细胞凋亡抑制因子(Fas/APO-1)与抗β2-肾上腺素能受体自身抗体的关系

作者：陈牧雷，杨新春，刘瑞红，刘秀，张 磊，张 麟

【摘要】 目的 检测并比较心肌梗死急性期不同时间点，β2自身抗体阳性组与阴性组，患者血清中Fas/APO-1水平差异，了解β2自身抗体对Fas/APO-1的影响。方法 41例急性心肌梗死患者，分别于发病24h、7天、2～4周时取血，采用ELISA的方法，检测血清中β2自身抗体的阳性率以及Fas/APO-1的水平；另外取34位性别、年龄匹配的健康人的血同法检测Fas/APO-1作为对照。结果 心肌梗死急性期Fas/APO-1的水平均高于对照组（P<0.05），以梗死后24hFas/APO-1的水平为最高；心肌梗死急性期不同时间点，β2自身抗体阳性组Fas/APO-1的水平均高于阴性组，但两组的结果差异无显著性（P＞0.05）。结论 血清Fas/APO-1水平可以在一定程度上反映心肌细胞凋亡的变化趋势，β2自身抗体对Fas/APO-1的确切影响，有待更大规模的实验来证实。

【关键词】 心肌梗死；细胞凋亡；Fas/APO-1；自身抗体；β2受体

【Abstract】 Objective To find the influence of autoantibody against the β2-adrenergic receptor (β2 autoantibody) on Fas/APO-1，by comparing the difference of serum levels of Fas/APO-1 between β2 autoantibody positive and negative groups on different time point at acute stage of myocardial infarction.Methods By ELISA method，the positive ratio of β2 autoantibody and the serum level of Fas/APO-1 were tested in 41 acute myocardial infarction(AMI) patients on 24 hours，7days and 2～4 weeks of symptoms onset，and the same method was used to test the serum level of Fas/APO-1 in 34 sex and age matched healthy donors.Results The serum level of Fas/APO-1 in patients at the acute stage of myocardial infarction was higher in the β2 autoantibody positive group than that of the negative group，but the difference was not significant statistically （P＞0.05）.Conclusion The serum level of Fas/APO-1 may to certain extent reflective the cardiomyocyte apoptosis.The large scale of trails should be done to confirm the accurate influence of β2 autoantibody on Fas/APO-1.

【Key words】 myocardial infarction；apoptosis；Fas/APO-1；autoantibody；β2-receptor

目前有研究认为，多种心血管疾病中存在心肌细胞凋亡，而β2-肾上腺素能受体表达的轻度升高，有对抗心肌细胞凋亡的作用。抗β2-肾上腺素能受体自身抗体（β2-受体自身抗体）因具有β2受体激动剂样作用，可能也具有对抗细胞凋亡的作用。血清中细胞凋亡抑制因子（fas/apo-1）的水平能间接反应机体细胞凋亡的情况，但尚无文献报道，在心肌梗死急性期β2-受体自身抗体与Fas/APO-1的关系。本实验希望通过检测心肌梗死急性期β2-自身抗体阳性与阴性组患者血清中Fas/APO-1的水平，明确两者之间的关系，为临床对抗心肌细胞凋亡提供一些参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 急性心肌梗死组（AMI组） 共41例，为2002年2月～2002年11月在朝阳医院心脏中心CCU病房住院治疗的患者，男28例，女13例，平均年龄60.4±12.8（36～80）岁。急性心肌梗死的诊断标准见文献［1］。所有病人均为症状发生12h以内来院的，并经冠状动脉造影证实为急性心肌梗死。

1.1.2 对照组（NC组） 34例性别、年龄与AMI组匹配的健康人，经胸片、肝、肾功能、尿常规检查未见异常，排除冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压病、心肌病、内分泌及自身免疫性疾病。

1.2 取血 正常对照组取静脉血5ml，AMI组患者分别于发病24h、7天及2～4周内各取静脉血5ml，2000rpm室温下离心10min，收集上层血清，装入Eppendorf管，-20℃冰箱贮存待测。

1.3 细胞凋亡抑制因子Fas/APO-1测定

1.3.1 测定原理 采用上海森雄科技实业有限公司提供的试剂盒，用ELISA法定量检测Fas/APO-1的水平。操作时标准孔及待测样品均做双孔，两孔的平均值作为检测结果。

1.3.2 结果计算与判断 （1）所有OD值都应减去空白值后再行计算。(2)以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.2、1.6ng/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。（3）根据样品OD值在该曲线图上查出相应人血清Fas/APO-1的含量。

1.4 受体抗原肽段的合成及血清自身抗体的测定 由中国科学院生物分子研究所，合成相当于人β2-肾上腺素能受体细胞外第二环氨基酸序列的特异性抗原决定簇，合成肽段纯度为99%，β2-肾上腺素能受体肽段为172～197位的氨基酸序列：H-W-Y-R-A-T-H-G-E-A-I-N-C-Y-A-N-E-T-C-C-D-F-F-T-N-G-C。

用SA-ELISA法，以5ug/ml的β2抗原液包被酶标板，血清按1：20～1：160浓度进行倍比稀释，其它检测步骤见文献［2］。

1.5 判断标准 用比例法，以阳性血清与阴性血清的吸光度之比即P/N比值来判断，P/N≥2.1为阳性［P/N=（标本OD值-空白对照OD值）/（阴性对照OD值-空白对照OD值）］。

1.6 统计学处理 使用SPSS统计软件包进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间数据比较采用t检验，多组样品的比较采用方差分析；计数资料用χ2检验，均以P<0.05为差异有显著性，以P<0.01为差异有非常显著性。

2 结果

2.1 将标准品倍比稀释后的浓度及所测得的对应的OD值输入计算机进行数据处理，二者在半对数条件下呈正相关关系，计算出相关方程Y=2.0372e1.7677x，R2=0.9634［X为OD值，Y为Fas/APO-1的浓度（ng/ml），R为相关系数］。

2.2 AMI后24h、7天及2～4周时，Fas/APO-1的水平均高于对照组，且这种差异都有显著性（P<0.05）。AMI后24h Fas/APO-1的水平，明显高于7天及2～4周时的检测结果，这种差异也有显著性（P<0.05）。具体数值见表1。

表1 AMI组与对照组血清中Fas/APO-1比较表

注：VS对照组**P<0.11；VS心肌梗死后24h组##P<0.01

2.3 心肌梗死后24h、7天及2～4周时，β2受体自身抗体阳性组Fas/APO-1的水平均高于阴性组，但两组比较差异无显著性(P＞0.05)。具体结果见表2。 表2 心肌梗死急性期β2受体自身抗体阳性组与阴性组Fas/APO-1比较

3 讨论

在急性心肌梗死动物模型中，心肌细胞凋亡在梗死后4～12h达高峰，并可持续至梗死后10天左右［3］，这与本实验所得出的，心肌梗死急性期患者血清中Fas/APO-1的水平，均显著高于对照组，且以发病24h时血清中的Fas/APO-1的水平为最高，以后逐渐减低，至2～4周时显著降低的结果相吻合。促进心肌细胞凋亡的因素很多，如低氧血症、缺血再灌注、持续过度的机械牵拉以及β1受体的过度表达或持续刺激等［4，5］。在细胞凋亡活跃时，血清中的Fas/APO-1可以显著升高，抑制细胞凋亡的进一步发生［6，7］。

近来的研究表明，β2受体在心肌细胞凋亡的调节中也有重要的作用，β2受体表达的轻度升高，具有抗心肌细胞凋亡的作用［5，8］。β2受体的作用与β1受体不同，它除了与刺激性G蛋白（Gs）结合外，还能与抑制性G蛋白（Gi）结合，起到减弱β肾上腺素能受体信号系统的作用；此外β2受体还能调节非G蛋白依赖性信号系统的作用，起到保护心脏对抗心肌细胞凋亡的作用［5，8］。当然β2受体对心脏的保护作用，是有一定限度的，如果β2受体表达轻度升高，可以改善心功能减少心肌细胞凋亡；如果β2受体表达过度升高，反而可以诱发心肌细胞凋亡以及纤维化，甚至造成实验动物早死。

β2受体自身抗体对β2受体有激动剂样作用，所以可能在一定范围内具有对抗细胞凋亡的作用。但是在本实验中，心肌梗死后24h、7天、2～4周时，β2受体自身抗体阳性组Fas/APO-1的水平虽轻度高于阴性组（两组均数的差值分别为0.4971，0.1860，0.4786），可是差异无显著性。产生这一结果的原因可能与下列因素有关：(1)β2受体自身抗体的测定不是定量的，阳性组中部分病因自身抗体的浓度过高，对细胞凋亡的作用会变成促进性的，所以影响了两组的比较结果。如能定量检测β2受体自身抗体的水平，有望更好地反映它与Fas/APO-1的相关关系。(2)实验例数较少。Fas/APO-1的血清浓度较低，在心肌梗死急性期与对照组的比较中，两组均数的最小差值仅为0.851，但因两组例数均在30例以上，故仍体现出显著的统计学差异。而在β2受体自身抗体阳性组与阴性组的比较中，每组的例数仅在20例上下，所以很难体现出如此细微的差别。(3)β2受体自身抗体通过多条途径作用于心肌细胞凋亡，这些途径是否与Fas有关尚无定论，所以需要更为深入的基础研究提供有关的信息。

结论：血清Fas/APO-1水平可以在一定程度上反映心肌细胞凋亡的变化趋势，如能增加样本量，定量检测β2受体自身抗体的水平，有望明确Fas/APO-1与β2受体自身抗体的关系，进一步阐明β2受体自身抗体在对抗心肌细胞凋亡中的作用，为心肌细胞凋亡的临床治疗提供更多的参考。

【参考文献】

1 链激酶多中心临床试验协作组.急性心肌梗死链激酶静脉溶栓疗法的多中心试验.中华心血管病杂志，1991，22：403-405.

2 张麟，刘慧荣，赵荣瑞，等.扩张型心肌病抗心脏β1和M2受体的自身抗体的初步研究.中华心血管病杂志，1998，26：15-17.

3 Abbate A，Biondi-Zoccai GG，Baldi A.Pathophysiologic role of myocardial apoptosis in post-infarction left ventricular remodeling.J Cell Physiol，2002，193：145-153.

4 Saraste A，Pulkki K，Kallajoki M，et al.Apoptosis in human acute myocardial infarction. Circulation，1997，95：320-323.

5 Singh K，Xiao L，Remondino A， et al.Adrenergic regulation of cardiac myocyte apoptosis.J Cell Physiol，2001，189：257-265.

6 Nishigaki K，Minatoguchi S，Seishima M，et al.Plasma Fas ligand， an inducer of apoptosis， and plasma soluble Fas， an inhibitor of apoptosis， in patients with chronic congestive heart failure. J Am Coll Cardiol，1997，29：1214-1220.

7 Cheng J，Zhou T，Liu C，et al.Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule.Science，1994，263：1759-1762.

8 Chesley A，Lundberg MS，Asai T，et al.The {beta}2-adrenergic receptor delivers an antiapoptostic signal to cardiac myocytes through Gi-dependent coupling to phosphatidylinositol 3’-kinase.Circ Res，2000，87：1172-1179.