active repressors，and their stability and activity are modulated by auxin[J].Plant cell，2001，13（12）：2809-2822.
[11] TATEMATSU K，KUMAGAI S，MUTO H，et al. MASSUGU2 encodes Aux/IAA19，an auxin-regulated protein that functions together with the transcript ional activator NPH4/ARF7 to regulate differential growth responses of hypocotyl and formation of lateral roots in Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell，2004，16（2）：379-393.
[12] KIM H，PARK P J，HWANG H J，et al.Brassinosteroid signals control expression of the AXR3/IAA17 gene in the cross-talk point with auxin in root development[J].Biosci Biotechnol Biochem，2006，70（4）：768-773.
[13] KNOX K，GRIERSON C S，LEYSER O.AXR3 and SHY2 interact to regu-late root hair development[J].Development，2003，130（1）：5769- 5777.
[14] BLILOU I，FRUGIER F，FOLMER S，et al.The Arabidopsis HOBBIT gene encod es a CDC27 homolog that links the plant cell cycl to progression of cell differentiation[J].Genes Development，2002，16（10）：2566-2575
[15] SERRALBO O，PEREZ-PEREZ J M，HEIDSTRA R，et al.Non-cell-automonous rescue of anaphase-promoting complex function revealed by mosaic analysis of HOBBIT，an Arabidopsis CDC27 homolog[J].PNAS，2006，103（35）：13250-13255.
[16] HARPER J W，BURTON J L，SOLOMON M J.The anaphase-promoting comp lex：its' not just for mitosis more[J].Genes Development，2002，16（10）：2179-2206.
[17] PETERS J M.The anaphase-promoting complex：proteolysis in mitosis and beyond[J].Mol Cell，2002，9（5）：931-943.
[18] FUKAKI H，NAKAO Y，OKUSHIMA Y，et al.Tissue-specific expression of stabilized SOLITARY-ROOT/IAA14 alters lateral root development in Arabidopsis[J].Plant J，2005，44（3）：382-395.
[19] VANNESTE S，DE RYBEL B，BEEMSTER G T S，et al.Cell cycle prog-ression the the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell，2005，17（1）：3035-3050.
[20] ROGG L E，LASSWELL J，BARTEL B.A gain-of-function mutation in IAA28 suppresses lateral root development[J].Plant Cell，2001，13（3）：465-480.
[21] NAGPAL P，WALKER L M，YOUNG J C，et al.AXR2 encodes a member of the Aux/IAA protein family[J].Plant Physiol，2000，123（2）：563-573.
[22] MUTO H，WATAHIKI M K，NAKAMOTO D，et al.Specificity and simi-larity of functions of the Aux/IAA.genes in auxin signaling of Arabido-psis revealed by promoter-exchange experiments among MSG2/IAA19，AXR2/IAA7，and SLR/IAA14[J].Plant Physiol，2007，144（1）：187-196.
[23] HAYASHI K，JONES A M，OGINO K，et al.Yokonolide B，a Novel inhi-bitor of auxin action，blocks degradation of AUX/IAA factors[J].J Biol Chem，2003，278（26）：23797-23806.
[24] TIAN Q，REED J W.Control of auxin-regulated root development by the Arabidopsis thaliana SHY2/IAA3 gene[J].Development，1999，126（15）：711-721.
[25] TIAN Q，NAGPAL P，REED J W.Regulation of Arabidopsis SHY2/IAA3 protein turnover[J].Plant J，2003，36（5）：643-651.
[26] UEHARA T，OKUSHIMA Y，MIMURA T，et al.Domain II mutations in CRANE/IAA18 suppress lateral root formation and affect shoot developm-ent in Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Physiol，2008，49（7）：1025-1038.
[27] TIWARI S B，HAGEN G，GUILFOYLE T.The roles of auxin response factor domains in auxin-responsive transcription[J].Plant Cell，2003，15（2）：533-543.
[28] WILMOTH J C，WANG S，TIWARI S B，et al.NPH4/ARF7 and ARF19 promote leaf expansion and auxin-induced lateral root formation[J].Plant J，2005，43（1）：118-130.
[29] OKUSHIMA Y，OVERVOORDE P J，ARIMA K，et al.Functional geno-micysis of the AUXIN RESPONSE FACTOR gene family members in Arabi dopsis thaliana：unique and overlapping functions of ARF7 and ARF19[J].Plant Cell，2005，17（2）：444-463.
[30] OKUSHIMA Y，FUKAKI H，ONODA M，et al.ARF7 and ARF19 regul-ate lateral root formation via direct activation of LBD/ASL genes in Arabido psis[J].Plant Cell，2007，19（1）：118-130.
[31] OKUSHIMA Y，MITINA I，QUACH HL，et al.AUXIN RESPONSE FA-CTOR2（ARF2）：a pleiotropic developmental regulator[J].Plant J，2005，43（1）：29-46.
[32] LIM P O，LEE I C，KIM J，et al.Auxin response factor 2（ARF2）plays a major role in regulating auxin-mediated leaf longevity[J].J Exp Bot，2010，61（5）：14191430.
[33] ULMASOV T，HAGEN G，GUILFOYLE T J.Activation and repression of transcr iption by auxin response factors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（10）：5844-5849.
[34] HARDTKE C S，CKURSHUMOVA W，VIDAURRE D P，et al.Overlap-ping and non-redundant functions of the Arabidopsis auxin response factors MONOPTEROS and NONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL4[J].Develop ment，2004，131（925）：1089-1100.
[35] LLAVE C，XIE Z，KASSCHAU K D，et al.Cleavage of scarecrow-like mRNA targets directed by a clas of Arabidopsis miRNA[J].Science，2002，297（5589）：2053-2056.
[36] KASSCHAU K D，XIE Z，ALLEN E，et al.P1/HC-Pro，a viral suppressor of RNA silencing，interferes with Arabidopsis development and miRNA function[J].Development Cell，2003，4（2）：205-217.
[37] TANG G，REINHART BJ，BARTEL DP，et al.A biochemical framework for RNA silencing in plants[J].Genes Development，2003，17（10）：49-63.
[38] PALATNIK J F，ALLEN E，WU X，et al.Control of leaf morphogenesis by microRNAs[J].Nature，2003，425（6）：257-263.
[39] AUKERMAN M J，SAKAI H.Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-Like target genes[J].Plant Cell，2003，15（11）：2730-2741.
[40] CHEM X.A microRNA as translational repressor of APETALA2 in Ara-bid opsis flower development[J].Science，2004，303（5666）：2022-2025.
[41] VAZQUEZ F.Arabidopsis endogenous small RNAs highways and byways[J].Trends Plant Sci，2006，11（9）：460-468.
[42] VAUCHERET H.Post-transcriptional small RNA pathways in plants：me-cha nisms and regulations[J].Genes Development，2006，20（4）：759-771.
[43] JONES-RHOADES M W，BARTEL D P，BARTEL B.MicroRNAs and the regula tory roles in plants[J].Anu Rev Plant Biol，2006，57（2）：19-53.
[44] KLENOV M S，LAVROV S A，STOLYARENKO AD，et al.Repeat-asso-ciated siRNAs cause chromatin silencing of retrotransponsons in the Drosophila melano gaster germiline[J].Nucleic Acids Res，2007，35（16）：5430-5438.
[45] GODLEWSKI J，NOWICKI M O，BRONISZ A，et al.Targeting of the Bmi-1 oncogene/stem cell renewal factor by microRNA-128 inhibits glioma proliferation and self-renewal[J].Cancer Research，2008，68（8）：9125-9130.
[46] BARTEL B，BARTEL D.MicroRNAs：At the root of plant development?[J].Plant Physiol，2003，132（2）：709-717.
[47] ECKARDT N A.MicroRNAs regulate auxin homeostasis and plant deve-lopm ent[J].Plant Cell，2005，17（2）：1335-1338.
[48] GUTIERREZ L，BUSSELL J D，PACURAR D I，et al.Phenotypic Plast-icity of Adve ntitious Rooting in Arabidopsis Is Controlled by Complex Regulation of AUXIN RESPONSE FACTOR Transcripts and MicroRNA Abundance[J].Plant Cell，2009，21（10）：3119-3132.
[49] MALLORY A C，BARTEL D，BARTEL B.MicroRNA-directed regulat-ion of Arab idopsis AUXIN RESPONSE FACTOR17 is essential for proper develop ment and modulates expression of early response genes[J].Plant Cell，2005，17（5）：1360-1375.
[50] WILLIAMS L，CARLES C C，OSMONT K，et al.A database analysis method ide ntifies an endogenous trans-acting short-interfering RNA that targets the Arabidopsis ARF2，ARF3，and ARF4 genes[J].PNAS，2005，102（27）：9703-9708.
[51] YOON E K，YANG J H，LIM J，et al.Auxin regulation of the microRNA 390-dependent transacting small interfering RNA pathway in Arabi dopsis lateral root development[J].Nucleic Acids Res，2010，38（4）：1382-1391.
植物蛋白篇4
关键词：蛋白质组；双向电泳；双向电泳；植物
中图分类号：Q946.1文献标识码：A
由于基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现，因此蛋白质是生命活动真正的执行者。蛋白质组学是后基因组时代功能基因组学研究的新兴学科和热点领域，借助于多种技术从整体水平研究生物体内蛋白质。Cordwell等于1997年提出了功能蛋白质组（functional proteome）的概念，即在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白。蛋白质组学研究主要包括蛋白的表达模式和蛋白的功能模式两个方面。
1蛋白质组分离技术
合理的样品制备是获得高分辨率、高重复性的2-DE图谱的保证。植物蛋白质常用提取方法包括：酚提取法、分步提取法和TCA-丙酮沉淀法等。为了增加蛋白溶解液的溶解能力，常加入离液剂、表面活性剂、还原剂等。为了更好的使胞内低组分蛋白在2-DE胶中得以成像，蛋白的染色技术就显得至关重要。常用的蛋白质的染色方法有银染法、考马斯亮蓝染色、荧光染色、负染法和同位素标记等。利用图像分析系统对2-DE凝胶图像进行保存，以利于进一步的分析。图像采集时，要注意扫描系统的分辨率及扫描方式，保证捕获的蛋白点的光密度信息与蛋白点的表达丰度成正比。然后进行图像分析，包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据分析。
2蛋白质组鉴定技术
质谱技术具有高灵敏度、高通量及自动化，从而能与蛋白质组大规模研究相适应。其原理是将样品分子离子化，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定相对分子质量。质谱鉴定主要有两种方法：肽质量指纹图谱法（peptide mass fingerprint，PMF）和肽序列标签法（peptide sequence tag，PST）。肽质量指纹图谱的原理是通过测定一个蛋白质酶解混合物中肽段的电离飞行时间来确定其分子量等数据，这一图谱对蛋白质应是专一而特异，然后所得的肽片断质量与数据库中理论肽质量相匹配。肽序列标签技术是经质谱分析的肽段进一步断裂，分解为氨基酸或含有C末端的片断，再次进行质谱分析，得到肽序列信息。片断的数据不仅可以在蛋白质序列数据库中搜寻，还可以在核酸数据库，如EST数据库中搜寻。
3蛋白质组生物信息学技术
生物信息学通过对生物学实验数据的采集、加工、存储、检索与分析，达到解释数据所蕴含的生物学意义的目的。在进行蛋白质功能预测和结构分析时，生物信息学就成为蛋白质组学研究的核心技术之一。目前蛋白质组生物信息学主要围绕对双向电泳、质谱、蛋白质测序等实验技术获得的数据进行生物信息的获取与加工等。数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。随着蛋白质组数据库的建立，出现了许多蛋白质组辅助分析软件，主要包括三类：2-DE凝胶成像分析软件、蛋白鉴定分析软件和蛋白特征化软件。蛋白质组研究依赖于生物信息学的理论、技术与数据库，为迅速准确地研究和鉴定蛋白质奠定了基础。
4双向电泳技术在植物基因功能研究中的应用
植物在生长发育过程中会受到各种不利环境因子如高温、低温、干旱和高盐等，植物感受这些逆境信号后通过信号转导过程调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，进而调整自身的生理状态或形态的改变来适应不利环境。利用蛋白质组学技术为我们寻找更多且更有效的新抗逆相关基因或蛋白开辟了新的方向。
Bongani等以拟南芥细胞悬浮培养物为材料，系统研究了盐胁迫和高渗胁迫对植物细胞蛋白质的影响。研究发现在胁迫条件下有266个蛋白表现出丰度的变化。鉴定出了75个差异蛋白，分属于10个功能类型［1］。Lee等研究了水稻叶片在低温胁迫下低丰度蛋白的表达。蛋白样品经双向电泳分离，使用MALDI-TOF质谱技术及ESI MS-MS技术分析鉴定蛋白点，共发现12个上调表达蛋白，同时鉴定出一些新的蛋白，为进一步提高转基因植物的耐冷性的研究提供了理论基础［2］。Li等利用双向电泳技术和MALDI-TOF/MS技术分析了铁离子对番茄根中蛋白表达的影响，共得到97个差异表达的蛋白，其中上调表达蛋白涉及代谢途径［3］。采用2-DE技术对转基因prosystemin烟草植株叶片进行蛋白质组分析，研究表明番茄中系统素基因在烟草中组成型表达影响蛋白合成，经统计分析，显著差异的蛋白点为21个［4］。
采用蛋白质组学的方法分析CA-OsRac1水稻，共检测到258个表达发生变化的蛋白，其中206个被上调，52个被下调。SE激发子诱导100个蛋白表达，其中87个同时也是受CA-OsRac1调控，这表明OsRac1在抗病反应中起很重要的作用［5］。为了研究超表达S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（AdoMetDC）对转基因植株影响和多胺分解，采用蛋白质组技术分析转基因烟草叶片蛋白质组。研究发现，在转基因植株中只有一系列叶绿体核糖白同源异构体发生变化，且蛋白表达丰度降低。同时，超表达AdoMetDC引起 PR1防卫蛋白家族8个同源异构体的上调表达，如PR-1a，PR-1b 和PR-1c等［6］。
5结论
蛋白质组学是蛋白质水平上直接研究基因功能的有效工具。但蛋白质组技术仍存在一些问题，如蛋白样品制备效率低；疏水性蛋白分离难度大；蛋白质组定量问题等。并且植物中大部分蛋白未能有效鉴定，植物蛋白质组学研究仍主要集中在少数测序的植物。随着蛋白质研究技术不断完善，以及植物EST数据库的丰富，蛋白质组学在植物胁迫应答调控途径中研究将越来越广泛和深入。
参考文献
［1］Bongani KN，Stephen C，William JS，et al．，Identification of Arabidopsis salt and osmotic stress responsive proteins using two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry［J］．Proteomics．2005（05）：4185-4196．
［2］Lee DG，Ahsan N，Lee SH，et al．，A approach to identify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf，2007（330）：215-225．
［3］Li J，Wu XD，Hao ST，et al．，Proteomic response to iron deficiency in tomato root［J］．Proteomics，2008（08）：2299-2311．
［4］Rocco M，Corrado G，Arena S，et al．，The expression of tomato prosystemin gene in tobacco plants highly affects host proteomic repertoire．J．Proteomics，2008（71）：176-185．
［5］Fujiwara M，Umemura K，Kawasaki T，et al．，Proteomics of Rac GTPase signaling reveals its prekominant role in elicitor-induced defense response of cultured rice cells［J］．Plant Physiol，2006（140）：734-745．
植物蛋白篇5
关键词：糖蛋白；提取分离；抗氧化性
我国植物覆盖率很高，充分利用植物提取生物的抗氧化物质运用于工业、商业乃至生活中，必然能达到很好的经济效益，从而促进经济可持续发展。糖蛋白是一类由糖类同多肽或蛋白质以共价键连接而形成的结合蛋白，普遍存在植物中，特别是在部分工业产物的副产物中，充分再利用能起到有效的资源配置。
一、糖蛋白的提取分离研究进展
水提取法 秦宏伟等[1]人的研究结果表明：甘薯糖蛋白提纯最佳条件为室温条件下水浸提，料液比为1：6，提取时间1h，提取次数3次，上清液加无水乙醇沉淀，透析3d，用deae-52和sephadex g-100 柱层析，经定性、定量分析得到甘薯糖蛋白纯品。
盐溶液或缓冲溶液浸提 袁燕等[2]用20 mmol/l pbs，ph 7.2 （内含2. 5mol/l （nh4 ） 2 so4 ）的缓冲液平衡疏水预装柱hip reptm phenyl ff （high sub， 20 ml）4个柱体积，进样，用去离子水按0～80%线性梯度洗脱11个柱体积， 4 ml /min， 280 nm紫外吸收检测，按峰高用分部收集器收集提取了蒜头果蛋白。
醇溶液提取 k0等[3]将漆树果实粉碎，在黑暗的地下室用99%乙醇浸渍数月，然后用滤纸过滤乙醇浸提物，经旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，并经硅胶柱层析，收集70%乙醇洗脱液，再经冻千、盐析、透析等步骤获得糖蛋白。
酸碱溶液提取 孙艳丽[4]等人用ph 值为6.5～7.5 的1%的亚硫酸氢钠溶液可较好的从甘薯叶片中提取可溶性蛋白质。经浸提、沉淀、透析、冻干处理获得的台农叶片蛋白粉中含有62.6%粗蛋白。
还有酶解法提取，是将不溶性糖蛋白转化为可溶性糖肽、游离肽或氨基酸，从而提高提取率。
二、抗氧化能力测定方法的研究进展
抗氧化能力的测定方法主要包括体内和体外评价两大类，但是体内环境复杂，多用体外评价方法，体外研究为体内研究奠定了基础。
过氧化值（pv）法 此法是测量脂质氧化最常用的方法，反映了脂质和含脂原料中氢过氧化物和脂质过氧化物的总含量。测量pv 的方法有很多，但其原理均系碘化氢还原。但是碘化氢易被氧化，还极易与碳碳双键加成，而且生成的碘也能与不饱和双键加成，使测得的结果偏低。
（1）硫氰酸铁（ftc）法。此法是根据脂质氧化产生的过氧化物将fe2 + 氧化成fe3 + ，fe3 + 与硫氰酸铵反应，生成的硫氰酸铁在500 nm 处有强吸收，通过500 nm 吸光度的变化可测得过氧化物的含量。
（2）dpph法。dpph法可分为动力学法和静力学法2种。dpph·是一种很稳定的自由基，在乙醇溶液中呈深紫色，在517nm处有最大吸收峰，当有自由基清除剂（ah）：存在时，其单电子被结合而使其颜色减褪，在最大吸收波长处的吸光度减小，减小的程度与清除剂的清除能力（a·越稳定，抗氧化能力越强）及其数量呈定量关系。该能力用清除率ip表示，ip值越大，样本抗氧化能力越强。rathee等[5]用dpph法测nagkesar的甲醇提取物和水-乙醇提取物的抗氧化性，结果显示甲醇提取物的清除能力（ic508.33±0.39lg/ml）优于水-乙醇提取物的清除能力。
（3）化学发光（cl）法。其基本原理是活性自由基氧化发光剂能发光，发出的光可由发光计检测，容易记录。抗氧化剂是活性自由基清除剂，它能抑制cl ，使发光强度减弱，通常有一个明确的诱导期（ tind） 。抗氧化活性以trolox 当量的形式给出。由抗氧化剂抑制cl的能力（由t ind估算） 与trolox 抑制cl 能力的比值可定量得出样品的抗氧化能力。
（4）trap法。其原理是，抗氧化剂干扰由aaph 或abap 产生的自由基与目标探针之间的反应，目标探针已使用的有r - 藻红蛋白荧光物质，abts 吸光度，耗氧量，最后以抗氧化剂滞后反应时间来比较抗氧化能力的大小，结果用trolox 当量来表示。
（5）清除超氧阴离子自由基能力的测定。主要有邻苯三酚自氧化法（mtt），即邻苯三酚在碱性条件下自动氧化，不断释放出o·，o·又可进一步促进自氧化。在邻苯三酚自氧化30～40s后，中间物积累浓度与时间呈线性关系，一般线性时间可维持4min左右，可求得自氧化速率来表征o·的清除能力。加入电子传递物质gr
ess氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，蒸馏水调零，用分光光度计测550nm处的吸光度，计算出试样溶液对o2-·的清除能力。
（6）清除羟基自由基能力的测定。fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应：h2o2+ fe2+ fe3+ +oh- +· oh 。h202的量和fenton反的·oh量成正比，当给予电子受体后，用gress 试剂成红色物质，其呈色与·oh的多少成正比关系。于550 nm处测定各管吸光度值，vc为对照品。
（7）还原力的测定。实质上是检验物质是否为良好的电子供应者的过程。还原力强的物质供应的电子除可以还原氧化性物质外，也可与自由基反应，使自由基成为稳定的物质。普鲁士蓝fe4 （fe（cn）6）生成量作为指标。将赤血盐k3fe（cn）6还原成黄血盐，再利用fe2+形成普鲁士蓝。700nm吸光值反映普鲁士蓝的生成量，吸光度值越大，样品还原力值愈强，表示抗氧化效果愈佳。
三、结论
植物糖蛋白抗氧化性优越，本文搜集的提取分离方法及抗氧化能力测定方法为其充分利用提供可能，形成工业化集约生产，长久以来必将带来良好的经济效益和环境效益，有重要的现实意义。
参考文献：
[1]秦宏伟，杨红花，王明林.甘薯糖蛋白分离纯化工艺研究[j].粮食与油脂，2006，（2）：27～29
[2]袁燕，戴晓畅，段玲燕. 蒜头果中一种新的植物蛋白（malanin）的分离纯化[j]. 云南大学学报（ 自然科学版），2009，31（4）：428～432
[3] ko j h，lee s j，lira kt.36 kda glycoprotein isolated from rhus verniciflua stokes fruit has a protective activity to glucose/glucose oxidase-induced apoptosis in nih/3t3 cells[j].toxicol in vitro，2o05，19（3）：353～363
[4]孙艳丽，刘鲁林，木泰华.甘薯叶片可溶性蛋白提取方法探索及其成分分析[j].食品工业科技， 2006，27（11）：88～91
植物蛋白篇6
1.1 大豆蛋白的研究背景
近年来，随着人们生活水平的提高，对膳食结构的要求也越来越高，而大豆的营养价值很高，是一种优质的高蛋白、高脂肪作物，含蛋白质40％-45％，每100g含蛋白质36-50g，生物学价值接近肉类。氨基酸组成也与动物蛋白质近似，并含有较多的赖氨酸，属于完全蛋白质(完全蛋白质就是包含有人体所需的22种氨基酸，且比例适当的蛋白质，动物蛋白和豆类蛋白都属完全蛋白），可以充足地提供人体所需的八种必需氨基酸以及多种维生素和矿物质等，并有降低人体血液中胆固醇含量的作用，因此被越来越多的人所认可。并且，其在食品加工领域也有广泛的应用前景，可制成各种富有营养的食品，充分使人体最大限度地吸收大豆蛋白质以满足恢复期病人、消化功能衰退的老年人、消化能力尚束成熟的婴幼儿及急需体力补充的运动员及高血脂、高血压等人群的营养要求[1]。
大豆蛋白资源丰富，原料成本低廉，具有乳化性、起泡性等功能特性。同时，大豆蛋白也有一些性质不能满足人们的要求，从而影响它作为食物的可接受性，例如溶解性、胀气因子、不良气味等。因为大豆蛋白主要由7s和11s球蛋白组成，从而使得SPI的消化率和生物效价远不及牛奶等动物蛋白质：一般动物蛋白质的消化率为90％-98％ ，而植物蛋白质的消化率为73％。但经过对大豆蛋白的酶法水解，将大分子大豆蛋白质水解成小分子多肽和氨基酸，可提高大豆蛋白的生物效价，易为人体吸收和消化。同时还可以提高溶解度，降低粘度，改善大豆蛋白的功能特性[2]。
1.2 固定化酶的研究背景
1.2.1 酶固定化的方法
酶的固定化是利用化学或物理手段将游离酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性和可反复使用的一种技术[3]。
酶的固定方法有很多，主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。
吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。采用吸附法制备固定化酶或固定化菌体，操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用，但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。
包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构[4]，应用最为广泛。包埋法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用，包埋材料主要有琼脂、琼脂糖、卡拉胶、明胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、纤维素等，其中海藻酸钠具有无毒、安全、价格低廉、材料易得等特点，是食品酶工程中常用的包埋材料之一[5]。
结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法。根据结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。用离子键结合法固定，条件温和，操作简便。只需要在一定的pH值，温度和离子强度等条件下。用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构想而影响酶的催化活性。
交联法：借助双功能试剂使用酶分子之间交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不方便。
热处理法：将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到的固定化菌体。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不方便。
以上这5种常见的酶的固定方法各自有各自的优点和缺点，必要时可以结合其中的不同种方法进行固定以取长补短，可以制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体[6]。
1.2.2 固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之出，具有显著的优点。因此已广泛地应用于食品、医药、环境等领域。
(1) 固定化酶在食品方面的应用
固定化酶得到最早和最广泛应用的领域是食品工业，目前已有几十种酶应用于食品工业。据2000 年的统计，国际上所生产的酶总产量有近40%应用于食品工业的生产。而且应用的酶剂还在不断增加。食品工业中应用的酶法生产方式也由传统的向现代化的方式转变。而且，固定化酶和固定化细胞在食品领域的应用越来越广泛 [7]。比如说，固定化酶在乳酸生产、果汁生产等食品工业方面都有一定的应用。
(2) 固定化酶在医药方面的应用
固定化酶在医药方面的应用已经越来越广泛。固定化酶应用于医学工业不仅仅限制于药物合成上。如Odaci 等[8]将漆酶固定于生物传感器的氧极制成酶电极，用于检测药物扑热息痛(paracetamol)。Tang 等[9]基于固定anti-AFP酶制成了一种免疫测定系统，并分析了它的作用原理,并预期能在临床上有广泛的用。
(3) 固定化酶在环境方面的应用
废水处理中，由于废水组分复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶，很难收到好的处理效果。因此，要用多种单一的固定化酶组合处理，才能使有机物完全无机化和稳定化。如德国将九种降解对硫磷农药的酶共价组合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理硫磷废水获得95%以上的处理效果，连续工作70天酶的活性没有变化，说明多种酶的作用大于单一酶的作用[10]。
(4) 固定化酶应用的展望
毋庸置疑，固定化酶已经在多个方面都有了广泛的应用，而且仍有很多尚在研究过程中。不过，有一点是可以明确地：随着固定化技术的发展, 将会有更多的固定化酶应用于生产, 充分显示出固定化技术的优越性, 开启固定化技术的新局面。
1.3 固定化酶水解大豆蛋白的优势
传统工业从大豆中得到能被人体直接吸收的游离氨基酸是采用酸水解，但是在酸水解过程中常会产生对人体有害的致癌物——氯丙醇[11]。中性蛋白酶具有较高的蛋白水解能力，但是如果直接用游离酶进行水解，酶的稳定性差，酶只能使用一次，所得的产物难以分 离。而固定化酶可提高酶的稳定性，其热稳定性、pH稳定性均显著高于游离酶[12]，还有易于和产物分离、可反复多次使用等优点，因而受到越来越广泛的重视和应用。目前世界各国都在不断研究这一领域。
2.实验部分
2.1 材料和准备工作
2.1.1 实验材料与仪器设备
(1) 主要实验材料
木瓜蛋白酶（BR）： 江苏天锡天达酶制剂有限公司
无水氯化钙（AR）： 衢州巨化试剂有限公司
海藻酸钠（AR）： 中国医药上海化学试剂公司
无水乙醇（AR）： 安徽安特生物化学有限公司
氢氧化钠（AR）： 杭州萧山试剂厂
甲醛（AR）： 衢州巨化试剂有限公司
草酸（AR）： 上海美兴化工有限公司
其他试剂均为常规试剂
大豆： 市售
(2) 主要实验设备
SW-CJ-1B型单人单面净化工作台： 苏州净化设备有限公司
XQ-LS-30SI型立式压力蒸汽灭菌锅： 上海博迅有限公司医疗设备厂
DHZ-DA型摇床： 太仓实验设备厂
HZ-9210K型摇床： 太仓市科教器材厂华利达实验设备公司
MJX-250B-Z型霉菌培养箱： 上海博迅有限公司医疗设备厂
双层铁皮电炉： 浙江嘉兴市凤桥电热器厂
GO-5003B型搅拌机： 广东省中山市哥尔电器有限公司
自制固定床装置如图1所示。
↑产物
大豆蛋白液→
图1 自制固定床装置图
2.1.2 准备工作
(1) 大豆蛋白液制备
称取一定量大豆加一定量温水浸泡12h后在0.1Mpa高压蒸汽灭菌锅内煮熟10min，迅速降压至常压下取出，用豆浆机磨浆，过滤去渣， 调pH值到中性（pH=7.0），再用高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却后放入4OC冰箱中备用。
(2) NaOH标准溶液的配制及标定
a. 快速称取化学纯固体氢氧化钠约4g（因它易吸潮，不易称准），先用烧杯将NaOH溶解，倒入容量瓶中加蒸馏水定容到1L。
b. 标定：用草酸标定
干净的碱式滴定管用少量NaOH溶液洗三遍, 再将NaOH溶液装入滴定管中,赶走橡皮管和尖嘴部分的气泡,调整管内液面的位置恰好为“0.00”。
用洗净且已用标准草酸溶液润洗过三遍的移液管准确量取20.00mL标准草酸溶液，加入锥形瓶中,加入2-3滴酚酞指示剂,摇匀。
将NaOH溶液滴入锥形瓶中,边滴边摇动，开始时，滴定速度可快一点，当接近终点，粉红色消失较慢时，开始逐滴加入碱液，每加入一滴都应摇匀,观察红色是否消失，决定是否再滴加，最后应控制加入半滴碱液,并用洗瓶冲洗锥瓶内壁,摇匀,30s内粉红色不消失,即认为已达终点,记下滴定管液面的位置。
如此标定三次（求三次液量相差不超过0.05mL），取其平均值。按N1V1=2N2V2公式计算当量浓度。
2.2 实验方法
2.2.1 酶的固定化方法
本实验采用海藻酸钠包埋法。
用天平准确称取一定量的海藻酸钠于100mL水中，再准确称取10g CaCl2于200mL水中，放入立式压力蒸汽灭菌锅灭菌中灭菌（另量取一定体积的水放入其中一起灭菌以制备无菌水）。
先将仪器、玻璃器皿等在净化工作台中在紫外灯的照射下灭菌15min，再用天平准确称取一定量的酶，在净化工作台将酶缓慢加入灭菌好的海藻酸钠溶液中，一边加一边搅匀（因中性蛋白酶在海藻酸钠溶液中极易结成颗粒状，不搅匀会导致酶的分布不均匀，而且会引起后面用注射器制备海藻酸钠凝胶珠过程中堵塞注射器）。混合均匀后，用注射器逐滴滴入灭菌好的5%（w/v）CaCl2溶液中进行凝胶化反应，于4oC冰箱中钙化2-3h，制备成直径约为3mm的海藻酸钠凝胶珠，用无菌水洗涤3次以洗去附在表面的CaCl2溶液，即得球状固定化颗粒。
图2 用注射器滴入CaCl2中
图3 包埋法固定化酶模式
2.2.2 自制固定床的安装
取固定化酶填充至反应柱, 将一定量一定浓度的大豆蛋白溶液倒入1500mL三口烧瓶中，并置于恒温水浴锅保温,然后用皮管将固定床、泵和三口烧瓶连成一个密封的循环，以恒流泵控制较缓和的系统流速, 循环反应。皮管中间连一段玻璃管，以便运行过程中观察循环是否正常，而且留一个取样口，平时用夹子夹住以维持无菌状态。此固定床下口为进口，上口为出口，如图1 所示。固定床在使用前要在净化工作台紫外线杀菌15min,装固定化酶过程中，手及皮管要用75%的乙醇杀菌。
2.2.3 游离氨基酸的测定方法
游离氨基氮的测量用双指示剂甲醛滴定法。
水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的—N+H3结合，使N+H3上的H+游离出来，与甲醛的反应：用过量的中性甲醛与氨基酸反应，可游离出氢离子，然后用NaOH滴定，从消耗的碱量可以计算出氨基氮的含量。
(1) 具体测量步骤
用10.00mL移液管精确吸取10.00mL样品水解液放入250mL烧杯中用于氨基氮的测量，加入蒸馏水80.00mL及3滴1%酚酞指示剂，用标定好的NaOH标准溶液滴定至刚显微红色（与未滴定的一瓶对照），所耗用的NaOH标准溶液毫升数即总酸滴定数。然后吸取甲醛10.00mL加入其中，摇匀，马上再用标定好的NaOH标准溶液滴定至粉红色（颜色与第一次相比，红色更深），记下加入甲醛后所耗的NaOH标准溶液毫升数（V），同时做空白实验，用蒸馏水代替样品液在同一条件下，作一空白滴定，记下所耗的NaOH标准溶液毫升数（V1）。
(2) 游离氨基氮计算：
氨基酸氮（g/100mL）=
式中V——加入甲醛后所耗用的已标定好的NaOH标准溶液毫升数
V1——空白滴定所耗用的已标定好的NaOH标准溶液毫升数
N——所用标定好的NaOH标准溶液的当量浓度
0.014——氮的毫克当量
10——吸取样品水解液10.00mL
2.2.4 实验流程
配海藻酸钠、CaCl2溶液→灭菌→将酶加入海藻酸钠中→酶的固定化
↓
大豆浸泡→大豆磨浆→调大豆蛋白液PH值→灭菌 →在无菌条件下放
入摇床(或者固定床)→每12小时测游离氨基值
3. 结果与讨论
3.1 NaOH标准溶液的浓度
经过3次标定，得值：10.19，10.21，10.23，取平均值10.21代入CNaOHVNaOH=2C草酸V草酸计算得NaOH浓度：
CNaOH=0.098mol/L
3.2空白滴定的结果
经滴定得空白对照：V1=1.09mL
3.3 固定化酶与游离酶的性能比较
固定化酶和游离酶对大豆蛋白的水解效果有较大的差别。取底物浓度（大豆：水）为1：7，固定化时间为2.5h，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）为3%，进行对比实验，实验结果如图4所示。
图4 游离酶和固定化酶的活性比较
由图4可看出：水解刚刚开始后，游离酶的水解效果要明显好于固定化酶。因为酶固定化后，酶与底物的接触受到了一定程度的阻碍，固定化酶与底物的接触明显没有游离酶与底物的接触充分。因此，游离酶在水解刚开始时得水解效果要好得多，并比固定化酶早12h到达峰值。
然而，游离酶与底物极难分离，如果要从中分离出游离酶则要付出较大的成本。
3.4 单因素实验确定最佳固定化条件
3.4.1 海藻酸钠浓度对酶固定化的影响
海藻酸钠浓度不但影响到凝胶珠的机械强度，而且还影响着底物及产物的扩散，进而影响带固定化酶的生物活性。当海藻酸钠浓度为2.0%时，形成的凝胶珠的机械强度较弱，有明显的拖尾现象，且凝珠脆弱，易破壁；当海藻酸钠浓度为4.0%时，由于溶液粘度较高，固定化时不易成球。
取底物浓度（大豆：水）为1：7，固定化时间为2.5h，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）分别为2.0%、3.0%、4.0%，进行单因素实验，实验结果如表1和图5所示。
表1 不同海藻酸钠浓度对酶固定化效果的影响
海藻酸钠浓度 凝胶珠强弱 凝胶珠形状 使用时间 游离氨基峰值（g/100mL） 成球难易度
2.0% 较弱 偏圆形 10d 0.129 较难
3.0% 适中 圆形 25d 0.120 易
4.0% - 不成球 - - -
图5 不同海藻酸钠浓度下水解效果
从表1和图5可知：海藻酸钠浓度过低，虽然游离氨基的峰值，可以达到较高水平，但是其可使用时间稍短，不利于固定化酶的反复使用，如2%浓度下，游离氨基峰值要高于3%浓度，这可能是因为在酶促反应期间底物和产物易通过凝珠微孔，反应速度较快。但其可是使用时间太少；海藻酸钠浓度过高，使用时间可以达到比较理想的状态，但是与外界的能量和物质的传递都受到了不小的障碍，酶的活性受阻，其游离氨基的峰值并不理想；而且当海藻酸钠浓度为4.0%时，由于溶液粘度较高，固定化时不易成球。当海藻酸钠浓度为3.0%时，虽然游离氨基的峰值有少许的降低，但是其可利用时间可达25d，符合反复使用的特性，凝珠的机械强度适宜，反应速度也较快。
3.4.2 固定化时间对酶固定化的影响
海藻酸钠的固定化过程是一个化学反应过程：CaCl2溶液中的Ca2+通过海藻酸钠凝胶珠由外向内置换Na+而形成海藻酸钙，而置换反应是需要一定时间的。不同固定化时间对大豆蛋白水解效果有所影响。取底物浓度（大豆：水）为1：7，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）为3.0%，固定化时间分别为2h、2.5h、3h，进行单因素实验，实验结果如表2和图6所示。
表2 不同固定化时间下水解大豆蛋白的峰值
固定化时间 游离氨基峰值（g/100mL）
2h 0.107
2.5h 0.119
3h 0.088
图6 不同固定化时间下水解效果
由表2和图6可以看出，固定化时间较短时，固定化酶的活性较低；固定化时间2.5h时效果最好，游离氨基峰值可达0.119g/100mL；当固定化时间继续增加，固定化酶的活性又降低，这主要是因为固定化时间较长，交联程度高，高分子链结较致密，底物扩散阻力增加，固定化酶活性降低[13]。
3.4.3 固定化酶浓度对水解效果的影响
固定化酶量直接关系到固定化酶的活性。酶液浓度越高，反应所需时间越短，反应速度越快。取底物浓度（大豆：水）为1：7，固定化时间为2.5h，海藻酸钠浓度（w/v）为3.0%，将酶浓度（固定化酶量：海藻酸钠溶液体积）调整为0.5%，1%，1.5%进行固定化后，进行单因素实验，测定固定化酶的活性，实验结果如表3所示。
表3 不同酶量下水解大豆蛋白的峰值水解大豆蛋白的峰值
固定化酶浓度 游离氨基峰值（g/100mL）
0.5% 0.105
1% 0.123
1.5% 0.124
由表3可以看出，在其他条件不变时，随着酶液量的增加，酶的活性有所提高。当酶液量与海藻酸钠用量比从0.5%增加到1%时，固定化酶活性极显著提高，之后酶液量与海藻酸钠用量从1%增加到1.5%，固定化酶活性变化不大。而酶的价钱是比较昂贵的，因此酶液量与海藻酸钠用量比为1%较为合适。
3.4.4 底物浓度对水解效果的影响
不同底物浓度对固定化酶水解大豆蛋白液效果有重要的影响。取固定化时间为2.5h，酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液浓度）为1%，海藻酸钠浓度（w/v）为3%，改变最佳底物浓度（大豆：水）分别为1:5、1:6、1:7、1:8，进行单因素实验，实验结果如表4和图7所示。
表4 不同底物浓度下水解大豆蛋白的峰值
大豆：水 游离氨基峰值（g/100mL）
1:5 0.098
1:6 0.100
1:7 0.129
1:8 0.121
图7 不同大豆蛋白液浓度下水解效果
从表4和图7可以看出，当大豆蛋白稀释较小时，底物浓度过高，而固定化凝胶珠与底物接触不良，很容易覆盖固定化凝胶珠，从而影响水解效果［14］；而当大豆蛋白稀释较大时，底物浓度过低，底物中含有大量的水，在不断的使用中，固定化凝胶珠会吸水胀破，影响固定化酶的使用时间。由图可知：大豆：水=1：7时水解效果最好。
3.5 固定化酶在固定床与摇床中的比较实验
取最适固定化时间为2.5h，最适酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%，最适海藻酸钠浓度（w/v）为3%，最佳底物浓度（大豆：水）为1:7，其比较实验结果如表5和图8所示。
3.5.1固定化酶在固定床与摇床中的性能比较
表5 固定化酶在固定床与摇床中对水解效果的影响
使用时间（d） 嗅觉 游离氨基峰值（g/100mL）
固定床 〉40 轻微异味 0.122
摇床 25 强烈异味
0.118
从表5中可知，固定化酶在摇床和固定床中对水解效果的影响有一定影响:对游离氨基峰值影响不大，但在使用时间和嗅觉方面有较大的差异。固定化酶在固定床中可以反复使用的时间大大高于在摇床中，这主要是因为摇床的不断摇动使得固定化酶珠之间、酶珠与三角烧瓶壁之间不断的发生摩擦，酶珠与大豆蛋白液之间的剧烈冲洗，从而使固定化酶在使用一段时间以后破裂，导致仍具剩余活性的酶不能实现再利用，减少了固定化酶重复使用次数，降低了酶活性的利用率。
而在嗅觉方面的差异，主要是由于染菌引起的，因反应时间较长，反应温度为50 oC，比较适合一些菌种的生长。实验过程中，固定床取样是从事先设计好的取样口取样的，不易染菌；而从摇床中的锥形瓶中取样测量时，虽然在净化工作台中进行，手与相关器皿也都用75%乙醇杀菌，但其染菌的概率仍然大大高于在固定床中。
3.5.2固定化酶在固定床与摇床中水解效果的比较
图8 摇床和固定床 中水解效果
从图8可以看出，在反应之初，固定化酶在摇床中的水解效果要略微好于在固定床中，这主要是因为在摇床中，底物与固定化酶之间的接触要比在固定床中更充分。但随着时间的推移，在摇床中的水解效果反而不如在固定床中。这主要是因为，在多次取样测量游离氨基以后，摇床中染菌造成的。细菌消耗了一部份产物或者尚未被完全水解的蛋白质，从而降低了游离氨基的值。
3.6 实验中注意点
(1) 滴定完毕后,尖嘴外不应留有液滴, 尖嘴内不应留有气泡。
(2) 由于空气中CO2影响，已达终点的溶液放久后仍会褪色，这并不说明中和反应没有
完全，而是因为溶液中的NaOH与空气中的CO2反应成中性的Na2CO3，从而使溶液成中性而褪色。
(3) 因本实验过程需要3-4d，并且反应温度为50OC，大豆蛋白液极易染菌变质，所以实验中的各步骤都尽量应在净化工作台中进行，如取样测值等操作。
(4) 本次实验中取样测值的次数较多，所以应尽量减少取样对水解反应的影响，应采取的措施：减少取样次数，或者以相同的比例增加反应所需的各溶液量。
4.总结与展望
4.1 总结
经过这段时间的实验，我学到了很多知识与技能。通过查阅文献，我巩固了文献检索的方法，进一步学习了固定化酶的研究进展、应用、优点和水解蛋白的相关知识，还探索了固定床在固定化酶水解植物蛋白方面应用的可能性。而实验中，我更将理论知识应用到实际中去，提高了动手能力：学会了海藻酸钠固定化酶的具体操作步骤、水解植物蛋白的条件控制，并在导师的指导下，参与固定床的自制和安装。
经过实验，我得出：
(1) 固定化酶水解植物蛋白最佳参数：最佳底物浓度（大豆：水）为1：7；最适固定化时间为2.5h；最适酶浓度（酶量：海藻酸钠溶液体积）为1%；最适海藻酸钠浓度（w/v）为3%。
(2) 并在此最佳参数基础上，进行在固定床与摇床条件下的对比实验，得出：在固定床中，固定化酶使用次数和时间方面有很大的改善，从而使得酶的利用率更高；而且实现批量或连续操作模型的可能，更适于产业化、连续化、自动化生产。
由于客观条件所限制和关于固定化酶在固定床中水解植物蛋白的研究寥寥无几，本实验尚有诸多不足之处，比如:蛋白水解液仍有染菌几率，对实验有些许影响；实验中所用的自制固定床比较容易堵塞，且会发生泄漏现象，从而要经常检查；因时间紧迫，酶的固定化条件除了本实验所研究的4个参数外，还有pH、温度等因素的影响没有研究，而是经过查询相关文献取最佳参数的。
4.2 展望
展望未来，固定化技术作为一项新兴技术有着不可限量的活力,引起了酶工业极大的变化。固定化酶作为第二代酶制剂正日益成为酶应用方面的主力军。可以预期,今后最引人注目的进展将会是优良菌株固定化技术和连续反应器的巧妙结合。 毫无疑问,这将在工业生产中将发挥越来越重要的作用。
致 谢
首先我要感谢我的导师王克明教授。本课题在选题及研究过程中得到王克明教授的悉心指导。王克明教授在百忙之中，仍对我们的实验进行细心的指导，多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。王老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，给予我终生受益之道。在此，学生谨向导师表示衷心的感谢！
其次，我要感谢生化学院的全体老师和学校，是你们让我在大学的四年里，不但学到了知识，更学会了做人；是你们为我提供了良好的研究条件。
再次，我要感谢我的同学。在我迷茫时，你们鼓励我；在我困难时，你们帮助我。并在实验过程中不断地对我伸出援助之手。
最后，我要衷心感谢审阅此文的各位老师。
程 慧
2007年6月17日
参考文献
[1] 刘宇峰,陈琪.大豆蛋白水解多肽系列制品的研究[J].大豆通报,2000,5:19-20
[2] 王尔惠.大豆蛋白质生产新技术[M].北京:中国轻工业出版社,1999:60-66
[3] 王洪祚,刘世勇.酶和细胞的固定化[J].化学通报,1997,(2):22-27
[4] 刘秀伟,司芳,郭林,等.酶固定化研究进展[J].化工技术经济,2003,(4):12-16
[5] 郑婉玲,邹云珍,臧向莹.强化海藻酸钠凝胶制备固定化酶[J].工业微生物,1998,
(3):15-18
[6] 郭勇.酶工程[M].北京:科学出版社,2004:177
[7] 李勤.固定化技术在食品工业中的应用和发展研究[J].四川食品与发酵,2006,
42(4):16-19
[8] Odaci. D, Timur. S, Pazarlioglu. N, et al. The effect of mediator on laccase biosensor response for paracetamol detection[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2006, (4) :12
[9] Tang D, Yuan R, Chai Y. Direct elect rochemical immunoassay based on immobilization
of protein-magnetic nanoparticle composites on to magnetic elect rode surfaces by sterically enhanced magnetic field force [J]. Biotechnol Lett , 2006, 28, (8): 4-27
[10] 运艳霞.环境工程中固定化酶与固定化微生物的应用[J].大学时代,2006,6:99
[11] 李祥,杨百勤,丁红梅.水解蛋白质调味液中氯丙醇的形成及其控制[J].中国制造,2003,3:1-4
. Biotechnol Lett, 2007, 4(accepted)
[13] 王康,何志敏,范庆军.有机相中壳聚糖一海藻酸固定化脂酶的特性[J].化学工程,2001,(5):39-43
[14] 韩继福,任建波.Alcalase酶水解玉米蛋白粉制备可溶性肽最佳条件的研究[J].
植物蛋白篇7
胶原蛋白 何方神圣
胶原蛋白（collagen）是一种生物性高分子物质，是一种白色、不透明、无支链的纤维性蛋白质。它可以补充皮肤各层所需的营养，使皮肤中胶原活性增强，有滋润皮肤，延缓衰老、美容、消皱、养发等功效。
胶原蛋白是人体延缓衰老必须补足的营养物质，占人体全身总蛋白质的30%以上，一个成年人的身体内约有3公斤胶原蛋白。它广泛地存在于人体的皮肤、骨骼、肌肉、软骨、关节、头发组织中，起着支撑、修复、保护的三重抗衰老作用。
胶原蛋白主要分布在哺乳动物的结缔组织中，对动物和人体皮肤、血管、骨 骼、筋腱、牙齿和软骨的形成都十分重要，是这些结缔组织的主要物质基础。因此，我们可以毫不夸张的说，胶原蛋白是一切动物的生命支架。
随着年龄的增长，胶原蛋白会逐渐的流失。女性在20岁时胶原蛋白已经开始老化、流失，含量逐年下降，25岁则进入流失的高峰期，40岁时，含量不到18岁时的一半，老年人脸上沟沟坎坎的皱纹，正是因为胶原蛋白和水分流失，造成皮肤塌陷。胶原蛋白的流失导致支撑皮肤的胶原肽键和弹力网断裂，其螺旋网状结构随即被破坏，皮肤组织被氧化、萎缩、塌陷，肌肤就会出现干燥、皱纹、松弛无弹性等衰老现象。所以，要延缓衰老必须要补充胶原蛋白。
胶原蛋白也能植入
胶原蛋白流失了，怎么补回来？很多朋友，尤其是女性都听说过胶原蛋白是可以口服的。对此，北京世纪坛医院整形美容科主任徐光教授认为，虽然胶原蛋白是可以通过口服起到一些补充的作用，但是起效慢、效果也不明显。“口服胶原蛋白经过胃肠道消化最后能够到达皮肤真皮层中发挥作用，并保持这种作用，这并不是一件容易的事。”
而相比较口服胶原蛋白，徐光主任推荐了另外一种方法：胶原蛋白植入剂。对，胶原蛋白也能植入。经过多项研究和临床验证，这种植入性的胶原蛋白已经越来越受到追求生活品质的人士的青睐。安全、可靠地植入型胶原蛋白，具有植入方便、恢复期短、无癌化风险、效果立竿见影等特点。少部分人注射时可能出现淤青，但冷敷后会很快恢复。这种微整形手术得到了许多爱美人士的认可和追捧。
徐主任介绍说，胶原蛋白植入剂是一种皮下填充剂，通过非手术方式将胶原蛋白植入皮下，增加真皮层组织的容量，从而达到抚平皱纹、改善脸部缺陷、雕塑完美肌肤的目的。目前，世纪坛医院使用的胶原蛋白植入剂来源于台湾，是以专利纯化制程生产，结合先进免疫修饰技术，修饰后的胶原蛋白几乎没有过敏反应的风险，并且透过创新的纤维诱导技术让完整的胶原蛋白纤维更紧密的堆叠，让植入后的胶原蛋白在真皮层中可停留更长的时间。
徐主任特别说明，这种胶原蛋白是从猪皮中提取出的。为保证提取物的质量，这些提供胶原蛋白的可爱的小猪都在绝对自然的环境下健康成长。要知道，在所有的动物中，与人类皮肤最接近的就要数猪皮了。
关于胶原蛋白植入剂，徐主任说，植入后对蛋白酶具适度之抗力，不会马上被分解，分散的胶原蛋白会形成一个柔软具粘性的纤维状结构，可停留于植入部位，使凹陷恢复，持续修补效果。植入的胶原蛋白经过数个月后，会被人体的结缔组织同化，成为人体组织的一部份，也会被人体内如胶原蛋白酶分解，因此，具生物分解性，不致于永久留在植入部位。另外，胶原蛋白本身即是最佳的凝血剂，故对于血管丰富的区域，如：下眼皮、眼周，或是易瘀青体质的病患较为安全。蛋白填充剂植入真皮层下不易有吸水肿胀的特性，故针对像眼睛周围水份代谢较慢、较易浮肿的组织，可减少术后不适应。
胶原蛋白植入剂的“势力范围”
1．皮肤缺陷的矫正、凹洞填补。
2．脸部皱纹、鱼尾纹、唇纹、笑纹、额头纹、法令纹、眉间纹、皱折补平、唇形美化、耳垂增大、鼻梁增高、下颏增高、丰唇。
3．植入后的胶原蛋白直接填补真皮层的缺陷，达到皱纹立即填补的目的，并且可以运用于脸部轮廓的修饰。同时，也会引导新生胶原进行真皮层组织的更新再造，新植入后的胶原蛋白完全融入于真皮层中并如同人体自身胶原蛋白一样被自然吸收，使用安全、无副作用。
治疗时间
整个疗程只需要很短的时间，除特殊部位外，不需要额外的麻醉，注射效果立竿见影，注射后只需20～40分钟，即可继续任何工作。
植入胶原蛋白ABC
治疗效果：
一般维持约12～18个月以上，需视施打技巧、植入深度、植入部位及患者年龄、生活习惯之不同而有不同的效果。对于面积较大的修复和填充，使用大分子胶原蛋白，维持时间在18个月左右。对于细小部位的雕琢，比如抚平小皱纹，使用小分子胶原蛋白，则时间相对短些，在12个月左右。
术后保养：
1．植入部位做好防晒工作，并于早晚涂抹含有胶原蛋白的保养品。
2．植入部位保持清洁、干净。
3．植入部位不接触不洁物及水，避免感染细菌。
4．必要时给予冰敷及涂抹消炎药剂。
5．避免熬夜，保持生活作息正常。
术后禁忌：
1．注射后48小时内，应保持注射部位静止，不要触摸、按压，同时，避免大哭、大笑等面部肌肉的频繁运动，以保持注射部位填充物的均匀分布。二日内不宜做浓妆涂抹于植入部位。
2．注射后24小时内，整脸不要使用化妆品，不要沾水或被污染；注射后72小时内，不得在注射部位和注射周边部位涂抹刺激性化妆品；1个月内，不要蒸桑拿、不做激光或者光电类的美容。
3．注射后不要吸烟、饮酒，不吃辛辣等刺激性食品，避免熬夜和在极端阳光及其它射线下暴露。
4．丰唇者二日内避免抿嘴唇与热食。
徐光主任特别提醒爱美人士，虽然说植入性胶原蛋白是安全系数较大的微整形项目，但仍然有一定的技术含量。比如，注射时掌握好皮肤层次很重要。因此，爱美人士在选择机构时，最好到正规医疗单位。
植物蛋白篇8
不过，虽然第一次绿色革命成绩巨大，但还有许多问题急待解决，例如产量还须进一步提高，蛋白质含量也必须增加。总之，第一次绿色革命并没有圆满成功，农业科学家正在和生物学家、遗传工程师们合作进行一场规模更大的绿色革命。
这次的目标，首先是要大幅度地提高产量。第一次绿色革命中的新品种之所以增产，是因为提高了从土地中吸收养料的能力。但是，光靠这个办法增产还很不够。据研究，一株植物的干重量只有5—10％来自土壤，绝大部分来自光合作用时吸收的二氧化碳。因此，提高光合作用的效率，将能大大提高作物产量。植物在光合作用时一方面积蓄能量和物质，一方面又通过光呼吸消耗相当一部分能量和物质，如果降低光呼吸作用，提高光合作用，就能使作物增产。美国科学家蔡利思发现了一种光呼吸抑制剂，能使烟草的光呼吸大大降低，从而光合作用的效率提高了3倍。他的研究开辟了一条增产的新途径。
当然，仅仅提高作物的产量还不够，还要提高作物的质量。第一次绿色革命没有提高作物的蛋白质含量，蛋白质的短缺已成为一个十分严重的问题。解决植物蛋白不足，是科学家们努力的又一个目标。
人们吸收的植物蛋白主要来自大米、小麦和玉米。提高它们的蛋白质含量，就能提高粮食的质量。美国科学家沃斯特尔用以色列和伊朗的野生小麦杂交培养出高产量、高蛋白的新小麦，它们的蛋白质含量达26.5％，比普通小麦高一倍。科学家们也不断地在种类繁多的植物王国中探索，寻找新的植物蛋白资源。全球约有35万种植物，可食植物约8万多种，而现在食用的仅3千种，占3—4％。在植物王国中，豆类的蛋白质含量很高，但许多豆类植物没有开发利用。最近，美国科学院对豆类植物作了一次大普查，发现有200多种豆类植物有很高的蛋白质含量，并发表了《豆类植物：未来的资源》一书，认为这是一个巨大的蛋白质资源，急待开发利用。例如生长在巴布亚新几内亚的翅豆，果实含有37％的蛋白质，块根的蛋白质含量为土豆的10倍，目前已有70多个国家引进和研究
此外，进行分子和细胞水平的嫁接、培育新品种，也是这次绿色革命的一个显著特征。不同植物的细胞在一定的培养液中，细胞核会结合，细胞壁会再生，并进行细胞分裂，最后生长出完整的植株。用这种细胞杂交法，美国科学家霍尔和坎罗去年利用根瘤菌作为媒介，把腰豆的蛋白基因转移到向日葵细胞中去，成为向日葵细胞中DNA的一部分。这个基因在向日葵细胞中很稳定，并产生了合成腰豆蛋白的信使物质RNA.“向日豆”的成功表明，有可能通过根瘤菌进行分子水平的大豆、水稻、小麦的杂交，使新作物中具备各种必须氨基酸，将蛋白质的质量提高。