多组织阳性对照蜡块的制作及应用

摘要：目的 建立多组织对照，使免疫组化染色阳性对照获取更方便，结果更可靠。方法 选择正常的阑尾、扁桃体、胰腺、肝脏组织制作成石蜡块，然后选择4～6 mm直径的空心管在组织块上打孔，分别包埋于一个蜡块中建立多组织对照蜡块。预先切取对照片干燥后保存备用，常规免疫组化染色。结果 染色后不同组织呈不同分布或表达，且对照组织中至少有一个组织显示阳性。结论 此多组织对照蜡块可用于常见的多种抗体的对照，相比于不设置对照，结果更可靠；相比于单组织对照和组织芯片，也更为方便实用。

关键词：免疫组化；质量控制；阳性对照；多组织对照

根据免疫组化技术的特点，在染色过程中设立对照是进行染色质量控制的重要措施之一，Dr.Hector Battifora首次提出免疫组化的多组织对照的概念，经过多次改良和优化，形成多组织对照蜡块（Multi-tissue control blocks）[1-4]。经过多次尝试单组织阳性对照蜡块、组织芯片和多组织对照蜡块，发现多组织对照蜡块具有结果可靠、使用方便等优点。现将最常用的阑尾、扁桃体、胰腺、肝脏组织制作成多组织对照蜡块，下文将详细介绍制作过程和阳性对照设计。

1 资料与方法

1.1材料 选取本科室手术标本中的正常阑尾、扁桃体、胰腺、肝脏组织进行常规的取材，脱水浸蜡和包埋制成蜡块。

1.2多组织对照蜡块的制作 选取4～6 mm直径的空心管在已经制作好的蜡块上打孔，存放于离心管里备用。然后将上述四类组织组织按顺序放入预热的蜡块模具，组织面朝下紧贴并黏附于模具，使四块组织位于同一平面，然后灌注蜡，加上塑料包埋盒，再将模具置于加热台上，使组织与蜡融合，最后置于冷却台，冷却后取出蜡块即可。

1.3多组织对照蜡块的使用 蜡块制作完成后按常规连续切片，厚度3～4 μm，裱贴于正离子玻片靠近标签的一端，干燥后可以叠放在一起，需要时随时取用。若需长时间保存可烤片后放入4℃冰箱。常规免疫组化染色时，就将检测组织裱在对照组织的旁边，然后同时进行烤片、脱蜡以及免疫组化染色。

1.4免疫组化染色方法 选用全自动的Ventana Benchmark XT免疫组化染色仪，整张玻片都能覆盖，也可用于手工染色，同时滴加抗体。

1.5阳性结果的判断和设计 介绍部分广泛使用的抗体在阑尾、扁桃体、胰腺、肝脏中的表达，见表1。

2 结果

阳性对照染色理想，不同抗体在不同组织中具有不同的染色强度和定位，即使同一组织也有强弱不同的表达，体现了组织抗原含量的变化，且四个位点至少有一个位点呈现阳性反应，其余组织则可作为阴性对照。且由于是在同一张玻片上染色，便于读片医生可以做出更为可靠的判断。

3 讨论

3.1单组织阳性对照蜡块制作简单，虽然组织获取方便，但由于标记覆盖面不够广，往往需要准备大量用于各种标记类型的组织蜡块，且单组织阳性对照蜡块通常是使用已知抗原表达较强的组织，相对于抗原表达较弱的检测组织就容易产生假阴性的结果。且阳性对照的设置必须考虑免疫组化染色的检测下限（1ow limitofdetection，LLOD）[7]，LLOD是指在已知的可低表达某一抗原蛋白的组织或细胞成分中观察的阳性反应，所以多组织蜡块可以很好的避免判断为假阴性的风险。所以位于纽约罗切斯特大学医学中心的生物染色委员会（The biological Stain commission.University of Rochester Medical Center， Rochester，NY）和很多专家建议使用低表达的对照组织以保证染色系统足够的灵敏度检测低抗原水平的组织和减少假阴性结果产生的风险[8-10]。当然，最理想的是使用细胞蜡块和多肽类阳性对照，但前期成本昂贵，制作繁琐[11]，可以作为下一步研究的方向。多组织对照标记覆盖面广，阑尾、扁桃体、胰腺、肝脏四种组织的对照能覆盖100余种抗体，且取材也非常方便。同一种抗体在不同的组织中有不同的表达，以此可以减少假阳性的风险。

3.2虽然组织芯片抗体覆盖面最广，且高通量的特点也使检测的准确性更高，同时更为节约组织[12-13]，但组织芯片操作太过繁琐，对制作过程要求高，包埋容易形成空泡，且由于组织量太小，细胞数量少，大量连续切片阳性率不稳定，同一平面经常无法切全，而如果使用专业设备制作组织芯片又加大了工作成本，不利于日常操作。多组织对照蜡块克服了组织芯片组织量太少的不足，操作成本及便利性提高，按常规制作包埋就可取得理想的效果。

3.3多组织对照蜡块一般选择四个对照组织，兼顾抗体覆盖面和实际操作，更为方便。可以对大量标记进行检测，组织获取方便，制作工具和方法也十分简便，且与待检组织于同张玻片上同时检测，达到了实验条件的一致性，保证了实验结果的准确性和科学性，多组织蜡块可以很好的避免判断为假阴性的风险。同时也较好地达到了对免疫组化进行质控的目的。

3.4根据抗体表达强度的差异，如 CD34在骨髓造血干细胞得表达量很大，而对于皮肤肿瘤来说，仅隆突性皮肤纤维肉瘤可表现 CD34强阳性染色，而在其他类型的皮肤肿瘤中 CD34表达较弱。因此可根据该类疾病的特c，设计专门用于一类疾病的多组织蜡块，该方法可对疾病的诊断和分类有较大的指导意义。此外对于需要定量分析的抗体，如临床上 HER-2免疫组化染色，多组织阳性对照能提供能代表“0-3+”染色结果的信息使其判读更为精确标准。

参考文献：

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